JP3482853B2 - ハプテン抗原結合固相及びそれを用いた免疫測定方法 - Google Patents
ハプテン抗原結合固相及びそれを用いた免疫測定方法Info
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- JP3482853B2 JP3482853B2 JP37054397A JP37054397A JP3482853B2 JP 3482853 B2 JP3482853 B2 JP 3482853B2 JP 37054397 A JP37054397 A JP 37054397A JP 37054397 A JP37054397 A JP 37054397A JP 3482853 B2 JP3482853 B2 JP 3482853B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ハプテン抗原結合
固相及びそれを用いた免疫測定方法に関する。
固相及びそれを用いた免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハプテン抗原を測定する方法としては、
競争反応法による測定が広く用いられており、競争反応
法には、固相結合抗原を用いる方法と固相結合抗体を用
いる方法との２通りがある。前者においては、ハプテン
抗原を直接固相に結合させる他に、予め、高分子蛋白質
等の抗原支持物質にハプテン抗原を結合した後、抗原支
持物質を固相に結合することによってハプテン抗原結合
固相を得る手段も用いられている（特開昭６４−６８６
６１号公報）。
競争反応法による測定が広く用いられており、競争反応
法には、固相結合抗原を用いる方法と固相結合抗体を用
いる方法との２通りがある。前者においては、ハプテン
抗原を直接固相に結合させる他に、予め、高分子蛋白質
等の抗原支持物質にハプテン抗原を結合した後、抗原支
持物質を固相に結合することによってハプテン抗原結合
固相を得る手段も用いられている（特開昭６４−６８６
６１号公報）。
【０００３】ハプテン抗原結合固相による競争反応法
は、液相中の標識抗体に対して検体中の未知量の測定対
象抗原と既知量の固相化抗原とを競争させる抗原抗体反
応である。この測定方法において、目的とする測定範囲
内で良好な阻害曲線を得る為には、各反応物の反応濃度
を調節する。一般的には、測定対象ハプテン抗原に対す
る固相化ハプテン抗原のモル比を下げると、測定系の感
度が高くなる。よって、固相に結合するハプテン抗原量
を低下させることで、未知量の抗原量の固相化ハプテン
抗原に対する相対モル比を上げ、測定感度を高めること
ができる。
は、液相中の標識抗体に対して検体中の未知量の測定対
象抗原と既知量の固相化抗原とを競争させる抗原抗体反
応である。この測定方法において、目的とする測定範囲
内で良好な阻害曲線を得る為には、各反応物の反応濃度
を調節する。一般的には、測定対象ハプテン抗原に対す
る固相化ハプテン抗原のモル比を下げると、測定系の感
度が高くなる。よって、固相に結合するハプテン抗原量
を低下させることで、未知量の抗原量の固相化ハプテン
抗原に対する相対モル比を上げ、測定感度を高めること
ができる。
【０００４】ところが、固相に結合するハプテン抗原量
を低下させることは、固相の結合面に対するハプテン抗
原量を少なくすることであり、結果的に、固相上のハプ
テン抗原非結合面が増大する。この場合、ハプテン抗原
非結合面のマスキングが不十分であると、血清由来成
分、例えば、脂質、ステロイド結合性の種々の蛋白質、
その他固相の疎水面に対して親和性を持つ成分等が吸着
しやすくなる。このような血清由来成分の固相への吸着
は、固相に結合した抗原そのものが血清由来成分によっ
て特異的・非特異的に被覆されたり、標識抗体と固相化
抗原との反応が立体的に阻害されたりして、測定値が異
常に高値化する例が多発する結果を引き起こしていた。
を低下させることは、固相の結合面に対するハプテン抗
原量を少なくすることであり、結果的に、固相上のハプ
テン抗原非結合面が増大する。この場合、ハプテン抗原
非結合面のマスキングが不十分であると、血清由来成
分、例えば、脂質、ステロイド結合性の種々の蛋白質、
その他固相の疎水面に対して親和性を持つ成分等が吸着
しやすくなる。このような血清由来成分の固相への吸着
は、固相に結合した抗原そのものが血清由来成分によっ
て特異的・非特異的に被覆されたり、標識抗体と固相化
抗原との反応が立体的に阻害されたりして、測定値が異
常に高値化する例が多発する結果を引き起こしていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ハプテン抗原結合固相を用いた免疫測定方法におい
て、血清由来成分の影響を従来よりも抑制することがで
きるハプテン抗原結合固相及び該固相を用いた免疫測定
方法を提供することである。
は、ハプテン抗原結合固相を用いた免疫測定方法におい
て、血清由来成分の影響を従来よりも抑制することがで
きるハプテン抗原結合固相及び該固相を用いた免疫測定
方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく鋭意研究した結果、ハプテン抗原を抗原
支持物質を介して固相に結合させる際に、固相に対する
結合能力が該抗原支持物質の１／３ないし３倍である共
感作物質を固相に同時に感作させることにより、血清由
来成分の影響を従来よりも抑制することができ、かつ、
測定すべき検体中のハプテン抗原又は抗体を従来よりも
正確に測定することができることを見出し、該ハプテン
抗原結合固相を用いた免疫測定方法を確立して本発明を
完成した。
題を解決すべく鋭意研究した結果、ハプテン抗原を抗原
支持物質を介して固相に結合させる際に、固相に対する
結合能力が該抗原支持物質の１／３ないし３倍である共
感作物質を固相に同時に感作させることにより、血清由
来成分の影響を従来よりも抑制することができ、かつ、
測定すべき検体中のハプテン抗原又は抗体を従来よりも
正確に測定することができることを見出し、該ハプテン
抗原結合固相を用いた免疫測定方法を確立して本発明を
完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、ハプテン抗原が結合
