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JP3457664B2 - 組換え宿主によるエタノール生産 - Google Patents
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JP3457664B2 - 組換え宿主によるエタノール生産 - Google Patents

組換え宿主によるエタノール生産

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JP3457664B2 JP50994192A JP50994192A JP3457664B2 JP 3457664 B2 JP3457664 B2 JP 3457664B2 JP 50994192 A JP50994192 A JP 50994192A JP 50994192 A JP50994192 A JP 50994192A JP 3457664 B2 JP3457664 B2 JP 3457664B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、USDA Alcohol Fuels Program補助金第8
6CRCR12134号、第88−37233−3987号及び第90−37233−
5372号並びにDOE Office of Basic Energy補助金第
FG05−86ER13574号のもとにフロリダ農業試験場（the
Florida Agricultural Experiment Station）を経て
与えられた政府補助によりなされたものである。連邦政
府は本発明に所定の権利を有する。
この出願は、1992年３月６日出願第07/846,344号、19
91年３月18日出願第07/670,821号及び1990年12月７日出
願第07/624,277号の一部係属出願であり、これらの出願
は更に1989年５月15日出願第07/352,062号（現時点で米
国特許第5,000,000号）の一部係属出願であり、更にこ
の特許出願第07/352,062号自体は1988年８月31日出願第
07/239,099号（現時点で放棄）の一部係属出願である。
上記特許明細書の内容は参照により本明細書の一部を構
成するものとする。
解糖の際、細胞はグルコースのような単純な糖をピル
ビン酸に変換し、それに伴ってATP及びNADHが正味生産
される。酸化的リン酸化において機能する電子伝達系が
不在であると、解糖及びATP生成を続行するには絶対に
必要なNAD+を再生する短経路において95％以上のピルビ
ン酸が消費される。かかるNAD+再生系の不用産物は一般
に発酵産物と称されている。
微生物は、属によって実に多様な発酵産物を産生す
る。かかる産物としては、乳酸、酢酸、コハク酸及び酪
酸のような有機酸、並びにエタノール、ブタノール、ア
セトン及びブタンジオールのような中性生成物を挙げる
ことができる。実際、細菌由来の発酵産物の多様性は、
分類学における一次決定因子として使用される。例えば
BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERILOGY,Will
iams＆Wilkins Co.,Baltimore（1984）（以降“バージ
ェイのマニュアル”と記す）参照。
発酵の最終産物は幾つかの基本的な特性を共通に有す
る。それらは、最初に産生された条件下では比較的無毒
性であるが、蓄積するとより毒性となる。最終産物の直
前の前駆体は解糖過程の末端電子受容体（terminal el
ectron acceptors）として作用するので、最終産物
はピルビン酸よりも還元され易い。微生物が産生する発
酵産物は、最初の最も成功したバイオテクノロジーの実
用的利用の基礎をなしており、乳製品、肉類、飲料及び
燃料がこれに含まれる。最近では、研究者がある種の微
生物の遺伝子構造を選択的に変性し得る新技術の結果、
バイオテクノロジー分野で大きな進歩がなされている。
細菌Escherichia coliは、バイオテクノロジーにお
いて遺伝子をクローニング及び修飾するための重要なビ
ヒクルであると共に、組換え産物の生産に最も重要な宿
主である。最近では、組換えDNA研究に使用される宿主
域が、種々の細菌、酵母、菌類及び真核細胞を含むまで
に拡張されている。本発明は、変性宿主による特に有効
な産物の産生を誘発するための組換えDNA技術の使用に
係わる。
本発明の宿主を変性するために使用されるDNAは、一
般に植物樹液及び蜂蜜中に認められる細菌Zymomonas m
obilisから単離することができる。Z.mobilisは、パー
ム酒や、メキシコ産アルコール飲料であるプルケ（pulq
ue）を製造するためにリュウゼツラン（Agave）の樹液
発酵のための接種材料として長い間使用されている。こ
の微生物は燃料エタノールの生産にも使用されており、
酵母よりも実質的に高い生産率でエタノールを生産し得
ると報告されている。
Z.mobilisの栄養摂取は単純であり、アミノ酸、ヌク
レオチド及びビタミンを合成することができるが、この
微生物によって代謝される糖の範囲は極めて限定されて
おり、通常はグルコース、フルクトース及びスクロース
からなる。これらの糖の発酵に由来する基質レベルのリ
ン酸化は、生合成及びホメオスタシスの唯一のエネルギ
ー源である。Zymomonas mobilisは、発酵性糖なしでは
栄養ブロスのようなリッチ培地中でさえ増殖できない。
Z.mobilisは、酸化的リン酸化のための機能系を欠く
絶対発酵性細菌である。酵母Saccharomyces cerevisia
eと同様に、Z.mobilisは主要発酵産物としてエタノール
及び二酸化炭素を産生する。Z.mobilisは、２種の酵素
活性物質、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコー
ルデヒドロゲナーゼしか必要としない短経路によってエ
タノールを産生する。ピルビン酸デカルボキシラーゼ
は、この経路においてピルビン酸からエタノールへの流
れを制する鍵酵素である。ピルビン酸デカルボキシラー
ゼは、ピルビン酸の非酸化的脱炭酸を触媒してアセトア
ルデヒド及び二酸化炭素を生産する。この微生物中には
２種のアルコールデヒドロゲナーゼアイソザイムが存在
し、発酵の際にアセトアルデヒドをエタノールに還元す
る反応を触媒し、それに伴ってNADHがNAD+に酸化され
る。細菌アルコールデヒドロゲナーゼは多くの微生物に
一般的に存在するが、ピルビン酸デカルボキシラーゼは
幾つかの細菌しか持っていない。エタノール生産者とし
ての工業的有用性を増強すべくZ.mobilisを変性しよう
という試みは、極めて制限された範囲でしか成功してい
ない。
現在、ほとんどの燃料エタノールは、コーンスターチ
またはショ糖シロップのヘキソース糖からS.cerevisiae
またはZ.mobilisを使用して製造されている。しかしな
がら、かかる糖は比較的高価なバイオマス糖源であり、
食品としても比肩の価値を有している。澱粉及び糖は、
植物における全炭水化物の一部を占めるにすぎない。
幹、葉、外皮、殻、穂軸などの植物炭水化物の主形態
は、構造壁ポリマー、即ちセルロース及びヘミセルロー
スである。かかるポリマーが加水分解されると、グルコ
ース、キシロース、マンノース、ガラクトース及びアラ
ビノースを含む中性糖の混合物が放出される。これらの
糖の全てをエタノールまたは他の価値ある単一生成物に
迅速に且つ効率的に代謝し得る単一生物は見つかってい
ない。
Z.mobilisにおいてアルコールデヒドロゲナーゼII及
びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が
別々にクローニングされ、特性分析され、E.coli中で発
現されている。Brｕ＆Sahm［1986a］Arch.Microbiol.
144:296−301,［1986b］Arch.Microbiol.146:105−10;C
onway et al.［1987a］J.Bacteriol.169:949−54;Con
way et al.［1987b］J.Bacteriol.169:2591−97;Neal
e et al.［1987］Nucleic Acid.Res.15:1753−61;In
gram＆Conway［1988］Appl.Environ.Microbiol.54:397
−404;Ingram et al.［1987］Appl.Environ.Microbio
l.53:2420−25参照。
Brｕ及びSahm［1986a］（上掲）は、組換えE.coli
においてZ.mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼの過
剰発現によってエタノール生産が増加し得るが、その濃
度は極めて低いことを示した。後の研究で他の２種の腸
内細菌Erwinia chrysanthemi及びKlebsiella plantic
olaを使用することにより上記研究が拡張され、ヘキソ
ース、ペントース及び糖混合物からより多量のエタノー
ルを得ることができた。Tolan＆Finn［1987］Appl.Envi
ron.Microbiol.53:2033−38,2039−44参照。
単純な糖の原料が入手可能であれば、上述の微生物は
通常有用である。しかしながら、世界的に安価で且つ再
生可能なバイオマス源の大部分は、単糖としてではな
く、主にセルロース、ヘミセルロース及びリグニンの混
合物であるリグノセルロースの形態で見い出されてい
る。セルロースはグルコースのホモポリマーであり、ヘ
ミセルロースは、一次構成成分であるキシロースだけで
なく有意な量のアラビノース、マンノース、グルコース
及びガラクトースをも含むより複雑なヘテロポリマーで
ある。米国ごみ処理場由来の紙廃棄物及びヤードトラッ
シュ（yard trash）中に存在する糖残基の微生物変換
によって千億ガロン以上のエタノールが提供されると推
定されている。上述のごとき微生物は、リグノセルロー
ス中に存在するセルロース及びヘミセルロースポリマー
を構成するモノマー糖を効率的に発酵するが、リグノセ
ルロースの優れた糖化方法の開発は依然として研究対象
である。
リグノセルロースを糖化する現行方法は、酸及び酵素
による加水分解を含む。酸加水分解は通常は熱を必要と
し、エネルギー使用、酸性廃棄物の生成、あとに続く微
生物発酵を妨害し得る毒性化合物の形成を含む幾つかの
欠点を与える。酵素による加水分解は望ましい代替法を
与える。例えば酵素は、リグノセルロース材料を含む培
地に直接加えることができる。
エタノールまたは乳酸生産のために微生物に糖化性を
付加する遺伝子工学的方法は、培地中に高レベルの酵素
を分泌させる方向で行われている。即ち該方法は、多糖
基質に作用して単糖及びオリゴ糖を与える、細胞内で産
生された酵素を発酵培地中に輸送するのに必要なタンパ
ク質を既に所有する微生物を変性することに係わる。か
かるタンパク質を輸送するのに必要な能力を欠く微生物
をうまく変性することは困難と認識されていることか
ら、上記方法が採られている。
発明の要約 本発明の目的は、好気及び嫌気の両条件下で増殖する
間にピルビン酸をエタノールに効率的に変換し得る微生
物を提供することである。
本発明の別の目的は、組換え宿主の増殖を増大し、且
つ、かかる宿主の増殖培地における望ましくない代謝産
物の蓄積を低下させることである。
本発明の更に別の目的は、グルコースまたはキシロー
スオリゴマーを、該宿主がエタノールに発酵し得る生成
物に分解するポリサッカラーゼ酵素を十分な細胞内レベ
ルで産生する組換え宿主を提供することである。
上記目的及び他の目的を達成するため、本発明の第１
主要ドメインにおいては、宿主内でのアルコールデヒド
ロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼの産生を
コードする異種DNAを含む、Escherichia coli以外の組
換え宿主を提供する。宿主は、宿主の一次発酵産物とし
てのエタノールの産生を容易にすべく、該DNAを十分な
機能レベルで発現する。
１つの有利な実施態様は、アルコールデヒドロゲナー
ゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするZ.mo
bilis遺伝子を組換え宿主に使用する。第１ドメインの
他の態様は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン
酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラス
ミドを含み、該プラスミドは、本発明の組換え宿主を提
供する上で有用である。
本発明の第２主要ドメインにおいては組換え宿主は、
アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキ
シラーゼをコードするDNAを含む上に、宿主がオリゴ糖
を輸送及び代謝し得るようにするタンパク質をコードす
るDNAをも含む。宿主は該DNAを、宿主がオリゴ糖代謝か
ら一次発酵産物としてエタノールを産生するようなレベ
ルで発現する。このドメインの好ましい宿主としては、
Erwinia及びKlebsiellaのような腸内細菌を挙げること
ができる。他の好ましい宿主は、グルコース、キシロー
ス及びマルトースのようなC5及び／またはC6糖モノマー
を含む二糖及び／または三糖を代謝する。
本発明の第３主要ドメインにおいては、上述のごとき
組換え宿主は、１種以上のポリサッカラーゼを産生する
のに必要なDNAを含む。宿主によるポリサッカラーゼの
産生及びこれに続くポリサッカラーゼの培地中への放出
によって、原料を発酵性単糖及びオリゴ糖に分解するの
に必要な市販酵素の量が低減される。
ポリサッカラーゼDNAは宿主に生来のものとし得る
が、DNAは外来、即ち異種であることが多い。有利なポ
リサッカラーゼとしては、セルロース分解酵素、キシラ
ン分解酵素及び澱粉分解酵素を挙げることができる。ポ
リサッカラーゼは少なくとも一部分は宿主によって分泌
されてもよいし、後で放出されるよう実質的に細胞内に
蓄積されてもよい。熱安定性である細胞内に蓄積された
酵素が、熱誘導溶解によって所望のときに放出されるの
が有利である。一部は分泌され、一部は蓄積される酵素
の組合せを、異種DNAによってコードすることができ
る。
上記宿主のエタノール産生を増強すべく他の変性を行
なうこともできる。例えば宿主は更に、その発現産物が
単糖及び／またはオリゴ糖を組換え宿主中に輸送するこ
とに関与するタンパク質である別の異種DNAを含むこと
ができる。同様に、解糖系由来の別の遺伝子を宿主に組
込むこともできる。このような方法で、エタノール生産
量を増強することができる。
更に、上記全ての宿主を使用するエタノール生産方法
が提供される。また、オリゴ糖をエタノール並びにより
単純なオリゴ糖及び／または糖モノマーに変換するため
にオリゴ糖原料を処理する方法をも提供される。更に別
の態様は、本発明の形質転宿主を使用して培地中にエタ
ノールを生産することにより、増殖培地における酸性代
謝産物の蓄積を低減する方法を提供する。更に別の態様
は、Z.mobilis中に見られるようなadhB遺伝子を宿主中
で過剰発現させることからなる、組換え宿主における機
能タンパク質の産生を増強する方法を提供する。本発明
の別の態様は、オリゴ糖含有バイオマスをエタノールに
発酵する方法設計を含む。
本発明の他の目的、特性及び利点は後述の詳細説明か
ら明らかとなろう。しかしながら、詳細説明から本発明
の主旨及び範囲内での種々の変更及び改良が当業者には
明らかであり、詳細説明及び特定の実施例は本発明の好
ましい実施態様を示すものであって、例示のためにのみ
与えられていることを理解されたい。
図面の簡単な説明 図１は、Z.mobilis由来のピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼIIをコードする遺
伝子を含むpLOI295の構築を示す。省略記号:R I,EcoR
I;H,Hind III;B,BamH I;t,ターミネーター;adh,Z.mobil
isアルコールデヒドロゲナーゼII;pdc,Z.mobilisピルビ
ン酸デカルボキシラーゼ;cat,クロラムフェニコールア
シルトランスフェラーゼ;Ap,β−ラクタマーゼ;Zm Pro
frags,プロモーター活性を示すZ.mobilis DNAのフラ
グメント;ColE1,pBR322由来の複製開始点;oriV,RSF1010
由来の複製開始点;Plac,lacプロモーター;PZm,Z.mobili
s由来のプロモーター;P？，ベクター上の潜在プロモー
ター;Kb,キロベース。
図２は、Z.mobilis由来のピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼIIをコードする遺
伝子を含む幾つかのプラスミドを示す。
図３は、株TC4及びエタノール産生酵素をコードする
プラスミドを含む組換え体による増殖及び酸生成を示
す。
図４は、組換え体におけるピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ活性と増殖度の相関を示す。24時間増殖させた後の
細胞質量を、550nm（O.D.550）における光学密度として
表してある。
図５は、pLOI510の構築を示す。
図６は、Erwinia及びKlebsiellaのエタノール産生組
換え体によるセロビオーズの発酵から生成されたエタノ
ール濃度を示す。
図7A、7B及び7Cは、xynZ及びxy1Bを含む組換えプラス
ミドの構築を示す。
図8A及び8Bは、４％カンバ材キシランを含むルリアブ
ロス（pH6.0）中で45℃（図8A）または60℃（図8B）で
インキュベートしたE.coli株KO11（pLOI2003）を使用し
たキシラン加水分解の薄層クロマトグラフィー分析の結
果を示す。
図9A及び9Bは、組換えE.coli株KO11（図9A）及びK.ox
ytoca M5A1（図9B）による増殖時キシロオリゴ糖消費
を示す。
図10A及び10Bは、組換えK.oxytoca M5A1によるキシ
ロース及びキシラン加水分解物のエタノールへの変換を
示す。図10Aは増殖を示しており、図10Bはエタノール生
成を示している。
図11A及び11Bは、K.oxytoca M5A1の組換え株による
エタノール産生を示す。図11Aは、株M5A1（pLOI555）、
pet遺伝子が組み込まれた株P2、及びpet遺伝子が組み込
まれた株B1によるグルコース（100g/リットル）からの
エタノール生成を示す。図11Bは、株P2によるセロビオ
ーズ（100g/リットル）発酵からのエタノール産生を示
す。
図12は、120時間後の、50gのSOLKA FLOC SW40/リッ
トルからのエタノール収量に及ぼす市販セルラーゼ添加
の影響を示す。
図13A、13B及び13Cは、酸膨潤セルロース（図13A）、
塩基膨潤セルロース（図13B）及び結晶セルロース（図1
3C）のP2（pCT603T）によるセルロース加水分解及び発
酵の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す。
図14は、５％CYTOLASEに等価のエタノール収量を与え
る、ce1D遺伝子産物による前処理及び１％セルラーゼ使
用のエタノール産生に及ぼす増強作用を示す。
図15は、Bacillus stearothermophilus由来のα−ア
ミラーゼ遺伝子及びThermoanaerobium brockii由来の
プルラナーゼ遺伝子を含む、プラスミドpLOI140及びpLO
I141の構築を示す。
図16A及び16Bはそれぞれ、KO11によるグルコース及び
マルトースの発酵におけるエタノール産生及び細胞質量
を示す。
図17は、組換えE.coli株KO11（pLOI140）及びKO11（p
LOI141）による澱粉発酵の結果を示す（両株における結
果は実質的に同一であるので、KO11（pLOI141）におけ
る結果のみを示す）。
図18は、発酵（72時間）中のKO11（pLOI141）による
コーンスターチ発酵の薄層クロマトグラフィー分析の結
果を示す。
図19は、本発明の発酵方法の概略装置を示す。
発明の詳細な説明 I.通常の炭水化物代謝 ほとんどの動植物並びに細菌、酵母及び真菌類におい
て、グルコースはまず嫌気経路によって分解されてか
ら、酸化的または発酵的に代謝される。解糖と称される
最も一般的なこの経路は、６炭素グルコース分子が複数
の中間物質を経て２分子の３炭素化合物、ピルビン酸に
分解される一連の酵素反応ステップを指す。この過程
で、２分子のNAD+が還元されてNADHを形成する。このグ
ルコースからピルビン酸への変換の正味反応は、 グルコース＋2Pi＋2ADP＋2NAD+→ ２ピルビン酸＋2ATP＋2NADH＋2H+ と表される。
解糖が継続するためには、解糖によって消費されるNA
D+が、NADHが酸化されることにより再生される必要があ
る。酸化的代謝の間、NADHは通常、水素等価物を一連の
ステップを経て酸素に与え、水を形成することにより酸
化される。しかしながらほとんどの生物は、酸素のよう
な化合物の不在下でも解糖を続行し得る別の嫌気経路を
含んでいる。かかる嫌気過程は発酵と称され、恐らくは
ホモ乳酸発酵が、多くの細菌及び動物に存在するかかる
経路の最も一般的なものである。ホモ乳酸発酵におい
て、グルコースは最終的に２分子の３炭素酸、乳酸に変
換される。NADHは、水素等価物をピルビン酸に与えるこ
とにより酸化され、乳酸を生成する。乳酸発酵によるNA
D+の再生の正味反応は、 ２ピルビン酸＋2NADH→２乳酸＋2NAD+ で表される。
前述したように、Z.mobilis及びS.cerevisiaeのごと
きエタノール産生生物は、グルコースを２分子のエタノ
ールと２分子のCO2とに代謝する第２のタイプの発酵
（アルコール発酵）をし得る。アルコール発酵は、NAD+
の再生に使用されるステップが乳酸発酵とは異なる。ア
ルコール発酵には２種類の酸素ステップが必要である。
ピルビン酸デカルボキシラーゼはピルビン酸をアセトア
ルデヒドと二酸化炭素に切断する。アルコール発酵は、
水素等価物をNADHからアセトアルデヒドに移行させてエ
タノールを生成することにより、NAD+を再生するよう作
用する。アルコール発酵によるNAD+再生反応は、 ２ピルビン酸→２アセトアルデヒド＋2CO2 ２アセトアルデヒド＋2NADH→２エタノール＋2NAD+ によって表される。アルコール発酵の正味反応は、 ２ピルビン酸＋2NADH →２エタノール＋2CO2＋2NAD+ で表される。
上記各酵素をコードするDNAはそれぞれクローニング
されており、Z.mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼ
は組換え発現されている。例えばBrｕ＆Sahm［1986
a］（上掲）参照。しかしながら、一次代謝物としてエ
タノールを産生しない生物（“非エタノール産生生
物”）をアルコール発酵に必要な両酵素を発現するよう
幾分変性できたとしても、かかる生物の解糖系がピルビ
ン酸段階で大きく経路変更し得るかは全く不確定であ
る。
これに反して、このような経路変更によって組換え宿
主においてピルビン酸及びその正常産物が欠乏すること
が推定された。Brｕ＆Sahm［1986a,b］（上掲）参
照。非エタノール産生生物における解糖由来の炭素をエ
タノール産生へ向ける経路変更は、相関エネルギー生成
及び生合成経路に重要なNAD/NADH比を乱す可能性もあっ
た。
II.本発明の発酵 しかしながら、解糖を実施する生物またはその変種
を、本発明に従って、ピルビン酸段階で解糖由来の炭素
の流れの95％ほどを、実質的に、異種ピルビン酸デカル
ボキシラーゼ（pdc）遺伝子及びアルコールデヒドロゲ
ナーゼ（adh）遺伝子によってコードされる酵素からな
る合成経路に経路変更すべく遺伝子操作（engineered）
し得ることが判明した。得られたものは、一次発酵産物
としてエタノールを産生する遺伝子操作生物である。即
ち、産生されるエタノールは全発酵産物の50％を超え
る。
オリゴ糖を輸送及び代謝する生来能力によってより複
雑な原料を発酵し得る異種発現について宿主を選択し得
ることが判明した（この点で“オリゴ糖”とは２つ以上
の糖モノマーからなる分子を指し、例えば、限定的では
ないが、セロビオース、マルトビオース及びキシロビオ
ースのような二糖、セロトリオース及びキシロトリオー
スのような三糖、並びに、セルロース、ヘミセルロー
ス、澱粉、グリコーゲン、ペクチン及びイヌリンのよう
な長鎖多糖などがこれに含まれる）。選択及び形質変換
した宿主の能力は、ポリサッカラーゼ、即ち複合オリゴ
糖をより小さなオリゴ糖及び／または糖モノマーに分解
する反応を触媒する酵素をコードする１つ以上の遺伝子
を同じ宿主中で発現させることにより更に増強し得る。
（Ａ）遺伝子操作による人工エタノール産生経路の構
築：本発明の重要な態様は、細胞にエタノールを産生さ
せるオペロンである。かかるオペロンの例は、それぞれ
アルコールデヒドロゲナーゼII活性及びピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ活性をコードするZ.mobilisの遺伝子
と、適当な調節配列、例えばプロモーター、インデュー
サー、オペレーター、リボソーム結合部位及び転写ター
ミネーターとを含む、“petオペロン”と称される本発
明の構築物である。従って、先の組換え系においてエタ
ノール産生が天然アルコールデヒドロゲナーゼ活性に依
存することは、アルコールデヒドロゲナーゼII及びピル
ビン酸デカルボキシラーゼをコードするZ.mobilis遺伝
子を結合してpetオペロンを形成することにより回避さ
れる。更に、petオペロンを含む組換え体においては、
好気及び嫌気の両条件下で有意な量のエタノールが産生
され得る。
微生物に、キシラナーゼ及びセルラーゼのようなポリ
サッカラーゼを産生する能力を付与するため、本発明の
エタノール産生オペロンを、所望の酵素をコードする遺
伝子を付加することにより変性することができる。或い
は、１つ以上のポリサッカラーゼをコードする遺伝子
を、上述のごときエタノール産生を誘導するオペロンで
既に操作した宿主生物を形質転換するために使用される
プラスミド中に組込むこともできる（本発明のこの態様
は後記セクションII（Ｅ）において詳述する）。更に別
の方法によって、エタノール産生オペロンを用いて形質
転換すべき宿主を、ポリサッカラーゼを発現する天然能
力について選択する。更に別の方法では、ポリサッカラ
ーゼ遺伝子を染色体中に組込むことによって付加する。
単一構築物において代謝経路をコードする遺伝子を組
合わせる方法は、種々の遺伝子座由来の遺伝子を合わせ
て人工的なオペロンを作製する多様な状況に容易に一般
化される。従って、petオペロンの作製は、本発明が意
図する用途の一例にすぎない。例えば、所望の経路をコ
ードするオペロンを作製するために、種々の生物由来の
アルコールデヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子
を、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をコードする他
の遺伝子と組み合わせることができる。他の経路をコー
ドするオペロンを作製することもできる。上述のエタノ
ール産生経路において、アルコールデヒドロゲナーゼ活
性及びピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をコードする
遺伝子が共通制御下にある必要はなく、別個の制御下に
あってもよいし、場合によっては異なるプラスミドまた
は染色体上の異なる位置にあってもよいことは明らかで
ある。同様に、ポリサッカラーゼをコードする遺伝子も
共通または別個の制御下にあってもよいし、異なるプラ
スミドまたは異なる染色体位置にあってもよい。
本発明の別の態様は、組換えペプチドまたはタンパク
質を効率的に産生するために組換えエタノール産生宿主
を使用することに係わる。即ち、ポリサッカラーゼ以外
の有効産物をコードする遺伝子を更に用いて組換え細胞
を形質転換することができる（かかる追加遺伝子は、プ
ラスミドに担持させるかまたは染色体内に組込むことが
できる）。特に、必要なエタノール産生酵素をコードす
る遺伝子は通常は高レベルで発現され、嫌気的増殖過程
でピルビン酸及びNADH酸化からの炭素の流れを支配す
る。かかる条件下で、ピルビン酸炭素骨格の流れは、有
機酸の生成から一次発酵産物としてのエタノールの産生
に変更され得る。
このようにして、細胞タンパク質１単位当たりの酸性
化の程度は、有機酸よりはむしろエタノールの産生によ
って最小化される。微生物の高密度培養体の増殖の際、
酸素移動は主要制限要因となることが多く、増殖培地に
おける酸生成及びpH変動をもたらすのはこの制限要因で
ある。これに対して本発明のエタノール産生オペロンを
発現する組換え体においては、エタノール産生酵素が解
糖由来のピルビン酸の一部をアセトアルデヒドに導き、
NADHを再度酸化して、害の少ない代謝産物エタノールを
産生する。酸化的リン酸化酵素及びエタノール産生酵素
のための両機能的呼吸鎖を含む株は、NAD+の再生及び酸
性不用産物の還元の際の両経路の作用過程の故に、より
高い細胞密度にまで増殖し得る。かかる固有の融通性に
よってプロセス制御要件は緩和され、組換え産物の容量
収量が増大する結果となる。
通常起こる有機酸の蓄積は、嫌気増殖の際の発酵の結
果と見なされている。しかしながら、好気条件下、例え
ば迅速に撹拌してさえ、十分量の酢酸が産生され得る。
即ち、細胞密度が高く且つ嫌気条件が優勢である場合
は、酢酸生成は増殖の初期段階から進行するものであ
り、後期段階に限定されない。リン酸緩衝液を補充した
培地において最終細胞密度が増加することによって示さ
れるように、グルコースからの酸生成は、好気条件下で
さえ、ブロス及び固体培地での増殖を制限するよう作用
する。
従って、本発明のエタノール産生形質転換体は、嫌気
条件下でさえ酸生成が最小の、組換え産物の産生に優れ
た宿主である。多くの組換えタンパク質及びペプチドは
システインまたはジスルフィド架橋を含み、これらの適
正な折り畳み（folding）または反応は、活性酵素を形
成するのに必須の特性である。ジスルフィド結合の形成
は酸素によって促進されることから、嫌気条件下でかか
るタンパク質が合成されると、制御条件下で単離及び折
畳みする前に不適正な折り畳みの起こる可能性が小さく
なり、生物学的活性産物をより多く回収し得る。
上記構築物におけるadhBの使用は特に有利となり得
る。adhBはstress proteinをコードする（An et al.
