JP3477832B2 - 肝疾患の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は肝疾患の診断方法に関
し、詳細にはヒト肝実質細胞増殖因子（以下、「ｈＨＧ
Ｆ」と略記する）に対する特定の抗体を用いることによ
る肝疾患の診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】肝炎
や肝硬変等に代表される肝疾患は、肝臓癌へと進行し、
死に至ることがある重篤な疾患である。ところが肝臓は
生体内の中でも極めて複雑な臓器であり、その機能が十
分に解明されていないため、肝疾患障害に対する有望な
薬剤はいまだに見出されていない。

【０００３】近年、インターフェロンの肝疾患、特に肝
炎に対する効果が報告されている。しかしインターフェ
ロンは全ての肝炎患者に対して効果を有するわけではな
く、またその多用による副作用が問題視されている。肝
疾患の診断系においても、肝炎の原因と考えられている
ウイルスのゲノム構造が解明されたことに伴い、かかる
ウイルスの遺伝子がコードするポリペプチド等を使用し
たアッセイ系が開発されているが、ウイルスが極めて変
異しやすい等の理由により、十分な検出感度は得られて
いないのが現状である。

【０００４】一方、ヒト肝実質細胞増殖因子（以下、
「ｈＨＧＦ」と略記する。また単に肝実質細胞増殖因子
を表す場合、「ＨＧＦ」と略記する）は、生体内より取
り出した初代培養肝実質細胞の増殖を促進させうるヒト
由来の蛋白性因子で、劇症肝炎患者血漿より見出だされ
た（特開昭６３−２２５２６号公報）。さらにその後、
ｈＨＧＦ蛋白質をコ−ドするアミノ酸配列および遺伝子
（ｃＤＮＡ）配列（特開平３−７２８８３号公報）、さ
らにこのｃＤＮＡを用いることによる組換えｈＨＧＦ蛋
白質の生産方法（特開平３−２８５６９３号公報）につ
いても報告されている。かかる組換えヒトＨＧＦ（以
下、「ｒｈＨＧＦ」と略記する）蛋白質は、生体外
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８７，１８５３−１
８５７（１９９１））、また生体内（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．，５９（ｓｕｐｐｌ．１），１３７
（１９９２））において肝実質細胞の増殖および機能を
促進する働きが認められた。さらに、ｈＨＧＦの標的細
胞・組織が広く検索され、肝細胞以外の種々の上皮細胞
（尿細管上皮・肺上皮・胆管上皮・胃上皮）や線維芽細
胞・リンパ球系細胞がＨＧＦに反応してその増殖や運動
性を変化させることが判明した（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ
Ｋａｓｅｉ Ｒ＆Ｄ Ｒｅｖｉｅｗ，７，１６−２４
（１９９３））。また、これらＨＧＦ標的細胞上のレセ
プター分子として、癌原遺伝子ｃ−ｍｅｔ産物が機能し
ていることも明らかとなっている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
５１，８０２−８０４（１９９１））。