された抗原支持物質と、固相に対する結合能力が該抗原
支持物質の１／３ないし３倍である共感作物質とを固相
に同時に感作させることにより、前記ハプテン抗原が結
合された抗原支持物質と前記共感作物質とが前記固相に
固相化され、次いでさらにマスキングタンパク質を固相
化して成るハプテン抗原結合固相を提供する。また、本
発明は、上記本発明のハプテン結合固相を用いて行う免
疫測定方法を提供する。
された抗原支持物質と、固相に対する結合能力が該抗原
支持物質の１／３ないし３倍である共感作物質とを固相
に同時に感作させることにより、前記ハプテン抗原が結
合された抗原支持物質と前記共感作物質とが前記固相に
固相化され、次いでさらにマスキングタンパク質を固相
化して成るハプテン抗原結合固相を提供する。また、本
発明は、上記本発明のハプテン結合固相を用いて行う免
疫測定方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のハプテン抗原結合固相に
おいて結合されるハプテン抗原は、何ら限定されるもの
ではなく、いかなるハプテン抗原であってもよい。例と
して、テストステロン、プロゲステロン及びエストラジ
オールのようなステロイド系ホルモンを挙げることがで
きるがこれらに限定されるものではない。
おいて結合されるハプテン抗原は、何ら限定されるもの
ではなく、いかなるハプテン抗原であってもよい。例と
して、テストステロン、プロゲステロン及びエストラジ
オールのようなステロイド系ホルモンを挙げることがで
きるがこれらに限定されるものではない。
【０００９】前記ハプテン抗原は、抗原支持物質に結合
されている。抗原支持物質としては、高分子物質（分子
量１万以上、好ましくは５万〜１００万）が好ましく、
なかでもタンパク質、脂質等が好ましい。好ましいタン
パク質の例として、抗体、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、カゼイン、ゼラチン、フェリチン等を挙げること
ができ、脂質の例として、グロポシド型糖脂質、ガング
リオシド型糖脂質、リン脂質等を挙げることができるが
これらに限定されるものではない。これらのうち、抗体
が特に好ましく、抗体としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＭ等、いずれの動物由来の抗体も用いることが
できる。また、抗体はモノクローナル抗体、ポリクロー
ナル抗体のいずれでも用いることができるが、測定対象
ハプテン抗原に対して反応特異性を持たない抗体でなけ
ればならない。なお、モノクローナル抗体は、同一分子
を大量に得ることが可能であるので、抗原支持物質及び
後述の共感作物質を共にモノクローナル抗体とすること
により、特定の特性を有するハプテン抗原結合固相を再
現性良く作製できるという利点がある。
されている。抗原支持物質としては、高分子物質（分子
量１万以上、好ましくは５万〜１００万）が好ましく、
なかでもタンパク質、脂質等が好ましい。好ましいタン
パク質の例として、抗体、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、カゼイン、ゼラチン、フェリチン等を挙げること
ができ、脂質の例として、グロポシド型糖脂質、ガング
リオシド型糖脂質、リン脂質等を挙げることができるが
これらに限定されるものではない。これらのうち、抗体
が特に好ましく、抗体としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＭ等、いずれの動物由来の抗体も用いることが
できる。また、抗体はモノクローナル抗体、ポリクロー
ナル抗体のいずれでも用いることができるが、測定対象
ハプテン抗原に対して反応特異性を持たない抗体でなけ
ればならない。なお、モノクローナル抗体は、同一分子
を大量に得ることが可能であるので、抗原支持物質及び
後述の共感作物質を共にモノクローナル抗体とすること
により、特定の特性を有するハプテン抗原結合固相を再
現性良く作製できるという利点がある。
【００１０】ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させ
るには、共有結合が好ましく、該結合には公知の技術を
適宜用いることができる。例えば、抗原支持物質として
タンパク質を用いる場合は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミ
ド活性化エステル法により、ハプテン抗原に導入したサ
クシイミド基とタンパク質又は糖タンパク質のアミノ基
とを反応させ、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合さ
せることができる。
るには、共有結合が好ましく、該結合には公知の技術を
適宜用いることができる。例えば、抗原支持物質として
タンパク質を用いる場合は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミ
ド活性化エステル法により、ハプテン抗原に導入したサ
クシイミド基とタンパク質又は糖タンパク質のアミノ基
とを反応させ、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合さ
せることができる。
【００１１】この時のハプテン抗原と抗原支持物質との
反応比は測定系の感度に影響するため、目的とする感度
に合わせて反応条件を設定する。通常、反応時のハプテ
ン抗原：抗原支持物質のモル比は、０．１〜１００：１
で用いることができるが、ハプテン抗原と抗原支持物質
を１：１で結合させるためには、ほぼ同モルで反応させ
るのが好ましい。また、抗原支持物質とハプテン抗原の
結合比は、結合反応時のモル比だけでなく、結合反応時
の反応濃度にも関係するため、目的とする比率でハプテ
ン抗原と抗原支持物質とを結合させる為には、反応濃度
にも留意する必要がある。通常、反応濃度を濃くすると
ハプテン抗原が高比率で結合した抗原支持物質結合ハプ
テン抗原が、薄くするとハプテン抗原が低比率の抗原支
持物質結合ハプテン抗原が調製できる。
