JP3424682B2 - 表面増幅体 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、被分析物の存在の検出に使用するための膜
に関する。
に関する。
国際特許出願WO90/08783は、支持された二重層膜にイ
オノホアを取り込む側方拡散原理に基づいて、高感度で
かつ高い特異性を備えたバイオセンサーを構成する方法
を開示している。この出願に記載された発明の好ましい
実施態様は、各二重層リーフレットの各々に一つの二つ
のモノマーがそれ自身適切に並んで二重層に架かるダイ
マーを形成するときにのみ伝導チャネルを形成すること
が知られたグラミシジンをイオノホアとして含むもので
あった。一方の単一層（“下方”の単一層と称される）
のモノマーは、この単一層内の化学的架橋結合により、
もしくは適切な結合基を介して土台となる基質に結合さ
れることにより、あるいは別の方法により、側方に動か
ないようにされている。他の単一層（“上方”と称され
る）のモノマーは、この単一層内で自由に側方拡散で
き、下層のモノマーと並んで伝導チャネルを形成する。
上層のモノマーは、結合したレセプター分子を有してお
り、この膜の上方の液相中の被分析物に近づくことがで
きる。これらのレセプターは、ポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体、少なくとも一つのFabフラグメン
トを含む抗体断片、抗原等の、以前に記載された一般的
な種類のものでよい。また、レセプター分子のもう一方
のクラス（“相補的”と称される）も、膜表面に結合さ
れてもよい。この第二クラスのレセプター分子は、下方
の（不動の）層に接合されることによって横に動かない
ようにされている。被分析物の検出は、被分析物分子
が、その相補的な部位で、可動及び不動の両方のクラス
の二つのレセプターに結合したときになされる。これに
より、一方のレセプターに接合したグラミシジンモノマ
ーが、それ自身下層のモノマーと並ぶことから抑制さ
れ、検出結果を与える膜の電気的伝導の低下が引き起こ
される。
オノホアを取り込む側方拡散原理に基づいて、高感度で
かつ高い特異性を備えたバイオセンサーを構成する方法
を開示している。この出願に記載された発明の好ましい
実施態様は、各二重層リーフレットの各々に一つの二つ
のモノマーがそれ自身適切に並んで二重層に架かるダイ
マーを形成するときにのみ伝導チャネルを形成すること
が知られたグラミシジンをイオノホアとして含むもので
あった。一方の単一層（“下方”の単一層と称される）
のモノマーは、この単一層内の化学的架橋結合により、
もしくは適切な結合基を介して土台となる基質に結合さ
れることにより、あるいは別の方法により、側方に動か
ないようにされている。他の単一層（“上方”と称され
る）のモノマーは、この単一層内で自由に側方拡散で
き、下層のモノマーと並んで伝導チャネルを形成する。
上層のモノマーは、結合したレセプター分子を有してお
り、この膜の上方の液相中の被分析物に近づくことがで
きる。これらのレセプターは、ポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体、少なくとも一つのFabフラグメン
トを含む抗体断片、抗原等の、以前に記載された一般的
な種類のものでよい。また、レセプター分子のもう一方
のクラス（“相補的”と称される）も、膜表面に結合さ
れてもよい。この第二クラスのレセプター分子は、下方
の（不動の）層に接合されることによって横に動かない
ようにされている。被分析物の検出は、被分析物分子
が、その相補的な部位で、可動及び不動の両方のクラス
の二つのレセプターに結合したときになされる。これに
より、一方のレセプターに接合したグラミシジンモノマ
ーが、それ自身下層のモノマーと並ぶことから抑制さ
れ、検出結果を与える膜の電気的伝導の低下が引き起こ
される。
このようなバイオセンサーは、決まってかなりの表面
濃度の接合されたチャネルおよび不動のレセプター分子
を有している。このように、全ての不動および可動レセ
プターが、それぞれ同じ種類であることを確実にするこ
とが必要であり、可動チャネルが接合されたレセプター
間の架橋接合を引き起こす被分析物は、決まって効率的
なゲーティングを起こさない。さらに通常の時間（約10
0秒）におけるこのような装置の検出感度は、既知の拡
散速度定数、すなわち生理的条件下で溶液から接合する
ためのKon（約108M-1S1）によってセットされる。検出
部位の重要な（約50％）フラクションが占有される（こ
こでは、ゲートされるチャネル）ように、検定濃度Ｃ