【０００５】ｈＨＧＦは、分子量約８６，０００のヘテ
ロダイマー構造を有する糖蛋白質であるが、もともとは
１本鎖の前駆体蛋白質としてｍＲＮＡより合成され、次
いでジスルフィド結合を介した活性型の２本鎖蛋白質に
プロセスされることが判明している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９
６７−９７３（１９８９））。また、このプロセスの過
程に着目し、１本鎖前駆体から２本鎖成熟体にプロセス
されて初めてＨＧＦとしての活性が獲得されること
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２０１１４−２
０１１９（１９９２））、およびこのプロセス化に新規
なセリンプロテアーゼ（以下、「ＨＧＦアクチベータ
ー」と略記する）が関与することも知られている（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１００２４−１００２
８（１９９３））。また、実験動物を用いた解析から、
ＨＧＦは種々の肝障害及び肝切除に伴ってその合成が促
進されること（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２７０，８１−
８４（１９９０））、さらにＨＧＦが正常肝中にも潜在
型として存在しており、肝障害に伴ってＨＧＦアクチベ
ーターが活性化されてＨＧＦを２本鎖型にプロセスする
こと（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，８９６６−
８９７０（１９９４））が明らかとなっている。ラット
においては、ＨＧＦと各種臓器障害との関連において、
肝障害のみならず腎障害（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４３５７−４３６１（１９
９４））および肺障害（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６８，２１２１２−２１２１７（１９９３））の再生過
程へのＨＧＦ関与が示唆されている。ヒトにおいても、
ＨＧＦ測定系が開発され（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１
３，１−５（１９９１））、種々の肝疾患及びその他の
疾患における生体内ＨＧＦ濃度が測定されている。それ
によると、血中ＨＧＦ量は種々の肝疾患において上昇す
ることが認められ、ＨＧＦの診断意義として、劇症肝炎
早期診断、肝不全の早期予知、肝障害程度の推定などが
示唆された。さらに、最近、妊娠中毒症や腎疾患で血中
ＨＧＦ高値が、リウマチで滑液・骨髄液中ＨＧＦ高値
が、各種白血病で骨髄液中ＨＧＦ高値が認められ、それ
ら疾患におけるＨＧＦ診断意義も議論されている（第１
回ＨＧＦ／ＳＦ研究会、１９９４抄録）。しかしなが
ら、従来の技術においては、体内ＨＧＦ値は抗ＨＧＦ抗
体と反応するＨＧＦの総和を見ているにすぎず、各種ヒ
ト疾患において増加する体内ＨＧＦが、２本鎖成熟体Ｈ
ＧＦであるのか１本鎖前駆体ＨＧＦであるのかは明らか
ではなかった。また、ヒト体内においてもラット同様に
１本鎖ＨＧＦ前駆体が存在しており、それがヒト疾患に
おいて変動するものであるかは不明であった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、肝疾患の
新しい診断法を提供するべく検討を重ねてきた結果、１
本鎖ＨＧＦ前駆体が健常人血漿中には存在せず、劇症肝
炎・慢性肝炎・肝硬変等の肝疾患患者血漿中にのみ存在
することを初めて見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明の要旨は、ヒト体液中に含
まれる不活性型の１本鎖ヒト肝実質細胞増殖因子を検出
することを特徴とする肝疾患の診断方法に存する。以
下、本発明につき詳細に説明する。１本鎖のＨＧＦは、
前述したように活性型である２本鎖ＨＧＦの前駆体であ
る。従って１本鎖のＨＧＦを検出する手段としては、 １本鎖のＨＧＦのみを特異的に検出する １本鎖のＨＧＦおよび２本鎖のＨＧＦの総和を検出
し、そこから２本鎖のＨＧＦ量を差し引く 等が具体的な方法として挙げることができる。いずれに
しても、本発明においては１本鎖のＨＧＦおよび／また
は２本鎖のＨＧＦに対する抗体を使用することが望まし
い。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
のいずれもが使用できる。これらの抗体は、いずれも常
法に従って調製することができる。例えばモノクローナ
ル抗体は、特公平５−６０３５９号公報に記載の方法に
従って、容易に作製することができる。

【０００８】抗体は、例えば西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素を用いて標識することに
より、エンザイム・イムノアッセイに供することができ
る。本発明においては、ヒト由来の体液、例えば血液、
血漿、血清、リンパ液、汗、尿等に含まれる１本鎖のＨ
ＧＦを、上記抗体を用いて検出する。１本鎖のＨＧＦ
は、後述の実施例に示すように、健常人には存在せず、
急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、肝硬変等の肝疾患患者
内においてのみ存在する。従って１本鎖のＨＧＦを検出
することは上記肝疾患の早期発見につながるものであ
り、臨床上の意義は極めて大きいものである。

【０００９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。 実施例１ 劇症肝炎患者血漿中の１本鎖および２本鎖Ｈ
ＧＦの検出 特開平５−２０８９９８号公報に記載の方法に従って、
組換えヒト１本鎖ＨＧＦ前駆体を調製した。すなわちチ
ャイニーズハムスター卵巣由来細胞株ＣＨＯにヒトＨＧ
ＦｃＤＮＡ発現ベクターを導入し、安定してｈＨＧＦを
生産する産生株を作製した。ｈＨＧＦ産生株を無血清ｅ
ＲＤＦ培地（極東製薬社）中でローラーボトルで培養
し、０．２μｍフィルター（アミコン社）通過後の培養
上清をＳＰ−セファロース・ファースト・フロー（Ｆ
Ｆ）（ファルマシア社）カラムにアプライした。０．３
Ｍから１ＭのＮａＣｌにてグラジエント溶出し、組換え
ｈＨＧＦ標品を得た。本条件では１０％程度の２本鎖Ｈ
ＧＦを含み、１本鎖、２本鎖ＨＧＦとも約０．７ＭＮａ
Ｃｌにて溶出された。