反応比は測定系の感度に影響するため、目的とする感度
に合わせて反応条件を設定する。通常、反応時のハプテ
ン抗原：抗原支持物質のモル比は、０．１〜１００：１
で用いることができるが、ハプテン抗原と抗原支持物質
を１：１で結合させるためには、ほぼ同モルで反応させ
るのが好ましい。また、抗原支持物質とハプテン抗原の
結合比は、結合反応時のモル比だけでなく、結合反応時
の反応濃度にも関係するため、目的とする比率でハプテ
ン抗原と抗原支持物質とを結合させる為には、反応濃度
にも留意する必要がある。通常、反応濃度を濃くすると
ハプテン抗原が高比率で結合した抗原支持物質結合ハプ
テン抗原が、薄くするとハプテン抗原が低比率の抗原支
持物質結合ハプテン抗原が調製できる。
【００１２】本発明では、ハプテン抗原が結合された抗
原支持物質と同時に、共感作物質が感作される。共感作
物質は、固相への結合能力が、抗原支持物質の１／３〜
３倍、好ましくは１／２〜２倍、最も好ましくは約１倍
である。ここで、固相への結合能力は、抗原支持物質と
共感作物質の等モル混合物を固相に共感作した場合の、
固相に固相化される抗原支持物質と共感作物質のモル比
により規定される。すなわち、例えば、共感作物質の固
相への結合能力が抗原支持物質の３倍である場合とは、
共感作物質と抗原支持物質の等モル混合物を固相に感作
した場合、固相に固相化される共感作物質のモル数が抗
原支持物質の３倍であることを意味する。
原支持物質と同時に、共感作物質が感作される。共感作
物質は、固相への結合能力が、抗原支持物質の１／３〜
３倍、好ましくは１／２〜２倍、最も好ましくは約１倍
である。ここで、固相への結合能力は、抗原支持物質と
共感作物質の等モル混合物を固相に共感作した場合の、
固相に固相化される抗原支持物質と共感作物質のモル比
により規定される。すなわち、例えば、共感作物質の固
相への結合能力が抗原支持物質の３倍である場合とは、
共感作物質と抗原支持物質の等モル混合物を固相に感作
した場合、固相に固相化される共感作物質のモル数が抗
原支持物質の３倍であることを意味する。
【００１３】共感作物質の固相への結合能力が、抗原支
持物質の結合能力の１／３〜３倍（以下、このことを
「同等の結合能力を有する」ということがある）である
という要件は、共感作物質として抗原支持物質と同じ物
質又は類似の物質を採用することにより容易に達成でき
る。例えば、抗原支持物質として抗体を用いる場合に
は、共感作物質としても抗体を用いればよい。抗体同士
であれば、クラス、サブクラス、由来動物、モノクロー
ナル抗体であるかポリクローナル抗体であるか等にかか
わらず、同等の結合能力を有する。特に、抗原支持物質
及び共感作物質を共に同一のモノクローナル抗体とする
場合には、モノクローナル抗体は抗体分子が同一である
から固相への結合能力も完全に同一であり、従って、一
定の性質のハプテン抗原結合固相を再現性良く調製する
ことができ、有利である。
持物質の結合能力の１／３〜３倍（以下、このことを
「同等の結合能力を有する」ということがある）である
という要件は、共感作物質として抗原支持物質と同じ物
質又は類似の物質を採用することにより容易に達成でき
る。例えば、抗原支持物質として抗体を用いる場合に
は、共感作物質としても抗体を用いればよい。抗体同士
であれば、クラス、サブクラス、由来動物、モノクロー
ナル抗体であるかポリクローナル抗体であるか等にかか
わらず、同等の結合能力を有する。特に、抗原支持物質
及び共感作物質を共に同一のモノクローナル抗体とする
場合には、モノクローナル抗体は抗体分子が同一である
から固相への結合能力も完全に同一であり、従って、一
定の性質のハプテン抗原結合固相を再現性良く調製する
ことができ、有利である。
【００１４】共感作時の、ハプテン抗原が結合された抗
原支持物質と共感作物質の混合比率は、モル比で１：１
〜１：５００が好ましく、１：１０〜１：２００がさら
に好ましい。測定系の感度が高くなるよう固相結合ハプ
テン抗原量を少なくし、かつ、共感作時のハプテン抗原
結合抗原支持物質と共感作物質との混合比を再現性良く
調整するためには、ハプテン抗原：抗原支持物質の結合
モル比を１：１とし、共感作時の抗原支持物質：共感作
物質モル比を１：１０程度に条件設定することが好まし
い。尚、特に、共感作液中のハプテン抗原モル比を低く
設定した場合には、共感作時の感作物質量（すなわち、
ハプテン抗原が結合された抗原支持物質と共感作物質の
合計量）を、固相上の物質総吸着容量とほぼ同程度とす
ると、再現性の高いハプテン抗原結合固相を調製するの
に好ましい。
原支持物質と共感作物質の混合比率は、モル比で１：１
〜１：５００が好ましく、１：１０〜１：２００がさら
に好ましい。測定系の感度が高くなるよう固相結合ハプ
テン抗原量を少なくし、かつ、共感作時のハプテン抗原
結合抗原支持物質と共感作物質との混合比を再現性良く
調整するためには、ハプテン抗原：抗原支持物質の結合
モル比を１：１とし、共感作時の抗原支持物質：共感作
物質モル比を１：１０程度に条件設定することが好まし
い。尚、特に、共感作液中のハプテン抗原モル比を低く
設定した場合には、共感作時の感作物質量（すなわち、
ハプテン抗原が結合された抗原支持物質と共感作物質の
合計量）を、固相上の物質総吸着容量とほぼ同程度とす
ると、再現性の高いハプテン抗原結合固相を調製するの
に好ましい。
【００１５】共感作には、通常使われている感作条件を
適宜用いることができる。例えば、共感作液（すなわ
ち、ハプテン抗原が結合された抗原支持物質と共感作物
質との混合溶液）と固相とを３７℃で１時間〜数時間反
応させたり、４℃で一晩反応させることで、ハプテン抗
原結合固相を調製することができる。この場合、共感作
液中の感作物質量は、特に限定されないが、０．０５〜
１０ｍｇ程度が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３
ｍｇ程度である。また、共感作液の溶媒としては、通常
この分野において用いられている緩衝液を用いることが
できる。
適宜用いることができる。例えば、共感作液（すなわ
ち、ハプテン抗原が結合された抗原支持物質と共感作物
質との混合溶液）と固相とを３７℃で１時間〜数時間反