は、次の式を満たさなければならない。
濃度の接合されたチャネルおよび不動のレセプター分子
を有している。このように、全ての不動および可動レセ
プターが、それぞれ同じ種類であることを確実にするこ
とが必要であり、可動チャネルが接合されたレセプター
間の架橋接合を引き起こす被分析物は、決まって効率的
なゲーティングを起こさない。さらに通常の時間（約10
0秒）におけるこのような装置の検出感度は、既知の拡
散速度定数、すなわち生理的条件下で溶液から接合する
ためのKon（約108M-1S1）によってセットされる。検出
部位の重要な（約50％）フラクションが占有される（こ
こでは、ゲートされるチャネル）ように、検定濃度Ｃ
は、次の式を満たさなければならない。
Ｃ＞1/（Kon X 100） （１）
この一般的な要求は、上記の要求の下で、検出増幅の
何らかの付加的手段なしに作動するあらゆる検出装置を
限定し、約10-10Mの被分析物検出濃度限度を定める。
何らかの付加的手段なしに作動するあらゆる検出装置を
限定し、約10-10Mの被分析物検出濃度限度を定める。
本発明者らは、被分析物の存在の検出に使用する膜の
感度が、可動性のレセプター分子に対する固定されたレ
セプター分子の割合を1:1の割合以上に増加させること
によって改良されることを見いだした。
感度が、可動性のレセプター分子に対する固定されたレ
セプター分子の割合を1:1の割合以上に増加させること
によって改良されることを見いだした。
従って、本発明は、被分析物の存在を検出することに
使用される膜からなり、この膜は、密接に詰め込まれた
自己整列する両親媒性分子と、複数の第一及び第二のレ
セプター分子との整列を含み、第一のレセプター分子は
被分析物の一方の部位と反応し、第二のレセプター分子
は被分析物の他の部位と反応し、第一のレセプター分子
は膜内で側方拡散しないが、第二のレセプター分子は膜
内を自由に側方拡散するもので、第一のレセプター分
子：第二のレセプター分子の割合が、10:1もしくはそれ
以上とすることを特徴とする。
使用される膜からなり、この膜は、密接に詰め込まれた
自己整列する両親媒性分子と、複数の第一及び第二のレ
セプター分子との整列を含み、第一のレセプター分子は
被分析物の一方の部位と反応し、第二のレセプター分子
は被分析物の他の部位と反応し、第一のレセプター分子
は膜内で側方拡散しないが、第二のレセプター分子は膜
内を自由に側方拡散するもので、第一のレセプター分
子：第二のレセプター分子の割合が、10:1もしくはそれ
以上とすることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様では、第一のレセプター分
子：第二のレセプター分子の割合が、10:1〜105:1の範
囲であり、好ましくは約1000:1とされる。
子：第二のレセプター分子の割合が、10:1〜105:1の範
囲であり、好ましくは約1000:1とされる。
本発明のさらに好ましい実施態様では、第一及び第二
のレセプター分子が、被分析物の異なる抗原決定基（エ
ピトープ）に結合する。
のレセプター分子が、被分析物の異なる抗原決定基（エ
ピトープ）に結合する。
本発明の好ましい実施態様では、膜が二重層であり、
一方の層の第一半膜間モノマーと、他方の層の第二半膜
間モノマーとを含む複数のイオノホアを含有し、第一半
膜間モノマーは膜内での側方拡散が妨げられるが、第二
半膜間モノマーは膜内を自由に側方拡散し、第二のレセ
プター分子が第二半膜間モノマーに結合され、第一及び
第二のレセプター分子への被分析物の結合が、膜のコン
ダクタンスに変化を及ぼすものである。
一方の層の第一半膜間モノマーと、他方の層の第二半膜
間モノマーとを含む複数のイオノホアを含有し、第一半
膜間モノマーは膜内での側方拡散が妨げられるが、第二
半膜間モノマーは膜内を自由に側方拡散し、第二のレセ
プター分子が第二半膜間モノマーに結合され、第一及び
第二のレセプター分子への被分析物の結合が、膜のコン
ダクタンスに変化を及ぼすものである。
第一及び第二半膜間モノマーは、当該技術分野で知ら
れたいずれの分子でもよいが、現在のところ、グラミシ
ジンもしくはその誘導体が好ましい。
れたいずれの分子でもよいが、現在のところ、グラミシ
ジンもしくはその誘導体が好ましい。
本発明のさらに好ましい実施態様では、膜が膜間脂質
を含有する。さらに、第一のレセプター分子が、膜間脂
質に接合していることが好ましい。
を含有する。さらに、第一のレセプター分子が、膜間脂
質に接合していることが好ましい。
また、本発明者らは、膜に接合されたルーズポリマー
ネットワークを用いた第一のレセプター分子の総数を増
