JP3474882B2

JP3474882B2 - 植物のリン酸トランスポーター遺伝子及び該遺伝子を用いた植物の成長を制御する方法

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Publication number: JP3474882B2
Application number: JP53424197A
Authority: JP
Inventors: 典宏光川; 暁奥村; 由美子白野; 大輔柴田
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc; Toyota Motor Corp; Oji Paper Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; New Oji Paper Co Ltd; Toyota Motor Corp
Priority date: 1996-03-25
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2003-12-08
Anticipated expiration: 2017-03-24
Also published as: WO1997035984A1; AU1945097A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、遺伝子工学の分野に関する。特に遺伝子工
学を用いた有用な形質転換植物の作出に関する。

背景技術植物の成長、例えば、発芽、花芽形成、開花などは、
日照時間、ホルモン条件、温度、栄養条件など様々な環
境要因の下に制御されているといえる。従って、これら
の環境要因を調節することにより植物の成長を調節する
ことが可能であり、このような考えを基に、これまで様
々な技術が考えられてきた。

例えば、日照時間を調節するものとして、キク、カラ
ンコエ等の短日植物に対し、日没後や夜半に照明を与え
て開花を抑制する技術や、ストック等の長日植物を被覆
して光を遮り、開花を促進する技術が花卉栽培において
実施されている。また、温度条件を調節するものとし
て、低温処理により、開花時期を早めることがユリやチ
ューリップ等に適用されてきた。さらに、ホルモン条件
を調節するものとして、長日植物にジベレリン処理によ
る開花促進が実用化され、（以上、花卉栽培と経営、養
賢堂、横木清太郎、渡部弘共著、（昭和42年））、ジベ
レリン生合成阻害剤の投与は成長抑制に効果があり、同
時に植物の光合成速度が向上することが知られている
（関本均ら、日本土壌肥料学雑誌、66（1995）681−68
2））。しかし、いずれも適用可能な植物種が限られた
り、実施に労力、資材等のコストが必要であるなどの欠
点があった。また、花卉、園芸作物を対象とする技術で
あるために、大規模な農地、森林等での適用が事実上不
可能である。

栄養条件を調節するものとしては、一般には、窒素肥
料を過剰に施肥することにより、開花が抑制されたり、
窒素欠乏時に窒素を投与することで開花を促進すること
が知られているが（Walter R.,園芸植物の開花生理と栽
培，誠文堂新光社（1978））、シロイヌナズナでは全養
分の投与量を減少させることにより開花が遅延するとの
報告（Myerscough P.J.,et al.,72（1973）595−617）
もあり、養分と開花時期に一般則は成立しないと考えら
れる。

また、近年の遺伝子工学技術の発展に伴い、植物に遺
伝子導入を行い、植物の形質を転換することにより、植
物の生長を制御することも僅かながら報告されている。

例えば、タバコを西洋わさび（horseradish）のペル
オキシターゼで形質転換することにより、タバコの成長
速度を向上させ、ひいてはタバコの開花時期を早めるこ
とが行われている（Yosida K.et al.Abstracts 6th Int
ernational Meeting on Arabidopsis Research,（199
5）p.337）。しかし、シロイヌナズナ（Arabidopsis th
aliana）のペルオキシターゼで形質転換した場合には、
同様の結果は得られないなど、その応用範囲は狭いもの
となっている。

一方、原形質膜に局在する無機リン酸の輸送タンパク
質の遺伝子が、酵母（Bun−ya M.et al.Mol.Cell.Biol.
11,3229−3238（1991））、アカパンカビ（Versaw W.K.
Gene 153,135−139（1995））、VA菌根菌（Harrison M.
J.et al.Nature,378,626−629（1995））で単離され、
遺伝子産物の機能が確認された。さらに、酵母無機リン
酸トランスポーターとアミノ酸配列で相同性を示す部分
cDNAが、イネ（GenBank D25132およびD25087）とシロイ
ヌナズナ（GenBank Z33763）で単離され、ジャガイモか
らはcDNAが単離された（Leggewie G.et al.Abstracts o
f 10th International Workshop on Plant Membrane Bi
ology（1995）p.R32）。

しかし、植物においてリン酸輸送タンパク質遺伝子の
構造は明らかになっておらず、また単離されたcDNAがコ
ードするタンパク質の機能は確認されていない。

発明の開示リン酸は植物にとって重要な栄養素であり植物の成長
と密接に関与しているため、該遺伝子を単離してその構
造を解明することは、植物の成長を制御する技術を確立
する上で重要なステップとなると考えられる。さらに、
該遺伝子を植物へ導入し植物内で発現させることが可能
となれば、植物の成長を制御する上で重要な技術となる
といえる。

そこで本発明は、新規なリン酸輸送タンパク質遺伝子
を単離し、その構造を解明することを課題とする。ま
た、本発明は、該遺伝子を植物へ導入して植物のリン酸
吸収能を向上させ、これにより植物の生長量を増大させ
ることを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行っ
た結果、シロイヌナズナからリン酸の輸送タンパク質の
遺伝子を単離することに成功し、さらに構造を解明する
ことに成功した。

さらに本発明者らは、該遺伝子を高発現ベクターに組
み込み、タバコの培養細胞への形質転換を行うことによ
り、形質転換されたタバコ培養細胞のリン酸吸収能を顕
著に高め、さらに生長量を増大させることに成功した。