【００１０】一方、健常人５名、劇症肝炎患者２名（昏
睡グレードＩＩ）、慢性肝炎患者２名および肝硬変患者
２名より血清を採取した。劇症肝炎患者２名からは、血
漿交換時に血漿を採取した。血漿及び血清サンプルは使
用まで−７０℃にて保存した。次に、健常人血清由来の
ＨＧＦアクチベーターを部分精製した。約５０ｍｌの健
常人血清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）
にてＳＰ−セファロースＦＦカラムにアプライし、次い
で素通り画分をヘパリン−セファロース（ファルマシア
社）カラムにアプライして、０．１−１Ｍ ＮａＣｌに
てグラジエント溶出した。活性画分をさらにヒドロキシ
アパタイト（ファルマシア社）カラムに載せ、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて溶出した。各画分の活
性は以下のように確認した。すなわち、各画分１００μ
ｌと劇症肝炎患者由来血漿サンプル１００μｌを３７
℃、２時間反応させ、サンプル中のＨＧＦ量をＥＬＩＳ
Ａにて測定し、サンプル中ＨＧＦ量を増大させる画分を
ＨＧＦアクチベーター画分とした。

【００１１】上記劇症肝炎患者由来の血漿サンプル２０
０μｌを、ウサギ抗組換えｈＨＧＦ（以下、「ｒｈＨＧ
Ｆ」と略記する）ポリクロ−ナル抗体１０μｇと４℃に
て２０時間、次いで１０μｌのプロテインＡセファロー
スを加えて４℃にて３時間インキュベートし、免疫複合
体を形成させた。これを０．５％ＮＰ−４０を含む２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて十分に
洗浄後、２０μｌのＳＤＳ−サンプル緩衝液（Ｎａｔｕ
ｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））中で５分
間ボイルした。サンプルを還元および非還元条件にてド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法にて分離し（２０ｍＡ
一定）、次いで泳動ゲルを水平型ブロッティング装置
（ザルトリウス社）にセットして１５０ｍＡ一定、１時
間にてナイロン膜（ミリポア社）上に泳動蛋白質をブロ
ットした。ナイロン膜上のＨＧＦ蛋白質は、アビジン／
ビオチン結合を利用したウエスタンブロッティング法に
より検出した。すなわち、膜を５％スキムミルクにてブ
ロッキング後、まずウサギ抗ｈＨＧＦポリクローナル抗
体またはマウス抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体（１０μ
ｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間、次いで抗ウサギまたはマ
ウスＩｇＧビオチン化抗体で３７℃、１時間、さらにス
トレプトアビジン溶液で、室温、約１５分反応させて、
膜上ｈＨＧＦ蛋白質を検出した（ベクター社、ＥＬＩＴ
Ｅキット）。