加させる新規の方法を開発した。従って、本発明の他の
実施態様では、旋回運動の半径が約100〜300オングスト
ロームの直線状ポリマー鎖が膜の表面に接合され、第一
レセプター分子が、この直線状ポリマー鎖に接合され
る。
ネットワークを用いた第一のレセプター分子の総数を増
加させる新規の方法を開発した。従って、本発明の他の
実施態様では、旋回運動の半径が約100〜300オングスト
ロームの直線状ポリマー鎖が膜の表面に接合され、第一
レセプター分子が、この直線状ポリマー鎖に接合され
る。
この直線状ポリマー鎖は、上層における適切に官能を
有する（functionalised）脂質を介して一または二点で
膜に接合されることが好ましい。これらは、膜間脂質で
あってもよい。
有する（functionalised）脂質を介して一または二点で
膜に接合されることが好ましい。これらは、膜間脂質で
あってもよい。
本発明の好ましい実施態様では、直線状ポリマー鎖の
旋回運動半径が、約200オングストロームである。しか
して、ポリマー鎖に接合された全ての抗体は、膜表面の
約500オングストローム以内である。
旋回運動半径が、約200オングストロームである。しか
して、ポリマー鎖に接合された全ての抗体は、膜表面の
約500オングストローム以内である。
直線状ポリマー鎖：膜の脂質の割合が、約1:104であ
ると好ましい。これにより、膜表面におけるポリマーの
“ゆるい接触の”パッキングが与えられ、従って第一半
膜間モノマーが自由に拡散できる。
ると好ましい。これにより、膜表面におけるポリマーの
“ゆるい接触の”パッキングが与えられ、従って第一半
膜間モノマーが自由に拡散できる。
ポリマー鎖は、濃縮されたポリエチレングリコールで
あることが好ましい。
あることが好ましい。
旋回運動半径S0は、四面体型結合の長さｌを有する一
本鎖に対して以下の式 によって与えられ、上式においてｎは結合数であり、α
２はポリマーに特有な定数である。PEO（−CH2−CH2−
Ｏ−）ｍでは、ｌはCH2−CH2またはCH2−Ｏ結合の長さ
の平均、〜1.5オングストロームであり、α２は〜２で
ある。
本鎖に対して以下の式 によって与えられ、上式においてｎは結合数であり、α
２はポリマーに特有な定数である。PEO（−CH2−CH2−
Ｏ−）ｍでは、ｌはCH2−CH2またはCH2−Ｏ結合の長さ
の平均、〜1.5オングストロームであり、α２は〜２で
ある。
PEOでは、ｎ＝3m（すなわちモノマー単位の〜３倍の
数字）である。
数字）である。
もしS0が〜200オングストロームであれば、ｎは〜250
00（分子量〜400000）とされる。
00（分子量〜400000）とされる。
500オングストローム厚の層におけるポリマーのマス
フラクション（mass fraction）の平均は、 すなわち＜１％である。
フラクション（mass fraction）の平均は、 すなわち＜１％である。
これは、表面上における抗体／イオンチャネル複合体
の側方拡散を非常に容易にする。
の側方拡散を非常に容易にする。
PEOのすぐに利用できる形態は、PEG、すなわちポリエ
チレングリコールである。OH−CH2−CH2−（CH2−CH2−
Ｏ）ｍ−CH2−CH2−OH。これは、鎖の各末端にヒドロキ
シル基を備えている。ｎ〜25000であって、膜定着もし
くは抗体結合のための官能的接合点が〜10である鎖は、
抗体／脂質接合用の側鎖（例えばヒドラジド）も含む適
切な二官能（例えばジカルボン酸）分子を備えたより短
い鎖状のPEG（ｎ〜2500）を濃縮することにより形成さ
れる。
チレングリコールである。OH−CH2−CH2−（CH2−CH2−
Ｏ）ｍ−CH2−CH2−OH。これは、鎖の各末端にヒドロキ
シル基を備えている。ｎ〜25000であって、膜定着もし
くは抗体結合のための官能的接合点が〜10である鎖は、
抗体／脂質接合用の側鎖（例えばヒドラジド）も含む適
切な二官能（例えばジカルボン酸）分子を備えたより短
い鎖状のPEG（ｎ〜2500）を濃縮することにより形成さ
れる。
抗体及び膜接合脂質（例えばアルデヒドに対するヒド
ラジドの結合）には、通常の接合化学が用いられること
が予想される。このポリマーは、（生理食塩水中に〜１
％の溶液となるように添加されて）まず最初に膜表面に
接合され、未反応の過剰分は除去される。次いで、適切
に活性化された抗体を添加し、反応させる。
ラジドの結合）には、通常の接合化学が用いられること
が予想される。このポリマーは、（生理食塩水中に〜１
％の溶液となるように添加されて）まず最初に膜表面に
接合され、未反応の過剰分は除去される。次いで、適切
に活性化された抗体を添加し、反応させる。