即ち、本発明は、（１）植物由来の、細胞内外の能動的に作られた水素
イオン濃度勾配を利用して、リン酸を細胞外から細胞内
へ輸送する機能を有するタンパク質をコードするDNA、（２）配列番号:9〜13のいずれかに記載されたタンパ
ク質、または該タンパク質のアミノ酸配列の一部が欠
失、置換または他のアミノ酸の挿入などによって変異し
たタンパク質であって細胞内外の能動的に作られた水素
イオン濃度勾配を利用して、リン酸を細胞外から細胞内
へ輸送する機能を有するタンパク質をコードするDNA、（３）シロイヌナズナに由来するタンパク質をコード
する（１）または（２）に記載のDNA、（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAを含む
ベクター、（５）（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAが導入
された植物細胞、（６）配列番号:9〜13のいずれかに記載されたタンパ
ク質、または該タンパク質のアミノ酸配列の一部が欠
失、置換または他のアミノ酸の挿入などによって変異し
たタンパク質であって細胞内外の能動的に作られた水素
イオン濃度勾配を利用して、リン酸を細胞外から細胞内
へ輸送する機能を有するタンパク質。

（７）（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAが導入
された細胞を含む植物、（８）（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAを細胞
に導入し、形質転換された細胞から植物体を製造する工
程を含む、形質転換植物の製造方法、（９）（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAを植物
細胞に導入することを含む、植物または植物細胞におい
てリン酸の取り込みを促進する方法、に関する。

なお、配列番号:9にはIPT1のアミノ酸配列が、配列番
号:10にはIPT4のアミノ酸配列が、配列番号:11にはIPT3
のアミノ酸配列が、配列番号:12にはIPT2のアミノ酸配
列が、配列番号:13にはIPT5のアミノ酸配列がそれぞれ
記載されている。

以下に説明されているDNAの切断、連結、大腸菌の形
質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーショ
ン等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用
する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書
や、実験書（例えば「Molecular cloning（Maniatis T.
et al.Cold Spring Harbor Laboratory Press）」参
照）の記載に従って行うことができる。

＜１＞リン酸トランスポーター遺伝子の単離・同定本発明のDNA（例えば、cDNAおよびゲノムDNAなど）
は、例えば、リン酸トランスポーターをコードする塩基
配列またはリン酸トランスポーターの推定アミノ酸配列
（例えば、配列番号:1〜６に記載の塩基配列または配列
番号:9〜13に記載のアミノ酸配列）に基づいて作製し
た、一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR
法、あるいは前記配列またはアミノ酸配列を基に作製し
たオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼ
ーション法により、植物細胞、例えばシロイヌナズナの
植物組織から単離することが可能である。

また、以下の方法により調製することも可能である。
例えば、リン酸を過剰に投与していない発芽後２週間目
のシロイヌナズナ植物体からmRNAを抽出し、逆転写酵素
を用いてcDNAを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本
鎖化したものを、市販のベクターに挿入し、大腸菌を形
質転換することにより、cDNAライブラリーを作製する。
スクリーニングに用いるプローブは、GenBank、DDBJな
どの配列データベースに登録されているシロイヌナズナ
等のリン酸トランスポーターの部分長cDNAを、「Arabid
opsis Biological Resource Center」（アメリカ合衆
国、オハイオ州立大学内）等から入手するか、あるい
は、部分長cDNAの配列に基づいて一対のオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて、シロイヌナズナ染色体DNAな
どを鋳型に用いたPCR法によってDNA断片を増幅すること
ができる。

そして、これにより得られたプローブを用いたコロニ
ーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイ
ゼーションにより、作製したcDNAライブラリーから、ハ
イブリダイゼーション陽性のクローンを選択して本発明
のDNAを調製することが可能である。また、マキサムギ
ルバート法やサンガー法などの常法により、適宜塩基配
列を決定することができる。

なお、このようにして得られた本発明のDNAの塩基配
列を、配列番号:1と配列番号:2に示す。配列番号:1に示
した遺伝子をIPT1、配列番号:2に示した遺伝子IPT4と命
名した。配列番号:1の遺伝子の翻訳産物（配列番号:9に
記載のタンパク質）は、酵母（Bun−ya M.et al.Mol.Ce
ll.Biol.11,3229−3238（1991））、アカパンカビ（Ver
saw W.K.Gene 153,135−139（1995））、VA菌根菌（Har
rison M.J.et al.Nature,378,626−629（1995））から
単離された、リン酸トランスポーター遺伝子のアミノ酸
配列と、それぞれ、34％、34％、43％の相同性を示し
た。

配列番号:2の遺伝子の翻訳産物（配列番号:10に記載
のタンパク質）は、酵母、アカパンカビ、VA菌根菌のリ
ン酸トランスポーター遺伝子のアミノ酸配列と、それぞ
れ32％、30％、40％の相同性を示した。

さらに、一旦cDNAが得られれば、これらのcDNA配列を
用いたハイブリダイゼーション法によって、P1ファージ
ベクターやλファージベクター等を用いて作製した染色
体DNAライブラリーから、あるいは、これらのcDNA配列
に基づく一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
染色体DNAなどを鋳型に用いたPCR法によって、染色体DN
Aからリン酸トランスポーター遺伝子を単離することが
できる。

このようにして得られたシロイヌナズナのリン酸トラ
ンスポーターの遺伝子を含むDNA断片の配列を、配列番
号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6に示す。ま
た、後述の実施例で得られた、配列番号:3と配列番号:4
のDNA断片を含んむP1ゲノムクローン（92C10）を保持す
る大腸菌（92C10 XL1−blue）を平成８年３月14日、〒3
05日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託した（受
託番号FERM BP−5474）。

なお、本発明の遺伝子のコード領域の上流には、本発
明の遺伝子の発現を制御する領域が含まれる。これらの
領域としては、配列番号:3の塩基番号１〜1944で表され
る配列の少なくとも一部を含む領域、配列番号:4の塩基
番号１〜2560で表される配列の少なくとも一部を含む領
域、配列番号:4の塩基番号4249〜9110で表される配列の
少なくとも一部を含む領域、配列番号:5の塩基番号１〜
1875で表される配列の少なくとも一部を含む領域、配列
番号:6の塩基番号１〜1980で表される配列の少なくとも
一部を含む領域があげられる。

