JP3414766B2 - 単純ヘルペスウイルス２型の特異的検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、ヒト単純ヘルペスウイ
ルス２型（以下、ＨＳＶ２と称することがある）の特異
的検出方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヒト単純ヘルペスウイルス（以下、ＨＳ
Ｖと称することがある）はヒトの知覚神経節に潜伏し、
一度感染すると回帰発症を繰り返す。ＨＳＶには１型と
２型とがあり、型によって回帰発症率や薬剤感受性が異
なるので、ＨＳＶの型判別は重要な問題である。ＨＳＶ
感染症の最も確実な診断方法は、ウイルスを分離して判
定することであるが、この方法は培養細胞の準備が必要
であり、また判定までに数日を必要とするので、治療に
適切に反映させることが困難である。蛍光抗体法により
判定する方法もあるが、この場合には患部細胞を必要と
する。また、ＨＳＶを型特異的に識別するＤＮＡ断片を
プローブとして患者検体をドットブロット法で検査する
方法もあるが、従来の方法では多量の試料（例えば、２
００〜５００μｌ）を必要とするだけでなく、ＨＳＶで
あることを判別することができても、型の判別まではで
きない場合があった。以上のように、従来の方法では、
医療の現場の要求に十分応えることが困難であった。従
って、短時間に、精度高くＨＳＶ１型と２型の型を判別
することのできる手法と体外診断薬の開発が望まれてい
た。 【０００３】一方、ＨＳＶには型特異的な識別を可能に
する塩基配列は存在しないと言われてきたのに対し、本
発明者らは、ＨＳＶの型特異的ＤＮＡプローブを既に開
発している。即ち、ＨＳＶ１型又はＨＳＶ２型のＤＮＡ
を特定の制限酵素によって切断して得られるＤＮＡ断片
〔又は、そのＤＮＡ断片を適当なベクター（プラスミ
ド）に挿入し、クローン化して得られるベクター（プラ
スミド）ＤＮＡを特定の制限酵素で切断して得られるＤ
ＮＡ断片〕を標識化し、型特異的なＤＮＡプローブを得
ることができる。これらの標識化ＤＮＡ断片は数百〜数
キロｂｐ（塩基対）の大きさであり、型別の特異性が優
れている（特開平２−１４２４９９号公報及び特願平２
−９０１９８号明細書）。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記の
方法とは別途に、迅速かつ確実にＨＳＶ２型を検出する
ために、上記のＨＳＶ２型に特異的な塩基配列を新たに
検索し、ＨＳＶ２型のＤＮＡと特異的にハイブリダイズ
する塩基配列を、プローブとして用いることができるこ
とを新たに見出した。本発明は、かかる知見に基づくも
のである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】従って、本発明は、配列
表における配列番号１の配列からなるオリゴヌクレオチ
ド部分を含有する２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒの第１のＤＮ
Ａプライマー、及び配列表における配列番号２の配列か
らなるオリゴヌクレオチド部分を含有する２０ｍｅｒ〜
２５ｍｅｒの第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、
ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試料とを含む混合
液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られた反応液と、配列表
における配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド部分を含有し、標識を担持するプローブとを接触さ
せ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、
単純ヘルペス２型の検出方法に関する。本明細書の塩基
配列において、Ａはアデニン残基、Ｃはシトシン残基、
Ｇはグアニン残基、そしてＴはチミン残基の意味であ
る。 【０００６】本発明方法で用いる被検試料は、ヒトＨＳ
Ｖ２型を含有している疑いのある試料であれば特に制限
されない。例えば、患者水疱内溶液、咽頭拭い液、髄液
等を用いることができる。 【０００７】本発明による前記のＨＳＶ２型検出方法
は、主に、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検査
工程とからなる。このＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣ
Ｒ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）を用いることができる。ＰＣＲ法を利用すると、