応させたり、４℃で一晩反応させることで、ハプテン抗
原結合固相を調製することができる。この場合、共感作
液中の感作物質量は、特に限定されないが、０．０５〜
１０ｍｇ程度が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３
ｍｇ程度である。また、共感作液の溶媒としては、通常
この分野において用いられている緩衝液を用いることが
できる。
【００１６】上記共感作後、ＢＳＡ、スキムミルク、ゼ
ラチン、動物血清等のマスキングタンパク質による通常
のマスキングを行う。この場合のマスキングの条件は、
従来と同様であり、例えば、マスキングタンパク質を
０．１〜２０％（ｗ／ｖ）程度に含む溶液を３７℃で１
時間〜数時間又は４℃で一夜反応させればよい。マスキ
ングを行うことにより、非特異吸着をさらに抑制するこ
とができる。
ラチン、動物血清等のマスキングタンパク質による通常
のマスキングを行う。この場合のマスキングの条件は、
従来と同様であり、例えば、マスキングタンパク質を
０．１〜２０％（ｗ／ｖ）程度に含む溶液を３７℃で１
時間〜数時間又は４℃で一夜反応させればよい。マスキ
ングを行うことにより、非特異吸着をさらに抑制するこ
とができる。
【００１７】本発明の共感作によるハプテン抗原結合固
相は、公知の免疫学的測定方法のいずれにも用いること
ができる。測定対象がハプテン抗原である場合には、例
えば、標識したハプテン抗原特異抗体に対して、測定対
象ハプテン抗原と本願発明の共感作によるハプテン抗原
とを競争させる競争反応測定法により、測定対象ハプテ
ン抗原を検出することができ、また、測定対象が抗体で
ある場合には、例えば、本発明の共感作によるハプテン
抗原結合固相に測定対象の抗体を反応させ、標識した抗
抗体にて、測定対象抗体量を検出することができる。該
免疫測定方法に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体のいずれにも限定されるものではな
い。なお、これらの免疫測定方法自体はこの分野におい
て周知であり、下記実施例にも具体的に記載されてい
る。
相は、公知の免疫学的測定方法のいずれにも用いること
ができる。測定対象がハプテン抗原である場合には、例
えば、標識したハプテン抗原特異抗体に対して、測定対
象ハプテン抗原と本願発明の共感作によるハプテン抗原
とを競争させる競争反応測定法により、測定対象ハプテ
ン抗原を検出することができ、また、測定対象が抗体で
ある場合には、例えば、本発明の共感作によるハプテン
抗原結合固相に測定対象の抗体を反応させ、標識した抗
抗体にて、測定対象抗体量を検出することができる。該
免疫測定方法に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体のいずれにも限定されるものではな
い。なお、これらの免疫測定方法自体はこの分野におい
て周知であり、下記実施例にも具体的に記載されてい
る。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００１９】参考例１ 抗体結合テストステロンの調製
特開昭６４−６８６６１号公報に記載の方法に準じ、テ
ストステロン−３カルボキシメトキシム−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステルのサクシニミドとマウス抗カル
シトニンモノクローナル抗体ＫＬＧ１−７（自家製、以
下、「ＫＬＧ１−７」と記載する）のリジンにおけるア
ミノ基とを反応させ、抗体結合テストステロンを調製し
た。
ストステロン−３カルボキシメトキシム−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステルのサクシニミドとマウス抗カル
シトニンモノクローナル抗体ＫＬＧ１−７（自家製、以
下、「ＫＬＧ１−７」と記載する）のリジンにおけるア
ミノ基とを反応させ、抗体結合テストステロンを調製し
た。
【００２０】すなわち、０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ
７．０で１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＫＬＧ１−７
１ｍｌに、ジメチルホルムアルデヒドで２．４４ｍｇ
／ｍｌに調製したテストステロン−３カルボキシメトキ
シム−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ベーリン
ガーマンハイム社製）２５μｌを添加し、３０℃１時間
静置してカップリング反応を行った。その後、反応液を
０．１％アジ化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７．０にて平衡化したＰＤ−１０カラムセファ
デックスＧ−２５Ｍ（ファルマシア社製）で脱塩した。
７．０で１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＫＬＧ１−７
１ｍｌに、ジメチルホルムアルデヒドで２．４４ｍｇ
／ｍｌに調製したテストステロン−３カルボキシメトキ
シム−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ベーリン
ガーマンハイム社製）２５μｌを添加し、３０℃１時間
静置してカップリング反応を行った。その後、反応液を
０．１％アジ化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７．０にて平衡化したＰＤ−１０カラムセファ
デックスＧ−２５Ｍ（ファルマシア社製）で脱塩した。
【００２１】得られたテストステロン−３カルボキシメ
トキシム結合ＫＬＧ１−７溶液（以下、テストステロン
結合ＫＬＧ１−７と記載する）は吸光度を測定して濃度
を算出した。
トキシム結合ＫＬＧ１−７溶液（以下、テストステロン
結合ＫＬＧ１−７と記載する）は吸光度を測定して濃度
を算出した。
【００２２】実施例１ ＫＬＧ１−７とテストステロン
結合ＫＬＧ１−７との共感作法による粒子の調製 ＫＬＧ１−７と参考例１で調製したテストステロン結合