【００１２】図１ＡおよびＢに結果を示す。図１Ａは、
ＣＨＯトランスフェクタント培養上清より精製したｒｈ
ＨＧＦ１本鎖前駆体(２μｇ／ｌａｎｅ)を還元下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティングの後
に、ナイロン膜上のｒｈＨＧＦ蛋白質をマウス抗ｈＨＧ
Ｆモノクローナル抗体（ｌａｎｅ１）、またはウサギ抗
ｒｈＨＧＦポリクロ−ナル抗体（ｌａｎｅ２）と反応さ
せてＥＬＩＴＥキットで発色させたものである。約９０
ＫダルトンのＨＧＦ１本鎖前駆体は、ｌａｎｅ２でのみ
検出されている。図１Ｂは、劇症肝炎患者由来血漿（ｌ
ａｎｅ１および４）、健常人血漿（ｌａｎｅ２および
５）、または健常人由来ＨＧＦアクチベーター画分と前
処理した劇症肝炎患者由来血漿（ｌａｎｅ３および６）
からＨＧＦ蛋白質を免疫沈降させ、非還元（ｌａｎｅ１
−３）または還元（ｌａｎｅ４−６）条件にてＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分離し、さらにマウス抗ｈＨＧＦモノクロー
ナル抗体（ｌａｎｅ１−３）またはウサギ抗ｒｈＨＧＦ
ポリクロ−ナル抗体（ｌａｎｅ４−６）を用いたウエス
タンブロッティングにてＨＧＦ蛋白質を検出したもので
ある。非還元下において、劇症肝炎由来血漿中には２本
鎖ＨＧＦが検出される（ｌａｎｅ１）が、その量は血漿
サンプルをＨＧＦアクチベーター画分と前処理すること
により２倍以上に増大した（ｌａｎｅ３）。還元下で
は、１本鎖ＨＧＦ前駆体が劇症肝炎由来血漿中に見出さ
れ（ｌａｎｅ４）、その量はＨＧＦアクチベーターとの
前処理により著名に減少した（ｌａｎｅ６）。また、健
常人血漿中には１本鎖、２本鎖いずれの型のＨＧＦも検
出できなかった。

【００１３】以上の結果から、１本鎖ＨＧＦ前駆体はこ
のウエスタンブロッティングの系においては、マウス抗
ｈＨＧＦモノクローナル抗体で検出されず、ウサギ抗ｒ
ｈＨＧＦポリクロ−ナル抗体で検出されること、劇症肝
炎患者血漿中には、２本鎖ＨＧＦに加えて１本鎖ＨＧＦ
前駆体が存在していること、そして１本鎖ＨＧＦも２本
鎖ＨＧＦ同様健常人血漿中には認められないことが判明
した。

【００１４】実施例２ 劇症肝炎患者由来血漿サンプル
中ＨＧＦ量の測定 劇症肝炎患者の血漿サンプル１００μｌに健常人血清等
量を添加して、３７℃にて０−２時間インキュベート
し、反応液の５０μｌをＥＬＩＳＡによるＨＧＦ定量に
供した。対照群として血清の代わりに０．５％ウシ血清
アルブミンを含むリン酸緩衝液／生理食塩水（ＰＢＳ）
を同量添加した。また、血清中ＨＧＦアクチベーターを
不活化する目的で血清とともにロイペプチン５０μＭを
添加する検討も行った。

【００１５】大塚製薬社製、ｈＨＧＦアッセイキットに
より定量した。すなわち、９６穴アッセイプレートの各
ウェルに希釈緩衝液５０μｌ及びｈＨＧＦ標準液または
検体５０μｌを加え、室温にて攪はんしながら１時間反
応させた。洗浄液にて３回洗浄後、第一抗体溶液（マウ
ス抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体）１００μｌを加え、
室温にて攪はんしながら１時間反応させた。次に洗浄液
にて３回洗浄後、第二抗体液（ウサギ抗ｈＨＧＦポリク
ローナル抗体）１００μｌを加え、室温にて攪はんしな
がらさらに１時間反応させた。洗浄液にて３回洗浄後、
発色液を１００μｌ／ウェル加えて室温で約１０分間反
応させ、適度な発色が見られた段階で反応停止液を１０
０μｌ／ウェル重層し、各ウェルの吸光度を４９２ｎｍ
で測定した。サンプル中ＨＧＦ濃度は、ｈＨＧＦ標準曲
線より算出した。表１に結果を示す。

【００１６】

【表１】 表１ ──────────────────────────────────── ＨＧＦ濃度 （ｎｇ／ｍｌ） ──────────────────── プレインキュベーション時間 ０ ３０分 １２０分 ──────────────────────────────────── 正常人血清＋ＰＢＳ <0.1 <0.1 <0.1 患者血漿 ＋ＰＢＳ 6.38±0.16 7.12±0.20 8.72±0.35 患者血漿 ＋ＰＢＳ ＋ロイペプチン − − 6.45±0.13 患者血漿 ＋正常人血清 <6.39 11.96±1.01 15.43±0.70 患者血漿 ＋正常人血清 ＋ロイペプチン − − 8.06±0.55 ────────────────────────────────────