微量のＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自動的
に約１００万倍にまで増幅することができる（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）。ＰＣＲ
法では、増幅させる領域を挟んで、＋鎖に対するプライ
マー（１）及び−鎖に対するプライマー（２）の２種の
プライマーを用いる。 【０００８】前記配列番号１の配列の２０塩基からなる
配列〔ＤＮＡプライマー（１）〕及び前記配列番号２の
配列の２０塩基からなる配列〔ＤＮＡプライマー
（２）〕は、ＨＳＶ２型ＤＮＡのａ’シークエンス
（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５５，３１５−３３１，
１９８１）上にある。配列番号１の２０塩基配列はａ’
シークエンスの５’末端から６１塩基下流から８０塩基
下流までの２０塩基に相当し、配列番号２の２０塩基配
列はａ’シークエンスの５’末端から１７８塩基下流か
ら１９７塩基下流までの補完鎖の２０塩基に相当する。
被検試料中にＨＳＶ２型ＤＮＡが存在する場合には、プ
ライマー（１）とプライマー（２）の組み合わせによ
り、ａ’シークエンスの遺伝子の一部に相当する１３７
ｂｐ部分が、短時間のうちに特異的に大量に増幅される
ので、ＨＳＶ２型ＤＮＡの存在を極めて特異的に検出す
ることができる。 【０００９】前記のプライマー（１）及びプライマー
（２）は、それぞれ２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。本
発明方法で用いる第１プライマー及び第２プライマーの
それぞれを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾
（例えば、ビオチン化又は発光物質によるラベル化）さ
れていてもよい。本発明による前記のそれぞれの第１プ
ライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成
機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、
公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によ
って調製することができる。 【００１０】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１
プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サ
イクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特に
９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮＡ
ポリメラーゼ例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用い
ることができる。 【００１１】本発明のＤＮＡ増幅工程では第１プライマ
ーと第２のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被
検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プ
ライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検
試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ
増幅工程を実行することができる範囲で容易に決定する
ことができる。この混合液は場合により、緩衝液（例え
ばトリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えばゼラチン）、
又は塩類（例えば塩化ナトリウム）を含有することがで
きる。 【００１２】本発明方法では、前記の混合液を用いてＰ
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、 （ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９８℃で、約１０
秒間から２分間） （ii）一本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマ
ーとのアリーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３０