［1991］FEBS LETTERS 282:205−208）。stress pro
teinは、生物学的機能の保持を可能にする異種タンパク
質の適正な折り畳みを支援することが判っている。Lee
et al.［1992］J.Biol.Chem.267:2849−2852。従っ
て、adhBを使用すると組換え生物における機能タンパク
質の産生を増強し得る。
E.coliにおける好気条件下で、解糖由来のピルビン酸
は主にピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体及び乳酸デヒ
ドロゲナーゼによって代謝され、このとき過剰量のアセ
チル補酵素Ａが酢酸に変換される。Gottschalk,BACTERI
AL METABOLISM,pp.210−80（Springer−Verlag 198
6）参照。上記２種の酵素の見掛けのKm値はそれぞれ0.4
及び7.2mMである。Z.mobilisピルビン酸デカルボキシラ
ーゼの見掛けのKmは、２種のE.coli酵素に等しい（ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ）かまたはそれより低く（乳酸
デヒドロゲナーゼ）、従ってアセトアルデヒド生成を容
易にしている。好気条件下でのNAD+再生は主に、生合成
及び見掛けのKmが50μＭの（電子伝達系に結合した）NA
DHオキシダーゼから生じる。Z.mobilisアルコールデヒ
ドロゲナーゼIIの見掛けのKmは、E.coli NAD+オキシダ
ーゼの４分の１以下であり、アセトアルデヒドをエタノ
ールに還元するために、Z.mobilis酵素は内因性NADHプ
ールに対し効果的に競合し得る。従って、Z.mobilisエ
タノール産生酵素の特性及びそれらの相対的に高い発現
レベルは、好気条件下で炭素の流れをエタノールへ導く
のによく適している。
E.coliにおける嫌気条件下で、解糖由来のピルビン酸
は主に乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアー
ゼによって代謝される。これら２種の酵素の見掛けのKm
値はZ.mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼのそれぞ
れ18倍及び５倍高い。同様に、E.coliにおけるNAD+再生
に関与する主要酵素の見掛けのKmは、Z.mobilisアルコ
ールデヒドロゲナーゼIIより著しく高い。従って、E.co
liにおいてZ.mobilis由来のエタノール産生酵素は、炭
素（ピルビン酸）及び還元可能性（NADH）を正常発酵酵
素及び酸化的リン酸と競合し、解糖産物をエタノールに
有効に導き得る。
セルロース及びヘミセルロース中に存在するラクトー
ス及び全ての主要な糖（即ち、グルコース、キシロー
ス、アラビノース、ガラクトース及びマンノース）は、
本発明によれば、エタノール産生酵素をコードする遺伝
子、例えばZ.mobilisの上記エタノール経路を含むもの
を発現する組換え宿主によってエタノールに変換し得る
ことが見い出された。
本発明のエタノール産生に適した宿主株を選択する際
には種々の因子を考慮する必要がある。かかる因子とし
ては、基質範囲、並びに耐糖性、耐塩性、耐エタノール
性、耐低pH性、及び耐熱性といった環境耐性（environm
ental hardiness）を挙げることができる。後述するよ
うに、例えばE.coli株ATCC9637（Waksman株Ｗ）は、グ
ルコースからのエタノール生産は他の株よりも低いが、
環境耐性の点で優れた特性を示す。主にスクロースを利
用する固有の能力のために株ATCC9637を選択した。有利
なことに、ATCC9637のこの特性によって、該株はテンサ
イ糖、ショ糖、及びスクロースを含む他の原料の発酵に
有用となる。pLOI297を含むATCC11303（ルリア株Ｂ）及
びATCC15244（Kepes株ML300）は最高レベルのエタノー
ルを産生すると共に、容認可能なレベルの環境耐性を示
した。これら２つの構築物中でプラスミドは全く安定で
あり、エタノール生成の更なる開発に最高の候補物質と
して選択した。両構築物は、十分なエタノール生成に要
求されるZ.mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼを高
レベルで発現した。Ingram et al.［1987］参照。
植物バイオマスの全ての主要な糖成分は、Z.mobilis
由来のエタノール経路を含む組換えE.coliによってエタ
ノールに変換された。グルコース及びキシロースからエ
タノールへの変換効率は、S.cerevisiae（Lovitt et
al.［1988］CRC Crit.Rev.Biotechnol.7:107−186参
照）及びペントース発酵酵母系について報告されている
値を超えていた。Beck［1989］Biotechnol.Bioeng.Sym
p.17:167−627;Jeffries et al.［1988］Biotechnol.
Bioeng.31:502−506;Skoog et al.［1988］Enzyme M
icrobiol.Technol.10:66−79;Slininger et al.［198
5］Biotechnol.Lett.7:431−436参照。Lovitt et al.
（上掲）によって報告されたところでは、グルコースが
S.cerevisiaeによって変換されるより高い効率で、キシ
ロースが組換えE.coliによってエタノール変換された。
キシロースにおける異常に高いエタノール収率（理論値
の100％以上）は、複合栄養物質の異化作用から誘導さ
れるエタノールに起因し得る。多くのアミノ酸及び複合
培地成分が、解糖中間物質または直接ピルビン酸に異化
される。次いでこのピルビン酸がエタノールに変換され
得る。
本発明によれば、pdc及びadh遺伝子を種々の宿主中に
形質変換し、種々のプロモーターを使用して発現するこ
とができる。かかる形質変換を行なうべく本明細書の記
述を使用することは当業者の能力内である。例えば、pd
c及びadh遺伝子は、異なる宿主域を有するプラスミド中
に容易に挿入することができる。E.coliまたは他の標的
生物中で複製すべく構築されたプラスミドは、２種以上
の宿主中で複製し得ることから、一般に“シャトルベク
ター”と称されている。かかるプラスミドは容易に入手
可能であり且つ容易に使用される。最も多く使用される
組合せとしては、E.coliと他の細菌、E.coliと酵母、及
びE.coliと動物細胞間のシャトルを挙げることができ
る。かかるベクターはカタログから入手可能であり、当
業者にはよく知られている。
Z.mobilis pdc及びadh遺伝子を、Xanthomonas、Kleb
siella及びErwinia中に挿入し、発現させた。他の生物
においても同様の成果が容易に得られるであろう。最適
な構築物を作製するためには例えばプロモーターの直接
的な変性が必要となり得るが、可溶性細胞質タンパク質
の生化学的特性及び現段階の発現の知識に基づき、うま
く行くことは十分に見込まれる。本発明によれば、ピル
ビン酸代謝を再誘導するのに必要な酵素活性を発現する
外来遺伝子を染色体中に組込み、プラスミドを必要とせ
ずに発現することができる。後記セクションII（Ｃ）参
照。例えば、プロモーターを欠くpet構築物をE.coli染
色体の、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子用のプロモータ
ーの直後に組み込むことができる。ほとんどの生物にお
いてpf1または他の遺伝子中に同様の組込みが可能であ
り、この場合標的遺伝子フラグメントが相同的組換えに
よる組込み部位を指示しさえすればよい。pf1以外の標
的遺伝子を組込みに使用することもできる。pet発現構
築物は指示プレート上で容易に同定されるので、この方
法は、エタノール産生のために他の生物を迅速に且つ効
率的に構築するために広範に使用し得る。
外来遺伝子を発現させる方法を記述している文献はか
なり多数ある。更にカタログは、種々の生物に使用し得
るベクターを列挙している。グラム陰性菌、グラム陽性
菌用のクローニングベクター、広範な宿主域が見込まれ
るベクター、真菌類クローニングベクター、昆虫クロー
ニングベクター、動物細胞クローニングベクター、及び
植物細胞クローニングベクターも当業者にはよく知られ
ている。これらのクローニングベクターを注文し得るカ
タログは容易に入手可能であり、当業者にはよく知られ
ている。例えばMarino［1989］BioPharm 2:18−33;VEC
TORS:A SURVEY OF MOLECULAR CLONING VECTORS A
ND THEIR USES（Butterworths 1988）参照。
熟練者は、別のpdc及びadh遺伝子を使用することもで
きるし、上述のZ.mobilis遺伝子をプローブとして用い
るかまたはより好ましくは指示プレートにおいて活性を
観察することにより同定し得る他の遺伝子を使用するこ
ともできる。本発明においては、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ活性が、ウマ、酵母、ヒト、昆虫、または他の細
菌遺伝子のどれから単離された遺伝子から提供されたか
は問題ではない。アルコールデヒドロゲナーゼ活性の発
現はアルデヒド指示プレート上で直接観察し得るので、
この酵素活性を示すタンパク質をコードする追加遺伝子
を単離するために、配列情報は必要でない。実際、1991
年３月現在でGenbankデータベースに252のadh遺伝子が
詳述されていることからも判るように、多数のアルコー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子が当業者には既によく知られ
ている（IntelliGenetics Inc.,700 E.El Camino D
rive,Mountain View,CA 94040）。
Z.mobilisは、機能的アルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子をコードする２つの遺伝子を含んでおり、そのうち
の一方（adhB）は、Clostridium acetobutylicum由来
のブタノールデヒドロゲナーゼ、E.coli由来のプロパン
ジオールオキシドレダクターゼ、及びSaccharomyces由
来のADHIVアルコールデヒドロゲナーゼに進化的に関連
している。これら全てはクローニングにされ、配列決定
されている。Z.mobilis由来の第２のアルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子adhAは亜鉛アルコールデヒドロゲナー
ゼであり、これもまたクローニング及び配列決定がなさ
れている。容易に入手可能な配列から推定される一次構
造を比較すると、adhA遺伝子は、動物及び植物において
記載されている典型的なアルコールデヒドロゲナーゼ並
びに酵母において優勢なadh遺伝子に進化的に関連して
いると考えられる。adhA遺伝子及び他のアルコールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子は、本明細書において例示した原型
のadhB遺伝子に代えて使用することができる。
同様にして、本発明においては、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ活性がZ.mobilis由来の遺伝子によって与え
られるか、必要な酵素活性はコードするがトウモロコ
シ、酵母または他の生物に由来する遺伝子によって与え
られるかは問題ではない。共通系統からの生活形の進化
は今や十分に容認されており、分子遺伝学的方法によっ
て驚くほど詳細に示されている。生物を巨視的特性に基
づく系統樹に整理分類し得るだけでなく、特定の機能の
ために進化した先祖遺伝子は進化の過程で保持され、か
かる機能に必要な特性は保存されている。高レベルの保
存によって当業者は、酵素ファミリーの１つ以上のメン
バーから得られる基礎情報を使用し、機能的に等価であ
り遺伝的に関係する他の生物由来の酵素を単離すること
ができる。解糖酵素は十分に研究されているので、この
最も良い例である。
実際、Z.mobilis pdc及びS.cerevisiae pdcにおけ
る情報を使用してDNAプローブを設計し、上記方法によ
りトウモロコシ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子がうまくクローニングされている。Kelly［1989］P
lant Molecular Biology 13:213−22参照。別の方法
では遺伝子全体をプローブとして使用することができ
る。配列情報を使用してトウモロコシ遺伝子が単離され
てはいるが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有す
るタンパク質の合成（ピルビン酸はアセトアルデヒドと
二酸化炭素とに変換される）は、アルデヒド指示プレー
ト上で直接観察することができることから、他の遺伝子
の位置決定に配列情報は必要ではない。機能的等価物を
与える多くの他のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
を他の生物から単離することもできる。かかる他の遺伝
子は、数種のアルコールデヒドロゲナーゼが適当である
と立証されているように、Z.mobilis pdcに代替し得る
ものとして適当である。更にこの点に関して言えば、19
91年３月現在でGenBankデータベースは５種以上のpdc遺
伝子を列挙している。
更なる改善として、本発明の組換え宿主は、Z.mobili
sにおけるグルコース輸送のキー成分をコードする遺伝
子、即ち、Z.mobilisグルコキナーゼ（glk）及びグルコ
ース支援拡散タンパク質（glucose−facilitated diff
usion protein,glf）をコードする遺伝子を用いて形質
転換することができる。特に、glk及びglfは、petのご
ときエタノール産生オペロンに対して上述したように、
人工オペロン内に併存させ、エタノール産生オペロンを
既に含む組換え体中に形質転換することができる。glk/
glfオペロンの発現によって、膜貫通グルコースフラッ
クスが増大し、従ってエタノール産生量が増加する。同
様に、他の宿主においてオリゴ糖輸送のキー成分をコー
ドする遺伝子または解糖系のキー成分をコードする遺伝
子を使用し、本発明の宿主を形質転換することもでき
る。フラックスの律速段階をコードする遺伝子による形
質転換は、エタノール産生量を高め、且つ生合成の骨格
源としての解糖中間体のレベルを増大することが期待さ
れる。
（Ｂ）発酵パラメーター：本発明によれば、異種エタ
ノール産生遺伝子は、組換え宿主による発酵産物として
エタノールの産生を容易にするレベルで発現される。上
述したように、かかる遺伝子を適当な非エタノール産生
生物中に挿入することにより、形質転換宿主は、セロビ
オース、セロトリオース、キシロビオース及びキシロト
リオースといったオリゴ糖から有意な量のエタノールを
産生することができる。後述するように、本発明の組換
え宿主からは約1M〜1.5Mのエタノール濃度を得ることが
できる。
（Ｃ）外来遺伝子の染色体組込み：外来遺伝子の染色
体組込みは、プラスミドベースの構築物が工業処理に多
くの制限を有するのに対して幾つかの利点を与える。プ
ラスミドベースの構築物は、染色体遺伝子よりも本質的
に安定性が低く、環境有害物質、即ち異種形質伝達の保
有体（resevoir for transmission of heterologou
s traits）として作用する。複数プラスミドを付加す
ると不安定性が悪化することが多い。しかしながらプラ
スミドベースの構築物は、これらを使用して宿主細胞を
容易に形質転換し得るので、セルラーゼをコードする遺
伝子のような異種遺伝子の発現を含む初期実験に有効と
なり得る。得られたタンパク質（例えばセルラーゼ）の
スクリーニングを容易にするためには、本発明の染色体
組込みにより、エタノール産生遺伝子を担うプラスミド
は必要としないことが望ましい。
エタノール産生遺伝子はE.coli Ｂにおいて染色体に
組み込まれている。Ohta et al.［1991］Appl.Enviro
n.Microbiol.57:893−900参照。一般にこれは、（１）
クロラムフェニコール遺伝子の上流に位置する所望の遺
伝子、及び（２）標的生物由来の同種DNAのフラグメン
トを含むDNAフラグメントを精製することにより行われ
る。このDNAを連結してレプリコンを含まない環を形成
し、形質転換に使用することができる。E.coliのケース
ではpfl遺伝子を標的とし、短くランダムなSau3Aフラグ
メントをKlebsiella中で連結し、相同的組換えを促進す
ることができる。
組換え体の一次選択は、単一コピー組込み後に増殖さ
せた20mgクロラムフェニコール（“Cm"）／リットルプ
レートにおいて行なうことができる。かかる構築物は、
極めて低い頻度で得ることができる。エタノール産生遺
伝子は最初は、効率的にエタノール発酵するには不十分
な低いレベルで発現する。600〜1000mg Cm/リットルを
含むプレートにおいて選択することにより、より高度の
発現が単一ステップで実現され得る。かかる株は極めて
安定であることが立証され、Klebsiella及びErwiniaの
より最適な株において同じ方法が成功するであろうこと
が推定される。幾つかの野生株の予備試験から、エレク
トロポーレーションによってプラスミド送達が向上さ
れ、組込みに必要な労力が軽減され得ることが示された
（後記実施例16参照）。
（Ｄ）宿主選択：上述のごとき異種pdc及びadh遺伝子
を発現すべく変性に適した生物としては、特に、動物細
胞、昆虫細胞、真菌細胞、及び生来的にはエタノール産
生性でない酵母のごとき真核細胞、並びに非エタノール
産生細菌を挙げることができる。E.coliに加え、Erwini
a属（例えばE.chrysanthemi）並びにKlebsiella属（例
えばK.planticola及びK.oxytoca）の他の腸内細菌は、
ペントースを含む種々の糖を代謝できるので特に重要な
宿主である。有利な宿主は、広範なグラム陰性菌（例え
ばXanthomonas属）及びグラム陽性菌（例えばBacillu
s、Clostridium及びCellulomonas属）から選択すること
ができる。これら種々の宿主の各々に対して適当な形質
転換法が可能である。
上記微生物のうち所定の生物が、本発明に従ってオリ
ゴ糖をエタノールに発酵する宿主の選択基準を満足して
いる。この点で特に、（１）オリゴ糖を細胞中に輸送す
るのに必要なタンパク質、及び（２）かかるオリゴ糖を
代謝する細胞内（原形質）レベルの酵素を産生すること
から、宿主を選択することができる。上記基準を満足す
る前述の微生物としては、E.chrysanthemi及び他のErwi
nia、β−キシロシダーゼを生来的に産生するK.oxytoca
並びにK.planticolaといったKlebsiella種のごとき腸内
細菌を挙げることができる。所定のE.coliもセロビオー
ス、マルトース及び／またはマルトトリオースを輸送及
び代謝するので、上記基準を満足する。例えばHall et
al.［1987］J.Bacteriol.169:2713−17参照。
宿主は、上記基準（１）及び（２）を満足した上で、
広範なグラム陰性菌〔例えばXanthomonas種〕及びグラ
ム陽性菌〔例えば、Bacillus属（例えばB.pumilus、B.s
ubtilis及びB.coagulans）;Clostridium属（例えばCl.a
cetobutylicum、Cl.aerotolerans、Cl.thermocellum、C
l.thermohydrosulfuricum及びCl.thermosaccharolyticu
m）;Cellulomonas種（例えばC.uda）；及びbutyrivibri
o fibrisolvens〕から選択することができる。例えばC
rptococcus種（例えばCr.albidus）のごとき種々の酵
母、Monilia、Pichia stipitis及びPullularia pullu
lans種；並びに、限定的ではないがBacteroides succi
nogenes、Thermoanaerobacter種（例えばT.ethanolicu
s）、Thermoanaerobium種（例えばT.brockii）、Thermo
bacteroides種（例えばT.acetoethylicus）、及びRumin
ococcus属（例えばR.flavefaciens）、Thermonospora属
（例えばT.fusca）及びAcetivibrio属（例えばA.cellul
olyticus）を含む他のオリゴ糖代謝細菌もまた容認し得
る。ここでも、かかる種々の宿主に対して適当な形質転
換法が可能である。
上記基準を満足する微生物に関する文献は、例えば、
Biely［1985］Trends in Biotech.3:286−90、Robsen
et al.［1989］Enzyme Microb.Technol.11:626−4
4、及びＢguin［1990］Ann.Rev.Microbiol.44:219−4
8に見られ、これらの文献の内容は参照により本明細書
の一部を構成するものとする。当業者は、多くの他の宿
主が本発明に使用するのに適していることを理解しよ
う。適当な宿主は、被試験微生物がオリゴ糖を輸送及び
代謝するか評価すべくスクリーニングすることにより同
定し得る。このようなスクリーニングは種々の方法で行
なうことができる。例えば、適当なオリゴ糖基質上でど
れが増殖するか評価すべく微生物をスクリーニングする
ことができるが、この場合のスクリーニングは、モノマ
ーのみを細胞内に輸送するのでない微生物を選択するよ
うに設計される。例えばHall et al.［1987］（上
掲）参照。或いは、微生物の適正な細胞内酵素活性、例
えばβ−キシロシダーゼ活性をアッセイすることもでき
る。
本発明に使用するのに適した選択方法の例は、ペクチ
ンを含む最少培地を使用して、軟腐病Erwinia株を腐敗
植物材料から単離することからなる。Starr,“The Gen
us Erwinia"in Vol.II THE PROKARYOTES 1260−71
（Springer−Verlag 1981）参照。カルシウム安定化ペ
クチン中に孔紋を生じる単離体を特性分析してアイデン
ティティを確認することができる。Bergey'sManual,Vol
ume 1,pp469−76参照。
パルプ及び紙廃棄物中に豊富な適当なKlebsiella候補
株（Huntley et al.［1976］J.Water Pollution Co
ntrol Federation 48:1766−1771;Knittel et al.