＜２＞リン酸トランスポータータンパク質の調製本発明のタンパク質は、例えば、本発明のDNAを適当
なベクターに挿入し、該ベクターを宿主に導入すること
により、該宿主から精製することにより組み換えタンパ
ク質として調製することが可能である。

本発明のタンパク質の生産に用いられる宿主として
は、例えば、大腸菌、酵母などが挙げられる。

本発明のタンパク質の生産のために用いられるベクタ
ーとしては、特に制限はないが、例えば、宿主が「Spod
optera frugiperda」であれば「pBacPAK8」（Clontech
社製）が、宿主が大腸菌BL21由来株であれば「pETベク
ターシリーズ」（Stratagene社製）が、宿主が酵母SP−
Q01であればpESP−１（Stratagene社製）が挙げられ
る。

これにより得られた形質転換体からの本発明の組み換
えタンパク質の精製は、例えば、本発明のタンパク質を
6XヒスチジンやグルタチオンＳ−トランスフェラーゼな
どの標識との融合タンパク質として発現させた場合に
は、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィー
などにより行うことが可能である。

なお、当業者にとっては、配列番号:9〜13に記載の本
発明のタンパク質中のアミノ酸を適宜置換などすること
により本発明のタンパク質の機能的同等物を得ることは
常套手段である。従って、配列番号:9〜13に記載のタン
パク中のアミノ酸配列の一部が欠失、置換または他のア
ミノ酸の挿入などによって変異したアミノ酸配列を有
し、細胞内外の能動的に作られた水素イオン濃度勾配を
利用して、リン酸を細胞外から細胞内へ輸送する機能を
有するタンパク質も本発明の範囲に含まれる。常套手段
としては、例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Zo
ller,M.J.and Smith,M.（1983）Methods in Enzymology
100,p468）などが挙げられる。

なお、「胞内外の能動的に作られた水素イオン濃度勾
配を利用して、リン酸を細胞外から細胞内へ輸送する機
能」は、例えば、文献（Berhe,A.,et al.Eur.J.Bioche
m.227,566−572（1995））に記載の方法で検出すること
が可能である。

＜３＞本発明の遺伝子を導入した形質転換植物の作製本発明のDNAの全部あるいは一部を、例えば、CaMV
（カリフラワーモザイクウイルス）35Sプロモーター等
の植物で発現可能なプロモーターと順方向に転写される
ように結合し、これを含む組換えDNAを植物に形質転換
することによって、リン酸トランスポータータンパク質
を高発現する植物を作製することができ、また、いわゆ
るコサプレッション（あるタンパク質をコードする遺伝
子が順方向に転写される組換えDNAを導入し、内在性の
該タンパク質の発現が抑制される方法）によって前記タ
ンパク質の発現量を抑制させた植物を作製することがで
きる。植物の形質転換に用いられるベクターとしては、
例えば、pBI121などのベクターが挙げられる。

また、本発明のDNAの全部あるいは一部を逆方向に転
写されるようにプロモーターに結合し、これを含む組換
えDNAを植物に形質転換して、いわゆるアンチセンスRNA
を発現させ、リン酸トランスポータータンパク質の発現
量を抑制させた植物を作製することができる。

本発明の遺伝子は、例えば、シロイヌナズナやタバコ
等の草本性双子葉植物、イネやトウモロコシ等の単子葉
植物、ユーカリやポプラ等の木本性植物に遺伝子導入が
可能である。

植物細胞の形質転換は、パーティクルガン法、エレク
トロポーレーション法（電気的穿孔法）、バキュームイ
ンフィルトレーション等のアグロバクテリウム感染法等
の常法によって、植物細胞、あるいは直接植物体にDNA
を導入することにより行うことが可能である。

形質転換植物体、または形質転換植物細胞は、形質転
換に用いる組換えDNA中にカナマイシンやハイグロマイ
シン等に対する薬剤耐性遺伝子を組み込み、これらの薬
剤を含む寒天固体培地、あるいは液体培地中で栽培ある
いは培養することにより安定的に維持することが可能で
ある。

図面の簡単な説明図１はシロイヌナズナリン酸トランスポーター遺伝子
のコピー数の解析を示す。IPT1遺伝子cDNA（pIPTC19）
をプローブに用い、ホモログ遺伝子とハイブリダイズす
る条件で洗浄した。

図２はシロイヌナズナリン酸トランスポーター遺伝子
ゲノムクローンの制限酵素地図を示す。上段より、IPT1
遺伝子、IPT3遺伝子とIPT2遺伝子、IPT4遺伝子、IPT5遺
伝子の制限酵素地図を示す。ボックス部はコード領域の
位置を示す。

図３はリン酸トランスポーター遺伝子のシロイヌナズ
ナ染色体上での位置を示す。矢印の位置に各遺伝子が座
乗する。上部の数字は染色体番号を、横線は既知のRFLP
マーカーの位置を示す。

図４はシロイヌナズナ各器官でのリン酸トランスポー
ター遺伝子（IPT1）の発現解析を示す。RNAを抽出した
組織を上部に示し、転写産物の位置を矢印（→）で示し
た。

図５はリン酸トランスポーター遺伝子（IPT1遺伝子）
を含む形質転換用コンストラクトを示す。上段はIPT1遺
伝子の制限酵素地図と遺伝子構造を示す。黒塗り部位は
非翻訳転写領域を白抜きボックスはコード領域を示す。
下部はp35S−IPT1のうち、Ｔ−DNA領域の構造を示す。p
nosはノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、NPT IIは
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン
耐性遺伝子）、tnosはノパリン合成酵素遺伝子ターミネ
ーターを表す。