秒間から約３分間）、及び （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約
６５℃〜８０℃で、約３０秒間から約５分間）とからな
る。１サイクル毎にＤＮＡ量は最高２倍に増幅され、ｎ
サイクル後には２ⁿ 倍に増幅される。本発明において
は、前記の増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２
０〜４０回繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程
（iii ）の加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ
合成が完全に行われるようにするのが好ましい。 【００１３】被検試料中にＨＳＶ２が存在する場合に
は、前記の増幅サイクル終了後に、約１４０ｂｐのＤＮ
Ａが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤＮＡ検査工
程によって検出する。ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電
気泳動及びエチジウムブロマイド染色を利用する方法、
サザンハイブリッド法、又はジデオキシ法による塩基配
列決定法、放射性標識法などを用いることができる。ゲ
ル電気泳動を行う場合には、例えば、アガロースゲルを
担体としたサブマリーン型電気泳動又はアクリルアミド
を用いたスラブ型電気泳動を使用することができる。 【００１４】ドットブロット法、サザンブロットハイブ
リッド法又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合
には、放射性プローブ、非放射性プローブ（例えば酵素
標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴケシゲニン化
プローブ又は化学発光物質、蛍光物質で標識したプロー
ブ）を用いることができる。更に、ジデオキシ法による
塩基配列決定法を利用する場合には、蛍光標識を使用し
たＤＮＡオートシークエンサー（アプライドバイオシス
テム社）を用いることができる。 【００１５】本発明は、更に、ＨＳＶ２型ＤＮＡの特異
的な検出に用いることのできるＤＮＡプローブを提供す
る。本発明では、配列表における配列番号３で表される
塩基配列からなる４０塩基のオリゴヌクレオチド部分を
含有し、標識を担持するプローブと被検試料とを接触さ
せ、前記標識からの信号を検出する。 【００１６】配列表における配列番号３の４０塩基から
なる配列は、Ｌ領域のａ’シークエンスの５’末端から
下流１００塩基から１３９塩基間での４０塩基に相当す
る。従って、前記の少なくとも４０塩基を含む本発明の
プローブはＨＳＶ２型ＤＮＡのＬ領域のａ’シークエン
スに特異的である。プローブの長さは被検試料に対する
前処理の種類によって異なる。被検試料がＰＣＲ法によ
るＤＮＡ増幅工程を経たものである場合には、４０ｂｐ
ないしＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片の大きさ（プラ
イマー部分は除く）まで可能である。被検試料がＰＣＲ
法による増幅工程を経たものでなく、プローブをドット
ブロットあるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法に用い
る場合には、プローブの長さは４０ｂｐないし１３７ｂ
ｐの大きさまで可能である。配列表における配列番号３
の４０塩基を含むＤＮＡプローブ（４０ｍｅｒ）は、被
検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであ
っても、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法の場合
であっても、何れにも用いることができるので好まし
い。本発明のプローブの調製法としては、サクシノイミ
ド（例えば、ジサクシミジルスベレイト）を用いる方
法、活性ハロゲン法、アジドを用いた光反応、あるいは
カルボジイミド法などを用いることができる。 【００１７】プローブの標識物質としては、従来公知の
任意の物質を使用することができる。好ましくは、非放
射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を
用いる。標識化ＤＮＡの合成法は、大別すると （１）ＤＮＡの合成過程で直接的に標識化ＤＮＡを調製
する方法と （２）リンカーが結合したＤＮＡを合成してから単離
し、これに標識試薬を作用させる方法 とがあり、特に方法（２）は目的に応じて標識の型を容
易に変更でき、応用面で優れているので好ましい。方法
（２）で用いるリンカーとしては、５’−ジメトキシト
リチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキ
シル）−３−アクリルイミド〕−２’−デオキシウリジ
ン−３’−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピル）〕ホスホルアミダイト等を挙げることができ
る。プローブに結合した標識から信号を発生させ、更
に、その信号を測定する方法も、従来から公知の任意の
方法を用いることができる。 【００１８】 【作用】本発明方法において、プライマー（１）及びプ
ライマー（２）の組合せを用いると、被検試料中にＨＳ
Ｖ２型ＤＮＡが存在する場合にのみＬ領域ａ’シークエ
ンスの遺伝子の一部に相当する１３７ｂｐ塩基部分が短
時間の内に特異的に大量に増幅、合成される。更に、被
検試料中のＨＳＶ２型ＤＮＡが微量であっても、ＤＮＡ
が増幅合成されるので高感度である。 【００１９】また、本発明方法においては、（場合によ
り増幅した）ＨＳＶ２型ＤＮＡに特異的な標識化ＤＮＡ
プローブを用いるので、極めて正確にＨＳＶ２型ＤＮＡ
を検出することができる。更に、前記の第１及び第２プ
ライマーを用いる増幅工程と前記プローブを用いる検査
工程とを併用した場合でも、検査の所要時間はエチジウ
ム染色の場合は４〜５時間程度であり、サザンブロット
ハイブリッド法まで行う場合でも４８時間以内に、迅速
に結果を得ることができる。 【００２０】 【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：プライマーの合成 ３８１型自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステ
ム社）に、シトシンＣＰＧカラムを装着して、配列表に
おける配列番号１の配列の塩基２０個からなるプライマ
ー（１）を合成し、更にグアニンＣＰＧカラムを装着し
て、配列表における配列番号２の配列の塩基２０個から
なるプライマー（２）を合成した。アンモニア水（約３
０％）２．５mlを入れたディスポシリンジ（約２．５m
l）を、合成工程が完了したＣＰＧカラムに接続し、ア
ンモニア水をカラム内に押し出して、合成したＤＮＡフ
ラグメントを溶出した。回収したＤＮＡアンモニア溶液
の入ったバイアル瓶を密栓し、６５℃で６時間加熱した
後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃縮物を凍結乾燥
し、１０mMトリエチルアンモニウムアセテート（以下、
ＴＥＡ−Ａと称す）（pH７．４）に溶解し、沈殿を除い
てから、Ｌ−６２００型高速液体クロマトグラフィイ装
置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カ
ラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ
社）を装着し、５％アセトニトリルを含んだ９５mM−Ｔ
ＥＡ−Ａとアセトニトリルとによる濃度勾配を用いて精
製し、メインピークを集めた。得られた残渣に８０％酢
酸（アセトニトリルで調製）を加えて懸濁させ、室温で
３０分保持してから減圧乾燥した。乾燥物を１０mM−Ｔ
ＥＡ−Ａに溶解し、ジエチルエーテルで抽出してから減
圧乾燥した。乾燥したＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解
し、沈殿を除いてから、２回目のＨＰＬＣによる精製を
行い、メインピークを集めた。こうして得られた精製Ｄ
ＮＡプライマーを減圧乾燥して保存し、後記の実施例５
で用いた。 【００２１】実施例２：酵素標識プローブの調製 ＤＮＡプローブの合成は、前記実施例１と同様の装置を
用い、同様の条件で行ったが、本プローブの合成ではシ
トシンＣＰＧカラムを用いて、５’末端から２０番目の
チミンを５’−ジメトキシトリエチル−５−〔Ｎ−（ト
リフルオロアセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイ
ミド〕−２’−デオキシウリジン−３’−〔（２−シア
ノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕ホスホアミダ
イト（以下、リンカーと称する）に置き換えた。なお、
リンカーの位置はこの部位に限らず、他のチミン部位に
置き換えることも可能である。リンカー付きプローブの
精製も、実施例１に記載した条件で行った。精製したリ
ンカー付きプローブ３ナノモルを滅菌水８μｌに溶解し
た。この溶液に０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ₃ ／４mM−ＥＤＴ
Ａ溶液８μｌを加えた後、ジサクシニミルスベレイト