【００１７】表１において、劇症肝炎由来血漿中のＥＬ
ＩＳＡにて測定されるＨＧＦ量は、血清とのプレインキ
ュベーションにより増大し、２時間後には約２．４倍に
なった。しかしながら、ロイペプチン添加サンプルで
は、この増加は認められず、健常人血漿中にもプレイン
キュベーション前後でＨＧＦは認められなかった。次
に、正常人血清の代わりにＨＧＦアクチベーターを用い
て同様の試験を行った。結果を表２に示す。

【００１８】

【表２】 表２ ─────────────────────────────── 粗精製ＨＧＦ ＨＧＦ濃度 アクチベーター （ｎｇ／ｍｌ） ─────────────────────────────── 患者血漿 − 8.18±0.24 患者血漿 ＋ 16.38±0.47 患者血漿＋ロイペプチン ＋ 8.57±0.33 組換え１本鎖ＨＧＦ前駆体 − 2.40±0.23 組換え１本鎖ＨＧＦ前駆体 ＋ 7.96±0.30 組換え１本鎖ＨＧＦ前駆体 ＋ロイペプチン ＋ 3.22±0.42 ───────────────────────────────

【００１９】正常人血清の代わりに粗精製ＨＧＦアクチ
ベーターを用いても、同様の結果が得られた。すなわ
ち、劇症肝炎患者血漿中ＨＧＦ値はＨＧＦアクチベータ
ーとのプレインキュベーションで約２倍に増加した。さ
らに、組換え１本鎖ＨＧＦ前駆体のＥＬＩＳＡによるＨ
ＧＦ値も、ＨＧＦアクチベーターとのプレインキュベー
ションで約３．３倍に増加した。以上の結果から、患者
血漿中には、２本鎖のみならず１本鎖ＨＧＦ前駆体が存
在しており、健常人血清中のＨＧＦアクチベーターによ
ってプロセスされること、およびプロセス化によって潜
在していた１本鎖ＨＧＦがＥＬＩＳＡに反応するように
なってＨＧＦ測定値が数倍に上昇することが明かとなっ
た。

【００２０】実施例３ 肝疾患患者由来血漿サンプルと
各種血清との前処理によるサンプル中ＨＧＦ量の変動 実施例１に示す如く採取した劇症肝炎、慢性肝炎、およ
び肝硬変由来血清を直接、または３７℃で２時間プレイ
ンキュベートした後にＨＧＦ測定用ＥＬＩＳＡに供し
た。その際、一部のサンプルには５０μＭロイペプチン
を添加して、血清中のＨＧＦアクチベーターの作用を抑
える処置を施した。表３に結果を示す。

【００２１】

【表３】 表３ ──────────────────────────────────── プレインキュベーション ロイペプチン ＨＧＦ濃度 （ｎｇ／ｍｌ） ──────────────────────────────────── 劇症肝炎患者Ａ − − 5.59±0.47 ＋ − 9.01±0.34 劇症肝炎患者Ｂ − − 7.43±0.35 ＋ − 9.62±0.31 ＋ ＋ 7.93±0.30 慢性肝炎患者Ａ − − 0.51±0.03 ＋ − 0.67±0.07 慢性肝炎患者Ｂ − − 0.45±0.04 ＋ − 0.68±0.06 ＋ ＋ 0.51±0.02 肝硬変患者Ａ − − 0.33±0.02 ＋ − 0.46±0.03 肝硬変患者Ｂ − − 0.31±0.05 ＋ − 0.47±0.06 ＋ ＋ 0.31±0.01 ────────────────────────────────────

【００２２】血清サンプルのプレインキュベーションに
より、サンプル中ＨＧＦ値は劇症肝炎、慢性肝炎、肝硬
変由来のいずれにおいても１．３−１．６倍上昇した。
実施例１および２で述べたように、この測定値の上昇
は、サンプル中に１本鎖ＨＧＦ前駆体が存在しており、
それがＨＧＦアクチベーターでプロセスされることによ
って初めてＥＬＩＳＡ抗原として認識されることに起因
する。実際、ＨＧＦアクチベーター活性を阻害するロイ
ペプチン存在下では、ＨＧＦ値の上昇は認められなかっ
た。