［1977］Appli.Environ.Microbiol.34:557−63）は、例
えばPerry and Palatka,Floridaにおける植物を処理
する廃棄物流から得ることができる。このような廃棄物
中の多数のklebsiellaの存在は、毒性化学物質に対する
耐性及びオリゴ糖を利用する能力のごとき最適特性を有
する特に有効な株の選択を促進し得る。まず、大腸菌特
異的培地（coliform−specific medium）において増殖
させることにより株を選択し〔Seidler,“The Genus
Klebsiella（Nonmedical Aspests）"in II THE PRO
KARYOTES 1166−72参照〕、更に、インドール産生、フ
ォゲス−プロスカウエル反応、シトレートなどによって
同定する〔Bergey's Manual,Volume 1,pp461−65参
照〕。
Klebsiella及びErwiniaの単離体を、それぞれエンド
グルカンス、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼ、セロ
ビオヒドロラーゼ、キシロシダーゼ及びアラビノシダー
ゼに対するモデル基質として、カルボキシメチルセルロ
ース、キシラン−ブルー、メチル−ウンベリフェリル
β−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−ウンベリフェリル
セロビロシド、メチル−ウンベリフェリル キシロシ
ド及びメチル−ウンベリフェリル アラビノシドを分解
する能力について、pH6.0に緩衝したプレート（30℃）
上で比較することができる。単糖（ヘキソース及びペン
トース）並びにセロビオース、セロトリオース、キシロ
ビオース及びキシロトリオースを代謝する能力について
株をスクリーニングすることもできる。二糖及び三糖レ
ベルは、一晩、試験管培養し、薄層クロマトグラフィー
によって一晩インキュベートしたときの糖の消費をモニ
ターすることで評価し得る。キシロシダーゼは、カンバ
材キシラン（Sigma）をC.thermocellumキシラナーゼで
処理することにより生成することができる。
更に有望株の増殖の耐エタノール性、耐塩性、耐熱性
は、E.coli Ｂの選択に使用したのと実質的に同じ方法
でスクリーニングすることができる。Alterhum et a
l.,［1989］Appl.Environ.Microbiol.55:1943−48;Beal
l et al.,Biotechnol.＆Bioeng.［1991］38:296−303
参照。ほとんどの単離体は、保存のために液体窒素中で
凍結することができるが、各グループから得られた３種
の最も有望な株を、別の開発のために選択することがで
きる。保存株は、新規の多糖遺伝子源として将来の研究
に有用となろう。
最適株は、リグノセルロースの全ての構成成分（二
糖、三糖及び単糖）を効率的に代謝し得る能力、440g/
リットル以上のエタノール濃度中で増殖し得る能力、塩
レベル0.3モルに耐性である能力、酢酸レベル0.2モルに
耐性である能力、温度40℃に耐性である能力、そして、
最少のプロテアーゼ活性で、セルロース、ヘミセルロー
ス及びペクチンの脱重合に有効な酵素を高レベルで産生
する能力を保持すべきである。ある種の株は天然キシラ
ナーゼまたはセルラーゼをも含む。アルコール産生用の
外来遺伝子を組込んだ後、最適構築物は、理論的収量の
90％以上の収量で、また上記有効特性を保持しつつ、試
験した全ての糖からエタノールを産生すべきである。
分泌されたセルラーゼの全pH及び最適温度を測定する
と共に熱安定性を評価すべく別の実験を行なってもよ
い。この情報は、加水分解及び発酵の併存過程に最適な
条件を設計する上で助けとなり得る。
（Ｅ）異種多糖の発現：前述したように、本発明の好
ましい実施態様は、異種ポリサッカラーゼを発現する組
換え体を製造し、それによってオリゴ糖を発酵する際の
市販酵素の必要性を小さくしようとするものである。ポ
リサッカラーゼの例としては、セルロース分解酵素、ヘ
ミセルロース分解酵素、キシラン分解酵素及び澱粉分解
酵素を挙げることができる。
１つの有利な実施態様においてはポリサッカラーゼは
熱安定性である。この点において、例えばClostridium
thermocellum（celA、Ｂ、Ｃ及びＤ）由来の好熱タン
パク質をコードする遺伝子は、個々に細胞質産物として
高レベルで発現される。組換え再生された酵素は、発酵
終了時点で細胞を収集し、酵素がほぼ最高の活性及び優
れた安定性を示す温度、例えば60℃に加熱することで熱
安定性酵素を細胞から放出することにより回収される。
次いで、酵素を複合多糖基質に所定時間、例えば約12時
間作用させる。選択した遺伝子のシグナル部分を排除す
る変性は、E.coli中で産生される活性物質を大幅に増強
し、これは、Klebsiella及びErwiniaにおいても同様の
効果を有する。
celD遺伝子は上記のごとく使用するのに特に好まし
く、本発明のcelD形質転換組換え体は、精製木材パルプ
の機械粉砕によって誘導される粉末化セルロース製品で
あるSOLKA−FLOCごとき基質の発酵に適している。後記
実施例18及び図14に示すように、celDによってコードさ
れる酵素を用いて基質を前加水分解すると、celDが欠失
した組換え体と比較して市販セルラーゼの必要量を約1/
5に減らすことができる。異種発現し細胞内に蓄積した
酵素を使用する、複合基質の“ジャンプスタート（jump
−start）”糖化方法は、本発明によれば、複合オリゴ
糖（セルロース、ヘミセルロース、澱粉、グリコーゲ
ン、ペクチン、イヌリンなど）を分解するためにその発
現産物が回収されるポリサッカラーゼコーディング遺伝
子を用いて更に形質転換される任意のエタノール産生組
換え体にまで一般化され得る。後記実施例17〜19参照。
例えば、先行の発酵で得た細胞を各後続の発酵の酵素
源として使用することができる。また、酵素分泌は必要
ではなく、代わりに該方法は、酵素の回収を容易にする
細胞内蓄積を利用する。増殖及び発酵の間にゆっくり蓄
積するのではなくて、最高レベルの組換え酵素が最初に
存在する。更に、微生物においてオリゴ糖が使用される
のは珍しく、かかる糖に対し競合する夾雑微生物はより
少数であるが故に、微生物汚染の危険性が低減される。
別の好ましい実施態様においては、上述のエタノール
産生組換え体がポリサッカラーゼを発現し、それが少な
くとも一部は宿主から分泌され、細胞の外での複合オリ
ゴ糖の加水分解を触媒する。かかる遺伝子産物は、糖化
及びエタノール産生の間に慣用的に供給される１種以上
の市販酵素、例えばcenA（エンドグルカナーゼ）及びce
x（エキソグルカナーゼ）製品の活性を補助し得る。こ
のように使用されるポリサッカラーゼコーディング遺伝
子の例としては、KlebsiellaまたはErwinia中に形質転
換されると一部（約50％〜60％）が分泌される、Cellul
omonas fimiのセルラーゼ遺伝子を挙げることができ
る。例えばcex遺伝子で形質転換した実験用Erwinia株に
おいては、異種発現産物の50％以上がブロス中に分泌さ
れる。
かかる分泌率は、Klebsiellaにおいてはプルナラーゼ
用、またErwiniaにおいてはペクテートリアーゼ用のシ
グナル配列にそれぞれ融合することにより増大される。
Murooka［1990］Ferment.Technol.Ind.Appl.40〜45;Pug
sley et al.［1990］Ann.Rev.Genetics 24:67−90;H
e et al.［1991］Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 88:107
9−83;Saarilahti et al.［1990］Gene 90:9−14参
照。
特に重要なのは、熱安定性遺伝子産物及び分泌される
遺伝子産物の両方を発現する本発明のエタノール産生形
質転換体である。かかる形質転換体は、（１）溶解によ
って、セルロースまたは別の複合基質をより単純なオリ
ゴ糖及び単糖に分解する前処理に使用するため酵素活性
を提供し、（２）分泌によって、発酵の間脱重合が継続
されるための酵素を提供する。
天然特性を過剰発現する突然変異または遺伝子修飾と
組み合わせた異種遺伝子は、特定の環境下で有効とな
る。例えば、Erwinia株において天然エンドグルカナー
ゼの発現レベルを増大すべく、突然変異誘発及び選択を
実施することができる。場合によっては、かかる突然変
異誘発及び選択は高濃度のグルコースによって抑制され
る。グルコース−CMCプレートにおいて抑制された突然
変異株を選択し、この制御を失い、場合によってはかか
る酵素を過剰産生し得る株を同定することができる。
当業者には、本発明のこの態様において種々のポリサ
ッカラーゼを使用し得ることが理解されよう。同様に、
広範な形質転換ベクターが本発明のこの態様に使用し得
る。宿主とベクターを最適に適合させるには、ある種の
慣用実験が必要となり得る。例えばRSF1010ベースのベ
クターを構築することができる〔Conway et al.［198
7c］Appl.Environ.Microbiol.53:235−41参照〕。該ベ
クターは宿主域が広く、全てのErwinia及びKlebsiella
単離体を含む多くのグラム陰性菌宿主中に異種遺伝子を
導入することができるし、テトラサイクリン耐性に関し
ても選択できるので好ましい。これに反して、pUCベー
スのプラスミドはある種のErwinia株において不安定と
なり、このためにあまり好ましくない。
本発明に適当に使用される他のポリサッカラーゼ遺伝
子のうち、セルロース分解活性のいずれかをコードする
ものを以下に挙げる。
エンドグルカナーゼはβ−1,4−グリコシド結合をラ
ンダムに加水分解する。これは、セロビオースを攻撃す
ることはないが、セロデキストリン、リン酸膨潤セルロ
ース、CMC及びHEC（ヒドロキシエチルセルロース）のよ
うな置換セルロースを加水分解する。ある種のエンドグ
ルカナーゼは結晶セルロースにも作用する。
これに反して、セロビオヒドロラーゼはセルロースに
作用し、特にセルビオース単位を鎖の非還元端部から分
離する。セロビオヒドロラーゼは、セロデキストリンは
加水分解するが、セロビオースは加水分解しない。β−
グルコシダーゼはセロビオース及びセロオリゴ糖をグル
コースに加水分解するが、セルロースまたは高級セロデ
キストリンを攻撃しない。
上述のC.thermocellum由来のセルラーゼコーディング
遺伝子のほかに、セルロース分解活性をコードする他の
遺伝子の特性も分析されている。例えばＢguin［199
0］Ann.Rev.Microbiol.44:219−48参照。この文献の内
容は参照により本明細書の一部を構成するものとする。
更にかかる遺伝子は、例えば1991年３月現在で特に13種
のエンドグルカナーゼ、３種のセロビオヒドロラーゼ、
及び３種のβ−グルコシダーゼを含むGenBankデータベ
ースによって容易に入手し得る。
同様に、キシラン分解酵素をコードする遺伝子を、本
発明に従って上述のごとく使用することができる。この
点で特に重要なものは、エンド−1,4−β−キシラナー
ゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−
Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及
びアセチルキシランエステラーゼからなる群から選択さ
れるキシラン分解酵素をコードする遺伝子である。後述
するエタノール産生形質転換体において発現させたC.th
ermocellum xynZ遺伝子及びButyrivibrio fibrisolve
ns xylB遺伝子の発現産物もこの群に含まれる（実施例
17参照）。キシラナーゼをコードする遺伝子もまた、19
91年３月現在で７種のエンド−1,4−β−キシラナー
ゼ、５種のβ−キシロシダーゼ、及び１種のα−Ｌ−ア
ラビノフラノシダーゼがGenBankに登録されていること
から判るように、容易に入手可能である。
同様に、澱粉の分解に関与する酵素をコードする遺伝
子を本発明に使用することもできる。この種の酵素の例
を、生物源及び他の特性情報と一緒に下記に挙げる。
澱粉分解に関与する酵素の例としては、B.stearother
mophilus α−アミラーゼ及びT.brockiiプルラナーゼ
を挙げることができる。かかる遺伝子は、19991年３月
現在で190種のα−アミラーゼ、３種のβ−アミラーゼ,
8種のグルコアミラーゼ、及び３種のプルラナーゼがGen
Bankに登録されていることから判るように容易に入手可
能である。β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、マン
ナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、及びペクテートリア
ーゼのごとき他のポリサッカラーゼも、GenBank及びこ
れらの遺伝子のクローニングを教示している文献から容
易に入手可能である。
Bacillusポリサッカラーゼ遺伝子はE.coli中で十分に
発現し、本発明に従って一般に腸内細菌に使用するのに
適している。実際、Bacillaceaeのメンバーは、アミラ
ーゼ、β−グルカナーゼ及びヘミセルラーゼを含む広範
な酵素を分泌し、B.subtilis株、B.polymyxa株、B.lich
eniformis株及びB.cereus株を含む多数の種がセルラー
ゼを分泌する。Ｂguin［1990］（上掲）及びRobson
et al.［1989］Enzyme Microb.Technol.11:626−44参
照。これらの文献の内容は参照により本明細書の一部を
構成するものとする。異種ポリサッカラーゼ遺伝子に付
随するシグナル配列が選択した宿主、例えばKlebsiella
またはErwinia中で非機能的である場合、上述のごとく
異種酵素の分泌が所望されるならばこのシグナルを宿主
由来のシグナル配列に融合した遺伝子で置き換えるのが
常套手段である。
Bacillus stearothermophilus株は、熱安定性ヒドロ
ラーゼ及び本発明に効果的に使用され得る他の活性物
質、例えばエンドグルコナーゼ（CMCase及びニトロフェ
ニル−セロビオシダーゼ活性）をコードする遺伝子源で
ある。このタイプの多くの遺伝子が特性分析されてお
り、GenBankまたは関連文献から入手可能である。Ｂg
uin［1990］（上掲）参照。
（Ｆ）宿主の選択及び形質転換：異種ポリサッカラー
ゼ遺伝子に使用し得る宿主として株を選択するため、ア
ルコール産生用遺伝子が組み込まれた本発明の組換え株
を、セルロース基質としてSOLKA−FLOC及び市販のセル
ロース加水分解用セルラーゼを使用して発酵させて試験
することができる。エタノール産生及び変換率を市販酵
素製剤の希釈度の関数として表した用量応答曲線を作成
し得る。工業用セルラーゼ製剤（例えばSPEZYME、MULTI
FECT AND CYTOLASE［Genencor］）を、例えば35℃,pH
6.0のpH制御発酵を使用する実験に使用することができ
る。
次いで、実施例17〜19に記載の方法で異種ポリサッカ
ラーゼを添加することができる。例えば特に有利である
として選択したポリサッカラーゼ遺伝子を同種組換えを
使用して組込むことができる。一次組換え体の選択には
テトラサイクリン（5mg/リットル）を使用し、有効遺伝
子がより多く発現した突然変異株を選択するには、より
多くの量を使用することができる。同じ手順で複数の酵
素を順次添加し得るよう、テトラサイクリン耐性（te
t）遺伝子を失活させるには、フザリン酸選択を使用す
ることができる。単一段階及び複数段階のセルロース発
酵過程におけるかかる構築体の有用性を評価することが
できる。
エタノール産生グラム陽性菌、例えばB.subtilisまた
はCellulomonas株を作出する好ましい経路は、Z.mobili
sピルビン酸デカルボキシラーゼに対する抗体を使用す
るコロニーのスクリーニングと組み合わせた化学的突然
変異誘発を含み、それによって発現の増加を検出する。
より高度の発現を示すとして同定されたクローンを、表
現型のもとになる機構を決定すべく試験する。かかる突
然変異株はそれ自体有用であり、更に、一般に安全と見
なされる生物（GRAS）における他の異種タンパク質の発
現には十分に有用である。
異種セルラーゼ遺伝子を用いてエタノール産生宿主を
形質転換し、活性酵素の細胞内濃度を高くする際、選択
した宿主及びセルラーゼに従って、別の慣用の遺伝子操
作またはスクリーニングが必要となり得る。例えば、宿
主が分泌するプロテアーゼが、本発明の異種発現に対し
て障壁となり得る。プロテイナーゼ活性用指示プレート
及びより高度のレベルの標的酵素の選択など、幾つかの
方法を使用して、この問題が最小化された突然変異株を
得ることができる。
更に、ポリサッカラーゼを含む任意の異種タンパク質
の製造において、増殖速度及び効率の点で代価を払うこ
とも多い。この“遺伝子負荷（gene burden）”は、特
に有効な遺伝子の複数の構築物を試験することにより最
小化することができる。組込み部位は見掛けの“遺伝子
負荷”に影響を及ぼし、従って本発明の試験において可
変因子となり得る。
このように製造された構築物は、実施例18に記載する
ように、市販酵素と併用した場合の有効性及び発酵効率
を評価するセルロース発酵試験に使用することができ
る。即ち、エタノール産生セルラーゼ分泌組換え体を接
種した時点で市販セルラーゼを加える単一ステップ方法
において、形質転換宿主によって分泌されるセルラーゼ
の、市販セルラーゼに代替する能力を試験することがで
きる。好熱セルラーゼの有用性は、先行の発酵で得られ
た酵素を含むエタノール産生細胞を60℃のセルロース懸
濁液に加えることにより試験することができる。インキ
ュベーションは、特定の酵素に対して最適化された条件
下で一定時間、例えば12時間継続する。温度及びpHを低
くしても、ほとんどのケースで、SPEZYME、MULTIFECT及
びCYTOLASEのような市販酵素及び12時間のインキュベー
ションに最適な条件を与えることができる。温度を35℃
に低下させ且つpHを6.0に上昇させた後、ブロスを組換
えエタノール源を用いて接種することができる。エタノ
ール収量及び収率を測定することができる。個々の酵素
の最適活性に特定の必要条件に適用するには、この方法
の多数の変形方法を使用し得る。
使用すべき分子遺伝学的方法は十分に文書化されてい
る。例えばManiatis et al.MOLECULAR CLONING:A L
ABORATOLY MANUAL（Cold Spring Harbor Laborator
y,1989）;Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS AND
MOLECULAR GENETICS（John Wiley＆Sons,1987）参
照。発酵は、前記説明及び実施例に記載したpHレベルで
行なうことができる。エタノールは、Goel et al.［1
984］Biotechnol Lett.3:177−182及びDombek et a
l.［1985］Appl Environ.Microbiol.51:197−200に記
載のごとき気−液クロマトグラフィーによって測定し得
る。モノマー糖は、比色分析及びHPLCによって測定し得
る。Ashwell［1966］Methods Enzymol.8:93−95;Wood
et al.［1988］Methods Enzymol.160参照。オリゴ
糖は、HPLC及び薄層クロマトグラフィーによって分析す
ることができる。培養体は、ルリアブロスのような複合
培地または鉱物塩中で増殖させ得る。Starr,Vol.II TH
E PROKARYOTES 1166−1172,1260−1271（Springer−V
erlag,1981）;Mizutani et al.［1986］Biotechnol.B
ioeng.28:204−09参照。生物は1.5％寒天を含む固形培
地上に維持し、ストックはグリセロール中−70℃で保存
し得る。
セルラーゼ酵素は実質的に、Curry et al.［1988］
Appl.Environ.Microbiol.54:476−484及びGripenet et
al.［1988］J.Bacteriol.170:4576−4581に記載のご
とくアッセイすることができる。エキソグルカナーゼ活
性は、モデル基質としてｐ−ニトロフェニルセロビオシ
ドを使用して評価し得る。カルボキシメチルセルラーゼ
（エンドグルコナーゼ）活性は還元糖の放出によって評
価することができる。セルラーゼ活性は、紙からの還
元糖の放出として測定する慣用方法によってアッセイす
ることができる。メチル−ウンベリフェリル誘導体、CM
C及びペクテートを使用して定性比較分析用指示プレー
トを準備することができ、任意の基質を加水分解する酵
素の高レベル生産体である株を同定することができる。
（Ｇ）耐アルコール性及び形質転換体生産の向上：本
発明のエタノール産生組換え体を用いて生産されるエタ
ノールの最高レベルは例えば1Mを超え得る。エタノール
生産は、ATCC55124で寄託されているE.coli形質転換体K
O11によるラクトースの発酵においては1.5Mを超え得
る。本発明のエタノール産生組換え体において耐アルコ
ール性が増強されていることは特に有効である。膜脂質
及び／またはstress proteinに影響する変化が、かか
る向上の基礎となっている。本発明の好ましいエタノー
ル産生オペロン（pet）の成分であるZ.mobilis adhB
も、温度及びアルコールの両方に応答可能な優れたZ.mo
bilis stress proteinとして同定されている。Haejun
g et al.［1991］J.Bacteriol.173:5975−82参照。st
ress proteinをコードする他のZ.mobilis遺伝子は同様
に有効である。かかる遺伝子を得るためには、Johnson
et al.,［1989］J.Bacteriol.171:1590−96;Ang et
al.［1989］J.Bacteriol.171:2748−55;Lipinska et
al.［1988］Nucleic Acids Res.16:7545−61;及びF
ayet et al.［1986］Mol.Gen.Genet.202:435−45によ
って報告されているように、主要なstress proteinを
発現するE.coli中で認められるような遺伝子が、Z.mobi
lis由来の対応遺伝子を単離するためのプローブとして
使用し得る。
脂質合成遺伝子は耐エタノール性に有効であることも
考えられる。耐エタノール性に有効な他の遺伝子は、ラ
イブラリーをエタノール産生体中に直接形質転換し、エ
タノールレベルが初期接種体の耐エタノールレベルを超
えたあとも耐エタノール性生物が増殖し得るよう過剰な
糖レベルを維持した発酵ブロス中で継代培養することで
富有化することにより選択し得る。かかる選択にはケモ
スタット（chemostat）方法が特によい。
高度の耐エタノール性を示すLactobacillus homohio
chii及びL.heterohiochii（Ingram［1990］Critical R
ev.Biotechnol.9:305−19参照）の遺伝子ライブラリー
を上記富有物において試験した。かかる微生物は酒中で
腐敗（spoilage）をもたらすことから、約15％v/v（2.5
M以上）のアルコールレベルに耐性である。この方法に
よると、１リットル当たり80g以上のエタノールレベル
を常に生成し得る組換え株を作出することができる。
更に、Z.mobilisの解糖酵素を使用し、本発明のエタ
ノール産生組換え体を増強することができる。即ち、解
糖酵素をコードする13の遺伝子のうち１つ以上を発現さ
せると、解糖フラックスを増大し、従ってエタノール産
生量を増大する。
（Ｈ）方法設計：本発明を実施するため、本明細書に
従って多数の発酵プロセスを構築することができる。か
かるプロセスは一般に２つ以上の段階を有する。バイオ
マスをポリサッカラーゼと接触させ、それに含まれるオ
リゴ糖をより単純なオリゴ糖及び／または単糖に分解す
る“糖化”段階と、より単純なオリゴ糖及び／または単
糖をエタノールに発酵する“発酵”段階とである。各段
階を実施する最適条件は著しく異なるので、２つの段階
は別々に実施するのが有利である。糖化段階の最適条件
は、温度が約50℃〜約60℃、pHが約4.5〜約5.0である。
発酵段階の最適条件は、温度が約30℃〜約35℃、pHが約
6.0である。
該プロセスの効率を高めるため、発酵段階から糖化段
階へ材料を一部再使用してもよい。更に、再使用材料は
約30℃〜約35℃の発酵段階の温度であるので、かかる材
料は熱交換器において糖化段階から来るより高温の流出
液を、発酵段階に導入する前に冷却するために使用する
ことができる。処理例を以下に述べると共に図19に示
す。
図19を参照すると、ポリサッカラーゼと前処理された
バイオマスとが酵素反応炉10に供給され、そこでバイオ
マス中の出発オリゴ糖がより単純なオリゴ糖及び単糖に
分解される。酵素反応炉10は、温度約50℃〜約60℃及び
pH約4.5〜約5.0に維持されている。固体及び液体の混合
物が酵素反応炉10から導管12を通して固体／液体分離器
14中に取り込まれ、そこで固体と液体とが例えば遠心機
によって分離される。
分離された固体は、導管16を通して酵素反応炉10に戻
される。分離器からの流出液は導管18を通って熱交換器
20に至り、そこで約30℃〜約35℃に冷却される。流出液
は導管22を通って膜分離器24に至り、分離器24は高分子
量多糖を分離する。次いで高分子量多糖は導管26を通っ
て酵素反応炉10に戻される。膜分離器は例えば、約10-3
〜約10-4ミクロンの分離等級を有するDu Pont（登録商
標）製CARREフィルターのような限外過フィルターと
し得る。或いは、膜分離器24は省略し、流出液を発酵器
30に直接導入することもできる。オリゴ糖及び／または
単糖を含む残りの糖溶液は導管28を通して発酵器30に移
送される。しかしながら発酵器に入る前に、例えば塩基
を加えることにより糖溶液のpHを高めるよう調整する。
二酸化炭素は、導管32を通して発酵器から排出され
る。流出液は発酵器からライン34を通して、エタノール
留出用の蒸留塔（図示なし）に導かれる。マッシュは発
酵器から取り出され、ライン36を通して固体液体分離器
40（例えば遠心機）中に導かれる。分離器40内で分離さ
れた微生物は導管42を通して発酵器に戻される。分離器
40から出た流出液は熱交換器20に供給され、固体／液体
分離器14から出た流出液を冷却する。熱交換器20を出た
後、例えば酸を加えることにより流出液のpHを約4.5〜
約5.0まで下げるよう調整され、次いで流出液は酵素反
応炉10に導入される。酵素反応炉10及び発酵30には、通
常タイプのミキサー48及び50を備えることができる。
必要によっては、連続方法においては、約0.5％〜約
５％、典型的には約１％〜約２％のエタノール濃度を有
する液体（ビール）を導管52を通して発酵器30から取り
出し、蒸発容器54内に供給し、そこでエタノールと水と
を蒸発させ、ライン56を通して別の蒸留段階（図示な
し）に導くことができる。ライン56内のエタノール濃度
は約20％〜約25％とし得る。蒸発器54から出てライン58
を通して発酵器30に戻されるビールは、約0.5％未満、
即ち一般に約0.3％のエタノール濃度を有する。このよ
うにして、発酵器内のエタノール濃度は比較的低いレベ
ルに維持され、それによって発酵器において高いエタノ
ール生成速度が維持される。
同様に、導管36、44及び46を通して反応炉10に戻され
る流出液はより低いエタノール濃度を有し、反応炉内の
反応を妨害することがより少ない。このような連続方法
は、バイオマスを反応炉10に連続的に添加することによ
り運転され得る。しかしながら、堆積固形物を排出し、
汚染の可能性を低減するため、反応炉10及び発酵器30の
内容物を定期的に排出することが望ましい。
上記発酵プロセスは、バイオマスをエタノールに発酵
する効率的な方法を提供する。当業者には、該発酵プロ
セスに多くの他の追加ステップ及び／または段階を付加
し得ることが理解されるであろう。例えば、バイオマス
を細断し、（水蒸気及び／または酸を用いてまたは用い
ずに）加水分解し、ポリサッカラーゼ及び／または他の
酵素で処理するなど、バイオマスの前処理段階を含める
ことができる。更に、ポリサッカラーゼを発現し細胞内
に蓄積する組換え宿主細胞を加熱し、細胞を溶解してポ
リサッカラーゼを放出させる初期段階もあり得る。工程
に沿って固体及び流出液の分離及再使用段階を追加し、
複数の発酵段階を含めることもできる。
III.実施例 以下、非限定的な実施例により本発明を更に説明す
る。特に記載しない限り、全百分率は重要に基づき、全
溶剤混合物の割合は容量に基づく。実施例の他の方法論
的特徴を以下に述べる。
生物及び成長条件：大腸菌TC4（Conwavら［1987a］参
照）及びプラスミドを含むその誘導体を使用した。Z.mo
bilisピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pLOI276）
及びアルコールデヒドロゲナーゼＢ遺伝子（pLOI284）
を含むプラスミドは、Conwayら［1987b］により記載さ
れている。
株及び成長条件：プラスミドpUC18及びpUC19はpLOI20
4及びpLOI295（Conwayら［1987b］、Ingramら［1987］
参照）と同様に従来記載されている（Yanisch−Perron
ら［1985］Gene 33:103−19参照）。pLOI292,pLOI291,
pLOI297,pLOI308,pLOI308−2,pLOI308−５及びpLOI308
−10の構築及び特性を以下に述べる。
50g/リットルのグルコースを含有するルリアブロス
（Luria＆M.Delbruck［1943］Genetics 28:491−511参
照）中で培養物を37℃で成長させた。37℃のブロス3ml
を収容する管（13×100mm）を管ローテーターに入れ、
この管内で酵素分析用細胞及び発酵試験用接種材料を成
長させた。一晩培養物を新鮮な培地で100倍に希釈し
た。好気性培養物（250ml容フラスコ中ブロス50ml）を
往復運動水浴（120回／分）中で振盪した。ジャイレー
ターによる撹拌機能（150rpm）を備える栓付き血清びん
（130ml容びん中ブロス100ml）をインキュベーターに入
れ、37℃で嫌気性培養物を成長させた。嫌気性培養物に
24ゲージ針を刺し、気体発酵産物を逃がした。
Spectronic 70スペクトロフォトメーター（Bausch＆
Lomb,Inc.Rochester,NY）を使用してスペクトロフォト
メトリーにより550nmで成長をモニターした。使い捨て
培養管（10×75mm）をキュベットとして使用した。本発
明の条件下の１吸光度単位は約0.25mg/mlの細胞タンパ
ク質を含有していた。成長をA550で測定した。
本発明のプラスミドを含む大腸菌宿主は、12301 Par
klawn Drive,Rockville,Maryland 20852、米国に所在
のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄
託した。培養物は寄託機関により以下の受託番号を付さ
れた。培養物 受託番号 寄託日 大腸菌pLOI308−10 ATCC 67983 1989年５月15日 TC4（pLOI292） ATCC 68237 1990年２月23日 TC4（pLOI308−11） ATCC 68238 1990年２月23日 TC4（pLOI297） ATCC 68239 1990年２月23日 TC4（pLOI295） ATCC 68240 1990年２月23日 大腸菌pLOI510 ATCC 68484 K.oxytoca M5A1 ATCC 68564 1991年３月14日 （pLOI555） 本発明の培養物は、37 CFR 1.14及び35 USC 122
の規定により米国特許商標庁長官によりその資格を有す
ると判断された者が本願の係属中に培養物を入手できる
ような条件下で寄託された。寄託物は本願の対応出願又
はその子孫出願が提出される外国の特許法の規定に従っ
て入手可能である。しかしながら、寄託物の入手可能性
は政府決定により付与された特許権の価値を落として本
発明を実施するためのライセンスを構成するものではな
いものと理解されたい。
更に、本発明の寄託培養物は微生物寄託のためのブダ
ペスト条約の規定に従って保管及び分譲可能な状態に維
持される。即ち、寄託物の試料の分譲の最新要求から起
算して少なくとも５年間、又は寄託日から起算して少な
くとも30年間、又は培養物の開示を含み得る特許の実施
可能期間の間、生存可能且つ非汚染状態に維持するよう
に細心の注意をもって保管される。寄託者は、寄託機関
が寄託物の状態により要求時に試料を分譲することがで
きない場合に寄託物を交換する義務を認める。本発明の
寄託培養物の分譲可能性に関する全制限は、これらを開
示する特許の付与後は最終的に取り除かれる。
遺伝子操作方法：形質転換、プラスミド構築、DNA消
化及び分析は従来記載されているように実施した。グル
コース2g/l及び適当な抗生物質を含有する固体培地（1.