ＫＬＧ１−７を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解
混合し、それぞれＫＬＧ１−７を０．５ｍｇ／ｍｌ、テ
ストステロン結合ＫＬＧ１−７を０．０１ｍｇ／ｍｌに
調製し、これを共感作用の緩衝液とした。次いで、蒸留
水で超音波洗浄した磁性粒子（日本ペイント社製）２０
ｍｇに、共感作用緩衝液４ｍｌを加え、充分混和後、ロ
ーテーターで３７℃１時間、回転反応させた。反応終了
後、磁性粒子を磁石で吸引して集め、反応液を吸引除去
し、蒸留水で１分間の超音波洗浄を３回行った。洗浄
後、感作磁性粒子を５０ｍＭメス緩衝液ｐＨ５．５に懸
濁し、４０ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−(3−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライテス
ク社製）水溶液を５０μｌ添加して、ローテーターで２
５℃３０分、回転反応させた。磁性粒子を磁石で吸引し
て集め、反応液を吸引除去し、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムと０．１％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭビス
−トリス緩衝液、ｐＨ７．２で１分間の超音波洗浄を３
回行った。以下、この粒子を共感作粒子と記載する。洗
浄後、共感作粒子を同緩衝液４ｍｌに懸濁して、４℃で
保存した。
結合ＫＬＧ１−７との共感作法による粒子の調製 ＫＬＧ１−７と参考例１で調製したテストステロン結合
ＫＬＧ１−７を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解
混合し、それぞれＫＬＧ１−７を０．５ｍｇ／ｍｌ、テ
ストステロン結合ＫＬＧ１−７を０．０１ｍｇ／ｍｌに
調製し、これを共感作用の緩衝液とした。次いで、蒸留
水で超音波洗浄した磁性粒子（日本ペイント社製）２０
ｍｇに、共感作用緩衝液４ｍｌを加え、充分混和後、ロ
ーテーターで３７℃１時間、回転反応させた。反応終了
後、磁性粒子を磁石で吸引して集め、反応液を吸引除去
し、蒸留水で１分間の超音波洗浄を３回行った。洗浄
後、感作磁性粒子を５０ｍＭメス緩衝液ｐＨ５．５に懸
濁し、４０ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−(3−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライテス
ク社製）水溶液を５０μｌ添加して、ローテーターで２
５℃３０分、回転反応させた。磁性粒子を磁石で吸引し
て集め、反応液を吸引除去し、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムと０．１％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭビス
−トリス緩衝液、ｐＨ７．２で１分間の超音波洗浄を３
回行った。以下、この粒子を共感作粒子と記載する。洗
浄後、共感作粒子を同緩衝液４ｍｌに懸濁して、４℃で
保存した。
【００２３】得られた共感作粒子を、１５０ｍＭ塩化ナ
トリウムと０．１％アジ化ナトリウム、２％ＢＳＡを含
有する５０ｍＭビス−トリス緩衝液、ｐＨ７．２で１分
間の超音波洗浄を３回行い、同緩衝液４ｍｌに懸濁し
て、４℃で保存した。
トリウムと０．１％アジ化ナトリウム、２％ＢＳＡを含
有する５０ｍＭビス−トリス緩衝液、ｐＨ７．２で１分
間の超音波洗浄を３回行い、同緩衝液４ｍｌに懸濁し
て、４℃で保存した。
【００２４】比較例１ 従来の感作法による粒子調製
法 参考例１で調製したテストステロン結合ＫＬＧ１−７を
０．０１ｍｇ／ｍｌになるよう０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ５．５に溶解し、感作用の緩衝液とした。実施例１と
同様の方法で、磁性粒子へ感作した（以下、本明細書で
は従来感作粒子と記載する）。従来感作粒子は、使用時
まで４℃で保存した。
法 参考例１で調製したテストステロン結合ＫＬＧ１−７を
０．０１ｍｇ／ｍｌになるよう０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ５．５に溶解し、感作用の緩衝液とした。実施例１と
同様の方法で、磁性粒子へ感作した（以下、本明細書で
は従来感作粒子と記載する）。従来感作粒子は、使用時
まで４℃で保存した。
【００２５】比較例２ マスキング処理従来感作粒子
比較例１に記載の方法と同様に調製した従来感作粒子
を、実施例１に記載の方法と同様にＢＳＡマスキング処
理し、使用時まで４℃で保存した。
を、実施例１に記載の方法と同様にＢＳＡマスキング処
理し、使用時まで４℃で保存した。
【００２６】実施例２ 固相の比較方法およびその結果
実施例１におけるマスキング処理前の粒子並びに実施例
１、比較例１及び比較例２で調製した４種類の感作粒子
を用いて、１ステップ競争反応における非特異反応の比
較を行った。すなわち、各粒子を、ＢＳＡを含有する５
０ｍＭビス−トリス緩衝液ｐＨ７．２（以下、粒子希釈
液と記載する）で３３．３倍希釈して粒子液とした。一
方、抗テストステロン抗体（ダコ社製）とウシ小腸由来
アルカリフォスファターゼ（オリエンタル酵母社製）と
をヨシタケらの方法（Yoshitakeet al., J.Biochem. 19
82, 92(5), p1413-1424）により結合し、酵素標識抗体
を調製し、酵素標識抗体の希釈用緩衝液には、ＢＳＡを
含有する５０ｍＭメス緩衝液ｐＨ６．８（以下、標識抗
体希釈液と記載する）で０．１μｇ／ｍｌとした。標準
抗原は、テストステロンをエタノールに溶解した溶解液
をステロイド除去血清（エービーティー社製）に添加し
て調製した。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰＣ社
製）と不一致を示す非特異検体４例を用いた。基質緩衝
液と洗浄液はルミパルス基質液（富士レビオ社製）とル
ミパルス洗浄液（富士レビオ社製）をそれぞれ用いた。
１、比較例１及び比較例２で調製した４種類の感作粒子