（以下、ＤＳＳと称する）のジメチルスルホキシド溶液
（１０mg／ml）５０μｌを加え、室温にて暗所で１５分
間反応させた。反応終了後、滅菌水３０μｌを加えて遠
心し、その上清をＨＰＬＣ（カラムとして東ソ−Ｇ３０
００ＰＷを用い、移動層に水を用いた）に通して、ＤＳ
Ｓを結合したＤＮＡ（以下、修飾リンカーＤＮＡと称す
る）を分取し、凍結乾燥した。乾燥した修飾リンカーＤ
ＮＡにアルカリホスファターゼＥＩＡ用（ベーリンガー
マンハイム山之内）（２０mg／ml）（以下ＡＰと称す
る）４０μｌを加え、室温で暗所にて１６時間反応させ
た。反応終了後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．
４）２．５mlを加え、ＨＰＬＣ（カラム：東ソ−ＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷ）で処理した。まず、０．１Ｍ−ＮａＣｌを
含む０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．４）で未反応のＡＰ
を除き、０．３３Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス緩
衝液（pH８．４）で目的のＡＰ標識ＤＮＡを溶出した。
分取した精製ＡＰ標識ＤＮＡの溶出液約６mlを３Ｍ−Ｎ
ａＣｌを含む０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．４）に対し
て透析した後、１mlに濃縮した。この溶出物をＡＰ標識
プローブとして後記の実施例６等で用いた。 【００２２】実施例３：ＨＳＶ２型ＤＮＡの抽出 ＨＳＶ２型の標準株としてＵＷ２６８を用い、更に、Ｈ
ＳＶ２型と同定されている臨床分離株を６株用いた。各
ウイルスをアフリカミドリザル由来のＣＶ−１細胞に１
ｐｆｕ／細胞の濃度で感染させた。ウイルスに感染した
細胞を５％二酸化炭素−９５％空気の気相中で培養し
た。細胞変性効果の見られた細胞を用いて、庶糖法（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ，９３，２６０−２６４，１９７９）に
よりウイルスＤＮＡを抽出した。 【００２３】実施例４：臨床検体のＤＮＡ抽出 臨床検体１０μｌを０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣ
ｌ、０．１１５％Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、０．０２％ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ の組成のＰＢＳ４９０μｌで希釈した検体５００μ
ｌに、同量の５０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．４）に溶
かした６Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液を加えた
後、ガラスパウダー懸濁液〔ＰｒｅｐＤＮＡ：（株）ダ
イアヤトロン〕１０μｌを加えて攪拌した後、室温に１
０分間放置した。次に１５，０００回転で２分間遠心
し、沈渣を集めた。得られた沈渣を５０％エチルアルコ
ールと５０mM−ＮａＣｌを含む１０mMトリス塩酸緩衝液
（pH７．４）１mlに懸濁し、１５，０００回転で２分間
の遠心により洗浄した。この遠心による沈渣の洗浄を更
に２回行った。洗浄済のガラスパウダーを蒸留水５０μ
ｌに懸濁した。ガラスパウダーに吸着している核酸を５
５℃で１５分間放置して溶出させた後、１５，０００回
転で２分間遠心し、上清を採った。この上清をＰＣＲ用
の検体として用いた。 【００２４】実施例５：ＰＣＲ法によるＨＳＶ２−ＤＮ
Ａの増幅 前記実施例３で抽出したＨＳＶ２型標準株のＤＮＡ及び
型既知のＨＳＶ野性株のＤＮＡ各１０ｎｇ、又は前記実
施例４で抽出した臨床検体からのＤＮＡ抽出物１０μｌ
を、１２５μＭ−ｄＡＴＰ、１２５μＭ−ｄＣＴＰ、１
２５μＭ−ｄＴＴＰ、３１．２５μＭ−ｄＧＴＰ、９
３．７５μＭ−デアザＣ ⁷ ｄＧＴＰ（以下ｄＣ⁷ ｄＧＴ
Ｐと称する）、０．０１％ゼラチン、２０mMトリス塩酸
緩衝液（pH８．８）、１．５mM−ＭｇＣｌ₂ 、５０mM−
ＫＣｌ、１０％ジメチルスルホキシド、２μＭプライマ
ー及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ：シータス社）を含むＰＣＲ反
応液１００μｌに加えた。ＰＣＲ法は（ｉ）９３℃で１
分間、（ii）６５℃で１分間、（iii)７５℃で２分間か
らなるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７５℃