5％寒天）上で組換体を選択した。Z.mobilisからの機能
的エタノール産生遺伝子を含む組換体を、グルコースを
含むルリア寒天プレート上で成長する過剰寸法コロニー
として同定し、グルコースを含まないルリア寒天プレー
ト上での低成長とアルデヒド指示培地上のアルコールデ
ヒドロゲナーゼ発現との観察により同定を確認した。
酵素アッセイ：細胞を破壊、熱失活させ、従来記載さ
れているようにピルビン酸デカルボキシラーゼ活性（熱
安定）についてアッセイした。Conwayら［1987b］参
照。固体硫酸アンモニウム第１鉄（最終濃度0.5mM）及
びアスコルビン酸ナトリウム（1mM）を新たに加えてお
いた30mMリン酸カリウム緩衝液中で細胞を洗浄及び破壊
した以外は、従来記載されているように細胞を調製し、
エタノール酸化の方向でアルコールデヒドロゲナーゼII
活性についてアッセイした。Nealeら［1986］Eur.J.Bio
chem.154:119−24参照。保存なしのアルコールデヒドロ
ゲナーゼ活性直接アッセイにこの変法を組み合わせた結
果、従来報告されているよりも著しく高い比活性が得ら
れた。エタノール産生効率を計算するために、Lowryら,
J.Biol.Chem.193:265−75のFolinフェノール試薬法を使
用して細胞量を培養物当たりのタンパク質含有量として
測定した。
発酵産物の分析：屈折率モニター及び電子積分器を備
えるMillipore/Waters高性能液体クロマトグラフ（Mill
ipore Corporation Bedford,MA）を使用して透明ブロ
ス中で発酵産物を定量した。Richmond CAに所在のBio
−Rad Laboratoriesから購入したAminex HPX−87Hカ
ラム（300×7.8mm）上、65℃、流速0.25ml/分（100μｌ
注入容量）で分離を行った。信頼できる標準を使用して
ピークを同定した。グルコースの前に溶出する２つのピ
ークと、45.4〜45.8分に溶出する後期未知ピークは非接
種培地の成分である。
実施例１ 株構築 ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒド
ロゲナーゼIIをコードする構造遺伝子のサイズは夫々1.
7及び1.1キロベースであり、これらの遺伝子は60000及
び40100の分子量を有するタンパク質をコードする。こ
れらの遺伝子は各々lacプロモーターの制御下でpUC18の
誘導体上に位置する（図１）。pLOI284（アルコールデ
ヒドロゲナーゼ）から制限エンドヌクレアーゼEcoR I及
びSal Iにより生成されたプロモーターなしの1.4キロベ
ースフラグメントをpLOI276中のピルビン酸デカルボキ
シラーゼ遺伝子から下流のBamH I部位に挿入することに
より２つの遺伝子を結合した。これらのクローンをアン
ピシリン耐性について選択する共に、アルデヒドの産生
を検出する新規に開発されたパラローザニリン−エタノ
ール指示プレート上のアルコールデヒドロゲナーゼ活性
の存在及び発現について選択した。指定した構築物pLOI
295を含むクローンはグルコースを添加しない場合には
ルリア寒天プレート（好気性）の表面上で十分に成長し
なかったが、２％グルコースを含有する寒天プレート上
ではプラスミドを含まない株及びpLOI276又はpLOI284を
含む株よりも著しく高密度に成長した。
petオペロンを含む組換体はグルコースを含むルリア
寒天プレート（好気性）上でより広くより不透明なコロ
ニーとして容易に検出された。コロニーサイズ及び不透
明度のこの差は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピル
ビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の両方を発現するプラ
スミドを含む組換体の同定のために有用なマーカーとな
ることが立証された。
pLOI295の完全塩基配列は知られている。ピルビン酸
デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のオープンリー
ディングフレームはlacプロモーターから163塩基下流で
開始し、アルコールデヒドロゲナーゼIIをコードする遺
伝子のオープンリーディングフレームから85塩基上流で
２つの終止コドンにより終結する。どちらの遺伝子も各
オープンリーディングフレームからすぐ上流のリボソー
ム結合部位に似た配列を含む。アルコールデヒドロゲナ
ーゼIIをコードする遺伝子は、単一の終止コドンを含
み、転写ターミネーターとして機能する13塩基対のパリ
ンドローム配列が後続する。
実施例２ 大腸菌におけるZ.mobilis遺伝子の発現 ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒド
ロゲナーゼII遺伝子の両方ともlacプロモーターの制御
下で単独（pLOI276及びpLOI284夫々）及び共同して大腸
菌中で高レベルで発現された。ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼは野生型大腸菌中には存在しないが、誘導性アル
コールデヒドロゲナーゼは低濃度で存在する。グルコー
スの存在下で大腸菌の成長中にZ.mobilis酵素の比活性
は約50％低下し、これはlacプロモーターのグルコース
抑制に一致する。petオペロン中で近位遺伝子によりコ
ードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの比活性は、
pLOI295ではpLOI276の３倍であった。petオペロン中の
遠位遺伝子であるアルコールデヒドロゲナーゼII遺伝子
の産物の比活性はpLOI295ではpLOI284の２倍であった。
実施例３ 組換株によるグルコースの発酵 大腸菌におけるpetオペロンの発現の結果、嫌気性成
長中に一次発酵産物としてエタノールが産生された。親
株はコハク酸（1.5mM）、乳酸（18mM）及び酢酸（7mM）
を主要発酵産物として産生した（図3A）。アルコールデ
ヒドロゲナーゼII遺伝子を担持するpLOI284を含む細胞
において同一の発酵曲線が観察された（図3C）。ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を担持する
pLOI276では、蓄積された発酵産物の３分の１に等価の
エタノールピーク（18mM）が明瞭に出現している。この
高レベルのエタノールは、Z.mobilisからのピルビン酸
デカルボキシラーゼと天然大腸菌アルコールデヒドロゲ
ナーゼの活性が結合した結果である。petオペロンを含
むpLOI295（Z.mobilisからのピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼII遺伝子の両方）
では、大腸菌は発酵産物の95％を上回る大量のエタノー
ル（750mM:4.3％vol/vol）を産生した。
petオペロンを含む細胞中で産生された高レベルのア
ルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシ
ラーゼは大腸菌中のNADH酸化を支配した。即ち、この生
物の発酵はS.cerevisiae及びZ.mobilisの発酵に転化さ
れた。正常な発酵成長中に、ピルビン酸はピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ複合体によりアセチル補酵素Ａに変換さ
れ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにより
オキサロ酢酸（及びコハク酸）に変換され、ピルビン酸
ギ酸リアーゼによりギ酸及びアセチル補酵素に変換さ
れ、乳酸デヒドロゲナーゼにより乳酸に変換される。こ
の最後の経路は大腸菌の非修飾株におけるNAD+の再生の
ための主要経路である。一方、細菌性乳酸デヒドロゲナ
ーゼのKmsは極めて高く、10〜1000mMである（Garvie,E.
I［1980］“Bacterial lactate dehydrogenases,"Mic
robiol.Rev.44:106−139;Tarmy,E.M.,及びN.O.Kaplan
［1968］“Kinetics of Escherichia coli Ｂ Ｄ
−lactate dehydrogenase and evidence for pyru
vate controlled change in conformation,"J.Bio
l.Chem.243:2587−2596）。Z.mobilisからのピルビン酸
デカルボキシラーゼのKmは0.4mMである（Bringer−Meye
r,S.,K.−L.Schimz及びH.Sahm［1986］“Pyruvate dec
arboxylase from Zymomonas mobilis:Isolation an
d partial characterization,"Arch.Microbiol.146:1
05−110）。低いKmに結び付けられる多量のこの酵素は
ピルビン酸の流れを解糖からエタノールに転換する。
ガス交換が制限されない培養槽の中度かきまぜ又は撹
拌による混合成長条件中にも高細胞密度が達せられる。
これらの条件下では曝気の程度に依存して6.3以上の最
終pHが観察された。
実施例４ プラスミド構築及び大腸菌におけるZ.mobili
sエタノール産生酵素の発現 プラスミドpLOI295はlacプロモーターの制御下でピル
ビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナ
ーゼIIをコードするZ.mobilis遺伝子を含む。この構築
物はpetオペロンと呼称され、代替プロモーターを有す
る付加的プラスミドの構築のためのエタノール生成遺伝
子源として使用される。エタノール産生遺伝子を含むpL
OI295からのEcoR I−Sal IフラグメントをDNAポリメラ
ーゼのクレノーフラグメントで処理し、平滑末端を生成
した。この平滑末端DNAフラグメントを、lacプロモータ
ーからすぐ下流のpdc遺伝子を有するpUC19のSma I部位
に挿入した。合成プラスミドpLOI293はBamH I部位を両
側に有するpet遺伝子を含んでいた。エタノール産生酵
素をコードする遺伝子を含むBamH Iフラグメントを発現
ベクターpLOI204に挿入することにより、プラスミドpLO
I291及びpLOI292（逆方向）を構築した。BamH Iフラグ
メントはリボソーム結合部位と、両方の遺伝子の完全配
列と、adhBに対して遠位の転写ターミネーターとを含
む。pLOI292において２つの遺伝子は元の発現ベクター
に含まれるZ.mobilisプロモーターの制御下に発現され
る。
pet遺伝子をlacプロモーターの制御から解放し且つ代
替プロモーターの挿入のために上流BamH I部位を維持す
るようにプラスミドpLOI308を構築した。pLOI293をBamH
Iで部分的に消化し、クレノー処理を使用してadhB遺伝
子から遠位のBamH I部位を除去した。（pdcにすぐ近位
の）プロモーターなしBamH I−（adhBから遠位の）EcoR
Iフラグメントとしてこのプラスミドからエタノール産
生遺伝子を除去し、pUC18のBamH I及びEcoR I部位に指
向的に挿入し、pLOI308を生成した。このプラスミドは
アルデヒド指示プレート上で低レベルのadhBを発現した
が、他の機能的petプラスミドpLOI295,pLOI291及びpLOI
292に関連する大コロニー表現型を示さなかった。
DNAの大部分が４キロベース未満の長さとなるように
Z.mobilisからの染色体DNAをSau3Aで部分的に消化し
た。この非分画化DNAをプロモーターフラグメント源と
して使用し、pLOI308の脱リン酸化BamH I部位に連結し
た。十分に発現されたpetオペロンを有するアンピシリ
ン耐性組換体が、グルコースを含有するルリア寒天プレ
ート上で大コロニーとして同定された。組換株の３種pL
OI308−2,pLOI308−５及びpLOI308−10を調査のために
選択した。これらのプラスミド中でプロモーター活性を
有するZ.mobilis DNAフラグメントは夫々６、２及び２
キロベース長であった。
表１は、組換大腸菌の一晩培養物中のピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの活性
を要約したものである。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの
活性は株TC4（pLOI291）中の0.37IU/mg細胞タンパク質
からTC4（pLOI295）中の8.23IUであった。ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ活性についてはTC4の組換株は（最高
から最低の方向で）pLOI295＞pLOI308−10＞pLOI308−
２＞pLOI308−５＞pLOI292＞pLOI291の順に並べること
ができる。
組換株におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は異
なるプラスミドからの発現に関してピルビン酸デカルボ
キシラーゼと同一の傾向に従った。測定したアルコール
デヒドロゲナーゼ活性は大腸菌からの天然酵素及びZ.mo
bilis酵素の組み合わせを示す。プラスミドを欠損する
株TC4で観察されたレベルはZ.mobilis遺伝子を有するプ
ラスミドを担持する株で観察されるレベルよりも相対的
に低かった。Z.mobilis酵素の活性（天然大腸菌アルコ
ールデヒドロゲナーゼに補正）は株TC4（pLOI291）の0.
13IU/mg細胞タンパク質からTC4（pLOI295）の9.6IUであ
った。
実施例５ Z.mobilisからのエタノール産生酵素を含む
組換株の成長 グルコースの異化作用をエタノールの産生に利用する
と、成長収量及び成長培地のpH変化にも影響した。発酵
産物は比較的非毒性であるが、発酵中に毒性レベルまで
蓄積し得る。10％グルコースを含有するルリアブロスを
収容するびんで嫌気性成長中にプラスミドを含まない株
及び（アルコールデヒドロゲナーゼIIをコードする遺伝
子を担持する）pLOI284を担持する株は48時間後に0.25m
g細胞タンパク質/mlの最終密度、4.4の最終pHに達し
た。細胞密度は（ピルビン酸デカルボキシラーゼをコー
ドする遺伝子を担持する）pLOI276を担持する株では２
倍に増加し、最終pHは4.5であった。pLOI295（petオペ
ロン）を担持する株の最終細胞密度は2.5mg/mlであり、
対照株の10倍であった。最終pHは4.7であった。2.5mg細
胞タンパク質/mlの密度ではマグネシウムが限定的であ
るように思われ、0.5mM硫酸マグネシウムの添加により
細胞密度は更に1.5倍の増加に容易に達せられる。
組換株の成長を好気性及び嫌気性条件下で試験した
（図３）。好気性条件下（図3A及び表２）では株TC4は
最も迅速な成長段階の間に約30分間の世代時間で成長し
た。pLOI308の誘導体を担持する株TC4は同等の最大成長
速度を示し、世代時間は26〜30分間であった。株TC4（p
LOI295）はこれらの条件下では十分に成長せず（世代時
間71分間）、部分的溶解を伴った。株TC4（pLOI291）及
びTC4（pLOI292）は中間速度で成長し、各々成長時間は
46分間であった。
嫌気性条件下（図3B及び表２）ではプラスミドを欠損
する株TC4の世代時間は32分間であり、エタノール産生
酵素を含む組換株よりも著しく短かった。TC4（pLOI29
2）を除く全組換体は同様の最大成長速度を示し、世代
時間は38〜41分間であり、TC4（pLOI292）はややゆっく
りと成長し、世代時間は48時間であった。
TC4（pLOI295）を除く全組換体はプラスミドを欠損す
る株TC4と同等以上の細胞密度まで嫌気性又は好気性成
長条件下で12時間後に成長した（図3A及びＢ）。表２
は、24時間成長後の株TC4及び組換体の最終細胞密度を
要約したものである。好気性条件下では、pLOI308−10
を含む株TC4は最高の細胞密度に達し、以下、pLOI308−
２、pLOI292、pLOI295（多少の溶解が出現）及びpLOI30
8−５を含むTC4の順であった。
嫌気性条件下ではpLOI308−10及びpLOI295を含む株TC
4の最終細胞密度は概ね同等であり、以下、pLOI292、pL
OI308−２、pLOI308−５及びpLOI291を含むTC4の順であ
った。
図４は細胞中のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の
レベルと24時間成長後の最終細胞密度との関係を示す。
ピルビン酸デカルボキシラーゼの合成はこれらの組換体
中のアルコールデヒドロゲナーゼIIの合成に結び付けら
れるので、このプロットはNAD+再生のための代替Z.mobi
lis系が最終細胞密度に及ぼす影響を示す。これらのデ
ータから明らかなように、エタノール産生のためのZ.mo
bilis経路の発現は嫌気性及び好気性条件の両方で最終
細胞密度を増加させる。株TC4（pLOI308−10）において
ピルビン酸デカルボキシラーゼ（6.5IU）及びアルコー
ルデヒドロゲナーゼII（2.5IU）の発現レベルは嫌気性
及び好気性成長の両方でほぼ最適であった。株TC4（pLO
I295）におけるエタノール産生酵素の発現レベルは過剰
であると思われ、その結果、好気性条件下では細胞成長
が低下すると共に部分的溶解が生じ、嫌気性条件下では
成長がやや低下する。
迅速振盪下のフラスコ中で成長中には成長が不良及び
溶解がおきるが、これとは対照的に嫌気性条件下での株
TC4（pLOI295）の成長は高く且つほとんど溶解が出現し
ないことから、高度に好気性の環境はこの構築に有害で
あり得ると考えられる。振動速度を３分の１に減らす
と、この組換体における溶解は著しく減少し、最終細胞
密度は振盪フラスコ中で成長中に増加した。
実施例６ 成長中にエタノール産生酵素がブロスの酸性
化に及ぼす影響 図3Cは嫌気性成長中のブロスのpHの変化のプロットを
示す。pHはプラスミドを欠損する株TC4の最初の６時間
成長中に迅速に低下したが、エタノール産生酵素を含有
する誘導体におけるpH低下はもっとゆっくりであった。
最初の12時間における酸性化はpLOI295を含む株TC4で最
大程度まで減少し、以下、pLOI308−10、pLOI308−２及
びpLOI308−５を含むTC4の順であった。株TC4（pLOI29
1）及びTC4（pLOI292）のデータは示さないが、夫々TC4
（pLOI308−５）の下及び上に位置する。組換体はより
高い最終細胞密度に達したが、嫌気性及び好気性両条件
下で24時間成長した組換体からのブロスのpHは、エタノ
ール産生酵素を欠損する株TC4からのブロスよりも酸性
度が低かった（表２）。
組換体では酸性化速度及び酸性化の程度の低下に伴っ
て細胞成長が増加したことから、pHの低下は高度に好気
性の条件下であっても成長を制限する主要な因子である
と予想された。この仮定は、1Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）の1/10容量を補充した培地で成長させた（プ
ラスミドを欠損する）株TC4の最終細胞密度の85％増加
により裏付けられた。低レベルの緩衝液を加えると、成
長は中間レベルになった。
実施例７ エタノール産生酵素が発酵産物に及ぼす効果 表３は、好気性及び嫌気性条件下で24時間成長後に株
TC4及び組換体により形成された発酵産物の分析を要約
したものである。好気性条件下ではプラスミドを欠損す
る株TC4の成長中に酢酸が一次発酵産物として高濃度培
地中に蓄積し、エタノールは検出されなかった。産生さ
れた酢酸の量はZ.mobilisからのエタノール産生酵素を
含む株では著しく低下し、主要発酵産物としてエタノー
ルが出現した。pLOI308−10を含む株TC4は最大量のエタ
ノールを産生し、以下、pLOI295、pLOI308−２、plOI29
2、pLOI308−５及びpLOI291を含むTC4の順であった。こ
れらの好気性条件下では少量の乳酸（0.6〜1.2mM）もこ
れらの株のすべてにより産生された。pLOI308−10を含
む株TC4のみがかなりの量のコハク酸を蓄積したが、こ
の産物は全発酵産物の僅か１％に止まり、94％はエタノ
ールであった。
嫌気性条件下では乳酸が主要発酵産物であり、プラス
ミドを欠損する株TC4の24時間成長中にグルコースを含
有する高濃度培地中に蓄積し、少量の酢酸、コハク酸が
存在し、エタノールも存在した。エタノール産生酵素を
含む株で乳酸産生は劇的に減少し、実質的な量のエタノ
ールの産生を伴った。株TC4（pLOI308−10）は最大量の
エタノールを産生し、この産物単独で合計可溶性発酵産
物の97％に相当した。試験生物間のエタノール産生の傾
向は好気性成長中のそれと同一であった。TC4（pLOI308
−10）を除く全生物は24時間後に好気性条件下よりも嫌
気性条件下のほうが少量の合計エタノールを実際に産生
した。エタノール蓄積量がこのように低レベルとなった
のは、これらの嫌気性条件下で産生される合計細胞量が
減少し、こうしてエタノール産生の容量速度が減少した
ためであると考えられる。
嫌気性及び好気性条件下のエタノール産生度（表３）
はZ.mobilisエタノール産生遺伝子の発現レベル（表
１）に直接関係していた。エタノール産生は株TC4（pLO
I308−10）で最適であると思われ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ活性6IU及びアルコールデヒドロゲナーゼII
活性2.5IUであった。
Z.mobilisからのエタノール産生酵素を発現するプラ
スミドを含む大腸菌TC4の誘導体はプラスミドを欠損す
る親生物よりも高細胞密度に成長した。最終細胞密度の
増加、エタノールが培地中に蓄積した程度及び成長中の
培養ブロスの酸性化速度の減少はいずれもZ.mobilisエ
タノール産生酵素の発現レベルに関連していた。転写調
節に関連する潜在的な問題を最小限にするようにpLOI29
5（lac）を除く全構築物で遺伝子を発現させるために異
種プロモーターを使用した。成長及びエタノール産生に
最適なレベルに最も近い発現レベルはpLOI308−10によ
り提供された（合計細胞タンパク質mg当たりピルビン酸
デカルポキシラーゼ6.5IU及びアルコールデヒドロゲナ
ーゼII2.5IU）。大腸菌におけるこの発現レベルは、NAD
+の再生のためにエタノール経路のみを含むZ.mobilis
CP4中に存在するレベルよりも著しく高かった。
エタノール産生酵素の発現レベルは株TC4（pLOI295）
では高すぎるようであった（可溶性細胞タンパク質の約
17％）。この高い発現レベルは、好気性条件下では部分
的な細胞溶解、低い成長速度及びエタノール産生の低下
を伴った。これらの効果は、撹拌速度を低下させ、嫌気
性条件下で成長させることにより軽減した。高度に好気
性の成長中に生じた明白な損害及び部分的溶解は、高レ
ベルのZ.mobilisアルコールデヒドロゲナーゼIIと（電
子伝達系に結びつけられる）天然NADHオキシダーゼとが
相俟って生じたNADHの消耗に関連していると考えられ
る。
主要産物としてのエタノールの産生は、大腸菌TC4の
成長速度に悪影響を与えないと考えられる。petオペロ
ンを発現し且つエタノールを産生するpLOI308の誘導体
（ColE1レプリコン）を含む株はグルコースを含む好気
性条件下で親生物が成長したと同様に迅速に成長し、親
生物よりも高い最終細胞密度に達した。RSF1010レプリ
コンを有するpLOI291又はpLOI292を含む株は好気性条件
下でゆっくりと成長した。これらの２種の構築物はより
低レベルのエタノール産生酵素を発現し、pLOI308−10
よりも低レベルのエタノールを産生したので、低い成長
の理由はpetオペロンの発現よりもむしろベクターの特
性によると考えられる。
実施例８ 追加株の調製 エタノール産生微生物として使用するための優れた特
徴を有する細菌を同定するために、追加大腸菌株を試験
した。以下の大腸菌株:ATCC8677,ATCC8739,ATCC9637,AT
CC11303,ATCC11775,ATCC14948,ATCC15244及びATCC23227
を評価した。トリプトン（10g/リットル）、酵母エキス
（5g/リットル）、塩化ナトリウム（5g/リットル）及び
発酵性糖を含有するルリアブロス（ルリア,S.E.及びM.D
elbruch［1943］Genetics 28:491−511）中、30℃の振
盪水浴中でこれらの株を成長させた。特に指定しない限
り、グルコース及びラクトースを濃度100g/リットルで
加え、キシロースを濃度80g/リットルで加えた。糖を別
々に蒸留水中２倍濃度でオートクレーブ処理した（121
℃、15分間）。キシロース（Sigma Chemical Co.,St.