この接合方法は、短い結合を介して膜間脂質に表面で
直接的にタンパク質を定着させるための以前に提案され
た方法を越えた、いくつかの潜在的な利点を有してい
る。
直接的にタンパク質を定着させるための以前に提案され
た方法を越えた、いくつかの潜在的な利点を有してい
る。
１）抗体が、架橋結合反応に順応する非常に優れた局所
自由度を備えている。これは、ELISA検定法で得られた
状態に近づけるべきである。もし内部層結合グラミシジ
ン密度が、〜1:104より高くなければ、チャネルの被分
析物誘発架橋結合と抗体結合ポリマーにおけるそれぞれ
の統計的なゲーティングオフ（gating off）が適当であ
る。可動性上層脂質に対するポリマー鎖の一点接合を用
いても、ポリマー“球体”の弱いオーバーラッピング量
（マス）は、数百オングストロームもしくはより長い規
模で横の動きに対抗する。
自由度を備えている。これは、ELISA検定法で得られた
状態に近づけるべきである。もし内部層結合グラミシジ
ン密度が、〜1:104より高くなければ、チャネルの被分
析物誘発架橋結合と抗体結合ポリマーにおけるそれぞれ
の統計的なゲーティングオフ（gating off）が適当であ
る。可動性上層脂質に対するポリマー鎖の一点接合を用
いても、ポリマー“球体”の弱いオーバーラッピング量
（マス）は、数百オングストロームもしくはより長い規
模で横の動きに対抗する。
２）実質的により高い表面密度の“不動の”抗体が可能
である。
である。
３）表面のゆるい“生体適合性”ポリマーネットが、膜
に結合する非特異的タンパク質をおそらく減少させる。
に結合する非特異的タンパク質をおそらく減少させる。
本発明のさらに好ましい実施態様では、膜と電極との
間に空間が存在するように、膜が結合分子を介して電極
に接合される。好ましい結合分子は、PCT/AU92/00132お
よびPCT/AU93/00509に開示されたものがある。これらの
各出願の開示内容を、参照としてここに取り込む。
間に空間が存在するように、膜が結合分子を介して電極
に接合される。好ましい結合分子は、PCT/AU92/00132お
よびPCT/AU93/00509に開示されたものがある。これらの
各出願の開示内容を、参照としてここに取り込む。
第一半膜間モノマーは、多数の既知の技術を用いて、
膜における側方拡散から妨げられてもよいが、現在のと
ころ第一半膜間モノマーは結合基を介して電極に接合さ
れることが好ましい。
膜における側方拡散から妨げられてもよいが、現在のと
ころ第一半膜間モノマーは結合基を介して電極に接合さ
れることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施態様では、蛍光消光剤が
第一レセプター分子に接合され、蛍光種が第二レセプタ
ー分子に接合される。
第一レセプター分子に接合され、蛍光種が第二レセプタ
ー分子に接合される。
このような変形例では、膜に蛍光種の励起波長を照射
する。被分析物を添加すると、この被分析物がレセプタ
ーに結合する。結合した第一レセプターの割合がより大
きいために、被分析物がより確実に第一レセプター分子
に結合する。次いで、膜を通した可動レセプターの拡散
は、第一レセプター分子に結合した被分析物に当接す
る。次いで第二レセプター分子が被分析物に結合し、蛍
光基は消光され、放射された蛍光が弱まる。この手段を
使用して、被分析物の存在が、蛍光の低下によって検出
できる。
する。被分析物を添加すると、この被分析物がレセプタ
ーに結合する。結合した第一レセプターの割合がより大
きいために、被分析物がより確実に第一レセプター分子
に結合する。次いで、膜を通した可動レセプターの拡散
は、第一レセプター分子に結合した被分析物に当接す
る。次いで第二レセプター分子が被分析物に結合し、蛍
光基は消光され、放射された蛍光が弱まる。この手段を
使用して、被分析物の存在が、蛍光の低下によって検出
できる。
ここで使用したように、“レセプター分子”という用
語は、その最も広い状況で用いられる。このレセプター
分子は、所望の被分析物に結合し得るあらゆる化学的実
体でもよい。レセプター分子は、他の分子を認識するこ
とのできるあらゆる化合物もしくは組成物である。天然
のレセプターは、抗体、酵素、レクチン、染料等を含
む。例えば、抗原に対するレセプターは抗体であるが、
抗体に対するレセプターは、抗−抗体あるいは、より好
ましくは、その特定の抗体によって認識される抗原のい
ずれかである。
語は、その最も広い状況で用いられる。このレセプター
分子は、所望の被分析物に結合し得るあらゆる化学的実