を用いて、１ステップ競争反応における非特異反応の比
較を行った。すなわち、各粒子を、ＢＳＡを含有する５
０ｍＭビス−トリス緩衝液ｐＨ７．２（以下、粒子希釈
液と記載する）で３３．３倍希釈して粒子液とした。一
方、抗テストステロン抗体（ダコ社製）とウシ小腸由来
アルカリフォスファターゼ（オリエンタル酵母社製）と
をヨシタケらの方法（Yoshitakeet al., J.Biochem. 19
82, 92(5), p1413-1424）により結合し、酵素標識抗体
を調製し、酵素標識抗体の希釈用緩衝液には、ＢＳＡを
含有する５０ｍＭメス緩衝液ｐＨ６．８（以下、標識抗
体希釈液と記載する）で０．１μｇ／ｍｌとした。標準
抗原は、テストステロンをエタノールに溶解した溶解液
をステロイド除去血清（エービーティー社製）に添加し
て調製した。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰＣ社
製）と不一致を示す非特異検体４例を用いた。基質緩衝
液と洗浄液はルミパルス基質液（富士レビオ社製）とル
ミパルス洗浄液（富士レビオ社製）をそれぞれ用いた。
【００２７】粒子液２５０μｌ、標識抗体液５０μｌ、
標準抗原又は検体５０μｌを用い、全自動化学発光免疫
測定システムルミパルス（富士レビオ社製）により３７
℃３０分の１ステップ競争法測定を行った。この操作は
具体的には次のように行った。すなわち、粒子液２５０
μｌに標準抗原又は検体５０μｌと標識抗体液５０μｌ
を加え、３７℃、２０分間免疫反応を行った後、磁力に
より磁性粒子と反応液を分離し、洗浄液２００μｌを注
入、撹拌、吸引することを繰返して洗浄を行った。次い
で基質液２００μｌを加えて３７℃、５分間酵素反応を
行った後、発光量を測定した。検体測定値は、標準抗原
の発光量から作成した検量線に基づいて算出した。な
お、これらの操作は全てコンピューター制御により実施
した。
標準抗原又は検体５０μｌを用い、全自動化学発光免疫
測定システムルミパルス（富士レビオ社製）により３７
℃３０分の１ステップ競争法測定を行った。この操作は
具体的には次のように行った。すなわち、粒子液２５０
μｌに標準抗原又は検体５０μｌと標識抗体液５０μｌ
を加え、３７℃、２０分間免疫反応を行った後、磁力に
より磁性粒子と反応液を分離し、洗浄液２００μｌを注
入、撹拌、吸引することを繰返して洗浄を行った。次い
で基質液２００μｌを加えて３７℃、５分間酵素反応を
行った後、発光量を測定した。検体測定値は、標準抗原
の発光量から作成した検量線に基づいて算出した。な
お、これらの操作は全てコンピューター制御により実施
した。
【００２８】結果を表１に示す。共感作粒子によって得
られた測定値は、従来感作粒子の測定値に対し、全例で
低下し、マスキング処理従来粒子とはほぼ同等の測定値
を示した。本発明の粒子であるマスキング処理共感作粒
子では、共感作粒子の測定値よりさらに低下し、共感作
とマスキング処理による相乗効果が認められた。
られた測定値は、従来感作粒子の測定値に対し、全例で
低下し、マスキング処理従来粒子とはほぼ同等の測定値
を示した。本発明の粒子であるマスキング処理共感作粒
子では、共感作粒子の測定値よりさらに低下し、共感作
とマスキング処理による相乗効果が認められた。
【００２９】
【表１】
【００３０】実施例４ 抗体共感作濃度の検討１
ＫＬＧ１−７濃度を０〜２ｍｇ／ｍｌの範囲で変化させ
て、実施例１と同様の方法で共感作粒子を調製し、実施
例３に記載の方法と同様にテストステロンの測定を行っ
た。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰＣ製）との不
一致検体５例を用いた。
て、実施例１と同様の方法で共感作粒子を調製し、実施
例３に記載の方法と同様にテストステロンの測定を行っ
た。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰＣ製）との不
一致検体５例を用いた。
【００３１】標準抗原０濃度のカウント値を１００％と
した時の各標準抗原液の応答（Ｂ／Ｂ0 （％））を図１
に、検体測定値を図２に示す。標準曲線のＢ／Ｂ0
（％）は、いずれの添加濃度域においても一定で、共感
作の抗体濃度による感度の変化はなかった。検体測定値
は、抗体共感作濃度０．２ｍｇ／ｍｌまでは急激に、
０．２〜０．５ｍｇ／ｍｌまでは緩やかに低下し、それ
以上では一定の測定値を示した。
した時の各標準抗原液の応答（Ｂ／Ｂ0 （％））を図１
に、検体測定値を図２に示す。標準曲線のＢ／Ｂ0
（％）は、いずれの添加濃度域においても一定で、共感
作の抗体濃度による感度の変化はなかった。検体測定値
は、抗体共感作濃度０．２ｍｇ／ｍｌまでは急激に、
０．２〜０．５ｍｇ／ｍｌまでは緩やかに低下し、それ
以上では一定の測定値を示した。
【００３２】実施例５ 抗体共感作濃度の検討２
参考例１に記載の方法で、プロゲステロン−１１α−カ
ルボキシメチルエステル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
エステル（ベーリンガーマンハイム社製）をＫＬＧ１−
７に結合したプロゲステロン−１１α−カルボキシメチ
ルエステル結合ＫＬＧ１−７抗体（以下、プロゲステロ
ン結合ＫＬＧと記載する）を調製した。これを、ＫＬＧ
１−７濃度を０〜２ｍｇ／ｍｌの範囲で変化させて、実
施例１と同様の方法で共感作粒子を調製し、粒子希釈液
で懸濁した。
ルボキシメチルエステル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
エステル（ベーリンガーマンハイム社製）をＫＬＧ１−
７に結合したプロゲステロン−１１α−カルボキシメチ
ルエステル結合ＫＬＧ１−７抗体（以下、プロゲステロ
ン結合ＫＬＧと記載する）を調製した。これを、ＫＬＧ
１−７濃度を０〜２ｍｇ／ｍｌの範囲で変化させて、実
施例１と同様の方法で共感作粒子を調製し、粒子希釈液
で懸濁した。
【００３３】一方、抗プロゲステロンモノクローナル抗
体（ダコ社製）とウシ小腸由来アルカリフォスファター
ゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタケらの方法（J.