Louis,MO）溶液は酸性であったので、オートクレーブ処
理前に水酸化ナトリウムで中和した。中和しない場合に
はかなりの褐色化及び分解を生じた。オートクレーブ処
理又は過滅菌した糖を使用して同様の発酵結果を得
た。エタノール経路の酵素をコードする遺伝子を含む組
換株がブロス中及びプレート上で生存するためには発酵
性糖の存在が必要であった。指定した場合には、最終濃
度10mg/リットルのテトラサイクリンを加えた。
実施例９ 追加株の環境耐性 エタノール産生のためにプラスミドを導入する前に、
予め同定した８種の異なる大腸菌株の成長の環境耐性を
比較した。塩化ナトリウム、糖、低pH及びエタノールに
対する耐性について株を試験した。表４の塩化ナトリウ
ム及び糖濃度は、元の培地中の濃度を含む。培地の最初
のpHは6.8であり、指定した場合にはこれをHClでより低
い値に調節した。酸性化した培地を過滅菌した。冷却
後、オートクレーブ処理した培地にエタノールを加え
た。糖を別々にオートクレーブ処理した。試験物質の不
在下で各糖中で成長した一晩培養物を、試験培地3mlを
収容する13×75mm培養管で60倍に希釈した。48時間後に
550nmのO.D.として成長を測定した。1.0のO.D.は0.25mg
/mlの細胞タンパク質及び0.33mgの細胞乾燥重量に等価
である。環境耐性試験では、0.2未満の最終O.D.は２未
満の倍加に相当するので、無視できるとみなした。
表４はグルコースを含有する培地中におけるこれらの
結果を要約したものである。ラクトース又はキシロース
を含有する培地で同様の結果を得た。株ATCC8677,ATCC8
739及びATCC11775は低濃度のエタノールによる阻害に対
して特に感受性であった。株ATCC9637及びATCC11775は
低pHに対して最も耐性であったが、ATCC23227以外の全
株はpH4.0で少なくとも２〜４の倍加で成長した。全株
はより45℃で成長し、それ以上の温度では成長は制限さ
れた。45℃を越えると継代培養することはできなかっ
た。全株は20％グルコース、20％ラクトース又は12％キ
シロースを含有する培地中で成長した。
実施例10 追加株の糖利用 糖利用を２種類の方法で試験した。２％炭水化物を補
充したMacConkey寒天上で赤色のコロニーを生じた株
を、糖利用に関して陽性であるとして評点した（Silhav
y,T.J.及びJ.R.Beckwith［1985］Microbiol.Rev.49:398
−418）。更にBiolog ECプレート（Biolog,Inc.,Haywa
rd,CA）を使用して製造業者の指示に従って細胞を試験
した。Biologプレートは迅速且つ便利であり、基質利用
の尺度としてNADH産生（テトラゾリウム塩から不溶性ホ
ルマザンへの変換）を検出する。どちらの方法も試験し
た13種の糖で完全に一致した。
試験した全株はグルコース、フルクトース、ガラクト
ース、マンノース、アラビノース、ラクトース、グルク
ロン酸及びガラクツロン酸を利用した。株11775はキシ
ロースを利用しなかった。マルトース及びマルトトリオ
ースはATCC11303及びATCC23227により使用されなかっ
た。全株はセロビオースに対して弱い陽性反応を示し
た。株ATCC9637のみがスクロースを利用した。糖利用の
試験結果を表５に示す。
実施例11 追加株の遺伝子改変 標準方法（Maniatis,T.,E.F.Fritsch及びJ.Sambrook
［1982］Molecular Cloning:A Laboratory Manual.C
old Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harb
or,NY）を使用して、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を選択マーカーとして含む２種の新規プラ
スミドを構築した。潜在型Z.mobilisプロモーター、ピ
ルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ及び転写ターミネーターを含むエタノール産生オペ
ロン（pet−オペロン）を5.2kb EcoR Iフラグメントと
してpLOI308−10（Ingram及びConway［1988］，前出）
から取り出し、pBR322のEcoR I部位に挿入し、pLOI308
−11を生成した。テトラサイクリン耐性遺伝子を含むpC
OS2EMBL（Poustka,A.,H.R.Rackwitz,A.−M.Firschauf及
びH.Lehrach［1984］Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4129
−4133）からの2.6kb EcoR IフラグメントをpLOI295
（Ingramら［1987］，前出）のSal I部位に挿入するこ
とによりプラスミドpLOI297を構築した。連結前に大腸
菌DNAポリメラーゼのクレノーフラグメントで処理する
ことにより付着末端を除去した（Maniatisら，前出）。
Mandel及びHiga（Mandel,M.及びA.Higa［1970］J.Mo
l.Biol.53:159−162）の塩化カルシウム手順を使用する
形質転換により種々の大腸菌株にプラスミドを導入し
た。２％グルコース及びテトラサイクリンを含有する固
体培地で選択を行った。抗生物質選択の不在下で25世代
成長後に抗生物質マーカーを維持する細胞の百分率とし
てプラスミド安定性を表した。
エタノール産生遺伝子を有するプラスミドを生息させ
る組換株は異常に大きいコロニーとして成長し、発酵性
糖を含む固体培地上で24〜48時間後に黄変した。液体培
地中では、これらの組換体の最終細胞密度はプラスミド
を欠損する対照の２〜３倍であった。ATCC14948とpLOI2
97又はATCC11775とpLOI308−11で数回試みたが、形質転
換細胞は得られなかった。株11775はキシロースを利用
せず、この株の組換体は発酵性糖としてキシロースの存
在下では対照よりも高密度には成長しなかったが、ラク
トース及びグルコースの存在下では高い成長が観察され
た。
グルコースを含有する培地で25世代成長後にプラスミ
ド安定性を試験した（表６）。どちらのプラスミドも同
一のレプリコンを含んでおり、ATCC8677及びATCC8739以
外の全株で良好に維持された。
実施例12 遺伝子改変株におけるピルビン酸デカルボキ
シラーゼ活性の発現 約半分の最大成長であるO.D.＝4.0で細胞を回収した
以外は従来の記載（Conwayら［1987］，前出;Nealeら
［1987］前出）に従ってピルビン酸デカルボキシラーゼ
活性を測定した。
テトラサイクリンの存在下で成長後にZ.mobilisピル
ビン酸デカルボキシラーゼ活性の発現を試験した（表
７）。pLOI297では、Z.mobilis遺伝子は大腸菌lacプロ
モーターの制御下で発現され、pLOI308−11はpet−オペ
ロンの発現のために潜在型Z.mobilisプロモーターを使
用する。株ATCC11303（pLOI297）、ATCC11775（pLOI29
7）及びATCC15224（pLOI297）は最高レベルの活性を含
んでいた。
実施例13 遺伝子改変株によるエタノール産生 最終濃度0.2Mのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）を加
えることによりルリアブロスを発酵実験用に修正した。
リン酸緩衝液、複合培地成分及び糖を別々にオートクレ
ーブ処理し、冷却後混合した。濃度10mg/リットルのテ
トラサイクリンを加えた。新たに単離したコロニーから
接種材料を24時間成長させ、被験発酵培地で洗浄し、約
1.0の初期O.D.550nmまで加えた。ブロス80mlを収容し、
ゴム隔膜とガスを逃がすための25ゲージ針とを備える10
0ml容フラスコ内で30又は37℃で発酵を行った。発酵フ
ラスコを温度調節水浴に浸漬させ、磁気撹拌機により10
0rpmで撹拌した。
従来記載されているように（Dombek,K.M.及びL.O.Ing
ram［1985］Appl.Environ.Microbiol.51:197−200）ガ
スクロマトグラフィーによりエタノール濃度を測定し、
容量百分率として表した。100％効率がグルコース又は
キシロース20g当たりエタノール12.75ml（10.2g）及び
ラクトース20g当たりエタノール13.5ml（10.8g）を産生
すると仮定して、添加される糖に基づいて変換効率を計
算した。
遺伝子組換による全大腸菌株は糖から実質的量のエタ
ノールを産生した（表８）。株ATCC15244（pLOI297）を
用いる予備実験によると、0.2Mリン酸カリウム緩衝液
（pH7.0）を含有する培地でより高レベルのエタノール
が産生された。この緩衝液の代わりに自動pH調節を使用
すると同等以上の結果が得られると予想される。15％グ
ルコースを使用すると、48時間後に37℃よりも30℃で高
レベルのエタノールが産生された。低いほうの温度であ
る30℃のみでラクトース及びキシロースの発酵を試験し
た。一般に、pLOI308−11よりもpLOI297を生息する株に
より高レベルのエタノールが産生された。株ATCC11303
（pLOI297）、ATCC11775（pLOI297）及びATCC15224（pL
OI297）は15％グルコースから48時間後に5.8〜6.9容量
％という最高レベルのエタノールを産生した。ほとんど
の株は初期実験でキシロース耐性が低かったので、８％
キシロースを使用して発酵の比較を行った。株ATCC9637
（pLOI297）、ATCC11303（pLOI297）及びATCC15224（pL
OI297）は８％キシロースから72時間後に最高レベル
（4.8〜5.2％）のエタノールを産生した。全株は15％ラ
クトース中で良好に成長した。株ATCC11303（pLOI297）
及びATCC15224（pLOI297）は48時間後にラクトースから
最高レベル（夫々6.1％及び5.6％）のエタノールを産生
した。
これらの比較試験によると、株ATCC11303（pLOI297）
及びATCC15224（pLOI297）はエタノール産生の最良の構
築物であると思われた。どちらの株も12％グルコース、
12％ラクトース及び８％キシロース中で成長時間経過及
びエタノール産生を試験した（図１）。細胞量は約10倍
増加し、3.6g乾燥重量／リットルの最終密度に達した。
キシロースでは細胞量はグルコース又はラクトースで観
察される速度の２分の１の速度で増加した。エタノール
濃度が５％に達するまでエタノール産生及び成長は３種
の糖でほぼ直線的であった。
糖からエタノールへの変換効率を計算するために、12
0時間後の最終エタノール濃度を３組の実験から平均し
た（表６）。12％グルコースの存在下で成長した培養物
中のエタノールの最終濃度は7.2容量％であり、これは
グルコースからの理論収量の94％に相当する。12％ラク
トースの存在下では、最終エタノール濃度は6.5％であ
り、ラクトースからの理論収量の80％に相当する。８％
キシロースの存在下では一貫して100％以上の収率を得
た。キシロースの存在下での低速成長中のこれらの高い
収率は、グルコースからピルビン酸以外に複合栄養の異
化作用からのピルビン酸からエタノールへの変換を示し
ていると考えられる。
図１のグラフからエタノール産生率を計算し、表９に
要約する。エタノールの容量産生率はグルコースでは1.
4g/リットル／時であり、キシロースでは0.64g/リット
ル／時である。エタノールの比産生率は３種の糖の各々
で初期成長時間中に最高であった。グルコースでは2.1g
エタノール/g細胞乾燥重量／時の最高産生率が得られ
た。糖ｇ当たりの最高のエタノール収量はキシロースで
得られ、糖単独の最大理論収量を上回った。
ATCC11303（pLOI297）を使用して実験を行い、アラビ
ノース、ガラクトース及びマンノースからのエタノール
産生を試験した。48時間後に30℃で３％〜４％のエタノ
ール濃度を得たが、それ以上は調べなかった。これらの
糖はグルコース及びキシロースに類似の経路により代謝
され、同様の収量を産生すると予想された（Lin,E.C.C.
［1987］“Dissimilatory pathways for sugars,pol
yols,and carboxylates,"In F.C.Neidhardt,J.L.Ingr
aham,K.B.Low,B.Magasanik及びM.Schaechter［編］,Esc
herichia coli and Salmonella typhimurium,Vol.
1,pp.244−284.American Society for Microbiolog
y,Washington,D.C.）。
実施例14 大腸菌以外の宿主からのエタノール産生 種々の生物間で経路が非常に類似していることから、
発酵産物としてエタノールを産生する能力を形質転換宿
主に与える遺伝子で種々の宿主を形質転換できると予想
できる。本明細書に記載するようにadh及びpdc遺伝子で
宿主を形質転換すると、適当な発現ベクターを発現のた
めに使用できることが十分に予想可能である。一旦発現
が達せられると、種々の可能な宿主間のこの経路の一貫
性により、エタノールの産生は十分に予想可能である。
実施例15 形質転換Klebsiellaにおけるエタノール産生 この試験で使用したKlebsiella株は従来Klebsiella
pneumoniae株M5A1と命名されている株である（Mahl,M.
C.,P.W.Wilson,M.A.Fife,W.H.Ewing［1965］J.Bacterio
l.89:1482−1487）。２窒素固定生物であるこの株は元
々Aerobacter aerogenesとして同定されたが、抗原性
に基づいて命名し直された。Klebsiella pneumoniaeの
新規分類学的基準はBergy's Manualの第８版に定義さ
れているので、この新規株の種分化を更に調査した。株
M5A1は10℃でグルコース最小培地中で成長したが、44.5
℃ではラクトースからガスを発生しなかった。この株は
インドール陽性であり、30℃及び37℃の両方で成長用単
独炭素源としてｍ−ヒドロキシ安息香酸及びゲンチジン
酸の両方を利用した。これらの試験に基づき、M5A1をK.
oxytocaと命名した。Z.mobilis遺伝子をコードするプラ
スミドを生息させない場合には、糖を付加しないルリア
寒天プレート上で株を継代培養した。adhB及びpdcを含
む組換体は生存のために発酵性炭水化物を必要とし、２
％グルコース及びキシロースを含むプレート上に維持さ
れた。抗生物質濃度は、アンピシリン50μg/ml、クロラ
ムフェニコール40μg/ml及びテトラサイクリン12.5μg/
mlであった。アルデヒド指示プレートを使用して組換体
におけるZ.mobilis adh IIの発現をスクリーニングし
た。大腸菌株TC4を全プラスミド構築のための宿主とし
て使用した。
M5A1はペニシリン及びその誘導体に対して比較的耐性
であるので、cat（Cmr）又はtet（Tcr）遺伝子を担持す
る大腸菌シャトルベクターを構築した。pcos2EMBL（Pou
stka,A.,H.R.Rackwitz,A.−M.Frischauf,B.Hohn,H.Lehr
ach［1984］Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4129−4133）
からの2.6kbpEcoR IフラグメントをpLOI276のSal I部位
に挿入することによりZ.mobilis pdcを含むpLOI276にt
et遺伝子を付加した。連結前に大腸菌DNAポリメラーゼ
のクレノーフラグメントで処理することにより付着末端
を除去した。得られた構築物を制限分析により確認し、
pLOI560と命名した。
予備試験の結果、大腸菌Ｂ（ATCC11303）は潜在的な
低コピー数のプラスミドを生息させることが判明した。
Z.mobilis pdc及びadhBをcatと共にこれらのプラスミ
ドに組み込むことにより、新規且つ有用なベクターをin
vivo構築した。これは、pLOI510からのpdc、adhB及び
catを含むプロモーターなしのPst Iフラグメントである
4.6kbpを単離することにより行った。このフラグメント
上に複製機能は存在しない。自己連結による環化後、２
％グルコースを含有するルリア寒天プレート上でこれら
のフラグメントをCmr選択性により大腸菌Ｂに形質転換
した。アルデヒド指示プレート上で形質転換細胞を試験
し、濃赤色のクローンをadhB遺伝子の高レベル発現とし
て選択した。抗生物質耐性及びZ.mobilis遺伝子を形質
転換により大腸菌TC4に伝達する能力についてこれらの
株からのプラスミド調製物を試験した。全組換体はアン
ピシリンに対して感受性であり、bla及びcolE1レプリコ
ンを含むpUC18フラグメントの欠損を示した。これらの
うちの１つであるpLOI555（8.4kbp）はアルデヒド指示
プレート上で最も濃赤色のコロニーを生成し、優れたエ
タノール産生能力を大腸菌に与え、小規模プラスミド単
離からの収量から判断すると低コピー数で存在すると思
われた。このプラスミド並びにpLOI297及びpLOI560を使
用してCmr選択性でK.oxytoca M5A1を形質転換した。
PDCをコードするZ.mobilis遺伝子を含む３種のプラス
ミド構築物をM5A1に形質転換した（表10）。PDCのレベ
ルはpUCをベースとする２種の構築物（pLOI297及びpLOI
560）でpLOI555の８倍であった。純PDCの最大比活性を1
00Uであると仮定すると、この酵素はM5A1（pLOI297）及
びM5A1（pLOI560）中に25％以上、M5A1（pLOI555）中に
3.6％の細胞質タンパク質を含有している。
M5A1におけるZ.mobilis遺伝子の発現をSDS−PAGEゲル
中で更に確認した。PDC及びADH IIを含むバンドは天然
株との比較により容易に同定された。PDCを含むバンド
はM5A1（pLOI555）よりもpUCをベースとする組換体のほ
うが著しく大きく、酵素活性の測定値に一致していた。
ADH IIはPDCよりも少量であるが、このZ.mobilis遺伝子
の相対発現はM5A1（pLOI555）よりもM5A1（pLOI297）の
ほうが高い。Z.mobilis pdc遺伝子のみを含むM5A1（pL
OI560）ではADH IIに対応するバンドは検出されなかっ
た。
小規模プラスミド調製の収量から、pLOI555のコピー
数は他の２種の構築物の1/10であると推算された。この
推算値は近似値に過ぎないが、pUCをベースとする構築
物中に存在する高レベルのPDCは高いコピー数に一部で
は存在することが明らかである。
30℃で60世代以上抗生物質の不在下で10％グルコース
を含むルリアブロスにpLOI555、pLOI297又はpLOI560を
生息させる細胞を順次移した。抗生物質を含まず２％グ
ルコースを含有するルリア寒天上で培養物の適当な希釈
液をプレート培養した。Z.mobilisからのエタノール産
生遺伝子の維持及び適当な抗生物質に対する耐性につい
てアルデヒド指示プレート上でコロニーを試験した。
Z.mobilis遺伝子はpBR322をベースとするベクターに
おいて非常に不安定性であることはKlebsiella planti
colaについて従来報告されており（Tolan,J.S.,R.K.Fin
n［1987］Appl.Environ.Microbiol.53:2039−2044）、
工業プロセスに許容できなかった。pLOI555を生息させ
る組換体は非常に安定であり、集団の98％が抗生物質耐
性遺伝子及びZ.mobilisからの遺伝子の両方を維持し
た。adhB発現のみがアルデヒド指示プレートにより検出
されるが、これらの組換体は同様に、pdc及びadhBの両
方の発現を示す大きいコロニー表現型を維持した。
30℃、pH6.0、撹拌速度100rpmで10％（w/v）グルコー
ス又はキシロースを含むルリアブロス中で発酵を行っ
た。非振盪下のフラスコ中で単離したコロニーから接種
材料を30℃で一晩成長させた。発酵物を1.0の初期O.D.
550nm（330mg細胞乾燥重量／リットル）まで接種した。
Bausch and Lomb Spectronic 70スペクトロフォト
メーターを使用して成長をモニターした。
ガス液体クロマトグラフィーによりエタノール濃度を
決定した。塩基を添加することにより生じた容量変化に
関して変換効率を補正し、全糖は代謝されたと仮定し
た。キシロース及びグルコースからの最大理論収量は0.
51gエタノール/g糖として計算され、残余は二酸化炭素
であった。最大活性時間から容量産生率を計算した処、
最大値を表した。表及び図面に示す全発酵データは２個
以上のバッチ発酵物からの平均である。
表11は、Z.mobilis PDC＋ADH IIが天然株M5A1で夫々
グルコース及びキシロースからのエタノール産生に及ぼ
す効果を示す。M5A1（pLOI555）は明らかにエタノール
産生のための最良構築物であり、最大容量産生率はグル
コース及びキシロースの両方について2.1g/リットル／
時であった。どちらの糖も、この組換体は30時間後に約
37gのエタノール／リットルを産生した。これらの糖の
発酵は48時間後に45gエタノール／リットルでほぼ完了
した。
エタノール産生と同様に、M5A1（pLOI555）の成長は
明らかに優れていた。この組換体の成長は親株の成長と
ほぼ同等であった。一方、親株と異なり、細胞密度は15
時間で最大に達した後に漸進的に低下した。溶解は現れ
なかったので、この低下は蓄積したエタノールとしての
耐性の低下を表し得る。pHを調節するために塩基を加え
ないと、pdc＋adhBを含む組換体は大腸菌で従来観察さ
れたように低い酸生成速度（高い割合の中性発酵産物）
により親生物の密度の２倍以上まで成長した。
最大容量産生率（2.1gエタノール／リットル／時）
は、同様に高い効率及び最終エタノール濃度が維持しな
がら大腸菌組換体のほぼ２倍である。大腸菌と異なり、
M5A1（pLOI555）は同等の速度でキシロース及びグルコ
ースを発酵する。プラスミドpLOI555は抗生物質選択の
不在下でM5A1中で安定的に維持された。M5A1の基質範囲
は大腸菌と同等であるので、M5A1組換体はエタノール産
生に顕著且つ予想外の利点を提供する。
実施例16 Erwinia及びKlebsiellaのエタノール産生組
換体によるセロビオースからエタノールへの発酵 本実施例はErwinia及びKlebsiellaのエタノール産生
組換体を使用してオリゴ糖セロビオースの発酵を説明す
る。
本実施例で使用したErwiniaはErwinia carotovoraの
典型的株であった。上記実施例15に記載したプラスミド
pLOI555を使用してErwiniaを形質転換した。Biorad El
ectroporationユニットを使用してItoら［1988］Ag.and
Biol.Chem.52（１）:293−４の手順に従ってプラスミ
ドpLOI555をErwiniaに挿入した（電圧＝2.0kV、容量＝2
5μＦ及び抵抗＝100Ω）。多数の形質転換細胞、即ちプ
ラスミドDNAμｇ当たり100000個を越える形質転換細胞
を回収した。
本実施例で使用したKlebsiellaは、実施例18に後述す
るようにして得たKlebsiella oxytoca M5A1株P2であ
った。
ルリアブロス（pH6,30℃）中10％セロビオース及び10
0rpm撹拌を使用して実施例15と同様に発酵を行った。Er
winia及びKlebsiella oxytocaにより産生されるエタノ
ールの濃度は夫々1.113モル及び1.065モルであった。産
生されたエタノールg/Lとして結果を図６に示す。記号
は、■:Erwinia、□:Klebsiellaを示す。
実施例17 単一の遺伝子組換微生物によるポリマーフィ
ードストックからエタノールへの発酵 実施例の要約：本実施例は、一次発酵産物としてエタ
ノールを産生し、細胞内でキシラナーゼを産生するよう
に遺伝子組換した単一微生物によりポリマーフィードス
トックをエタノールに発酵するための２段階プロセスを
示す。具体的には、好熱菌C.thermocellumからの截頭キ
シラナーゼ遺伝子（xynZ）をlacZのＮ末端に融合し、分
泌シグナルを除去した。このハイブリッド遺伝子は上述
の大腸菌KO11及びK.oxytoca M5A1（pLOI555）中で高レ
ベルで発現された。大量のキシラナーゼがエタノール産
生中に細胞内産物として蓄積した。発酵の終わりにキシ
ラナーゼを含む細胞を回収し、高温でキシラン溶液に加
え、こうして糖化のためにキシラナーゼを放出した。冷
却後、水解物はエタノールに発酵され、こうして同一生
物はその後の糖化のためにキシラナーゼの供給を補充し
た。
生物及び成長条件：本実施例で使用した細菌株及びプ
ラスミドを表12にリストする。
50g/リットルのキシロースを補充したルリアブロスで
株を成長させた。50mg/リットルのアンピシリン又は40m
g/リットルのクロラムフェニコールを含有するルリア寒
天プレート上で大腸菌の形質転換細胞を選択した。1000
mg/リットルのアンピシリン又は40mg/リットルのクロラ
ムフェニコールを含有するルリア寒天上でK.oxytoca M
5A1の形質転換細胞を選択した。
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−セロビオピラ
ノシド（100mg/リットル）を含む微量滴定プレートを使
用することにより組換クローンをキシラナーゼ活性につ
いてスクリーニングした（Millet［1985］FEMS Microb
iol.Lett.29:145−149）。同様に、４−メチルウンベリ
フェリル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（20mg/リット
ル）を固体培地に配合することにより、キシロシダーゼ
及びアラビノシダーゼの両方の活性をコードするButyri
vibrio fibrisolvens xylB遺伝子の発現をスクリーニ
ングした。（Uttら［1991］Appln.Environ.Microbiol.5
7:1227−1234）。これらの基質を陽性クローンにより加
水分解することにより蛍光産物（ウンベリフェロン）が
生成され、340nm紫外線下で容易に検出された。
遺伝子操作手順及び組換方法：プラスミド調製、制限
酵素による消化、連結、形質転換及びゲル電気泳動は標
準手順を使用して実施した。大腸菌株DH5αを全プラス
ミド構築の宿主として使用した。TempCycler Model 5
0（Coy Laboratory Product Inc.,Ann Arbor,MI）
及びTaqポリメラーゼを含むGeneAmpキット（Perkin El
mer Cetus,Norwalk,CT）を使用してポリメラーゼ鎖反
応を行った。増幅反応物は100μｌ総容量中に各2mMdNT
P、各100pmolプライマー、鋳型20ng及びTaqポリメラー
ゼ2.5Uを含有していた。30サイクル増幅（94℃で１分
間、47℃で２分間及び72℃で１分間、72℃で３分間最終
延長）後に生成物を単離した。
酵素活性の決定:30℃で一晩成長させておいた組換体
中でキシラナーゼ、キシロピラノシダーゼ及びアラビノ
フラノシダーゼ活性を測定した。細胞を遠心分離（7000
×ｇ、10分間）により回収し、キシラナーゼ活性を決定
するためにホスホクエン酸緩衝液（50mMリン酸カリウム
及び12.5mMクエン酸、pH6.3）又はキシロシダーゼ及び
アラビノシダーゼ活性の測定のためにリン酸緩衝液（10
mM ２−メルカプトエタノールを含有する5mMリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH6.8）で２回洗浄した。20000psiの
フレンチ加圧セルに２回通すことにより細胞を破壊し
た。得られた溶解物を遠心分離（４℃、13000×ｇで30
分間）し、細胞破片を除去した。
従来記載されている（Utt、前出）ようにキシロシダ
ーゼ及びアラビノフラノシダーゼ活性をアッセイした。
基質としてｐ−ニトロ−β−Ｄ−セロビオシドを使用し
た以外は同一手順によりキシラナーゼを測定した。更
に、カンバ材キシラン（Sigma Chemical Company,St.