体でもよい。レセプター分子は、他の分子を認識するこ
とのできるあらゆる化合物もしくは組成物である。天然
のレセプターは、抗体、酵素、レクチン、染料等を含
む。例えば、抗原に対するレセプターは抗体であるが、
抗体に対するレセプターは、抗−抗体あるいは、より好
ましくは、その特定の抗体によって認識される抗原のい
ずれかである。
第一及び第二レセプター分子は、同一または異なって
もよく、好ましくは、ポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体、少なくとも一つのFabフラグメントを含む前
記抗体フラグメント、抗原、レクチン、ハプテンおよび
染料からなる群から選択される。レセプター分子が、抗
体またはそのフラグメントであることが最も好ましい。
もよく、好ましくは、ポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体、少なくとも一つのFabフラグメントを含む前
記抗体フラグメント、抗原、レクチン、ハプテンおよび
染料からなる群から選択される。レセプター分子が、抗
体またはそのフラグメントであることが最も好ましい。
本発明の膜が、PCT/AU93/00509記載の多数の脂質及び
リンカー化合物を好都合に取り込むことは、当業者にと
って明らかなことである。このような変形は本発明の範
囲内であると考えられ、この互いに未決定の出願の開示
内容を参照としてここに取り込む。
リンカー化合物を好都合に取り込むことは、当業者にと
って明らかなことである。このような変形は本発明の範
囲内であると考えられ、この互いに未決定の出願の開示
内容を参照としてここに取り込む。
本発明の特徴をより詳しく理解できるように、その好
ましい形態を以下の実施例を参照してここに記述する。
ましい形態を以下の実施例を参照してここに記述する。
実施例
電極：
以下の方法は、バイオセンサーの応用に使用するため
の電極の製作を記述したものである。この電極は、ガラ
ス基質と、クロムの粘着層を備えた模様付けされた（pa
tterned）薄い金のフィルムからなる。対向電極は、バ
イオセンサーのウェル内に外部から適用される。
の電極の製作を記述したものである。この電極は、ガラ
ス基質と、クロムの粘着層を備えた模様付けされた（pa
tterned）薄い金のフィルムからなる。対向電極は、バ
イオセンサーのウェル内に外部から適用される。
1. 清潔な顕微鏡ガラススライド（Lobm Scientific ca
t no. 7101,寸法 26x76x1.0−1.2mm）を、以下の記載の
ように用いる。このスライドを扱うには、パウダーの無
いプラスチックグローブを使用する。
t no. 7101,寸法 26x76x1.0−1.2mm）を、以下の記載の
ように用いる。このスライドを扱うには、パウダーの無
いプラスチックグローブを使用する。
2. 箱の中で新たに調製されたH2O2（1vol.）とH2SO
4（3vol.）の溶液に10分間浸し、全てのスライドを箱か
ら移す。
4（3vol.）の溶液に10分間浸し、全てのスライドを箱か
ら移す。
3. 全てのスライドを、テフロンコートされたピンセッ
トを用いて前記溶液から移し、脱イオン水に浸し、さら
に10分間流動脱イオン水ですすぐ。次いで、液体窒素貯
蔵タンクから蒸発させて得られた純粋な窒素で風乾す
る。
トを用いて前記溶液から移し、脱イオン水に浸し、さら
に10分間流動脱イオン水ですすぐ。次いで、液体窒素貯
蔵タンクから蒸発させて得られた純粋な窒素で風乾す
る。
4. この清潔なスライドは、保存せずに、直ちに蒸発装
置に入れる。
置に入れる。
5. スライドを模様付けするための適切なシャドーマス
クを、圧がかけられた上述の高純度の窒素を用いて、過
剰物質を吹き飛ばすことにより洗浄した。
クを、圧がかけられた上述の高純度の窒素を用いて、過
剰物質を吹き飛ばすことにより洗浄した。
6. 洗浄されたガラススライドを、シャドーマスクに設
けた溝に配置し、マスクとスライドの両方を、高真空チ
ャンバーに入れた。
けた溝に配置し、マスクとスライドの両方を、高真空チ
ャンバーに入れた。
7. 真空システムは、約45分間以上、5x10-6Torr以下の
圧までくみ出される。
圧までくみ出される。
8. 電熱器を用いて、ドイツのバルゼルズ（Balzers）
の99.9％クロム元素をタングステンのコンテナーからガ
ラス表面上に蒸発させた。フィルムの厚さを測定し、0.
1−9.3mm/sの速さで堆積させて、堆積層を20nmの最終的
な厚さに調節した。
の99.9％クロム元素をタングステンのコンテナーからガ
ラス表面上に蒸発させた。フィルムの厚さを測定し、0.