Biochem. 1982 ）により結合し、酵素標識抗体を調製
し、酵素標識抗体希釈液で０．１μｇ／ｍｌとした。標
準抗原は、プロゲステロンをエタノールに溶解した溶解
液をステロイド除去血清（エービーティー社製）に添加
して調製し、プロゲステロンの測定は、標準抗原及び検
体量を２０μｌにする他は、実施例３に記載の方法で行
った。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰＣ社製）と
の不一致検体１３例を用いた。
体（ダコ社製）とウシ小腸由来アルカリフォスファター
ゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタケらの方法（J.
Biochem. 1982 ）により結合し、酵素標識抗体を調製
し、酵素標識抗体希釈液で０．１μｇ／ｍｌとした。標
準抗原は、プロゲステロンをエタノールに溶解した溶解
液をステロイド除去血清（エービーティー社製）に添加
して調製し、プロゲステロンの測定は、標準抗原及び検
体量を２０μｌにする他は、実施例３に記載の方法で行
った。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰＣ社製）と
の不一致検体１３例を用いた。
【００３４】標準抗原０濃度のカウント値を１００％と
した時の各標準抗原液の応答（Ｂ／Ｂ0 （％））を図３
に、検体測定値を図４及び５に示す。標準曲線のＢ／Ｂ
0 （％）は、いずれの添加濃度域においても一定で、共
感作の抗体濃度による感度の変化はなかった。検体測定
値は、抗体共感作濃度０．２ｍｇ／ｍｌまでは急激に、
０．２〜０．２５ｍｇ／ｍｌまでは緩やかに低下し、そ
れ以上では一定の測定値を示した。
した時の各標準抗原液の応答（Ｂ／Ｂ0 （％））を図３
に、検体測定値を図４及び５に示す。標準曲線のＢ／Ｂ
0 （％）は、いずれの添加濃度域においても一定で、共
感作の抗体濃度による感度の変化はなかった。検体測定
値は、抗体共感作濃度０．２ｍｇ／ｍｌまでは急激に、
０．２〜０．２５ｍｇ／ｍｌまでは緩やかに低下し、そ
れ以上では一定の測定値を示した。
【００３５】実施例６ 抗体共感作濃度の検討３
実施例５に記載の方法と同様に、エストラジオールの検
出系を用いて抗体共感作濃度の検討を行った。
出系を用いて抗体共感作濃度の検討を行った。
【００３６】参考例１に記載の方法で、エストラジオー
ル−３−カルボキシプロピルエステルＮサクシニミドエ
ステル（ベーリンガーマンハイム社製）をＫＬＧ１−７
に結合したエストラジオール−３−カルボキシプロピル
エステル結合ＫＬＧ１−７抗体（以下、エストラジオー
ル結合ＫＬＧと記載する）を調製した。これを、ＫＬＧ
１−７濃度を０〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲で変化させ
て、実施例１と同様の方法で共感作粒子を調製し、粒子
希釈液で懸濁した。
ル−３−カルボキシプロピルエステルＮサクシニミドエ
ステル（ベーリンガーマンハイム社製）をＫＬＧ１−７
に結合したエストラジオール−３−カルボキシプロピル
エステル結合ＫＬＧ１−７抗体（以下、エストラジオー
ル結合ＫＬＧと記載する）を調製した。これを、ＫＬＧ
１−７濃度を０〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲で変化させ
て、実施例１と同様の方法で共感作粒子を調製し、粒子
希釈液で懸濁した。
【００３７】一方、抗エストラジオールモノクローナル
抗体（インターファーム社製）とウシ小腸由来アルカリ
フォスファターゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタ
ケらの方法（上掲）により結合し、酵素標識抗体を調製
し、酵素標識抗体希釈液で０．１μｇ／ｍｌとした。標
準液は、エストラジオールをエタノールに溶解した溶解
液をステロイド除去血清（エービーティー社製）に添加
して調製し、実施例３に記載の方法でエストラジオール
の測定を行った。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰ
Ｃ社製）との不一致検体１２例を用いた。
抗体（インターファーム社製）とウシ小腸由来アルカリ
フォスファターゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタ
ケらの方法（上掲）により結合し、酵素標識抗体を調製
し、酵素標識抗体希釈液で０．１μｇ／ｍｌとした。標
準液は、エストラジオールをエタノールに溶解した溶解
液をステロイド除去血清（エービーティー社製）に添加
して調製し、実施例３に記載の方法でエストラジオール
の測定を行った。検体は、抗体固相法ＲＩＡ（日本ＤＰ
Ｃ社製）との不一致検体１２例を用いた。
【００３８】標準抗原０濃度のカウント値を１００％と
した時の各標準抗原液の応答（Ｂ／Ｂ0 （％））を図６
に、検体測定値を図７及び８に示す。標準曲線のＢ／Ｂ
0 （％）は、いずれの添加濃度域においても一定で、共
感作の抗体濃度による感度の変化はなかった。検体測定
値は、抗体共感作濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌまでは急激
に、０．１２５〜０．２５ｍｇ／ｍｌまでは緩やかに低
下し、それ以上では一定の測定値を示した。
した時の各標準抗原液の応答（Ｂ／Ｂ0 （％））を図６
に、検体測定値を図７及び８に示す。標準曲線のＢ／Ｂ
0 （％）は、いずれの添加濃度域においても一定で、共
感作の抗体濃度による感度の変化はなかった。検体測定
値は、抗体共感作濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌまでは急激
に、０．１２５〜０．２５ｍｇ／ｍｌまでは緩やかに低
下し、それ以上では一定の測定値を示した。
【００３９】
【発明の効果】本発明により、血清由来成分の影響を受
けないハプテン抗原結合固相を提供し、該ハプテン抗原
結合固相を用いた免疫測定方法により、正確度の高い免
疫測定方法を提供することができるようになった。
けないハプテン抗原結合固相を提供し、該ハプテン抗原
結合固相を用いた免疫測定方法により、正確度の高い免
疫測定方法を提供することができるようになった。
【図１】テストステロン測定系を用いた、共感作物質濃
度と標準液Ｂ／Ｂ0 （％）との関係を示す図である。
度と標準液Ｂ／Ｂ0 （％）との関係を示す図である。
【図２】テストステロン測定系を用いた、共感作物質濃