で５分間のプログラムでＤＮＡの増幅を行った。 【００２５】実施例６：電気泳動によるＰＣＲ反応生成
物の確認と診断 電気泳動用のゲルは、トリス塩基４．８４ｇ、氷酢酸
１．１４２ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２mlを含む緩衝液
（pH８．０）（以下１ｘＴＡＥと称する）１リットルに
アガロースゲルを４％になるように溶解し、ムピド（ア
ドバンス社）のゲルプレートに流して調製した。次に、
ＰＣＲ反応後の溶液１０μｌにフィコールタイプ４００
（ファルマシア社）の１５％水溶液２μｌを混合し、そ
の混合物の全量をサンプルウエルに入れた。１ｘＴＡＥ
を電極槽に入れて、室温で１００Ｖにて２時間電気泳動
を行った。電気泳動終了後に、アガロースゲルをエチジ
ウムブロマイド染色し、ＵＶイルミネイター照射下で電
気泳動の結果を確認した（図１）。図１のエチジウムブ
ロマイド染色によれば、ＨＳＶ２型用プライマーを用い
たＰＣＲ法において、複数のバンドが観察されるが、Ａ
Ｐ標識プローブを用い、サザンハイブリダイゼイション
を行った。即ち、電気泳動後のアガロースゲルからＤＮ
Ａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓＮＥＦ９７６：ＤｕＰ
ｏｎｔ社）にサザンブロットしたものと、ＡＰ標識プロ
ーブをハイブリダイゼイションした。図２の結果から明
らかなように、本発明のプライマーで患者検体のＤＮＡ
を増幅し、増幅されたＤＮＡを本発明のプローブで確認
することにより、ＨＳＶ感染症の起因ウイルスがＨＳＶ
２型であるとの型確定診断を行うことができる。図１及
び図２において、「Ｍ」はＤＮＡマーカー、「１」はＨ
ＳＶ２型標準株ＵＷ２６８、「２」〜「７」はそれぞれ
臨床分離株であり、「１３７ｂ」は本発明のプローブ１
及び２によって増幅されるＤＮＡ断片の位置を示す。ま
た、ＤＮＡマーカー（φ×１７４−ＨａｅIII ｄｉｇｅ
ｓｔ）としては、下から７２ｂｐ、１１８ｂｐ、１９４
ｂｐ、２３４ｂｐ、２７１ｂｐ、２８１ｂｐ、３１０ｂ
ｐ、６０３ｂｐ、８７２ｂｐ、１０７８ｂｐ及び１３５
７ｂｐに現れるものを用いた。 【００２６】実施例７：臨床検体のドットブロット法に
よるＨＳＶ２型の型判別 ヘルペス感染症の疑いのある患者から採取した水泡内容
液５μｌを生理食塩液２mlに懸濁して、希釈した。希釈
検体１０μｌから、実施例４に記載した条件でＤＮＡを
抽出し、実施例５に記載した条件下にＰＣＲを行った。
ＤＮＡの増幅を行った反応液に、同量の０．５Ｎ−Ｎａ
ＯＨを加え、室温で１０分間放置した。ＤＮＡを変性さ
せた前記の処理済検体１０μｌを、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅ
ｎＰｌｕｓＮＥＦ９７６（ＤｕＰｏｎｔ社）を装着した
ブロッティング装置に載せ、室温で３０分間放置した
後、吸引により液を除いた。ＤＮＡをブロットしたフィ
ルターをプラスチック袋に入れ、続いて、０．７５Ｍ−
ＮａＣｌ、７５mMクエン酸３ナトリウム、０．１％Ｎ−
ラウリルサルコシン、０．２％ＳＤＳ、３０％ホルムア
ミド、５％核酸ハイブリダイゼイション用ブロッキング
剤（ベーリンガーマンハイム社）の組成のハイブリダイ
ゼイション用緩衝液５mlを加えて、密封した。３７℃で
６０分間放置した後、ハイブリダイゼイション用緩衝液
を除いた。実施例２で調製したＡＰ標識したＨＳＶ２型
判別用プローブ３ピコモルを溶かしたハイブリダイゼイ
ション液１．５０mlを加え、３７℃で一夜放置した。検
体中のウイルスＤＮＡとプローブのハイブリダイゼイシ
ョンが完了したフィルターをプラスチック袋から取り出
し、先ず２ｘＳＳＣで５分間、２回、続いて０．１％ド
デシル硫酸ナトリウムを含む２ｘＳＳＣで１５分間、３
回、最後に２ｘＳＳＣで１０分間、３回洗浄した。洗浄
の済んだフィルターを、０．１Ｍ−ＮａＣｌ及び１０mM
−ＭｇＣｌ₂ を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH９．
５）（以下、発色液と称する）に３０秒から１分間浸し
た。 【００２７】ニトロブルーテトラゾリウム（ベーリンガ
ーマンハイム社）７５mgを３０％滅菌水−７０％ジメチ
ルホルムアミド混合液１mlに溶解した（以下、この溶液
をＮＢＴ溶液と称する）。また、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル燐酸（ベーリンガーマンハイム社）
５０mgをジメチルホルムアミド１mlに溶解した（以下、
この溶液をＢＣＩＰ溶液と称する）。ＮＢＴ溶液４０μ
ｌ及びＢＣＩＰ溶液４０μｌを加えた発色液１０mlを、