1−9.3mm/sの速さで堆積させて、堆積層を20nmの最終的
な厚さに調節した。
9. 同様であるが別のタングステンのコンテナーを用い
て、可動性の羽根を介してクロムのコンテナーから単離
された、Johnson Mathey （Australia） Ltdの99.99％
の金を、0.1nm/sで100nMの深さまで蒸発させる。
て、可動性の羽根を介してクロムのコンテナーから単離
された、Johnson Mathey （Australia） Ltdの99.99％
の金を、0.1nm/sで100nMの深さまで蒸発させる。
10. チャンバーと電極を約10分間冷却し、チャンバー
に窒素ガスを導入して大気圧まで上昇させる。
に窒素ガスを導入して大気圧まで上昇させる。
11. もう一度パウダーの無いグローブを使用して、清
潔なスライドを含むマスクをチャンバーから移し、テフ
ロンコートされたピンセットを用いてスライドをマスク
から外し、貯蔵コンテナーに移すか、あるいはクロムプ
レート真鍮組立体に直接移した。
潔なスライドを含むマスクをチャンバーから移し、テフ
ロンコートされたピンセットを用いてスライドをマスク
から外し、貯蔵コンテナーに移すか、あるいはクロムプ
レート真鍮組立体に直接移した。
12. 貯蔵用の箱に移された電極は、滅圧して、ヒート
シーラーを使用し、さらに低揮発性のプラスチックバッ
グ内に収納される。
シーラーを使用し、さらに低揮発性のプラスチックバッ
グ内に収納される。
13. 電極は、作製後24時間以内に使用するべきであ
る。
る。
材料および方法：
1. 金でコートされた上述の顕微鏡ガラススライドの全
体を、エバポレーターから直接取り出し、各ウェルが金
の表面と接触するシーリングを形成し、金の電極表面上
に約200μｌのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）を保持す
るように組み立てられた、16のテフロンのウェルを備え
たクロムコートされた真鍮のクランプに組み込む。
体を、エバポレーターから直接取り出し、各ウェルが金
の表面と接触するシーリングを形成し、金の電極表面上
に約200μｌのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）を保持す
るように組み立てられた、16のテフロンのウェルを備え
たクロムコートされた真鍮のクランプに組み込む。
2. 生理食塩水の添加の前に、一連のエタノール性溶液
をウェル、従って新しい金の表面に添加して膜を形成す
る。
をウェル、従って新しい金の表面に添加して膜を形成す
る。
3. 上記行程の間、作業者の息により新しい金表面が汚
染されないように、フェースマスクを装着する。
染されないように、フェースマスクを装着する。
4. エタノール性溶液は、二段階で添加され、一方は膜
の内側もしくは“下方の”層を形成し、二番目は、膜の
外側もしくは“上方の”層を形成する。
の内側もしくは“下方の”層を形成し、二番目は、膜の
外側もしくは“上方の”層を形成する。
下層：
３μｌのエタノール性溶液で、以下のものを含有する：
10mMのグリセロ−モノ−フィタニル（phytanyl）−エー
テル（GMPE）（この化合物の合成は、PCT/AU93/00509に
解説されている） 化合物Ｉ（図１に示されている） 1mMのジ−テトラ−エチレン−グリコール−ジフィタニ
ルベンジルジスルフィド（DLP） 化合物II（図２に示されている） .1、1.0、＆10μＭのビオチニル化（biotinylated）さ
れたジ−アミノカプリルに結合した膜間脂質（MSLXXB） 化合物III（図３に示されている） 0.8mMのメルカプト酢酸−ジスルフィド（MAAD） 化合物IV（図４に示されている） 0.1μＭのジテトラエチレン−グリコール−グラミシジ
ン−ベンジルジスルフィド（GaYYSSBn） 化合物Ｖ（図５に示されている） を各ウェルに添加し、直ちに20μｌのエタノールを加え
る。電極および溶液を、５分間インキュベートし、蒸留
したARエタノールで二度洗浄し、パラフィルムに密封し
て室温に保存した。この保存期間は、数分から数週間で
よく、重要なものではないと考えられる。
テル（GMPE）（この化合物の合成は、PCT/AU93/00509に
解説されている） 化合物Ｉ（図１に示されている） 1mMのジ−テトラ−エチレン−グリコール−ジフィタニ
ルベンジルジスルフィド（DLP） 化合物II（図２に示されている） .1、1.0、＆10μＭのビオチニル化（biotinylated）さ
れたジ−アミノカプリルに結合した膜間脂質（MSLXXB） 化合物III（図３に示されている） 0.8mMのメルカプト酢酸−ジスルフィド（MAAD） 化合物IV（図４に示されている） 0.1μＭのジテトラエチレン−グリコール−グラミシジ
ン−ベンジルジスルフィド（GaYYSSBn） 化合物Ｖ（図５に示されている） を各ウェルに添加し、直ちに20μｌのエタノールを加え
る。電極および溶液を、５分間インキュベートし、蒸留
したARエタノールで二度洗浄し、パラフィルムに密封し
て室温に保存した。この保存期間は、数分から数週間で
よく、重要なものではないと考えられる。
上層：
保存後、以下のものを含有する３μｌのエタノール性溶