度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
【図３】プロゲステロン測定系を用いた、共感作物質濃
度と標準液Ｂ／Ｂ0 （％）との関係を示す図である。
度と標準液Ｂ／Ｂ0 （％）との関係を示す図である。
【図４】プロゲステロン測定系を用いた、共感作物質濃
度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
【図５】プロゲステロン測定系を用いた、共感作物質濃
度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
【図６】エストラジオール測定系を用いた、共感作物質
濃度と標準液Ｂ／Ｂ0 （％）との関係を示す図である。
濃度と標準液Ｂ／Ｂ0 （％）との関係を示す図である。
【図７】エストラジオール測定系を用いた、共感作物質
濃度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
濃度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
【図８】エストラジオール測定系を用いた、共感作物質
濃度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
濃度と不一致検体測定値との関係を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/543 ５６５ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５６５Ｗ
33/577 33/577 Ｂ
(72)発明者 西薗 功
東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号
富士レビオ株式会社内
(72)発明者 小山石 好宏
東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号
富士レビオ株式会社内
(56)参考文献 特開 平７−107992（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−231591（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
G01N 33/543
G01N 33/577
Claims (12)
- 【請求項１】 ハプテン抗原が結合された抗原支持物質
と、固相に対する結合能力が該抗原支持物質の１／３な
いし３倍である共感作物質とを固相に同時に感作させる
ことにより、前記ハプテン抗原が結合された抗原支持物
質と前記共感作物質とが前記固相に固相化され、次いで
さらにマスキングタンパク質を固相化して成るハプテン
抗原結合固相。 - 【請求項２】 前記抗原支持物質及び前記共感作物質が
タンパク質である請求項１記載のハプテン抗原結合固
相。 - 【請求項３】 前記タンパク質が抗体である請求項２記
載のハプテン抗原結合固相。 - 【請求項４】 前記抗原支持物質と前記共感作物質が同
じ物質である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
ハプテン抗原結合固相。 - 【請求項５】 前記抗原支持物質と前記共感作物質が同
一のモノクローナル抗体である請求項４記載のハプテン
抗原結合固相。 - 【請求項６】 感作に供される前記ハプテン抗原が結合
された抗原支持物質と前記共感作物質のモル比が１：１
〜１：５００である請求項１ないし５のいずれか１項に
記載のハプテン抗原結合固相。 - 【請求項７】 前記モル比が１：１０〜１：２００であ
る請求項６記載のハプテン抗原結合固相。 - 【請求項８】 前記マスキングタンパク質がウシ血清ア
ルブミンである請求項１ないし７のいずれか１項に記載
のハプテン抗原結合固相。 - 【請求項９】 前記ハプテン抗原がステロイド系ホルモ
ンである請求項１ないし８のいずれか１項に記載のハプ
テン抗原結合固相。 - 【請求項１０】 前記ステロイド系ホルモンがテストス
テロン、プロゲステロン又はエストラジオールである請
求項９記載のハプテン抗原結合固相。 - 【請求項１１】 請求項１ないし１０のいずれか１項に
記載のハプテン抗原結合固相を用いて行う免疫測定方
法。 - 【請求項１２】 前記固相に結合されたハプテン抗原
と、検体中のハプテン抗原との競争反応を利用して検体
中のハプテン抗原を測定する請求項１１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37054397A JP3482853B2 (ja) | 1997-12-27 | 1997-12-27 | ハプテン抗原結合固相及びそれを用いた免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37054397A JP3482853B2 (ja) | 1997-12-27 | 1997-12-27 | ハプテン抗原結合固相及びそれを用いた免疫測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11194127A JPH11194127A (ja) | 1999-07-21 |
| JP3482853B2 true JP3482853B2 (ja) | 2004-01-06 |
Family
ID=18497182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37054397A Expired - Lifetime JP3482853B2 (ja) | 1997-12-27 | 1997-12-27 | ハプテン抗原結合固相及びそれを用いた免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3482853B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010181155A (ja) * | 2009-02-03 | 2010-08-19 | Fujifilm Corp | 物質固定基板の製造方法 |
-
1997
- 1997-12-27 JP JP37054397A patent/JP3482853B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11194127A (ja) | 1999-07-21 |
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