【００２３】以上の結果より、劇症肝炎のみならず、慢
性肝炎、肝硬変など種々の肝疾患においても１本鎖ＨＧ
Ｆ前駆体の存在すること、および患者自身の血清中にも
ＨＧＦアクチベーターが存在することが判明した。患者
血中においては、ＨＧＦアクチベーターは部分的にしか
活性化されていない為に、血中のＨＧＦの一部は１本鎖
前駆体として存在すると解釈される。 実施例４ １本鎖ＨＧＦ前駆体を測定可能なＥＬＩＳＡ
法 実施例１にて用いたｈＨＧＦアッセイキットは１本鎖Ｈ
ＧＦ前駆体を測定できず、それは一次抗体の反応性に起
因した。そこで、他の抗体、ウサギ抗ｒｈＨＧＦポリク
ローナル抗体およびマウス抗ｒｈＨＧＦモノクローナル
抗体を調製してＥＬＩＳＡを確立し、１本鎖ＨＧＦ前駆
体および２本鎖成熟型ＨＧＦに対する反応性を検討し
た。

【００２４】まずウサギ抗ＨＧＦポリクローナル抗体を
調製した。ニュージーランドホワイトラビット雌１０週
齢に、特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法で精
製したｒｈＨＧＦ５ｍｇをフロイント完全アジュバント
（１：１）とよく混合して背部皮内投与した（０週）。
次いで、１０週後にｒｈＨＧＦ約１．５ｍｇをフロイン
ト不完全アジュバント（１：１）とよく混合して脾臓内
に直接投与した。１３週後にｒｈＨＧＦ１５０μｇを３
００μｌの０．５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１％ツウィーン
２０に溶解して耳静脈より投与した。１６週目にはオク
タロニー法にて＞１２８倍の力価が認められたため、耳
動脈より採血し血清を得た。

【００２５】次に、マウス抗ＨＧＦモノクローナル抗体
を調製した。ＢＡＬＢ／ｃマウス雄８週齢に、ｒｈＨＧ
Ｆ３０μｇをフロイント完全アジュバント（１：１）と
よく混合して腹腔内投与した（０週）。次いで、２およ
び４週後にｒｈＨＧＦ３０μｇをフロイント不完全アジ
ュバント（１：１）とよく混合して腹腔内投与した。さ
らに、６週後、ｒｈＨＧＦ４５μｇをＰＢＳに溶解して
尾静脈より投与した。最終免疫の２日後に脾臓を摘出し
て、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させ、目的
の抗体を安定して生産するハイブリドーマを樹立した。
この細胞株を培養し、培養上清を取得して抗体ソースと
した。

【００２６】ウサギ抗ｒｈＨＧＦポリクローナル抗体を
含有する血清はＰＢＳにて１０倍に希釈し、またマウス
抗ｒｈＨＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの培養上清は４０％硫安沈澱析出物を１００ｍＭ
ＮａＣｌ−１０ｍＭ トリス（ｐＨ９）に溶解して、プ
ロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフィ−に
供した。サンプルを添加したカラムはＰＢＳ（血清サン
プル）または１００ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ トリス
（ｐＨ９）でよく洗浄後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ２．８）にて目的抗体を溶出した。得られた抗体
含有液はＰＢＳにて透析、分注し、使用まで−８０℃に
て保管した。

【００２７】得られた抗体のうち、ウサギポリクローナ
ル抗体の一部は２ステップＥＬＩＳＡ法の二次抗体とし
て用いるため、過よう素酸法によって西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガーマンハイム社）で標
識した。すなわち、ＨＲＰ５ｍｇ含有０．３Ｍ重炭酸ソ
ーダ緩衝液（ｐＨ８．３）１ｍｌに１％ １-フルオロ
２，４−ジニトロベンゼンエタノール液を０．１ｍｌ添
加し、室温にて１時間攪はん後、０．０６Ｍ過よう素酸
ナトリウム水溶液１ｍｌを徐々に添加して室温にて３０
分間攪はん、さらに０．１６Ｍエチレングリコール水溶
液１ｍｌを急速に加えて１時間攪はんした。これを１０
ｍＭ炭酸ソーダ緩衝液ｐＨ９．６に対して４℃、１昼夜
透析して酸化ＨＲＰを調製した。精製抗体５ｍｇも同様
に１０ｍＭ炭酸ソーダ緩衝液ｐＨ９．６に対して透析し
ておき、酸化ＨＲＰ液と抗体液を混合し、室温にて２時
間攪はんした。混合液に水酸化ほう素ナトリウム５ｍｇ
を添加し、４℃で２時間放置後、ＰＢＳに対して透析
し、ＨＲＰ標識抗体を得た。結合しなかった抗体および
ＨＲＰはセファクリルＳ−３００を用いたゲルろ過によ
って除去された。すなわち、予めＰＢＳにて平衡化した
底面積約３ｃｍ² 、ゲル高約１ｍのカラムに透析物をア
プライし、流速０．２−０．５ｍｌ／分程度でＰＢＳに
て溶出させた。ＯＤ₂₈₀ にてモニターしながら最初のピ
ークを分取し、標識抗体画分とした。標識抗体は、小分
けして−８０℃にて保存した。