液を添加した： 28mMのGMPE 0.28μＭのビオチニル化されたビス−ジ−アミノカプリ
ル−グラミシジン（Ga6X） 化合物VI（図６に示されている） 次いで、電極を、500μｌのガラスμｌシリンジから5
00μｌの0.1Nリン酸バッファー生理食塩水pH7.4、5mMの
PO4 +で二度すすぎ、この工程で形成された膜のインピー
ダンスを、電極上の200μｌウェルの内部の生理食塩水
と接触させて、銀のワイヤーと比較して測定する。
液を添加した： 28mMのGMPE 0.28μＭのビオチニル化されたビス−ジ−アミノカプリ
ル−グラミシジン（Ga6X） 化合物VI（図６に示されている） 次いで、電極を、500μｌのガラスμｌシリンジから5
00μｌの0.1Nリン酸バッファー生理食塩水pH7.4、5mMの
PO4 +で二度すすぎ、この工程で形成された膜のインピー
ダンスを、電極上の200μｌウェルの内部の生理食塩水
と接触させて、銀のワイヤーと比較して測定する。
インピーダンスの測定：
インピーダンスを、1000Hz〜0.1Hzまでの連続した周
波数で、10−100mVの交流（a.c.）励起電位を用いて測
定した。これらの測定から得られたインピーダンススペ
クトルは、以下の両方の観点で解釈される： 電極のヘルムホルツキャパシタンスを示す蓄電器と連
続している両方のイオンチャネルを示す抵抗器と並列
な、膜を示す蓄電器を含む等価電気回路（equivalent e
lectrical circuit）における抵抗要素。
波数で、10−100mVの交流（a.c.）励起電位を用いて測
定した。これらの測定から得られたインピーダンススペ
クトルは、以下の両方の観点で解釈される： 電極のヘルムホルツキャパシタンスを示す蓄電器と連
続している両方のイオンチャネルを示す抵抗器と並列
な、膜を示す蓄電器を含む等価電気回路（equivalent e
lectrical circuit）における抵抗要素。
金の電極と対称電極との間の膜を通した、与えられた
電位と得られた電流との間の位相角。このような流れで
行われた相測定の態様は、膜が最も抵抗を有し、伝導イ
オンチャネルによってそのインピーダンスにおいて支配
される周波数を示す最少位相が起こる周波数（fmin）で
ある。
電位と得られた電流との間の位相角。このような流れで
行われた相測定の態様は、膜が最も抵抗を有し、伝導イ
オンチャネルによってそのインピーダンスにおいて支配
される周波数を示す最少位相が起こる周波数（fmin）で
ある。
試験：
23℃で、通常の金の電極を分ける16のブロック中のx4
ウェルのグループ上でインピーダンスの測定を行った。
組み立てられたブロックは、可動性レセプター（Ga6X
B）の固定された濃度に対して、上記の範囲のつながれ
たレセプター（MSLXXB）を備えるものであった。
ウェルのグループ上でインピーダンスの測定を行った。
組み立てられたブロックは、可動性レセプター（Ga6X
B）の固定された濃度に対して、上記の範囲のつながれ
たレセプター（MSLXXB）を備えるものであった。
添付のグラフに示した、つながれた／可動性レセプタ
ーの割合は、０−1000であった。この割合は、［DLP］
／［MSLXXB］の割合から計算される： この種の溶液の濃度を、金の表面の数の比に変換すると
仮定して、 1mMのDLPに対して：− 10μＭ、１μＭ、0.1μＭもしくは０μＭのMSLXXB、10
0、1000、10000および無限大の割合を与える。ある程度
の量的差異が、溶液と表面の値との間に存在するが、定
性的な傾向は、図７において明白である。
ーの割合は、０−1000であった。この割合は、［DLP］
／［MSLXXB］の割合から計算される： この種の溶液の濃度を、金の表面の数の比に変換すると
仮定して、 1mMのDLPに対して：− 10μＭ、１μＭ、0.1μＭもしくは０μＭのMSLXXB、10
0、1000、10000および無限大の割合を与える。ある程度
の量的差異が、溶液と表面の値との間に存在するが、定
性的な傾向は、図７において明白である。
つながれたレセプターの数の比、および上層の可動性
レセプターの既知の濃度から、（GMPEと比べて1:10000
0）、つながれた／可動性のレセプターの比は、それぞ
れ1000、100、10および０と見積もることができる。ゲ
ーティング前後の伝導チャネルの数の比は、つながれた
／可動性レセプターの比の関数として図７に示されてい
る。
レセプターの既知の濃度から、（GMPEと比べて1:10000
0）、つながれた／可動性のレセプターの比は、それぞ
れ1000、100、10および０と見積もることができる。ゲ
ーティング前後の伝導チャネルの数の比は、つながれた
／可動性レセプターの比の関数として図７に示されてい
る。
ゲーティングは、各ウェルに直接２μｌの0.01mg/ml
ストレプトアビジンを添加することによって行われる。
添加後、位相が最少となる周波数（fmin）が観察され、
ゲーティング後のfminによるゲーティング前のfminを分
割することにより決定されたゲーティングの割合を完全
にした。
ストレプトアビジンを添加することによって行われる。
添加後、位相が最少となる周波数（fmin）が観察され、