図６はリン酸トランスポーター遺伝子の発現量とリン
酸吸収速度との関係を示す。

発現を実施するための最良の形態以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
が本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

［実施例１］リン酸トランスポーターcDNAクローンの
単離酵母無機リン酸トランスポーター遺伝子（PH084）（B
un−ya M.et al.Mol.Cell.Biol.11,3229−3238（199
1））と相同性を示すシロイヌナズナの部分cDNA（GenBa
nk Z33763）の塩基配列から、その塩基配列に基づき、
オリゴヌクレオチドプライマーを合成した（グライナー
ジャパン社に合成を委託）。5'側のプライマーにはHind
III、3'側のプライマーにはPst I認識部位を付加し
た。プライマーの配列は、 2854F1:5'−AAAGCTTCAAAACTATGGCTTGTTCTC−3'（5'側
プライマー） 2854R1:5'−ACTGCAGAACTGTGAACCAGTACCCTG−3'（3'側
プライマー）とした（それぞれ配列番号:7、配列番号:8に示す）。テ
ンプレートとして、シロイヌナズナ（コロンビア（Colu
mbia）株）の根から、文献（Cell,35（1983））に記載
の尿素フェノール法等により調製したゲノムDNAを用
い、「AmpliTaq DNA」（Perkin−Elmer社製）を用いて
酵素に添付のプロトコールに従ってPCR（ポリメラーゼ
チェインリアクション）を行った。増幅したPCR産物をH
ind IIIとPst Iで切断後、pBluescript II SK＋（Strat
agene社製）のHind IIIとPst Iにクローニングして（以
下、このクローニングされたものを「pIPT−PCR」と称
する）両末端から「ABI 373A DNA sequencer」（Perkin
−Elmer社製）を使用して、添付の説明書に従い塩基配
列を決定した。この結果、251bpのPCR産物とシロイヌナ
ズナの部分cDNAの塩基配列のうち、248bpが一致するこ
とを確認した。

シロイヌナズナ無機リン酸トランスポーター（以下単
に「IPT」と称する）遺伝子のcDNAクローンは、「Arabi
dopsis cDNA Library in the Uni−ZIP^TMXR Vector」
（Stratagene社製）を用い、4.0X10⁵個の組み換え体か
ら、pIPT−PCRのインサート（251bp）をプローブとして
スクリーニングした。ハイブリダイゼーションはLiuら
の方法（Liu Y.−G.et al.Theor.Apple.Genet.84,535−
543（1992））に従い、洗浄条件は、0.1X SSC,0.1％SD
S,62℃で行った。この結果、1755bpのcDNAクローンが得
られた（以下、このクローンを「pIPTC19」と称する）
（配列番号:1）。

また、後述のIPT4遺伝子のゲノムクローンであるpIPT
GZ7のEco R I−Xho I断片をプローブに使用して、スク
リーニングを行った。ハイブリダイゼーションはLiuら
の方法に従い、0.1X SSC,0.1％SDS,65℃の条件で、洗浄
を行って陽性クローンを選抜し、５個の陽性クローンを
得た。これらのクローンうち、全長cDNAクローンは無か
ったが、5'側のクローン（以下、このクローンを「pIPT
C402」と称する）と、3'側のクローン（以下、このクロ
ーンを「pIPTC403」と称する）により、オープンリーデ
ィングフレーム（以下、「ORF」と称する）全体をカバ
ーすることができた（配列番号:2）。

［実施例２］リン酸トランスポーターゲノムクローン
の単離ゲノムクローンの単離には、シロイヌナズナ（コロン
ビア株）P1ゲノムライブラリー（Liu Y.−G.et al.Plan
t J.7,351−358（1995））、および、シロイヌナズナ
（コロンビア株）λZap IIゲノムライブラリー（Strata
gene社製）を用いた。

上記P1ゲノムライブラリーのスクリーニングは、P1ク
ローンを保持する大腸菌１万株のDNAをナイロンメンブ
レンに固定し、フィルターを作製した。上記フィルター
に対して³²PでラベルしたpIPT−PCRのインサートをプロ
ーブに使用して、Liuらの方法（Liu Y.−G.et al.Theo
r.Apple.Genet.84,535−543（1992））に従ってハイブ
リダイゼーションを行った。洗浄条件は、0.1X SSC,0.1
％SDS,62℃で行ない、「バイオ・イメージアナライザー
BAS2000」（富士写真フィルム社製）でシグナルを検出
した。この結果、１個の陽性クローン（以下、このクロ
ーンを「92C10」と称する）が得られた。

λZap IIゲノムライブラリーのスクリーニングは、40
万個のλファージを大腸菌ホストXL1−Blue（Stratagen
e社製）に感染させ、これによりプラーク形成させて、
ナイロンメンブランに転写した。プローブにはpIPT−PC
Rのインサートを使用した。スクリーニングの条件は、5
5℃でハイブリダイズを行い、0.2X SSC、0.1％SDS、42
℃の条件で洗浄を行った。その結果、４個の陽性クロー
ン（以下、これらのクローンを「pIPTGZ1」、「pIPTGZ
2」、「pIPTGZ4」、「pIPTGZ7」と称する）が得られ
た。クローン末端の塩基配列決定と制限酵素断片の解析
から、これらのクローンは、互いに重複しない別の遺伝
子のゲノムクローンであることが明らかとなった。