前記発色液に浸したフィルターの入ったプラスチック袋
に入れ、室温で５分間〜１６時間保持して発色させた。
ＡＰとの反応は、１０mM−ＥＤＴＡを含むトリス塩酸緩
衝液（pH７．５）５０mlにフィルターを浸漬することに
より停止させた。 【００２８】これらの結果を表１に示す。供試した臨床
検体４０検体中、ウイルス分離ではＨＳＶ１型１６検
体、ＨＳＶ２型１４検体、判定不能（１型か２型か確定
不能の検体）２検体、陰性８検体であった。直接ドット
ブロット法では、ＨＳＶ１型１４検体、ＨＳＶ２型１７
検体、判定不能１検体、陰性８検体であった。これに対
し、本発明のＨＳＶ２型の型判別プローブでの結果は、
ＨＳＶ２型が２０検体となり、判定不能及び陰性の検体
はなかった。また、別の検査結果より、残りの２０検体
がＨＳＶ１型であることが確認されている。なお、表１
の基になった本発明のＰＣＲ法による検査結果を図３に
示す。図３において、レーンＡ〜ＣはＨＳＶ１型特異的
ＰＣＲ産物をドットブロットしたものであり、レーンＤ
〜ＦはＨＳＶ２型特異的ＰＣＲ産物をドットブロットし
たものである。また、Ｃ９及びＦ９はＨＳＶ１型標準株
（ＫＯＳ）であり、Ｃ１０及びＦ１０はＨＳＶ２型標準
株（ＵＷ２６８）であり、各レーンＡ〜Ｆの１〜８は臨
床検体をＰＣＲ処理後にブロットしたものであり、レー
ンＡ〜Ｃの検体１〜８とレーンＤ〜Ｆの検体１〜８は同
じ検体をＰＣＲ処理後にブロットしたものである。 【００２９】 【表１】 【００３０】 【発明の効果】本発明方法は、ＨＳＶ２型ＤＮＡに特異
的なＤＮＡ断片の増幅に用いることのできる１対のプラ
イマー及びＨＳＶ２型ＤＮＡに特異的なプローブとして
化学合成が可能な程度の大きさで、しかも型判別の特異
性が減少しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
提供するものである。従って、ＨＳＶ２型の感染症を、
高精度で、迅速に、しかも型特異的に識別でき、その結
果を診断及び治療に役立てることができる。 【００３１】 【配列表】 【００３２】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GCGCGAAGGC GGGCGGCGGC 【００３３】配列番号；２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： ＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧ ＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧ 【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GCAGCCCCGC GCGCCCCCTT CCCCGTCCCT CCCCCGGAGC

【図面の簡単な説明】 【図１】本発明の検査方法によって行った電気泳動の結
果を示す図面に代わる写真である。 【図２】図１のサザンハイブリダイゼイションの結果を
示す図面に代わる写真である。 【図３】ＨＳＢ型別ＰＣＲ産物のドットブロットの結果
を示す図面に代わる写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−290189（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−142499（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 55，Ｐｔ．２（1981），ｐ．315−331 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 配列表における配列番号１の配列からな
   るオリゴヌクレオチド部分を含有する２０ｍｅｒ〜２５
   ｍｅｒの第１のＤＮＡプライマー、及び配列表における
   配列番号２の配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含
   有する２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒの第２のＤＮＡプライマ
   ーの組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被
   検試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られ
   た反応液と、配列表における配列番号３の塩基配列から
   なるオリゴヌクレオチド部分を含有し、標識を担持する
   プローブとを接触させ、前記標識からの信号を検出する
   ことを特徴とする、単純ヘルペス２型の検出方法。