ゲーティング後のfminによるゲーティング前のfminを分
割することにより決定されたゲーティングの割合を完全
にした。
つながれた／可動性の種の増加した割合の利点
つながれた／可動性レセプターの割合の増加が、スト
レプトアビジンとの試みの前後で伝導するチャネルの割
合における増加を引き起こす。これは、より多数のつな
がれたレセプターによって、より効果的なイオンチャネ
ルの架橋結合および分解、並びに被分析物に対するより
敏感な反応を引き起こす。
レプトアビジンとの試みの前後で伝導するチャネルの割
合における増加を引き起こす。これは、より多数のつな
がれたレセプターによって、より効果的なイオンチャネ
ルの架橋結合および分解、並びに被分析物に対するより
敏感な反応を引き起こす。
これは、伝導チャネル数における最少の信頼できる検
出可能な変化（約10％）が、より小さい被分析物の濃度
で達成できる、つながれた／可動性レセプターの割合を
増加させる装置の検出感度を意味する。
出可能な変化（約10％）が、より小さい被分析物の濃度
で達成できる、つながれた／可動性レセプターの割合を
増加させる装置の検出感度を意味する。
広く記載した本発明の精神もしくは範囲から離れるこ
となく、特定の実施態様に示したように、多数の変形例
および／または修飾例が本発明に対してなされることは
当業者に理解されるであろう。本実施態様は、あらゆる
点で例証的であり限定的でないものである。
となく、特定の実施態様に示したように、多数の変形例
および／または修飾例が本発明に対してなされることは
当業者に理解されるであろう。本実施態様は、あらゆる
点で例証的であり限定的でないものである。
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(31)優先権主張番号 ＰＭ４３０２
(32)優先日 平成６年３月８日(1994．3．8)
(33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ）
(72)発明者 コーンネル，ブルース アンドリュー
オーストラリア国 2089 ニュー サウ
ス ウェールズ ニュートラル ベイ
ウィコム ロード 58
(72)発明者 ペース，ロナルド ジョン
オーストラリア国 2607 オーストラリ
アン キャピタル テリトリー ファー
ラー ホークスベリー クレセント
138
(56)参考文献 特表 平４−504714（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53 - 33/579
G01N 27/333
Claims (11)
- 【請求項１】密接に詰め込まれた自己整列する両親媒性
分子と複数の第一及び第二のレセプター分子とを含有
し、第一のレセプター分子は被分析物の一方の部位と反
応し、第二のレセプター分子は被分析物の他の部位と反
応し、第一のレセプター分子は膜内の側方拡散から妨げ
られるが、第二のレセプター分子は膜内を自由に側方拡
散する、被分析物の存在を検出することに使用する膜で
あって、第一のレセプター分子：第二のレセプター分子
の割合が、10:1もしくはそれ以上とすることを特徴とす
る膜。 - 【請求項２】第一のレセプター分子：第二のレセプター
分子の割合が、10:1〜105:1の範囲である、請求項１記
載の膜。 - 【請求項３】第一のレセプター分子：第二のレセプター
分子の割合が、約1000:1である、請求項２記載の膜。 - 【請求項４】第一および第二のレセプター分子が、被分
析物の異なるエピトープに結合する請求項１ないし３の
いずれか１項に記載の膜。 - 【請求項５】膜が二重層であり、一方の層の第一半膜間
モノマーと、他方の層の第二半膜間モノマーとを含む複
数のイオノホアを含有し、第一半膜間モノマーは膜内で
側方拡散しないが、第二半膜間モノマーは膜内を自由に
側方拡散し、被分析物の第一及び第二のレセプター分子
への結合が膜の伝導に変化を及ぼすように、第二のレセ
プター分子が第二半膜間モノマーに結合された請求項１
ないし４のいずれか１項に記載の膜。 - 【請求項６】膜が膜間脂質を含む、請求項１ないし５の
いずれか１項に記載の膜。 - 【請求項７】第一のレセプター分子が、膜間脂質に接合
された請求項６に記載の膜。 - 【請求項８】旋回運動半径が約100〜約300オングストロ
ームの直線状ポリマー鎖が、膜の表面に接合され、第一
のレセプター分子が直鎖状ポリマー鎖に接合された請求
項１ないし５のいずれか１項に記載の膜。 - 【請求項９】第一および第二の半膜間モノマーが、グラ
ミシジンもしくはその誘導体である請求項４ないし８の
いずれか１項に記載の膜。 - 【請求項１０】膜と電極との間に空間ができるように、
膜が結合分子を介して電極に接合された請求項１ないし
９のいずれか１項に記載の膜。 - 【請求項１１】蛍光消光剤が第一レセプター分子に接合
され、蛍光種が第二レセプター分子に接合された請求項
１ないし４のいずれか１項に記載の膜。
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1994
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