しかし、これらのクローンは遺伝子全体を含んでいな
いため、pIPTC19のインサートをプローブに使用して再
度スクリーニングを行った。スクリーニングの条件は、
55℃でハイブリダイズを行い、0.2X SSC,0.1％SDS,42℃
の条件で、洗浄を行って陽性クローンを選抜した。約20
万のプラークをスクリーニングした結果、10個の陽性ク
ローンが得られた。

クローン末端の塩基配列決定と制限酵素断片の解析か
ら、２クローン（GZ33、GZ37）が一つの無機リン酸トラ
ンスポーター遺伝子（以下単に、「IPT1遺伝子」と称す
る）、１クローン（GZ36）が、他の無機リン酸トランス
ポーター遺伝子（以下単に、「IPT2遺伝子」と称す
る）、６クローン（GZ34、GZ35、GZ38、GZ39、GZ40、GZ
41）が、さらに他の無機リン酸トランスポーター遺伝子
（以下単に、「IPT3遺伝子」と称する）、１クローン
（GZ32）がさらに他の無機燐酸トランスポーター遺伝子
（以下単に、「IPT5遺伝子」と称する）のゲノムクロー
ンであった。また、P1クローン92C10には前記の４種のI
PT遺伝子のうち３種のIPT遺伝子（IPT1、IPT2、IPT3）
が含まれていた。

pIPTGZ7の全長クローンが得られなかったので、再
度、pIPTGZ7のEco R I−Xho I断片をプローブとして、
λZap IIゲノムライブラリーの約16万のプラークを対象
に、スクリーニングを行った。ハイブリダイズは55℃で
行い、0.1X SSC,0.1％SDS,65℃の条件で、洗浄し、陽性
クローンを選抜した。この結果、１つの陽性クローン
（pIPTGZ20）を単離した。

また、IPT1をプローブとした、ゲノムサザンブロティ
ングを行った（図１）。ゲノムサザンブロティングは、
シロイヌナズナのコロンビア（columbia）株（レーン
１、３、５、７、９）およびランズバーグエレクタ（La
ndsberg erecta）株（レーン２、４、６、８、10）から
調製したDNAをBamH I（レーン１、２）、Dra I（レーン
３、４）、EcoR I（レーン５、６）、EcoR V（レーン
７、８）、Hind III（レーン９、10）で切断して行っ
た。なお、図中の両端はサイズマーカーである。この結
果、シロイヌナズナのIPTには、多数のホモログ遺伝子
があることが確認した（図１）。

このことからも、IPT遺伝子は少なくとも５種以上の
遺伝子から構成される多重遺伝子族を形成していると考
えられた。全ゲノムクローンの制限酵素地図を図２に示
す。

［実施例３］リン酸トランスポーターゲノムクローン
の解析 IPT1遺伝子については、pIPTGZ33とpIPTGZ37の全塩基
配列を決定した。決定したIPT1遺伝子の塩基配列を配列
番号:3に示す。配列番号:1記載のIPT1遺伝子cDNAクロー
ンであるpIPTC19の塩基配列との比較から、5'の非翻訳
領域とオープンリーディングフレーム（以下、「ORF」
と称する）中にあわせて２カ所にイントロンが存在し
た。

IPT2遺伝子とIPT3遺伝子については、pIPTGZ34、pIPT
GZ36、pIPTGZ38、pIPTGP2の全塩基配列を決定した。な
お、pIPTGP2は、前記92C10のインサートをPst Iで切断
した約7.5kbの断片をpBluescriptに挿入したサブクロー
ンである。決定したIPT2遺伝子とIPT3遺伝子の塩基配列
を配列番号:4に示す。推定ではあるが、いずれも少なく
ともそれぞれ１カ所にイントロンが存在した。IPT3のOR
Fの下流にIPT2のORFが同方向に位置しており、両遺伝子
のORF間の距離は約5kbであった。

IPT4遺伝子については、pIPTGZ20のうち、コード領域
の上流とORF全体を含む部分の塩基配列を決定した。決
定したIPT4遺伝子の塩基配列を配列番号:5に示す。翻訳
領域にはイントロンは見つからなかったが、非翻訳領域
に約1kbpのイントロンが存在した。またコード領域の上
流は約2kbpであった。

IPT5についてはpIPTGZ32の全塩基配列を決定した。決
定したIPT5遺伝子の塩基配列を配列番号:6に示す。IPT5
遺伝子に関してもcDNAが単離されていないが、少なくと
もORF中に２カ所のイントロンが存在すると考えられ
る。また、pIPTGZ32クローンのコード領域の上流は約2k
bであった。

cDNAとゲノムクローンの解析から推定した各遺伝子の
アミノ酸配列を酵母とアカパンカビとVA菌根菌のリン酸
トランスポーター遺伝子のアミノ酸配列と比較した。シ
ロイヌナズナの遺伝子に対する酵母、アカパンカビの遺
伝子のアミノ酸配列の相同性がいずれも30％前後であっ
た。シロイヌナズナ遺伝子のアミノ酸配列相互では約75
％以上の相同性を示した。特にIPT1とIPT2の相同性が高
く、98％であった。

［実施例４］リン酸トランスポーター遺伝子の染色体
マッピングシロイヌナズナは５本の染色体を持つが、単離した５
種のIPT遺伝子の染色体上での分布を知ることを目的
に、染色体マッピングを行った。