【００２８】前述した方法で組換えヒト１本鎖ＨＧＦ前
駆体および２本鎖成熟型ＨＧＦを取得した。それぞれの
蛋白量はＯＤ₂₈₀ の値から換算し、一定量を還元下にて
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミド）に
供した。図２にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン
２から４は１本鎖ＨＧＦ前駆体の、レーン５から７は２
本鎖成熟型ＨＧＦの電気泳動パターンを示す。１本鎖Ｈ
ＧＦ前駆体画分は少量の２本鎖ＨＧＦを含むため、図２
のゲルをデンシトメーター（島津製作所社）で解析し
て、バンドの面積から１本鎖／２本鎖の割合を求めた。
図中、レーン１〜６はそれぞれ、分子量マーカー、１本
鎖ＨＧＦ ２．５μｇ／レーン、１本鎖ＨＧＦ ５．０
μｇ／レーン、１本鎖ＨＧＦ １０．０μｇ／レーン、
２本鎖ＨＧＦ ４．３μｇ／レーン、２本鎖ＨＧＦ
８．６μｇ／レーン、２本鎖ＨＧＦ １７．０μｇ／レ
ーンを表す。

【００２９】図３に結果を示す。それによると、２本鎖
成熟型ＨＧＦサンプルは、ほぼ１００％２本鎖で、１本
鎖ＨＧＦ前駆体を含まなかった（図３Ａ）。一方、１本
鎖ＨＧＦ前駆体サンプルは、約７２％の１本鎖型に２８
％の２本鎖成熟型ＨＧＦを含んでいた（図３Ｂ）。次
に、これらのサンプルをＥＬＩＳＡに供して、１本鎖Ｈ
ＧＦ前駆体および２本鎖成熟型ＨＧＦの反応性を検討し
た。

【００３０】上記の如く調製した抗ＨＧＦ抗体を用い
て、ＨＧＦに特異的なＥＬＩＳＡ法を確立した。すなわ
ち、ファルコン社９６穴プレートに一次抗体としてマウ
ス抗ｒｈＨＧＦモノクローナル抗体またはウサギ抗ｒｈ
ＨＧＦポリクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌとなるよう
０．０５Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．６に懸濁）を５０μｌ／
ウェル添加して４℃、１昼夜静置、次いで液を捨て、１
％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを２５０μｌ／ウェル
加えて４℃、１昼夜以上置いてウェル壁をブロッキング
した。試験時にプレートのブロッキング液を捨ててよく
水気を切り、被検液を５０μｌ／ウェル加えた。被検液
は０．１％ＣＨＡＰＳ、１Ｍ（ウサギポリクローナル抗
体）または０．４Ｍ（マウスモノクローナル抗体）Ｎａ
Ｃｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、および０．０５％
ツウィーン２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）にて適当に希釈した。４℃、１昼夜反応後に液
を捨て、０．０５％ツウィーン２０含有ＰＢＳ（以下、
「ＰＢＳＴ」と略記する）にてよく洗浄後、二次抗体と
してＨＲＰ標識ウサギ抗ｒｈＨＧＦ抗体液を５０μｌ／
ウェル添加して室温にて２時間反応させた。二次抗体
は、上記方法にて調製したものを０．１％ウシ血清アル
ブミン含有ＰＢＳＴにて１００−２００倍に希釈して使
用した。２時間後、プレートをＰＢＳＴにてよく洗浄し
て水気を切り、５０μｌ／ウェルの発色液を添加した。
発色液は、０．４ｍｇ／ｍｌオルソフェニレンジアミン
および０．０１％過酸化水素水を含む０．０５Ｍクエン
酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）から成る。室温で１０
−２０分程度反応させ、適度な発色が得られた時点で
４．５Ｎ硫酸５０μｌ／ウェルを添加して反応を停止さ
せた。各ウェルの吸光度は二波長測定用イムノリーダー
（日本インターメッド社）にて測定（４９０／６２０ｎ
ｍ）した。