Louis,MO）の加水分解から放出される還元糖を測定する
ことによりキシラナーゼ活性を推定した（Bergmeyer
（編）［1983］Methods of enzymatic Analysis,Vo
l.II,第３版、p151−2,Verlag Chemie,Weinheim,Germa
ny）。全活性は毎分放出された生成物のミリマイクロモ
ルとして報告する。タンパク質濃度をBradfordの方法
（Bradford［1976］Anal.Biochem.72:248−254）により
決定した。
薄層クロマトグラフィーによるキシロオリゴ糖の分
離： 0.5％カンバ材キシランをトリフルオロ酢酸により部
分的に加水分解することによりキシロオリゴ糖の混合物
を調製した（Domer［1988］Meth.Enzymol.160:176−18
0）。溶液を真空下に室温で10倍に濃縮し、１μｌサン
プルを標準として使用した。アセトン、酢酸エチル及び
酢酸（夫々2:1:1）からなる溶剤を使用して未活化Whatm
anシリカゲル150Aプレート（Whatman Inc.,Clifton,Ne
w Jersey）上で１回展開することにより、キシロオリ
ゴ糖を室温で分離した。乾燥後、Bounias（Bounias［19
80］Anal.Biochem.106:291−295）により記載されてい
るようにオリゴ糖をナフチルエチレンジアミン試薬で可
視化した。
発酵実験：非振盪フラスコ（30℃）中で一晩成長させ
ることにより新たに単離したコロニーから発酵用接種材
料を調製した。発酵物を550nmで0.1又は0.3の初期O.D.
まで接種し、撹拌下のpHスタット（350ml操作容量、pH
6.0）で30℃でインキュベートした。（Beallら［1991］
Biotechnol.Bioengin.38:296−303.;Ohtaら［1991］App
l.Environ.Microbiol.57:893−900;及びOhtaら［1991］
Appl.Environ.Microbiol.57:2810−2815）。クロラムフ
ェニコール又はクロラムフェニコール及びアンピシリン
を発酵ブロスに配合した。
高温でキシラン分解を行った後、30℃で発酵させる２
段階プロセスによりキシランを発酵させた。キシランの
分解のために、350ml発酵物からの細胞を48時間後に遠
心分離（7000×g,10分間）により回収し、４％キシラン
（pH6.0）を含有する等量の新鮮なルリアブロスに再懸
濁させ、60℃で65時間インキュベートした。30℃まで冷
却後、550nmで初期O.D.＝0.3となるようにの水解物に組
換生物を接種した。
サンプルを種々の時刻に取り出し、キシロオリゴ糖
（薄層クロマトグラフィー）、細胞成長（550nmのO.
D.）及びエタノールをモニターした。ガス液体クロマト
グラフィー（Dombekら［1985］Appl.Environ.Microbio
l.51:197−200）により測定した。
キシランの加水分解のための組換プラスミドの構築：
非置換キシランの加水分解のためには少なくとも２種の
活性即ち内部溶解キシラナーゼ及びキシロシダーゼが必
要である。好熱菌Clostridium thermocellum（Grepine
tら［1988］J.Bacteriol.170:4582−4588）からのxynZ
（キシラナーゼ）遺伝子及びButyrivibrio fibrisolve
ns（Utt、前出）からのxylB（キシロシダーゼ及びアラ
ビノシダーゼ）遺伝子が単独及びオペロンとして組み合
わせて発現されたキシラン発酵物で使用するために３種
のプラスミドを構築した（図7A、7B及び7C）。
図7A、7B及び7Cは、xynZ及びxylBを含む組換プラスミ
ドの構築を示す。コーディング領域を四角で囲んだ。C.
thermocellum及びB.fibrisolvens DNAを細線により表
す。太線はベクターDNAを示す。平滑末端連結部位をＸ
により示す。Ｆは枠内lacZ::xynZ融合のコーディング領
域を示す。
pLOI1001からの２つのフラグメント、即ちリボソーム
結合部位を有するアミノ末端を含む0.3kbp Xba I−Pst
Iフラグメントと、コーディング領域の残部及び翻訳タ
ーミネーターを含む2.4kbp Pst Iフラグメントとを挿
入することにより、xylB遺伝子をpUC18のポリリンカー
のXba I−Pst I領域にサブクローニングした。合成プラ
スミドpLOI2000はlacプロモーターからxylB遺伝子を発
現した。
Grepinetら、前出による従来の研究は、プロセッシン
グ済みのキシラナーゼの分泌シグナル配列及びアミノ末
端をコードする大セグメントが除去されたlacZ融合でキ
シラナーゼ発現が高いことを示している。アミノ截頭xy
nZ遺伝子を含むpCT1202からのクレノー処理した2.4kbp
Sty IフラグメントをpUC18のクレノー処理したPst I
部位に平滑末端連結することにより非常に類似したlac
Z::xynZ融合物を構築した。合成プラスミドpLOI2001で
２つの読み枠を整合させた。
lacZ::xynZのコーディング領域から30bp下流の推定転
写ターミネーターを除去し、キシラナーゼ及びキシロシ
ダーゼの両方をコードする遺伝子が発現されるプラスミ
ドの構築前に融合遺伝子の3'末端に新しいSst I部位を
加えることが必要であった。これらの修飾はポリメラー
ゼ鎖反応を使用することにより行った。プラスミドpLOI
2001を鋳型として使用し、5'−GAATTCGAGCTCGGTAC−3'
を5'末端のプライマーとして、5'−GGGAGCTCCGGCATCATT
ATCTG−3'を3'末端（新しいSst I部位を含む）のプライ
マーとして使用した。Sst I消化後、このフラグメント
をpUC18及びpLOI2000のSst Iポリリンカー部位に挿入
し、夫々pLOI2001及びpLOI2003を構築した。
キシラン分解に関与する酵素の発現：構築に使用した
宿主細胞である株DH5αの定常相細胞でキシラナーゼ、
キシロシダーゼ及びアラビノシダーゼ活性の発現をまず
最初に試験した（表13）。キシラナーゼ（xynZ）活性
は、xynZ単独を含むpLOI2001に比較して下流にxylBを含
むpLOI2003を生息させるクローンのほうが60％低かっ
た。一方、キシロシダーゼ及びアラビノシダーゼ（xyl
B）活性はxylB単独を含むpLOI2000及び上流のxynZ遺伝
子を含むpLOI2003を生息させるクローンで同様であっ
た。
プラスミドpLOI2001及びpLOI2003を大腸菌KO11のエタ
ノール産生株に形質転換させ、エタノール産生用遺伝子
を染色体に組み込んだ。振盪フラスコからの定常相細胞
と、発酵の終わりにpHスタットから採取した細胞とで発
現を比較した（表13）。キシロシダーゼ、アラビノシダ
ーゼ及びキシラナーゼ活性はDH5αで観察される活性と
同等であった。また、xylBが下流に存在するpLOI2003で
はキシラナーゼ活性は低下した。
Z.mobilisエタノール経路からの遺伝子を含むpLOI555
を生息させるK.oxytoca株M5A1で同様に発現を試験し
た。pLOI555に存在するレプリコンの型は未知である
が、pUC18から構築された第２のプラスミドの存在下で
極めて安定であるように思われた。アラビノシダーゼ及
びキシロシダーゼ活性の発現は大腸菌で観察される発現
と概ね同等であった。多量の天然キシロシダーゼがM5A1
で発見された。キシロシダーゼ活性はpHスタットからの
細胞に比較して振盪フラスコからの細胞のほうがやや高
かったが、キシラナーゼ活性は逆の傾向に従った。
使用したアッセイ条件下でアラビノシダーゼ活性はキ
シロシダーゼ活性の1.5〜1.7倍であり、従来の報告（Ut
tら、前出）に一致した。47℃で測定したキシラナーゼ
活性は天然酵素の最適温度である60℃で測定した活性の
約２分の１であった（Grepinetら、前出）。呈示データ
によると、キシラナーゼ融合のための還元糖アッセイか
ら計算した比活性は、天然基質に強い選択を示すｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドの加水分解に基づ
く推定値の約100倍である。
組換クローンによる高温でのキシランの加水分解:8％
キシロースを収容するpHスタットで株KO11（pLOI2003）
を成長させ、キシラン加水分解の酵素源として試験し
た。４％キシランを含有する等量の新鮮なルリアブロス
に細胞を再懸濁させ、B.fibrisolvensキシロシダーゼが
安定状態にある最高温度である45℃と、C.thermocellum
キシラナーゼの最適温度60℃とでインキュベートした。
キシラナーゼ及びキシロシダーゼが細胞内産物として産
生されたが、初期実験は、これらの酵素が45℃及び60℃
でのインキュベーションにより培地中に容易に放出され
ることを示した。種々の時刻にサンプルを抽出し、消化
産物を薄層クロマトグラフィーにより分析した（図8A及
び8B）。
図8A及び8Bは、４％カンバ材キシランを含有するルリ
アブロス（pH6.0）中で45℃（図8A）又は60℃（図8B）
でインキュベートした大腸菌株KO11（pLOI2003）を使用
したキシラン加水分解の薄層クロマトグラフィー分析を
示す。１μｌのサンプルサイズを各レーンに加えた。各
レーンの下にインキュベーション時間（時間）を表す。
キシランの酸水解物を第１レーン（Ｓ）で標準として使
用した。
キシロース、キシロビオース、キシロトリオース及び
キシロテトロースが明白に分離し、キシロビオースが主
要産物であった。モノマーキシロースはゆっくりと蓄積
した。24時間後と48時間後の消化の程度を比較すると、
60℃でキシロシダーゼは不安定であるにも拘わらず、60
℃よりも45℃のほうが加水分解が起こりにくいことを明
示している。
キシラン消化は60℃で65時間後も不完全であったが、
キシラナーゼは非常に活性に維持され、基質として４−
メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−セロビオシドで容
易に検出された。キシロシダーゼはこの温度で迅速に不
活化された。両方の酵素を含有する細胞溶解物の添加及
び60℃で更に24時間インキュベーション後に、キシラン
水解物の薄層プロフィルにそれ以上の変化は観察されな
かった。従って、キシロオリゴ糖産物はSigmaカンバ材
キシランの制限消化産物に近似すると思われる。酸化産
物又は置換物はこの市販調製物の完全な消化を阻止し得
る。
大腸菌及びK.oxytocaの組換株によるキシラン水解物
の利用：キシロオリゴ糖が大腸菌KO11（pLOI2003）及び
K.oxytoca株M5A1（pLOI555）により代謝可能な程度を評
価するために小規模実験を行った。これらの株をキシラ
ン水解物1mlに接種し（60℃で65時間、遠心分離による
細胞破片の除去後の上清）、撹拌せずに48時間30℃でイ
ンキュベートした。サンプルを取り出し、薄層クロマト
グラフィーにより分析した（図9A及び9B）。
図9A及び9Bは組換大腸菌KO11（図9A）及びK.oxytoxa
M5A1（図9B）による成長のためのキシロオリゴ糖の利
用を示す。ルリアブロス（pH6.0）中で大腸菌株KO11（p
LOI2003）と共にインキュベートすることによりキシラ
ン（４％）を65時間加水分解し、遠心分離し、過滅菌
した。サンプルを接種及び30℃でインキュベートし、成
長させた。サンプルを各レーンの下に示すように24時間
間隔で取り出し、薄層クロマトグラフィーにより分析し
た。キシロオリゴ糖の混合物を第１のレーン（Ｓ）で標
準として使用した。
活性なB.fibrisolvensキシロシダーゼの存在にも拘わ
らずキシロースのみが組換大腸菌株により代謝された。
キシロース、キシロビオース及びキシロトリオースはい
ずれもエタノール産生K.oxytocaにより完全に消費され
た。これらの結果に基づき、キシランのエタノール変換
を更に検討するためにすぐれているとしてK.oxytocaの
誘導体を選択した。
K.oxytoca株M5A1の誘導体によるキシロース及びキシ
ランの発酵：従来の発酵から回収した細胞を糖化のため
に４％キシランを含有するルリアブロスに再懸濁させる
２段階プロセスとしてキシランの発酵を行った（60℃で
65時間）。糖化したキシランを接種及び30℃（pH6.0）
で発酵させた。接種前に細胞破片を遠心分離により除去
する平行実験を行った。更に比較のために4.47％キシロ
ース（４％キシランのキシロース含有量に等価）を使用
して発酵を行った（図10A及び10B）。発酵物からのデー
タを下記表14に示す。
図10A及び10Bは、組換K.oxytoca M5A1によるキシロ
ース及びキシラン水解物からエタノールへの変換を示
す。酵素源として従来の発酵からの細胞を使用して65時
間60℃でキシランを加水分解した。図10Aは細胞量の増
加を示し、図10Bはエタノール産生を示す。記号は▲:M5
A1（pLOI555）による4.47％キシロースの発酵、○:M5A1
（pLOI555及びpLOI2001）による4.47％キシロースの発
酵、■：糖化からの細胞破片を含む４％キシラン水解物
のM5A1（pLOI555及びpLOI2001）による発酵、□：細胞
破片を除去するための遠心分離後の４％キシラン水解物
のM5A1（pLOI555及びpLOI2001）による発酵を表す。
M5A1（pLOI555）は非常に高効率でエタノールを産生
したことが明らかである。キシロース発酵は24時間後に
ほぼ完了し、最大理論収量の93％であった。成長及びキ
シロースからのエタノール産生はいずれも第２のプラス
ミドであるpLOI2001又はpLOI2003の併存により減少し
た。pLOI2001で必要な発酵時間は約36時間まで増加し、
理論収量の91％であった。モノマー糖からのエタノール
産生率のこの減少は、組換酵素により加えられる付加的
な負担を反映している。
ハイブリッドキシラナーゼ遺伝子（pLOI2001）又はキ
シロシダーゼ及びハイブリッドキシラナーゼ遺伝子（pL
OI2003）のいずれかを含むM5A1（pLOI555）を使用して
キシラン加水分解（60℃で65時間）を行った。これらの
水解物の薄層プロフィルは図9A及び9Bに示すKO11（pLOI
2003）の薄層プロフィルと同一であることが判明した。
２種のM5A1誘導体間にキシラン加水分解程度の差は認め
られなかった。
糖化に使用した夫々の生物を接種後にこれらの水解物
で成長及びエタノール産生を測定した（図10A及び10
B）。透明水解物の成長は等価レベルのキシロースモノ
マーで観察される成長の僅か２分の１であった。発酵は
24時間後にほぼ完了し、透明水解物中でやや迅速に現れ
た。キシランからのエタノール収量は7.7〜7.9g/lと、
最大理論値の約1/3であった。
発酵ブロス中のキシロオリゴ糖を薄層クロマトグラフ
ィーによりモニターした。発酵の終わりのプロフィルは
図9Bに示すプロフィル（48時間）と同一であった。キシ
ロース、キシロビオース及びキシロトリオースは完全に
代謝され、キシロテトロース及びそれ以上の長さのオリ
ゴマーが残った。
考察：こうしてポリマー加水分解及びキシランからの
エタノール産生のための酵素源の両方としてK.oxytoca
M5A1の高度組換株を使用できることが明らかである。
天然の細胞内キシロシダーゼの存在並びにキシロオリゴ
糖を輸送及び代謝する能力はこの生物では従来報告され
ていない。天然起源の大腸菌単離物としては、セロビオ
ースのためのホスホトランスフェラーゼ系及び細胞内ホ
スホセロビアーゼを利用するものが従来記載されている
（Hallら［1987］J.Bacteriol.169:2713−2717;Kricker
ら［1987］Genetics 115:419−429）。類似の系がK.ox
ytoca M5A1でキシロビオース及びキシロトリオース代
謝のために機能し得る。K.oxytoca M5A1におけるキシ
ロースモノマー、ダイマー及びトリマーの代謝のための
輸送系及び酵素の存在は、バイオマスの一層の発展のた
めに大腸菌に基づく系又はS.cerevisiaseに基づく系に
まさる顕著な利点をエタノールプロセスに提供する。
ポリマー分解及びエタノール産生のための単一生物の
遺伝子組換における従来の問題の多くは、発酵中に細胞
内産物として熱安定酵素が生成される２段階プロセスを
使用することにより解消される。高レベルでの分泌を目
的とするタンパク質の合成は、正常な細胞プロセスに悪
影響を与えることが多い。この問題は、細胞内発現のた
めに分泌シグナルを除去したＮ截頭酵素を使用すること
により最小限にすべきである。加水分解時間は変換の制
限因子であるので、迅速発酵のために糖の初期放出を最
大にするように、変換プロセスの極く初期に加水分解酵
素のレベルを高くすると最も有利である。分泌に基づく
プロセスでは、酵素レベルは初期には低く、発酵の終わ
りに近い最大レベルに達するまで蓄積する。しかしなが
ら、酵素源として従来の発酵からの細胞を使用すること
により、初期にほぼ最大レベルに達することができる。
加水分解のために熱安定性酵素を使用すると、汚染を最
小限にするための付加的なプロセス利点となり、より高
い加水分解率を実現することができるが、一次的な利点
は回収された細胞からの細胞内酵素の放出の単純さにあ
る。
エタノール耐性はセルロース及びキシランを分解する
天然の生物でしばしば問題となる。このような生物は典
型的には20g/l未満のエタノールを産生する。（Taillez
ら［1989］Appl.Environ.Microbiol.55:203−06）。こ
のようにキシランからの高レベルのエタノール産生は達
せられていないが、M5A1（pLOI555）は100g/lのキシロ
ースから少なくとも48g/lのエタノールを産生すること
が可能である（最大理論収量の約95％）。
カンバ材キシランからの合成エタノール収量は予想さ
れるよりも低く、主に不完全なキシラン加水分解に起因
すると考えられる。65時間の糖化時間後も未分解のキシ
ロオリゴ糖が残った。本発明の構築物により産生される
キシラナーゼのレベルはGrepinetらの前出の文献により
報告された最適キシラナーゼ融合構築物により産生され
るレベルよりも低かったが、酵素レベル自体は非制限的
であるように思われた。キシラン（40g/l、約0.3モルの
アンヒドロキシロース）は105μモル／分の速度で加水
分解により24時間後にキシロビオース等価物に完全に分
解される筈である。発酵からの細胞収量は約4.5g細胞タ
ンパク質／リットルであり、144μモル／分/g細胞タン
パク質のキシラナーゼ活性は648μモル／分の総活性を
提供した。一方、活性キシラナーゼの残存にも拘わらず
65時間後にもキシロオリゴ糖が残存した。これらのキシ
ロオリゴ糖のレベルは新鮮な酵素の添加及び更に24時間
インキュベーションしても変わらなかった。キシロオリ
ゴ糖による加水分解の競合的阻害は不完全な消化に起因
すると思われ、キシロース、キシロビオース及びキシロ
トリオースを代謝するM5A1における天然酵素と同様にキ
シラナーゼが活性状態に維持された温度である45℃で加
水分解により部分的に試験した。これらの条件下のオリ
ゴ糖プロフィルはM5A1株による発酵後に観察されるプロ
フィルと同一であり、同等レベルのキシロテトロース及
びそれ以上の長さのオリゴ糖が未消化のまま残った（デ
ータは示さず）。消化を制限する置換基の種類はわかっ
ていないが、これらのオリゴ糖は制限消化産物であると
考えられる。製造業者によると、カンバ材キシランは99
％キシロースである。特定の理論に拘束する意図はない
が、本発明者らはこの産物は保存中に発生した酸化残基
又は塩基抽出及び精製に耐えた置換物を含有し得ると推
察している（Chessonら［1983］J.Sci.Food Agric.34:
1330−1340）。
米国における発酵エタノール製造は年間約10億ガロン
（38億リットル）である（Lyndら,Science 251:1318−
1323）。遺伝子組換K.oxytoca、大腸菌、S.cereviseae
又はZ.mobilisのような微生物を使用してエタノールと
の副産物として種々の酵素を製造することができた。ビ
ール２リットル当たりタンパク質2gの最小細胞収量で
は、細胞タンパク質の５％の転用により副産物として少
なくとも3,800,000kgの酵素を製造することができる。
これらの酵素は発酵用基質の解重合に制限する必要はな
いが、洗剤産業、食品産業、木材パルプ化及び新規化学
物質のための新規生物触媒利用産業の開発のような他の
大市場用酵素を含み得る。大市場が発展するならば、こ
のような酵素の価値はエタノール自体の現状の価値を優
に越え得る。
実施例18 エタノール産生のために染色体に組み込まれ
たZ.mobilis遺伝子及びClostridum thermocellumから
の熱安定セルラーゼ遺伝子を発現するプラスミドを含む
組換Klebsiella oxytocaによるセロビオース、アモル
ファスセルロース及び結晶質セルロースからのエタノー
ル産生 実施例の要約：この実験では、エタノール産生のため
のZ.mobilis遺伝子をKlebsiella oxytoca株M5A1の染色
体に組み込んだ。これらの構築物の最良の株である株P2
はモノマー糖以外にセロビオースから有効にエタノール
を産生した。この株によるセロビオース及びセロトリオ
ースの利用により、外部β−グルコシダーゼの要求がな
くなり、SOLKA FLOC SW40（主に結晶質のセルロー
ス）を発酵するために必要な市販のセルラーゼの量を減
らすことができた。Clostridium thermocellumからの
エンドグルカナーゼをコードするプラスミドを加えた結
果、発酵中にエタノールとの副産物として熱安定性酵素
の細胞内蓄積が生じた。これらのうちの最良の株である
celDを含む株P2（pCT603T）を使用してアモルファスセ
ルロースをセロビオースに加水分解し、２段階プロセス
でエタノールを産生させた。市販セルラーゼとの組み合
わせでも株P2（pCT603T）を試験した。SOLKA FLOC SW
40を60℃でエンドグルカナーゼＤで前処理することによ
り、SOLKA FLOCを発酵させるために必要な市販セルラ
ーゼの量を80％まで減らすことができた。エンドグルカ
ナーゼＤ前処理の刺激効果は真菌セルラーゼによる攻撃
のための付加的部位を暴露するアモルファス領域の加水
分解に起因し得る。エンドグルカナーゼＤはC.thermoce
llumで複合体の一部として機能するので、この酵素は真
菌酵素と複合又はセルロースと結合して加水分解のため
のより解放された構造を提供することが可能である。
実施例17はエタノールとの副産物としてK.oxytoca M
5A1中でClostridium thermocellumキシラナーゼを細胞
内に蓄積する利点を立証した。この実施例では本発明者
らはエタノール産生用遺伝子をK.oxytoca株M5A1に組み
込み、合成生物がセロビオースをエタノールに有効に変
換し得ることを立証した。この生物はセロビオース及び
セロトリオースの両方を輸送及び代謝し、異種β−グル
コシダーゼの必要をなくすことができると思われる。こ
の組み込み構築物に加えたプラスミドはエタノールとの
副産物として熱安定性エンドグルカナーゼを産生するこ
とができ、セルロースの発酵中に市販のセルラーゼの必
要が減った。
生物及び成長条件：表15はこの試験で使用した新規生
物及びプラスミドを示す。２％グルコースを含有するル
リア寒天上にエタノール産生遺伝子を生息させる株を維
持し（３）、糖を加えないルリア寒天上に他の株を維持
した。特に指定しない限り、クロラムフェノコール（20
μg/ml）、テトラサイクリン（６μg/ml）、及びアンピ
シリン（50μg/ml）を選択のために使用した。典型的に
は、大腸菌株を37℃で成長させ、K.oxytoca株を30℃で
成長させた。Z.mobilisからのエタノール産生オペロン
の発現をアルデヒド指示プレート上の色形成速度により
モニターした（Conwayら［1987］J.Bacteriol.169:2591
−2597）。カルボキシメチルセルロースを含有するルリ
ア寒天上で１〜２時間55℃でインキュベートした後、Co
ngo Redで染色することによりコロニーをセルラーゼ活
性についてスクリーニングした（Woodら［1988］Meth/E
nzymol.160:59−74）。
遺伝子操作方法及びプラスミド構築：標準遺伝子操作
手順を使用した。株M5A1へのpet遺伝子の組み込みは、
３種の必須要素:1）大腸菌pfl遺伝子又はM5A1 DNA、
２）Z.mobilis pet遺伝子、３）選択用cat遺伝子を含
む（全複製機能を欠損する）環化DNAで細胞を形質転換
することにより得た。まず最初にクロラムフェニコール
20μg/mlを使用して組換体を選択した処、低レベルのZ.
mobilis酵素を発現した。大腸菌（Ohtaら［1991］Appl.