染色体マッピングを実施するためには、RFLP（制限酵
素断片長多型）を検出する必要があり、そのプローブに
は、P1クローン92C10に含まれる３種の遺伝子（IPT1、I
PT2、IPT3）に対してはpIPT−PCRのインサートを用い、
IPT4遺伝子とIPT5については再度P1クローンを単離して
用いた。単離した。P1クローンは83A1（IPT4遺伝子）、
88C10（IPT5遺伝子）と命名した。これらのプローブを
用い、コロンビア（Columbia）株とランズバーグエレク
タ（Landsberg etrecta）株から調製したゲノムDNAを制
限酵素で切断した後、電気泳動し、ナイロンメンブレン
にDNAを転写したフィルターを用い、両株間で多型を示
す制限酵素断片を検索したRFLPを示した制限酵素で切断
した100ラインのRI line（コロンビア株とランズバーグ
エレクタ株を交雑したF8世代）（Lister et al.,Plant
J,4（1993）745−750）フィルターを使用して各RI line
の遺伝子型を決定した。この分離データを「Mapmaker M
acintosh V2.0」（Lander et al.,Genomics,1（1987）1
74−181）を用いてLODスコア6.0、「Kosambi mapping f
unction」（Kosambi D,D,Ann,Eugen,12（1944）172−17
5）によって解析した。

この結果、３種のIPT遺伝子（IPT1、IPT2、IPT3）の
染色体上での位置は、第５染色体の下腕部、IPT4遺伝子
とIPT5遺伝子は第２染色体の下腕部にに座乗していた。
IPT4とIPT5の両遺伝子間距離は5.4cMであった（図
３）。またこの遺伝子座はリン酸を過剰に吸収する吸収
の変異体として報告されているpho2（Delhaize E.et a
l.,Plant Physiol,107（1995）207−213）の遺伝子座と
一致はしないが、近い位置であった。

［実施例５］リン酸トランスポーター遺伝子の植物組
織における発現解析本発明の遺伝子のうち、cDNAを単離し、植物体内で発
現していることが確実なIPT1遺伝子についてもノーザン
ブロット分析を行った。６週間生育させたシロイヌナズ
ナの根、ロゼット葉、茎、カウライン葉、花からRNAを
調製して、電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写して
フィルターを作製した。このフィルターに対して,IPT1
遺伝子cDNAであるpIPTC19のインサートをプローブに用
い、ハイブリダイゼーションを行い、0.1X SSC,0.1％SD
S,65℃の条件で、洗浄を行って、転写産物を検出した。
この結果、IPT1遺伝子は根で特異的に発現していた（図
４）。

［実施例６］リン酸トランスポーター遺伝子の発現量と
リン酸吸収速度との関係（１）形質転換培養細胞の作出過剰発現用のコンストラクト（p35SIPT1）は、pKI121
（pBI121（Clonetech社製）のSst II−EcoR I断片をpGA
643（Pharmacia社製）のSst IIとEcoR Iサイトに挿入
し、この中間産物のSal I断片をpACYC177（accession n
o.X06402）のSal Iサイトに挿入して構築したプラスミ
ド）のGUS geneをBamH IとSac Iで切断し除去した部分
をブラント化し、IPT1のORFを含むpIPTGZ2ゲノムクロー
ンのブラント化したSac I−Hind III断片（エクソン
２、イントロン２、エクソン３を含む）をライゲーショ
ンした（図５）。

リン酸輸送遺伝子の機能を解析するために第２イント
ロンを含むIPT1遺伝子のコード領域をカリフラワーモザ
イクウイルス35S（CaMV35S）プロモーターの下流に結合
してタバコBY−２培養細胞に導入した。遺伝子導入はパ
ーティクルガンを用い、コントロールとしてベクターpK
I121も培養細胞に導入した。カナマイシンを含む培地で
形質転換体を選抜し多数の遺伝子導入株を得た。導入し
た遺伝子が発現している培養細胞系統を選抜するため
に、16系統のp35SIPT1導入系統を懸濁培養化し、IPT1cD
NAをプローブとするノーザン分析を実施した。分析した
16系統のうち、10系統（P2、P3、P10、P11、P20、P27、
P29、P33、P34、P38）でmRNAの発現が見られた。pKI121
導入培養細胞をGUS活性染色した。分析した30系統のう
ち、12系統のカルスでGUS遺伝子が機能しており、カナ
マイシン耐性カルスのうち40％のカルスが隣接するGUS
遺伝子も正常に発現するように導入されていることが判
明した。このうち６系統（C3、C8、C11、C16、C18、C2
3）のpKI121導入培養細胞を懸濁培養化した。

（２）タバコ培養細胞の維持とリン酸吸収速度の測定形質転換タバコBY−２培養細胞は懸濁培養化し、100m
lの改変MS培地（2.5mM phosphate,0.1mg/ml myo−inosi
tol,3％sucrose,1μg/ml thiamine−HCl,0.2μg/ml 2,4
−D and 2μg/ml glycine,50μg/ml kanamycine,pH5.
7）で25℃、100rpmで回転培養し、７日毎に3mlの飽和培
養細胞液を継代した。リン酸吸収の測定に用いる培養細
胞は、カナマイシンを含まない上記培地に継代後７−９
日目の細胞を新たなMS液体培地に移し、23−27時間経過
しないものを用いた。培養細胞は自然沈降により集め、
100μＭのシクロヘキシミドを含む無リン酸培地（5mM M
ES−Tris（pH6.0）,20.6mM NH₄NO₃,18.8mM KNO₃,3.0mM
CaCl₂・H₂O,1.5mM MgSO₄・H₂O,100μM cycroheximide,3
％sucrose）で４回洗浄した。最終濃度が約0.1g/mlにな
るように上記培地に懸濁し、9.5mlの細胞懸濁液を50ml
のプラスチックチューブ中で２時間、25℃、200rpmで前
培養した。50μCiの³²P−phosphate（Amersham社製,500
mCi/mmol final concentraton）を含む2mMリン酸を終濃
度が100μＭとなるよう0.5ml加え反応を開始した。適時
250μｌをサンプリングし、直ちに0.22μｍ遠心濾過チ
ューブウルトラフリーC3GV（UFC30GV00、MILLIPORE社
製）で細胞を除去し、濾液のうち50μｌを液体シンチレ
ーションカウンターで測定して培地中のPiの減少量を液
体シンチレーションスペクトロメーター（Beckman社
製）により測定し、培養細胞のPi吸収量を算出した。ま
た、細胞懸濁液の細胞濃度（g fwt/ml）は吸収測定後の
細胞懸濁液2mlから、0.45μｍの遠心濾過チューブ（UFC
40HV25、MILLIPORE社製）で細胞を集め、湿重量を測定
して算出した。また、遺伝子発現量とリン酸吸収速度の
関係を解析するために、リン酸吸収速度を測定し、導入
したリン酸トランスポーター遺伝子の発現をノーザン分
析により実施した（図６）。なお、培養細胞のリン酸吸
収速度は、高リン酸培地中での前培養とタンパク質合成
阻害剤存在下でリン酸初濃度100μＭで測定した。この
結果、過剰発現細胞のリン酸吸収速度は193から596nmol
Pi/h/g fwtで吸収活性はIPT1mRNAの発現量と相関があ
った。コントロール細胞のリン酸吸収速度は101から203
nmol Pi/h/g fwtであった（図６）。