【００３１】図４および５に結果を示す。図４は、一次
抗体としてウサギ抗ｒｈＨＧＦポリクローナル抗体をプ
レートに固相化した場合（図中□は２本鎖成熟型ＨＧＦ
を、◆は１本鎖ＨＧＦ前駆体を表す）、図５はマウス抗
ｒｈＨＧＦモノクローナル抗体３種を固相化した場合の
１本鎖（図中、◆で表す）および２本鎖ＨＧＦ（図中●
で表す）の反応性を示している。横軸は添加ＨＧＦ濃度
を、縦軸はＥＬＩＳＡ反応性を４９０ｎｍ吸光度で表し
ている。ポリクローナル抗体、３種のモノクローナル抗
体いずれの場合においても、２本鎖成熟型ＨＧＦとほぼ
同等に１本鎖ＨＧＦ前駆体とも反応した。

【００３２】以上の結果より、ＨＧＦのサンドイッチＥ
ＬＩＳＡ法において、固相化する一次抗体の性質を吟味
することにより、２本鎖成熟型ＨＧＦと同等に１本鎖Ｈ
ＧＦ前駆体も測定し得るＥＬＩＳＡが確立できることが
判明した。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、１本鎖ＨＧＦ前駆体を
検出することにより、現在の診断系よりも病態をよく反
映した肝疾患の診断系を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、組換えヒトＨＧＦ前駆体蛋白質に対
するマウス抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体およびウサ
ギ抗ヒトＨＧＦポリクローナル抗体の反応性の相違を、
ウェスタンブロッティングにて比較した図面に代わる電
気泳動写真である。図１Ｂは、劇症肝炎由来血漿中に、
１本鎖ＨＧＦ前駆体の存在を認めた図面に代わる電気泳
動写真である。

【図２】１本鎖ＨＧＦ前駆体および２本鎖成熟型ＨＧＦ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを示した図面に
代わる写真である。

【図３】図２の電気泳動ゲルをデンシトメーターにて解
析し、１本鎖ＨＧＦと２本鎖ＨＧＦの割合を定量化した
図面である。

【図４】ＨＧＦ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ法におけ
る１本鎖ＨＧＦ前駆体および２本鎖成熟型ＨＧＦの反応
性を示す図面である。

【図５】ＨＧＦ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ法におけ
る１本鎖ＨＧＦ前駆体および２本鎖成熟型ＨＧＦの反応
性を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−192297（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−27026（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−18028（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−3199（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−27491（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−22526（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−45534（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−45530（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−208998（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト体液中に含まれる不活性型の１本鎖
   ヒト肝実質細胞増殖因子を免疫学的方法により検出する
   ことを特徴とする、肝疾患の検出方法。
2. 【請求項２】 １本鎖ヒト肝実質細胞増殖因子の検出
   が、活性型の２本鎖ヒト肝実質細胞増殖因子と１本鎖ヒ
   ト肝実質細胞増殖因子の量の総和を検出し、該総和から
   ２本鎖ヒト肝実質細胞増殖因子の量を差し引くことによ
   り行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ２本鎖ヒト肝実質細胞増殖因子と１本鎖
   ヒト肝実質細胞増殖因子の量の総和が、２本鎖ヒト肝実
   質細胞増殖因子及び１本鎖ヒト肝実質細胞増殖因子に対
   して共に反応性を有する抗体を用いて検出され、２本鎖
   ヒト肝実質細胞増殖因子の量が、２本鎖ヒト肝実質細胞
   増殖因子のみに反応性を有する抗体を用いて検出される
   ことを特徴とする請求項２に記載の方法。