Environ.Microbiol.57:893−900）の場合と同様に、600
μｇクロラムフェニコール/mlに対する耐性を有する突
然変異株の直接選択により発現を助長した。各組み込み
毎に高レベルの耐性を発現する単一クローンを維持し
た。
celA（pCT105）、celB（pCT207）及びcelD（pCT603）
を含むプラスミドにテトラサイクリン耐性を加えた。プ
ラスミドpCT105及びpCT207をBamH Iで消化した後、大腸
菌DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントで処理し、平
滑末端を生成した。プラスミドpBR322をEcoR Iで消化
し、同様に処理して平滑末端を生成した。次に３種の全
プラスミドをSal Iで消化した。得られたtetのt'末端を
含むpBR322からの小さいフラグメントをpCT105及びpCT2
07からのより大きいフラグメントに連結し、（C.thermo
cellum DNAの挿入により予め失活させておいた）機能
的tet遺伝子を改変し、夫々pCT105T及びpCT207Tと命名
した。完全遺伝子を含むpCOS2EMBL（Poustkaら、前出）
からの2.5kbp EcoR IフラグメントをpCT603のユニーク
EcoR Iに挿入し、pCT603Tを生成した。このプラスミド
はcelCに加えて機能的tet遺伝子を含んでいたので、pCT
301をそれ以上修飾する必要はなかった。全セルラーゼ
含有プラスミドをテトラサイクリン耐性選択で組換K.ox
ytocaに形質転換した。
セルラーゼ活性:p−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビ
オシドを基質として使用して、細胞＋ブロス中及びブロ
ス単独中で60℃でエンドグルカナーゼ活性を決定した
（Petreら、前出）。更に、アモルファスセルロースか
らの還元糖の放出としてエンドグルカナーゼＤ活性を推
算した。アモルファスセルロース（酸膨潤及び塩基膨
潤）はAvicelについて従来記載されているようにSOLKA
FLOC SW40から調製した（Wood［1988］Meth.Enzymo
l.160:19−25）。還元糖は、Nelson−Somogyi法（Bergm
eyerら［1983］pp 151−152,in Bergmeyer H.U.
（編）,Methods of enzymatic analysis,vol.II、第
３版、Verlag Chemie,Weinheim,Germany）を使用する
ことにより測定した。アモルファスセルロースの初期濃
度はフェノール−硫酸法（Wood［1988］Meth.Enzymol.1
60:87−116）により合計炭水化物として推算した。
10％低粘度カルボキシメチルセルロース（Sigma Che
mical Company,St.Louis,Mo.）で凝固させたルリアブ
ロス約15mlを収容する18mm×150mm培養管を定常相培養
物2mlで被覆することにより、エタノール産生cel+組換
体間のエンドグルカナーゼ活性を更に比較した。55℃で
48時間インキュベーション後、液化の程度を反転により
決定した。
キシロシド及びキシラン消化について従来記載されて
いるように薄層クロマトグラフィーによりセルロース消
化産物を分析した（Domerら［1988］Meth.Enzymol.160:
355−362）。グルコース、セロビオース及びセロトリオ
ースをオリゴマーから分離した。セロビオース及びグル
コースを標準として使用した。
発酵実験：従来の記載とほぼ同様に（Beallら、前
出）pHスタット（350ml操作容量）として500ml Fleake
r中で発酵を行った。10％グルコース又は10％セロビオ
ースを含有するルリアブロスを30℃、pH600、100rpmで
試験した。ルリアブロス（４％グルコース）50mlを収容
する250ml容フラスコ中で振盪せずに発酵用接種材料を3
0℃で一晩成長させた。混合後、550nmで細胞密度を測定
し、0.32mg細胞乾燥重量/ml（O.D.550nm＝1.0）の初期
密度を提供するために必要な容量を計算するために使用
した。細胞を遠心分離によりこの容量から回収し、各pH
スタットからのブロスの一部に再懸濁し、発酵を開始し
た。
糖を別々に過滅菌した。セルロース発酵は50g/lのS
OLKA FLOC SW40（James River Corporation,Saddle
Brook,NJ）を含有しており、35℃で行った。セルロー
スを乾燥粉末としてオートクレーブ処理することにより
滅菌した。市販酵素を使用してセルロース発酵を試験す
るために、CYTOLASE又はMULTIFECTを接種時に加えた。
細胞量（O.D.550nm）及びエタノール（ガス液体クロ
マトグラフィー、Beallら、前出）を決定するためにサ
ンプルを取出した。エタノール濃度をg/lとして表し
た。発酵中に塩基を加えることによりエタノール収量を
希釈に関して補正し、糖又はセルロースの初期総量に基
づいて計算した。残留炭水化物については補正を行わな
かった。解糖及び発酵からの最大理論収量は0.51gエタ
ノール/gグルコース、0.536gエタノール/gセロビオー
ス、及び0.56gエタノール/gセルロースである。指示し
た以外は、結果は２回以上の発酵の平均である。
市販セルラーゼ:2種の市販セルラーゼ、CYTOLASE M1
04及びMULTIFECT CL（Genencor International,Rolli
ng Meadows,IL）を試験した。いずれも液体、恐らく適
切な修正を加えた突然変異Trichoderma longibranchia
tumからのブロスとして市販されている。いずれもペク
チナーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの混合物を含
有するとして記載されている。これらの酵素調製物は現
在食品加工に最も広く利用されている。
M5A1へのZ.mobilis pet遺伝子の染色体組み込み:3種
のアプローチを使用してpet遺伝子をM5A1の染色体に組
み込んだ（Orsdov［1984］p.461−465,in N.R.Kreig及
びJ.G.Holt（編）,Bergey's manual of systematic
bacteriology,vol.1.The Williams and Wilkins
Co.,Baltimore）。K.oxytocaと大腸菌は密接に関連して
いるので、大腸菌pfl遺伝子を同種DNAの主要源として使
用し、大腸菌に使用した方法に類似の組換を行った（Oh
taら、Appl.Environ.Microbiol.57:893−900）。大腸菌
のpfl遺伝子と共にpet遺伝子及びcatを含むpLOI510から
8.6kbpのSal Iフラグメントを精製した。（複製に関与
する遺伝子を欠失する）このフラグメントを連結により
環化し、組み込みを直接選択できるようにM5A1に形質転
換した。少量のフランキング大腸菌pflしか含まないよ
り短い5kbp Pst Iフラグメントを同様に使用した。第
３のアプローチでは、pet遺伝子とcatのみ（大腸菌DNA
なし）を含む4.6kbp BamH Iフラグメントに連結し、形
質転換に使用した。２％グルコース及び20μgCm/mlを含
有するルリアブロスプレート上で選択することにより、
全３種のアプローチから組み込み株を回収した。回収し
た３つの組み込みクローンはSal Iフラグメントを有し
ており、２つはPst Iフラグメント、１つがBmH Iフラグ
メントを有していた。
液体培養で一晩成長後、600μgCm/ml及び２％グルコ
ースを含有するプレート上に定常相細胞0.1mlを塗抹
し、高レベル発現について選択した。各組み込みから単
一の大きいコロニーを維持し、構築に使用した制限部位
に従って、S1,S2,S3,P1,P2及びB1と命名した。これらの
クローンをミニスクリーンDNAの形質転換によりプラス
ミドの存在について試験すると共に、アルデヒド指示プ
レート上でpet遺伝子の発現について試験した（表1
6）。プラスミドに担持されたcat遺伝子を含むことが判
明した推定組み込み株をミニスクリーンDNAの消化後に
廃棄し、pLOI510（恐らくゲル精製フラグメントの低レ
ベル汚染物質）の存在を確認した。親生物及び優れたエ
タノール産生物質であるM5A1（pLOI555）を夫々陰性及
び陽性対照として使用した。２種のクローンは、M5A1
（pLOI555）、株B1及びP2とほぼ同等レベルのエタノー
ル遺伝子を発現した。
組み込み株によるグルコース発酵とM5A1（pLOI555）
の比較:48時間後、pet組み込みを含む４種の株によりM5
A1（pLOI555）と同等の高レベルのエタノールが産生さ
れた（表16）。最低レベルの酸性副産物を産生した２種
も同様に最高密度まで成長した。これらの株P2及びB1を
更に試験するために選択した。
株P2及びB1によるグルコース及びセルビオースの発
酵:10％グルコース及び10％セロビオースを発酵する能
力について株P2及びB1を試験した（表17）。グルコース
発酵（図11A）中、どちらの組み込み株も親生物M5A1の
３倍のエタノールを産生したが、M5A1（pLOI555）（プ
ラスミドに担持したpet遺伝子）よりは収量及び容量産
生率でやや劣っていた。意外にも、株B1中のpet遺伝子
の組み込み及び高レベル発現は、セルビオースを発酵す
る能力の損失を伴った。一方、株P2は良好に成長し、セ
ロビオースからエタノールを産生し（図11B）、最大理
論収量の96％であった。株P2をATCC55307として1992年
３月11日付けで寄託した。
従って、図11A及び11BはK.oxytoca M5A1の組換株に
よるエタノール産生を示す。図11Aはグルコース（100g/
l）からの産生を示す。記号は、●：株M5A1（pLOI55
5）、▲：組み込みpet遺伝子を含む株P2、■：組み込み
pet遺伝子を含む株B1、○:M5A1対照を表す。図11Bは株P
2によるセロビオース（100g/l）発酵からの産生を示
す。記号は▲：エタノール、△：細胞量を表す。
種々の濃度の市販セルラーゼの存在下における組換K.
oxytoca M5A1と大腸菌とによる結晶質セルロース発酵
（SOLKA FLOC SW40）の比較：グルコースしか利用し
ないエタノール産生大腸菌とは対照的に、組換K.oxytoc
a P2はセロビオースを発酵することができ、セルロー
ス発酵中に外因性β−グルコシダーゼを必要としない。
市販の酵素を使用してセロビオース利用がセルロースか
らのエタノール産生をどの程度まで改善するかを試験す
るために、濃度０〜10％のCYTOLASE又はMULTIFECTの存
在下で50gのSOLKA FLOC SW40を基質として使用して発
酵を行った（図12、表17）。これらの調製物は、エンド
グルカナーゼ、エキソグルカナーゼ及びβ−グルコシダ
ーゼを含む真菌酵素の混合物を含有している。
従って、図12は市販セルラーゼの添加が120時間後に5
0g/lのSOLKA FLOC SW40からのエタノール収量に及ぼ
す効果を示す。破線は、添加したセルロースのみから形
成可能なエタノールの最大量を示す。エタノールのレベ
ルが高いのは、MULTIFECT CL調製物中に適切な補正と
して加えた付加的基質に主に起因する。記号は、▲:K.o
xytoca P2及びMULTIFECTによる発酵、■：大腸菌株KO1
1及びMULTIFECTによる発酵、△:K.oxytoca P2及びCYTO
LASEによる発酵、□：大腸菌KO11及びCYTOLASEによる発
酵を表す。
低濃度ではCYTOLASEはより効率的であることが判明し
たが、多少の毒性はこの酵素調製物の高濃度に関連して
いた。いずれの場合もK.oxytocaの組換株の性能はセル
ラーゼの市販調製物中のβ−グルコシダーゼの存在にも
拘わらず、大腸菌Ko11よりも優れていた。また、これら
の結果は、β−グルコシダーゼ活性市販セルラーゼ調製
物が他のセルラーゼ活性に比較して非飽和性であること
を示唆している。
MULTIFECT濃度が最高の場合、50gセルロース/lからの
理論的最大値を上回る収量が観察された。炭水化物又は
酵素を加えないルリアブロス及び10％CYTOLASE又は10％
MULTIFECTを含有し且つ炭水化物を加えないルリアブロ
スで発酵を行うことにより、この付加的エタノールの起
源を調べた。ルリアブロス単独からは約1g/lのエタノー
ルが産生され、10％のセルラーゼを添加したルリアブロ
スからは5g/lのエタノールが産生された。即ち10％MULT
IFECTを含有する発酵では、約4g/lのエタノールが市販
添加剤又は酵素安定剤の発酵に起因し得る。より低濃度
のセルラーゼからも比例量のエタノールが産生されると
予想される。ルリアブロス成分及び10％ MULTIFECTか
ら産生され得るエタノールを補正すると、エタノール収
量は理論的最大値の約94％である。
株P2におけるC.thermocellumセルラーゼの発現：セロ
ビオースは株P2から発酵され得、エンドグルカナーゼ及
びエキソグルカナーゼによるセルロース消化からの主要
産物である。本発明の生物により酵素は形成されない
が、pet遺伝子を染色体に組み込むことにより、発酵中
の副産物としてこれらの酵素を提供するために異種遺伝
子をコードするプラスミドを加え易くなる。選択のため
にテトラサイクリン耐性を加えた後、好熱菌であるClos
tridium thermocellumから４種のエンドグルカナーゼ
の発現を試験した（表18）。celD遺伝子は大腸菌中で非
常に高レベルで発現され、株P2で高レベルで発現され
た。これらの遺伝子から産生されたエンドグルカナーゼ
活性の大部分は細胞内に維持されたが、Klebsiella株は
タンパク質分泌系を有することが知られており、部分的
分泌の可能性はなくなった。
55℃で48時間インキュベーション中に培養管でCMCの
液化における効力の品質比較を行った。活性測定値によ
ると、celDを生息させる組換体（pCT603T）が最も有効
であり、celC（pCT301）がこれに続いた。celBを生息さ
せる株P2（pCT207T）はほとんど成長しなかったので、
それ以上試験しなかった。CelA（pCT105T）組換体はほ
とんど液化を生じなかった。
更に産生異種遺伝子産物が発酵性能に及ぼす効果を調
べた。cel遺伝子のいずれか１種を発現するプラスミド
を加えると、10％グルコース発酵中の最終細胞密度は10
〜30％減少し、エタノール収量は減少した（表18）。ce
lD遺伝子の発現は最も悪影響が少なく、エタノール収量
は0.32gエタノール/gグルコースであり、最大理論値の6
2％であった。ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビシ
ドを基質として使用して60℃でアッセイを行った。単位
は、細胞を含む発酵ブロス又は細胞を遠心分離により除
去した後のブロスml当たりの水解物μモル／分である。
celDを発現する株P2によるアモルファスセルロースの
加水分解及び発酵。celD遺伝子産物は結晶質セルロース
を加水分解しないが、この酵素はアモルファスセルロー
スを加水分解することが従来示されている（Ｂguin
ら,Joliffら，前出）。この遺伝子を発現する株P2（pCT
603T）がアモルファスセルロースをエタノールに変換す
る能力を試験した。エンドグルカナーゼＤ源として前の
グルコース発酵からのP2（pCT603T）の細胞及びエタノ
ールを産生するために同一生物を使用する２段階バッチ
プロセスでリン酸膨潤及び塩基膨潤（水酸化ナトリウ
ム）SOLKA FLOC SW40を試験した。
第１段階では、以前のグルコース発酵からの等容量か
ら回収した細胞を使用して、76mg/mlの酸膨潤セルロー
ス又は32mg/mlの塩基膨潤セルロースを含有するルリア
ブロス3mlを60℃（pH6.0）で72時間インキュベートし
た。60℃に加熱すると、細胞は失活してエンドグルカナ
ーゼＤを放出したので、この温度が活性のほぼ最適な温
度であった。加水分解中に還元等の放出を測定した。基
質濃度は異なるが、酸膨潤セルロースは塩基膨潤セルロ
ースの２倍の速度で加水分解され、24時間後に夫々240
μモル及び60μモル当量のセロビオースを産生した。酸
膨潤セルロースは非常に粘性になり、サンプリングが困
難になった。72時間後、塩基膨潤セルロースの消化物中
には110μモル当量のセロビオースが存在していた。こ
れらの収量は酸膨潤及び塩基膨潤セルロースの両方のほ
ぼ完全な加水分解を反映している。
図13A、Ｂ及びＣはP2（pCT603T）によるセルロース加
水分解及び発酵の薄層クロマトグラフィー分析を示す。
酸膨潤セルロース（図13A）、塩基膨潤セルロース（図1
3B）及び結晶質セルロース（図13C、SOLKA FLOC SW4
0）を試験した。セロビオース及びグルコースを各クロ
マトグラムのレーン１で標準として使用した。図13A及
びＢ中、レーン２〜６はアモルファスセルロースの加水
分解中に種々の時刻（夫々0,6,12,24,48及び72時間）に
取り出したサンプルを表し、レーン７は株P2（pCT603
T）で24時間30℃で発酵後にレーン６で分析したブロス
を表す。
図13Cは、１％ MULTIFECT及びC.thermocellum celD
を発現するP2（pCT603T）による結晶質セルロース（SOL
KA FLOC SW40）発酵の薄層クロマトグラフ分析を示
す。レーン構成は、２が消化直前のSOLKA FLOC懸濁
液、３が従来の発酵からのP2（pCT603T）により供給さ
れるエンドグルカナーゼＤで60℃で24時間消化後のブロ
ス、４がP2（pCT603T）により35℃で24時間発酵後のレ
ーン３に示されるブロス、５が35℃でP2（pCT603T）に
より更に24時間発酵後（合計発酵、48時間）のブロスを
示す。
即ち、図13A及び13Bのレーン２〜６は夫々酸膨潤及び
塩基膨潤セルロースからの種々の時刻におけるセルロー
ス消化産物を示す。セロビオースはどちらにおいても少
量のグルコースと共に主要な産物である。酸膨潤セロビ
オースの消化物中には低レベルのセロトリオースが存在
していた。35℃に冷却後、これらのブロスに50μｌのP2
（pCT603T）を接種し、撹拌又はpH制御せずに24時間発
酵させた。グルコース、セロビオース及びセロトリオー
スはこの間に完全に除去され（図13A＆Ｂ、レーン
７）、約5g/lのエタノールが産生された。塩基膨潤セル
ロースでは0.16gエタノール/gセルロースが産生され
た。pHの低下は恐らくエタノール産生の程度を制限する
のに役立ったと思われるが、このエタノール収量は理論
的最大値の27％に等価である。
C.thermocellumエンドグルカナーゼの内因性産生によ
る市販セルロースの部分的置換:P2（pCT603T）は外部か
ら付加されたβ−グルコシダーゼを必要とせず、アモル
ファスセルロースを加水分解するエンドグルカナーゼＤ
を提供し得るが、結晶質セルロースを加水分解するため
には付加的活性が必要である。この株が市販セルラーゼ
の要求を部分的に置換する能力を２段発酵プロセスで試
験した。従来のグルコース発酵から回収した細胞を、50
g/lのSOLKA FLOC SW40を含有する等量のルリアブロス
に再懸濁し、60℃で24時間インキュベートした。35℃に
冷却後、これらの発酵物に１％市販セルロースと共に同
一生物を接種した。CYTOLASE及びMULTIFECTの両方で同
様の結果が得られ、17.4g/lのエタノールが産生され、
最大理論収量の65％であった（表17）。
CYTOLASEについて図14に示すように、celD遺伝子産物
で前処理すると、１％セルラーゼを使用したエタノール
産生量は著しく増加し、５％CYTOLASEと同等のエタノー
ル収量が得られた。図14中、セルロース（50g SOLKA
FLOC SW40/リットル）はCYTOLASE及びエンドグルカナ
ーゼＤでは十分に糖化されず、株P2及びP2（pCT603T）
により発酵された。記号は△：接種時にブロス100ml当
たり5mlのCYTOLASEを加え、P2で発酵させた場合、□：
接種時にブロス100ml当たり1mlのCYTOLASEを加え、P2で
発酵させた場合、○：接種時にブロス100ml当たり0,1ml
のCYTOLASEを加え、P2で発酵させた場合、■:C.thermoc
ellumエンドグルカナーゼＤ源として以前の発酵から回
収したP2（pCT603T）を使用することによりSOLKA FLOC
を60℃で12時間予備消化し、発酵させた場合を表す。35
℃まで冷却後、1ml市販セルラーゼ/100ml発酵ブロスとP
2（pCT603T）とを加え、発酵を開始した。
図13Cは、MULTIFECTでの平行２段階発酵の異なる段階
からのサンプルの薄層クロマトグラムを示す。この場合
も同様に、グルコース、セロビオース及びセロトリオー
スは完全に代謝された。即ち、糖化に必要な市販セルラ
ーゼの量は、以前の発酵でエタノールとの副産物として
産生された組換エンドグルカナーゼＤで予備処理後に80
％まで減少した。
考察：β−グルコシダーゼによるセロビオースからモ
ノマー糖への加水分解は真菌ブロスによるセルロース消
化をしばしば制限することが知られている。β−グルコ
シダーゼの活性は典型的には、効率的なセルロース加水
分解に必要な酵素のうちで最少且つ最も低安定性であ
る。セルラーゼ作用の産物としてのセロビオースの蓄積
は、その後の解重合の競合的阻害剤として機能する（Er
ikssonら［1990］Microbial and enzymatic degrada
tion of wood and wood components.Springer−Ve
rlag,New York;Jeffries,前出）。K.oxytoca P2はセ
ロビオースを高レベルのエタノールに迅速且つ効率的に
変換することが報告された最初の生物である。
この生物はセロビオース及びセロトリオースを積極的
に輸送する能力を有しており、セロビオース蓄積を最小
限にし、外部酵素によるその後の解重合の必要をなくす
と考えられる。セロビオースの輸送系はK.oxytoca（Al
［1989］J.Biotechnol.12:79−86）では検討されていな
いが、密接に関連する生物である大腸菌は、ほとんどの
研究室株でまだ不明であるが、天然に機能するセロビオ
ース代謝のためのホスホトランスフェラーゼ成分及びホ
スホグルコシダーゼをコードする遺伝子を含んでいる
（HallらJ.Bacteriol.169:2713−2717;Krickerら［198
7］Genetics 115:419−429）。K.oxytocaでも類似の遺
伝子が機能すると予想される（Al,前出）。
エタノール産生のためのpet遺伝子を染色体に組み込
むことにより、エタノールとの副産物としてプラスミド
に担持された組換タンパク質を容易に製造することがで
きた。C.thermocellusからのセルラーゼ遺伝子を１例と
して使用したが、リパーゼ、プロテイナーゼ、グリコヒ
ドラーゼ、動物ホルモン及び生物医学産物のような他の
より有益な組換産物も使用できる。副産物としての株P2
によるC.thermocellusセルラーゼの産生は、発酵効率の
予期せぬ低下を伴った。この効率の低下の根拠はわかっ
ていないが、本発明者らはThermoanaerobium brockii
からのプルラナーゼ遺伝子を含むエタノール産生大腸菌
及びC.thermocellumキシラナーゼ遺伝子を発現するK.ox
ytocaの多重プラスミドエタノール産生構築物で同様の
観測をしている。
K.oxytocaを用いた以上の実施例は、セルロースをエ
タノールに変換するための改善方法の基本を形成するも
のである。セルビオース及びセロトリオースはエンドグ
ルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの阻害剤であり、β
−グルコシダーゼはオリゴマーをグルコースモノマーに
変換するのに関与することが知られている。一方、株P2
のようなエタノール産生組換体は代謝のために糖の解重
合を必要とせず、β−グルコシダーゼを必要とせず、セ
ロビオース及びセロトリオースによるセルラーゼの終産
物阻害が低下する。更に、モノマーグルコースに比較し
て少数の生物しかセロビオース又はセロトリオースを代
謝することができないので、主要汚染物質が減少すると
いう利点もある。セロビオース利用を欠損する大腸菌KO
11に比較すると、K.oxytoca P2により示されるセロビ
オースの輸送及び代謝は、セルロース発酵中の市販酵素
の要求を減少させた。
市販セルラーゼの要求は、発酵中に副産物として産生
される付加的なエンドグルカナーゼを使用することによ
り更に減少した。この点で、熱安定酵素は発酵後に細胞
内で容易に回収することができ、最良に機能する温度に
加熱するだけで活性形態で放出され得るので、特に有用
であると考えられる。SOLKA FLOC SW40を以前の発酵
からのエンドグルカナーゼＤで前処理すると、Genencor
セルラーゼの効力は著しく増加した。エンドグルカナー
ゼＤはセルロースのアモルファス領域のみで活性である
ので（Ｂguinら、前出）、この前処理の有益な効果は
市販セルラーゼによる新しい攻撃部位の形成に起因し得
る。C.thermocellusにおいて、エンドグルカナーゼＤは
セルラーゼ複合体の一部である（Ｂguinら、前出）。
この酵素は同様に真菌酵素と複合又はセルロースと結合
し、加水分解のためのセルロース構造の開放を容易にす
ると予想される。
エタノールへのセルロース発酵のための最良の構築物
であるP2（pCT603T）は天然のC.thermocellumほど有効
ではない（Tailliezら［1989］Appl.Environ.Microbio
l.55:203−211）。C.thermocellumと異なり、K.oxytoca
P2（pCT603T）は完全なセルラーゼ系を欠損する。一
方、１％市販CYTOLASE又はMULTIFECTと組み合わせる
と、P2（pCT603）は65℃のエタノール耐性C.thermocell
um突然変異株よりも35℃で高収量及び高最終濃度のエタ
ノールを産生した。更に遺伝子改善又はプロセス改善が
望ましい。
実施例19 エタノール産生のために染色体に組み込まれ
たZ.mobilis遺伝子及び糖化のための熱安定遺伝子を発
現するプラスミドを含む組換大腸菌による澱粉からのエ
タノール産生 実施例の要約：細胞内産物として澱粉糖化のための熱
安定酵素を発現し得る大腸菌のエタノール産生株が開発
された。これらの酵素は発酵の終わりに細胞内で回収す
ることができ、最大活性を示す温度（60〜70℃）に加熱
することにより遊離され得る。このような生物は副産物
として少量のエタノールを産生しながら酵母をベースと
する発酵のための酵素を供給するために使用することが
できた。
本実施例では、熱安定α−アミラーゼ及びプルナラー
ゼをコードする遺伝子を発現するエタノール産生株を細
胞内産物として開発することにより、大腸菌におけるタ
ンパク質分泌系の不在を利用する。熱安定酵素は発酵の
終わりに細胞内で回収され、単にこれらの酵素がほぼ最
適な活性を示す温度に加熱するだけで澱粉糖化のために
放出される。
生物及び成長条件：全エタノール発酵は大腸菌株KO11
を使用して炭水化物を加えたルリアブロス中で実施した
（Ohtaら1991）。この株に指定通りにプラスミドを加え
た。
プラスミド構築：標準方法を使用してBacillus stea
rothermophilus（Mielenzら［1985］米国特許第4493893
号）からのα−アミラーゼ遺伝子及びThermoanaerobium
brockii（Colemanら［1986］米国特許第4612287号、C
olemanら［1987］J.Bacteriol.169:4302−4307）からの
プラナーゼ遺伝子を含む２種のプラスミドpLOI140及びp
LOI141（図15A及びＢ）を構築した。部分的消化後、ア
ミラーゼ遺伝子を含むpWL625Amy（ATCC31,791）からの
5.4kbp Hind IIIフラグメントをpCPC902（Colemanら
［1986］前出）のHind III部位に挿入した。澱粉及びプ
ルランレッドを含むルリア寒天上で構築物を比較した
処、どちらの遺伝子もただ１つの部位に挿入した場合に
高レベルの発現を維持できることが判明した（pLOI56
8）。EcoR Iで部分的消化後、テトラサイクリン遺伝子
を含むpCOS2EMBL（Poustkaら［1984］Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 81:4129−4133）からの2.5kbp EcoR Iフラグ
メントをpLOI568に加え、pLOI140及びpLOI141を生成し
た。最終プラスミドはpBR322レプリコンを含んでおり、
株KO11中で非常に安定しており、抗生物質選択なしに48
世代後に細胞の96％により維持された。
図15A及びＢは以下の略号を使用している。amy:Bacil
lus stearothermophilusα−アミラーゼをコードする
遺伝子、pul:Thermoanaerobium brockiiプルラナーゼ
をコードする遺伝子、tet:テトラサイクリン耐性遺伝
子、amp:アンピシリン耐性遺伝子、ori:colE1レプリコ
ンである。
発酵及び分析：ほぼ従来の記載（Beallら、前出）に
従ってpHスタット（350ml操作容量）として500ml容Flea
ker中で発酵を実施した。培地は、10％グルコース、５
％グルコース、10％マルトース、５％マルトース又は4.