［実施例７］IPT1遺伝子の発現によるリン酸吸収活性の
上昇に対する阻害剤の影響タバコ培養細胞の内在性のリン酸吸収活性とシロイヌ
ナズナリン酸トランスポーター遺伝子IPT1の過剰発現に
より上昇したリン酸吸収活性の阻害剤に対する性質を解
析した（表１）。なお、下記の基質のうち、「リン酸
（100μＭ）」、「リン酸（2mM）」以外は、リン酸濃度
を100μＭとした。

この結果、プロトノフォアである2,4−ジニトロフェ
ノール（2,4−DNP）とシアニドｍ−クロロフェニルヒド
ラゾン（CCCP）はいずれもリン酸吸収を強く阻害した。
原形質膜のＨ＋−ATPase活性の阻害剤であるスチルベス
トロールも強い阻害を示した。また、リン酸やその類似
体であるヒ酸によっていずれの細胞でも同程度のリン酸
吸収が阻害された。これらの結果から、シロイヌナズナ
リン酸トランスポーター遺伝子IPT1の遺伝子産物のリン
酸吸収機構はプロトンとリン酸との共輸送であること、
およびIPT1遺伝子産物の活性が、タバコ培養細胞内の内
在性のリン酸吸収活性と阻害剤に対する反応が類似して
いることが示された。

［実施例８］IPT1遺伝子導入のタバコ培養細胞の生長量
への影響植え継ぎ後１週間経過したステーショナリーフェーズ
の培養細胞を細胞濾過器（Cell Strainer）でろ過し、6
0mmディスポペトリディッシュに0.5gの細胞を秤取り、
これを改変MS培地（−Km,100ml）に植え継いだ。24時間
後、培養液を細胞濾過器でろ過しリン酸を含まないMS培
地（リン酸飢餓培地）10mlで洗って、細胞濾過器の重量
を測定後、リン酸飢餓培地（−Km,100ml）に植え継い
だ。植え継ぎは培地15mlを細胞濾過器の反対側から流し
てフラスコに流し込んで行った。この後再度、細胞濾過
器の重量を測定して植え継いだ細胞量を計算した。リン
酸飢餓培地で４日間培養を続けた後、以下の方法で細胞
重量を測定した。フィルターホルダー（ガラスフィルタ
ーベース）に「ADVANTEC」（TOYO社製）No.3濾紙（55m
m）をセットし、新鮮なリン酸飢餓培地10mlで濾紙を湿
らせて吸引ろか後湿らせた濾紙の重量を測定した。濾紙
を再度セットして４日間培養した培養液を吸引濾過し、
濾紙の重量を測定した。この値から細胞の生育量（湿重
量）を計算した。さらにこの濾紙をデシケーターで一晩
乾燥させた後の重量を測定し、乾燥した濾紙の重さを引
いて乾燥重量とした。なお、測定はリン酸輸送遺伝子導
入細胞２ライン（P11、P38）、コントロール１ライン
（C3）についてリン酸飢餓状態下での細胞の生育量につ
いて行った。この結果、最初にリン酸を豊富に含む通常
培地で一日処理した後の湿重量はリン酸輸送遺伝子導入
細胞・コントロール細胞で有為な差はなかった。しか
し、リン酸欠乏培地植え継ぎ後４日目では、コントロー
ル株と比較して、湿重量・乾燥重量共にリン酸輸送遺伝
子導入株が約40％高かった（表２）。

これはリン酸飢餓処理前に吸収したリン酸量がリン酸
飢餓処理後の細胞生育量に影響したものと考えられる。
従来の培養細胞についての研究から、培養細胞の重量の
増加と窒素・炭素の吸収量は平行関係にあることが知ら
れている。また、リン酸吸収については生育の初期段階
で培地中のリン酸を速やかに吸収して生育の後半ではリ
ン酸吸収をしないで生育することが知られている。本実
施例において作出した形質転換株はリン酸吸収速度が顕
著に上昇したためにリン酸を通常量含む培地で24時間培
養したときにコントロール細胞と比較してより多くのリ
ン酸を吸収して蓄積したと考えられ、これがリン酸飢餓
培地への移植後の生育量に反映したと考えられる。本実
施例により一遺伝子を操作することにより植物の生長量
を増大させることが可能であることが判明した。