5％澱粉を含有するルリアブロス（30℃、pH6.0、100rp
m）から構成した。発酵物を初期細胞密度0.03mg乾燥重
量/mlまで接種した。糖を別々に過滅菌した。澱粉は
滅菌しなかった。
細胞質量をO.D.550nm（１ O.D.で約0.32g細胞乾燥重
量／リットル）として測定した。合計糖化活性は還元糖
の放出として60℃で測定した（Bergmeyerら、前出）。
エタノールはガス液体クロマトグラフィーにより決定し
た（Dombekら、前出）。エタノール濃度はg/リットルと
して表した。エタノール収量は発酵中に塩基を加えるこ
とにより希釈に関して補正し、未使用炭水化物について
補正なしの合計糖又は澱粉に基づいて計算した。発酵か
らの最大理論収量は約0.51gエタノール/gグルコース、
0.53gエタノール/gマルトース、及び0.56gエタノール/g
澱粉であった。結果は２回以上の発酵の平均を使用し
た。
澱粉の発酵：澱粉発酵のために、KO11（pLOI140）又
はKO11（pLOI141）細胞を72時間後に10％グルコース前
発酵から回収し、凍結保存した。これらの細胞をpH6.0
に調整したルリアブロス25mlに再懸濁した。澱粉（15.7
5g）をpH6.0に調整したルリアブロス325mlに懸濁した。
細胞懸濁液の２分の１を澱粉懸濁液に加え、70℃に達す
るまで撹拌下に煮沸水浴中でインキュベートし、70℃に
５分間保持した。この混合物を60℃に冷却した。残りの
細胞を加え、24時間60℃でインキュベーションを続け
た。加熱により組換大腸菌は失活し、澱粉加水分解のた
めの熱安定酵素を放出した。糖化澱粉を30℃に冷却し、
滅菌蒸留水で容量350mlに調整した。
接種材料を５％グルコース中で一晩成長させ、遠心分
離により回収し、発酵を開始するために使用した（0.03
g細胞乾燥重量の生存細胞／リットル）。サンプルを取
り出し、エタノール決定及び薄層クロマトグラフィー分
析した。
未活化Whatmanシリカゲル150Aプレート（Whatman In
c.,Clifton,New Jersey）を使用することにより、グル
コース、マルトース、マルトトリオース及びマルトテト
ロースを分離した。５〜50μｇ糖を含有する１μｌのサ
ンプルを加え、アセトン、酢酸エチル及び酢酸（夫々2:
1:1）に使用直前に２％水を加えて１回展開させること
により室温で分離した。乾燥プレートをBounias［198
0］Anal.Biochem.106:291−295により記載されているよ
うに染色した。澱粉及び糖はSigma Chemical Compan
y,St.Louis,Mo.から入手した。
大腸菌の組換株によるグルコース及びマルトースの発
酵:KO11によるグルコース及びマルトースの発酵を試験
した。図16A及びＢは結果をグラフにより示すものであ
り、夫々エタノール産生及び細胞量を表している。図面
で使用した記号は、●：株KO11と10％グルコース、△：
株KO11（pLOI140）と10％グルコース、□：株KO11（pLO
I141）と10％グルコース、○：株KO11と５％マルトース
の組み合わせを表す（５％及び10％マルトースの結果は
同一であった）。
大腸菌によるマルトースの利用は好気性培養で十分に
研究されているが、マルトースからの成長及びエタノー
ル産生はグルコースからよりも著しく時間がかかり、10
％マルトースからの最大理論収量（53.5gエタノール／
リットル）の25％未満、５％マルトースからの最大リッ
トル収量（26.8gエタノール／リットル）の50％未満で
ある。２種の濃度のマルトースで類似の結果が得られた
ので、成長及び発酵が遅いのは直接マルトース毒性に起
因するとは考えられない。グルコースに比較してマルト
ース発酵が遅いのは、糖輸送、グルコースリン酸化等の
ような他の制約によるものと考えられる。
図16A及びＢから明らかなように、α−アミラーゼ及
びプルラナーゼをコードするプラスミドpLOI140及びpLO
I141を大腸菌KO11に加えると、成長及びグルコースから
のエタノール産生速度は減少した。72時間後の最終細胞
収量及びエタノール収量は約1/3減少した。
糖化のための酵素の発現：ルリアブロス（pH6.0）中
のジャガイモ澱粉の懸濁液を基質（70℃）として使用し
て還元糖の放出として発酵の終わり（72時間）にKO11
（pLOI140）及びKO11（pLOI141）により産生される合計
糖化活性を測定した。両方の株で類似の活性が観察さ
れ、30μモル還元糖/ml培養物／分であった。この活性
の90％以上が細胞内であったが、70℃に加熱すると容易
に放出された。
澱粉の発酵：糖化及びエタノール産生のための酵素が
単一生物を必要とする２段階プロセスでKO11（pLOI14
0）及びKO11（pLOI141）を試験した。10％グルコースの
存在下での前発酵から細胞を回収し、再懸濁し、酵素源
として使用し、等量の冷温4.5％澱粉懸濁液（ルリアブ
ロス、pH6.0）を加水分解した。回収した細胞の２分の
１を加え、混合物を約５分間水浴中で迅速に70℃に加熱
した。この混合物を60℃にし、細胞の残りを加えて加水
分解し易くした。トウモロコシ、ジャガイモ、コメ及び
コムギ澱粉を試験し、いずれも同様の結果を得た。澱粉
遺伝子を欠失するKO11を使用した対照は３分間以内の加
熱で完全に凝固したが、澱粉懸濁液は加熱及び加水分解
しても液体のままであった。
24時間60℃でインキュベーション後、加水分解した澱
粉を含有するルリアブロスを30℃に冷却し、従来の記載
（Bealら,1991,前出）に従って接種し、発酵を開始した
（pH6.0,100rpm,接種材料0.03g細胞乾燥重量／リット
ル）。全種の澱粉から類似の速度でエタノールが産生さ
れ、最初の24時間の間、0.26〜0.28gエタノール／リッ
トルであった。0.56gエタノール/g澱粉の理論的最大値
に比較して、最終エタノール収量は0.35〜0.37エタノー
ル/g澱粉であった。澱粉発酵の結果を図17に示す。
KO11（pLOI140）及びKO11（pLOI141）のデータはほぼ
同一であったので、KO11（pLOI141）のデータのみを図1
7に示す。図17で使用した記号は、△：トウモロコシ澱
粉（Ｓ−4126）、□：ジャガイモ澱粉（Ｓ−2004）、
○：コメ澱粉（Ｓ−7260）、▲：コムギ澱粉（Ｓ−512
7）、■：トウモロコシ澱粉＋2mM CaCl2、●：対照と
してKO11＋５％グルコースを表す。
トウモロコシ澱粉を使用したこの２段階プロセスの種
々の段階でサンプルを取り出し、薄層クロマトグラフィ
ーにより分析した（図18）。24時間後に、グルコース、
マルトース、マルトトリオース、マルトテトロース及び
それ以上の長さのオリゴ糖が加水分解産物として出現し
た。グルコース、マルトース及びマルトトリオースは発
酵中（72時間）にKO11（pLOI141）により利用された。
図18は、トウモロコシ澱粉発酵の薄層クロマトグラフ
ィー分析を示す。マルトース及びグルコースを標準とし
て使用した。グルコース〜マルトテトロースを夫々G1〜
G4で示す。レーンは、1:標準としてのグルコース及びマ
ルトース、2:60℃で24時間糖化後のブロス、3:72時間発
酵後のレーン２のブロスを表す。
澱粉分解酵素はカルシウムイオンの存在により安定化
されることが多い。2mM塩化カルシウムを含有するルリ
アブロス中でトウモロコシ澱粉を使用して発酵実験を行
った処、やや速い発酵と高収量が得られ、夫々0.29エタ
ノール／リットル／時及び0.40gエタノール/g澱粉であ
った。酵母及び酵素を使用する従来の澱粉発酵に比較す
ると、組換大腸菌発酵は時間がかかり、産生される最終
エタノール濃度は低かった。単一生物でこの２段階プロ
セスを使用した際に得られる澱粉からの全体エタノール
収量は、酵母と付加的な酵素を使用する現行の商用プロ
セスの85％（約0.47gエタノール/g澱粉）であった。
結論：更に改善することが望ましいが、本実施例は組
換大腸菌によるエタノール産生発酵を使用して澱粉糖化
に必要な酵素の一部を製造できることを立証している。
酵素製造は極めて簡単であり、曝気の必要がない。熱安
定細菌酵素は大腸菌に基づく発酵と同一のpH（約6.0）
で最適に機能する。これらの生物を使用すると、トウモ
ロコシ皮のような低価値材料中の残留澱粉を基質として
使用し、コーンスティープリカーを複合栄養源として使
用することができる。このようなプロセスは糖化に必要
な酵素のコストを削減し、トウモロコシからのエタノー
ル収量を増加することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:22 (Ｃ１２Ｎ 1/21 1:64 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 イングラム，ロニー・オー アメリカ合衆国、フロリダ・32606、ゲ インズビル、ノース・ウエスト・フイフ テイセブンス・テラス・3132 (72)発明者 ビール，デイビツド・エス アメリカ合衆国、フロリダ・32601、ゲ インズビル、サウス・ウエスト・トウエ ンテイース・プレイス・1101 (72)発明者 バーチヤート，ガーハード・エフ・エイ チ アメリカ合衆国、フロリダ・32605、ゲ インズビル、ノース・ウエスト・トウエ ンテイサード・ブールバード・2701、ア パートメント・78 (72)発明者 ギマレイアス，ワルター・ブイ アメリカ合衆国、フロリダ・32611、ゲ インズビル、グリンター・ホール・223 (72)発明者 オオタ，カズヨシ アメリカ合衆国、フロリダ・32611、ゲ インズビル、グリンター・ホール・223 (72)発明者 ウツド，ブレント・イー アメリカ合衆国、フロリダ・32601、ゲ インズビル、ノース・ウエスト・13・ア ベニユー・301、アパートメント・５ (72)発明者 シヤンムガム，キールネイサム・テイー アメリカ合衆国、フロリダ・32605、ゲ インズビル、ノース・ウエスト・フオー テイセブンス・プレイス・3215 (72)発明者 フオウラー，デイビツド・イー アメリカ合衆国、フロリダ・32608、ゲ インズビル、サウス・ウエスト・フイフ テイシツクスス・レイン・1708 (72)発明者 ベン−バツサト，アリー アメリカ合衆国、フロリダ・32606、ゲ インズビル、ノース・ウエスト シツク ステイセブンス・プレイス・1901 (56)参考文献 国際公開90／002193（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/21 C12N 1/19 C12N 15/00 - 15/90 C12P 7/06 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (65)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸
    デカルボキシラーゼ及び１種類のポリサッカラーゼもし
    くは複数種のポリサッカラーゼの組合せをコードする異
    種DNAを含む組換え宿主であって、前記異種DNAを、該宿
    主の一次発酵産物としてのエタノール産生を促進するの
    に十分なレベルで発現する組換え宿主。
  2. 【請求項２】細菌、真菌類及び真核細胞からなる群から
    選択される請求項１に記載の組換え宿主。
  3. 【請求項３】グラム陰性菌からなる群から選択される請
    求項２に記載の組換え宿主。
  4. 【請求項４】腸内細菌からなる群から選択される請求項
    ３に記載の組換え宿主。
  5. 【請求項５】Erwinia、Klebsiella及びXanthomonasから
    なる群から選択される請求項３に記載の組換え宿主。
  6. 【請求項６】Erwinia及びKlebsiellaからなる群から選
    択される請求項５に記載の組換え宿主。
  7. 【請求項７】1991年３月14日付け寄託のATCC68564のKle
    bsiella oxytoca M5A1（pLOI555）のエタノール産生
    特性を有する請求項６に記載の組換え宿主。
  8. 【請求項８】アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸
    デカルボキシラーゼ及び１種類のポリサッカラーゼもし
    くは複数種のポリサッカラーゼの組合せをコードする遺
    伝子を含むプラスミドであって、宿主細胞を、該宿主の
    一次発酵産物としてのエタノール産生を促進するのに十
    分なレベルでアルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸
    デカルボキシラーゼ及び１種類もしくは複数種のポリサ
    ッカラーゼを産生させるべく誘導し得るプラスミド。
  9. 【請求項９】アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン
    酸デカルボキシラーゼをコードするZymomonas mobilis
    遺伝子を含む請求項８に記載のプラスミド。
  10. 【請求項１０】更に、アルコールデヒドロゲナーゼ及び
    ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする前記遺伝子
    の発現を誘導するlacプロモーターを含む請求項８に記
    載のプラスミド。
  11. 【請求項１１】pLOI555と称される請求項８に記載のプ
    ラスミド。
  12. 【請求項１２】請求項８に記載のプラスミドを含む請求
    項１に記載の組換え宿主。
  13. 【請求項１３】宿主を含む細胞の培養による発酵を含む
    エタノールの製造方法であって、該宿主が、ピルビン酸
    デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び
    １種類のポリサッカラーゼもしくは複数種のポリサッカ
    ラーゼの組合せをコードする異種DNAを含み、該宿主が
    一次発酵産物としてエタノールを産生するように十分な
    レベルで該宿主が該異種DNAを発現することを特徴とす
    る前記製造方法。
  14. 【請求項１４】前記宿主が、細菌、真菌類及び真核細胞
    からなる群から選択される請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記宿主がグラム陰性菌である請求項13
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記宿主が、Erwinia、Klebsiella及びX
    anthomonasからなる群から選択される請求項15に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】前記宿主が腸内細菌である請求項13に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】前記宿主が、Erwinia及びKlebsiellaか
    らなる群から選択される請求項13に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記組換え宿主が、1991年３月14日付け
    寄託のATCC68564のKlebsiella oxytoca M5A1（pLOI55
    5）のエタノール産生特性を有する請求項17に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】細胞の増殖培地中における酸性代謝産物
    の蓄積を低下させる方法であって、前記細胞を、ピルビ
    ン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ
    及び１種類のポリサッカラーゼもしくは複数種のポリサ
    ッカラーゼの組合せをコードする異種DNAを用いて形質
    転換することを包含し、前記細胞が前記異種DNAを、該
    細胞の一次発酵産物としてのエタノールの産生を促進
    し、それにより増殖倍地中における酸性代謝産物の蓄積
    を低下させるのに十分なレベルで発現する方法。
  21. 【請求項２１】請求項１に記載の組換え宿主であって、
    前記ポリサッカラーゼにより該宿主が、２以上の単糖類
    から成る複合オリゴ糖をより小さなオリゴ糖および／ま
    たは単糖類に分解し得ることを特徴とする前記組換え宿
    主。
  22. 【請求項２２】前記宿主が、細菌及び酵母からなる群か
    ら選択される請求項21に記載の組換え宿主。
  23. 【請求項２３】前記宿主が、グラム陰性菌である請求項
    22に記載の組換え宿主。
  24. 【請求項２４】前記宿主が腸内細菌である請求項22に記
    載の組換え宿主。
  25. 【請求項２５】前記宿主が、Erwinia及びKlebsiellaか
    らなる群から選択される請求項24に記載の組換え宿主。
  26. 【請求項２６】1991年３月14日付け寄託のATCC68564のK
    lebsiella oxytoca M5A1（pLOI555）のエタノール産
    生特性を有する請求項25に記載の組換え宿主。
  27. 【請求項２７】前記オリゴ糖が、セロビオース、マルト
    ビオース、キシロビオース、三糖類および長鎖多糖類か
    らなる群から選択される請求項21に記載の組換え宿主。
  28. 【請求項２８】前記オリゴ糖が、C5及びC6単糖類からな
    る群から選択される単糖類を含む請求項27に記載の組換
    え宿主。
  29. 【請求項２９】前記オリゴ糖が、グルコース及びキシロ
    ースからなる群から選択される請求項28に記載の組換え
    宿主。
  30. 【請求項３０】前記オリゴ糖がダイマー及びトリマーか
    ら成る群より選択される請求項29に記載の組換え宿主。
  31. 【請求項３１】前記三糖類が、セロトリオース及びキシ
    ロトリオースから成る群より選択される請求項27に記載
    の組換え宿主。
  32. 【請求項３２】前記ポリサッカラーゼが、セルロース分
    解酵素、キシラン分解酵素、ヘミセルロース分解酵素及
    び澱粉分解酵素からなる群から選択される請求項１に記
    載の組換え宿主。
  33. 【請求項３３】前記ポリサッカラーゼが、エンドグルカ
    ナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、
    エンド−1,4−β−キシラナーゼ、β−キシロシダー
    ゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシ
    ダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエス
    テラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコア
    ミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセル
    ラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒ
    ドロラーゼ及びペクテートリアーゼからなる群から選択
    される請求項１に記載の組換え宿主。
  34. 【請求項３４】前記ポリサッカラーゼが、celD、xynZ、
    xylB、α−アミラーゼ遺伝子及びプルラナーゼ遺伝子か
    らなる群から選択される遺伝子の発現産物である請求項
    33に記載の組換え宿主。
  35. 【請求項３５】前記celD及びxynZ遺伝子がClostridium
    thermocellum由来であり、前記xylB遺伝子がBacillus
    fibrisolvens由来であり、前記α−アミラーゼ遺伝子
    がBacillus stearothermophilus由来であり、前記プル
    ラナーゼ遺伝子がThermoanaerobium brockii由来であ
    る請求項34に記載の組換え宿主。
  36. 【請求項３６】前記ポリサッカラーゼが、Cellulomonas
    fimiのセルラーゼ遺伝子の発現産物を含み、前記宿主
    が前記ポリサッカラーゼの少なくとも一部を分泌する請
    求項32に記載の組換え宿主。
  37. 【請求項３７】その発現産物が、グルコースを該宿主中
    に輸送することに関与するタンパク質である異種DNAセ
    グメントを更に含む請求項32から35のいずれか一項に記
    載の組換え宿主。
  38. 【請求項３８】前記ポリサッカラーゼが前記宿主によっ
    て少なくとも一部は分泌される請求項32から35のいずれ
    か一項に記載の組換え宿主。
  39. 【請求項３９】前記ポリサッカラーゼが該宿主中に実質
    的に蓄積される請求項32から35のいずれか一項に記載の
    組換え宿主。
  40. 【請求項４０】前記ポリサッカラーゼが熱安定性酵素で
    ある請求項39に記載の組換え宿主。
  41. 【請求項４１】その発現産物が、該宿主によって少なく
    とも一部は分泌される別のポリサッカラーゼである別の
    異種DNAセグメントを更に含む請求項39に記載の組換え
    宿主。
  42. 【請求項４２】前記別のポリサッカラーゼが、Cellulom
    onas fimiのセルラーゼ遺伝子の発現産物を含む請求項
    41に記載の組換え宿主。
  43. 【請求項４３】更に該宿主にとって内因性であるポリサ
    ッカラーゼを産生する請求項１に記載の組換え宿主。
  44. 【請求項４４】前記長鎖多糖類がセルロース、ヘミセル
    ロース、澱粉、グリコーゲン、ペクチン及びインシュリ
    ンから成る群より選択される請求項27に記載の組換え宿
    主。
  45. 【請求項４５】オリゴ糖原料を処理する方法であって、 （Ａ）出発オリゴ糖を含む原料を提供するステップ、及
    び （Ｂ）前記原料を、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピ
    ルビン酸デカルボキシラーゼをそれぞれコードする第１
    の異種DNAを含む組換え宿主によって発現される酵素と
    接触させるステップを含み、前記宿主が、 （Ａ）更に、セロビオース、マルトビオース、キシロビ
    オース、三糖類及び長鎖多糖類から成る群より選択され
    た出発オリゴ糖をより小さなオリゴ糖及び／又は単糖類
    に分解する酵素をコードする第２の異種DNAを含み、 （Ｂ）前記オリゴ糖の代謝から該宿主が一次発酵産物と
    してエタノールを産生し、かつ、前記出発オリゴ糖が該
    酵素の作用を受けるようなレベルで、前記異種DNAを発
    現することを特徴とする前記処理方法。
  46. 【請求項４６】前記出発オリゴ糖がエタノールに発酵さ
    れる請求項45に記載の方法。
  47. 【請求項４７】前記出発オリゴ糖が二糖類または三糖類
    を含む請求項46に記載の方法。
  48. 【請求項４８】前記宿主が、細菌及び酵母からなる群か
    ら選択される請求項45に記載の方法。
  49. 【請求項４９】前記酵素がポリサッカラーゼであり、前
    記出発オリゴ糖が、前記ポリサッカラーゼによってより
    単純なオリゴ糖及び／または単糖類に変換される請求項
    45に記載の方法。
  50. 【請求項５０】前記出発オリゴ糖が二糖類または三糖類
    を含む請求項49に記載の方法。
  51. 【請求項５１】前記出発オリゴ糖が、セルロース、ヘミ
    セルロース及び澱粉からなる群から選択される不溶性オ
    リゴ糖である請求項49に記載の方法。
  52. 【請求項５２】前記組換え宿主が請求項32から36または
    43のいずれか一項に記載のものである請求項51に記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】前記組換え宿主が請求項32から36または
    43のいずれか一項に記載のものである請求項49に記載の
    方法。
  54. 【請求項５４】前記細胞を加熱して溶解し、前記酵素の
    放出を誘導することを更に含む請求項45に記載の方法。
  55. 【請求項５５】前記出発オリゴ糖及び／または前記のよ
    り単純なオリゴ糖がエタノールに発酵される請求項49に
    記載の方法。
  56. 【請求項５６】前記アルコールデヒドロゲナーゼコーデ
    ィングDNAを前記宿主中で過剰発現させ、それにより宿
    主による機能的タンパク質の産生を亢進することを特徴
    とする請求項13又は45に記載の方法。
  57. 【請求項５７】前記アルコールデヒドロゲナーゼコーデ
    ィングDNAが、Zymomonas mobilis由来のadhB遺伝子で
    ある請求項56に記載の方法。
  58. 【請求項５８】オリゴ糖含有バイオマスからエタノール
    を製造する方法であって、 A.第１反応器において、該バイオマス中のオリゴ糖がよ
    り単純なオリゴ糖及び／または単糖類に分解されるよう
    に温度約50℃〜約60℃及びpH約4.5〜約5.0で該バイオマ
    スをポリサッカラーゼと接触させるステップ、 B.前記第１反応器から、前記のより単純なオリゴ糖及び
    ／または単糖を含む糖溶液を製造するステップ、 C.前記糖溶液を、前記のより単純なオリゴ糖及び／また
    は単糖をエタノールに発酵し得る請求項１に記載の組換
    え宿主を含む発酵器内に導入するステップ、及び D.前記のより単純なオリゴ糖及び／または単糖類をエタ
    ノールに、温度約30℃〜約35℃及びpH約6.0で発酵させ
    るステップ を包含する方法。
  59. 【請求項５９】前記発酵器から第１の流れを取り出し、
    それを、前記第１反応器から取り出した前記のより単純
    なオリゴ糖及び／または単糖類を含む第２の流れを冷却
    するために使用する請求項58に記載の方法。
  60. 【請求項６０】前記第２の流れを冷却した後に、前記第
    １の流れを前記第１反応器に導入する請求項59に記載の
    方法。
  61. 【請求項６１】前記宿主が、マルトビオース、キシロビ
    オース、三糖類及び長鎖多糖類を代謝する請求項45に記
    載の方法。
  62. 【請求項６２】前記宿主が、その発現産物がグルコース
    を該宿主中に輸送することに関与するタンパク質である
    第３の異種DNAセグメントを含む請求項45に記載の方
    法。
  63. 【請求項６３】前記宿主が、その発現産物が前記ポリサ
    ッカラーゼである第２の異種DNAセグメントを含む請求
    項49に記載の方法。
  64. 【請求項６４】前記宿主がEscherichia coliでない請
    求項21に記載の組換え宿主。
  65. 【請求項６５】前記宿主がEscherichia coliでない請
    求項45に記載の方法。
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