［実施例９］過剰発現形質転換植物の作製シロイヌナズナの形質転換法は「改良vacuum infiltr
ation法」（Shirano,unpublised,Bechtold et al.,199
3）を用いて、p35S−IPT1とpKI121を導入した。形質転
換体は75μg/mlのカナマイシンを含む1/2 B5,1/1000 HY
PONex（pH5.7）の0.8％アガープレート上で２週間生育
させ、耐性個体を選抜した。植物体は20℃または、23
℃、16L/8Dまたは「continuous light」で1/1000 HYPON
exを与えて育成した。

産業上の利用可能性本発明により、シロイヌナズナのリン酸輸送タンパク
質遺伝子が単離され、その構造が解明された。さらに本
発明により、シロイヌナズナのリン酸輸送タンパク質遺
伝子をタバコ培養細胞へ導入してタバコ培養細胞のリン
酸吸収能を高めることが可能となった。従って、本発明
によれば、例えば、植物が利用可能な形態のリン酸が少
ない酸性土壌などの貧リン酸栄養土壌における植物の生
育を改善することが可能である。また、環境の変化が激
しい自然界では、土壌中のリン酸量は絶えず変化してい
るが、本発明の遺伝子が導入された植物はリン酸が存在
する時期に迅速にリン酸を吸収し蓄積することが可能で
あるため、本発明により、環境の変化に対し強い植物の
作出も可能である。本発明において、シロイヌナズナの
リン酸輸送タンパク質遺伝子がタバコの培養細胞で機能
することが明らかとなったことから、本発明は広く植物
において適用されることが期待される。

配列表配列番号:1 配列の長さ:1755 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA to mRNA 起源生物名:Arabidopsis thaliana 株名:colombia 配列の特徴特徴を表す記号:CDS 存在位置:55..1626 配列配列番号:2 配列の長さ:1766 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA to mRNA 起源生物名:Arabidopsis thaliana 株名:colombia 配列の特徴特徴を表す記号:CDS 存在位置:31..1632 配列配列番号:3 配列の長さ:5810 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 起源生物名:Arabidopsis thaliana 配列の特徴特徴を表す記号:CDS 存在位置:2226..2626 特徴を表す記号:CDS 存在位置:2778..3948 特徴を表す記号:exon 存在位置:1945..1978 特徴を表す記号:intron 存在位置:1979..2214 特徴を表す記号:exon 存在位置:2215..2626 特徴を表す記号:intron 存在位置:2627..2777 特徴を表す記号:exon 存在位置:2778..4054 配列配列番号:4 配列の長さ:12987 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 起源生物名:Arabidopsis thaliana 株名:colombia 配列の特徴特徴を表す記号:CDS 存在位置:2561..2961 他の情報:IPT3 特徴を表す記号:CDS 存在位置:3087..4248 他の情報:IPT3 特徴を表す記号:CDS 存在位置:9111..9511 他の情報:IPT2 特徴を表す記号:CDS 存在位置:9662..10832 他の情報:IPT2 特徴を表す記号:intron 存在位置:2962..3086 特徴を表す記号:intron 存在位置:4249..9110 配列配列番号:5 配列の長さ:4864 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 起源生物名:Arabidopsis thaliana 株名:colombia 配列の特徴特徴を表す記号:CDS 存在位置:3004..4605 特徴を表す記号:exon 存在位置:1876..1893 特徴を表す記号:intron 存在位置:1894..2991 特徴を表す記号:exon 存在位置:2992..4724 配列配列番号:6 配列の長さ:4249 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 起源生物名:Arabidopsis thaliana 株名:colombia 配列の特徴特徴を表す記号:CDS 存在位置:1677..1980 特徴を表す記号:CDS 存在位置:2158..2630 特徴を表す記号:CDS 存在位置:2729..3577 特徴を表す記号:intron 存在位置:1981..2157 特徴を表す記号:intron 存在位置:2631..2728 配列配列番号:7 配列の長さ:27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列配列番号:8 配列の長さ:27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列配列番号:9 配列の長さ:524 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:10 配列の長さ:534 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:11 配列の長さ:521 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:12 配列の長さ:524 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:13 配列の長さ:542 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者奥村暁茨城県つくば市千現２―１―６つくば研究支援センターＤ−21株式会社三井業際植物バイオ研究所内 (72)発明者白野由美子茨城県つくば市千現２―１―６つくば研究支援センターＤ−21株式会社三井業際植物バイオ研究所内 (72)発明者柴田大輔茨城県つくば市千現２―１―６つくば研究支援センターＤ−21株式会社三井業際植物バイオ研究所内 (56)参考文献Ｎａｔｕｒｅ，1995年，378（７）, 626−629 ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，1991 年，97，1087−1093 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号９に記載されたタンパク質、また
は該タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換または他のアミノ酸の挿入など
によって変異したタンパク質であって細胞内外の能動的
に作られた水素イオン濃度勾配を利用して、リン酸を細
胞外から細胞内へ輸送する機能を有するタンパク質をコ
ードするDNA。
【請求項２】シロイヌナズナに由来するタンパク質をコ
ードする請求の範囲第１項に記載のDNA。
【請求項３】請求の範囲第１項に記載のDNAを含むベク
ター。
【請求項４】請求の範囲第１項に記載のDNAが導入され
た植物細胞。
【請求項５】配列番号９に記載されたタンパク質、また
は該タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換または他のアミノ酸の挿入など
によって変異したタンパク質であって細胞内外の能動的
に作られた水素イオン濃度勾配を利用して、リン酸を細
胞外から細胞内へ輸送する機能を有するタンパク質。
【請求項６】請求の範囲第１項に記載のDNAを植物細胞
に導入する、形質転換された植物細胞の製造方法。
【請求項７】請求の範囲第１項に記載のDNAを植物細胞
に導入することを含む、植物細胞においてリン酸の取り
込みを促進する方法。