JP3483314B2 - 酵素電極用組成物および酵素固定化電極 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中に含まれる
特定成分を迅速かつ容易に定量することができる酵素セ
ンサーに関し、さらに詳しくは導電性酵素を用いた酵素
固定化電極並びにその電極の製造のための酵素電極用組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素の高い基質特異性を利用して種々の
物質の存在量を測定する酵素センサーが知られており、
例えばグルコースの定量分析に有用なセンサーが実用化
されている。

【０００３】現在実用化されている酵素センサーは、例
えば酸化酵素を利用した場合、生成する過酸化水素、水
素イオンまたは消費された酸素量を、過酸化水素電極、
水素イオン電極または酸素電極によって電気化学的に検
出することにより被測定物質を定量している。

【０００４】このような酵素センサーは、被測定物質に
対して高い基質特異性を有する酵素を基材に固定化し、
試料中の被測定物質と酵素を接触させて、酵素の作用に
よって生じる物質を、例えば電気化学的に検出し、定量
している。例えば、酸化酵素センサーは、酸化酵素を膜
中に固定化し、その酵素膜を隔膜酸素電極上に装着して
構成されている。基質である被測定物質が固定化された
酵素の作用によって酸化されると、酵素膜に密着されて
いる酸素電極の電流値が変化し、その値から基質の濃度
が測定できるのである。

【０００５】また、基質と酵素との反応を電極で容易に
検出可能なようにメディエータをセンサー系に存在させ
ることも行われている。例えば、人工メディエータを電
極表面に薄膜状に塗布し、さらにその上を半透明膜で被
膜する方法が提案されている（ＥＰ−７８６３６８
１）。また、難水溶性のメディエータを電極中に含有さ
せたり（Agric. Biol. Chem., 52, 1557(1988)）、水溶
性のメディエータを電極に予め含有させた後、その電極
表面にイオン性高分子と酵素とからなる組成物の薄膜を
設けることで、電解液中にメディエータが溶出しないよ
うにする方法（Agric. Biol. Chem., 52, 3187(1988)）
などが提案されている。さらに酵素とフェロセンをパラ
フィンなどに混ぜてペースト状にしたものを電極に擦り
込む方法が提案されている（Talanta, 38(1), 107-110
(1991) ）。

【０００６】しかしながら、従来の酵素センサーに用い
られる電極、とりわけメディエータを存在させた酵素電
極の調製は一般に繁雑である。従って、安定して精度を
得るためには、その製造過程において電極の品質管理に
細心の注意が払われなければならなかった。また、従来
の酵素センサーは電極としての寿命が十分でないとの問
題点も指摘されていた。さらに、メディエータが電極か
ら漏出することがあると、生体内での計測ができない。
従って、メディエータを存在させる場合、その安定化も
酵素センサー開発の重要な課題とされていた。

【０００７】このような背景の下、本発明者等は、導電
性酵素と、導電成分と、ビヒクルとを含んでなる、酵素
電極用組成物を発明し（以下、「先願発明」という）、
先に出願を行った（特願平５−９３９００）。先願発明
の酵素電極用組成物は、基質濃度の変化に伴う酵素組成
物の導電率の変化量により基質濃度を測定するものであ
るが、組成物を基材に固定化すると、溶液中に存在する
場合に比べ導電率の変化量が極めて少ないか減少すると
いう問題点があった。このため、導電率の変化量の小さ
い電位では、基質濃度を測定するのが困難な場合があっ
た。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】このような先願発明の
問題点を解決すべく、本発明は、基材に固定した場合に
おいても、導電率の変化量が減少しない酵素電極用組成
物を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決する手段】本発明者等は、酵素電極用組成
物の各成分について鋭意検討を行った結果、従来、酵素
電極用組成物の成分として極めて重要な役割を担ってい
ると考えられていたカーボンパウダー、バッファー、界
面活性剤、担体、溶媒等を除去し、酵素と樹脂のみの組
成としたところ、意外にも基質濃度に伴う導電率の変化
量が著しく増大することを見出し、本発明を完成した。

【００１０】本発明による酵素電極用組成物は、導電性
酵素と、親水性樹脂及び／又は疎水性樹脂を含む樹脂組
成物とからなる酵素電極用組成物である。また、本発明
による酵素固定化電極は、前記酵素電極用組成物を基材
に担持させてなるもの、である。

【００１１】本発明による酵素電極用組成物をスクリー
ン印刷などの手法によって絶縁性基材に担持させると、
電極を構成することができる。従って、本発明による酵
素電極用組成物を用いれば簡便な方法によって、安定し
た性能の酵素センサー用電極を製造することができる。
また、本発明による組成物は、スクリーン印刷という種
々のパターンの電極を容易に製造することができる手法
を利用できる点でも有利である。また、本発明による酵
素電極用組成物を用いて得られた電極中ではメディエー
タが酵素に固定されているため、被検試料中へのメディ
エータの漏出がなく安定した性能の電極を得ることがで
きる点でも優れる。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。酵素電極用組成物 本発明による酵素電極用組成物は、被測定物質に基質特
異性を有しかつ導電性を有する酵素を含んでなる。

【００１３】ここで「導電性酵素」とは、その酵素がそ
の系に存在する基質たる被測定物質の量に依存してその
導電性を変化させる酵素を意味する。本発明において、
導電性酵素とは、酵素それ自体が導電性を有するものに
加え、各種メディエータで修飾された結果導電性が付与
された酵素であってもよい。

【００１４】ここで、メディエータで修飾された結果導
電性を付与された酵素とは、次のようなものを意味す
る。一般に酵素の活性サイトは酵素たる蛋白質の内部に
存在するため、その酵素の作用の結果生じる電子の受け
渡しを外部から、例えば電極を通じて観察することは一
般には難しい。酸化酵素の場合、その電子の受け渡し
を、消費される酵素または発生した水素イオンもしくは
過酸化水素の量を介して観察することも可能であるが、
それらの量を系中で安定化させることが困難な場合も多
い。従って、系中に存在する基質量を正確に反映する指
標とはなりにくい。しかし、この活性サイトと電極との
間の電子の動きを（例えばそれ自体が酸化または還元さ
れて）媒介するメディエータを存在させると、活性サイ
トで生じる電子の動きを電極で安定して高い精度で観察
することができる。よって、本発明においてメディエー
タで修飾された酵素とは、上記のような役割を担うメデ
ィエータで修飾され、その結果導電性を付与されたもの
を意味するものとする。

【００１５】本発明において好ましい導電性酵素として
は、このメディエータで修飾された酵素が挙げられる。
この修飾酵素の態様としては、（１）酵素の側鎖（例え
ば、糖鎖、アルキル鎖、主鎖より枝分れしたペプチド鎖
など）にメディエーターを共有結合を介して結合させた
もの、（２）酵素の本体にメディエーターを共有結合を
介して結合させたもの、さらに（３）酵素本体及び酵素
の側鎖にメディエーターを共有結合を介して結合させた
もの、の三態様が挙げられる。これらの態様において、
メディエーターと酵素とは適当なスペーサーを介して結
合していても良い。

【００１６】本発明において、酵素は被測定物質との関
係で適宜選択されてよく、またメディエータは上記役割
を担うものであれば特に限定されない。好ましい修飾酵
素の具体例としては、メディエータで修飾されたオキシ
ダーゼが挙げられる。ここでオキシダーゼの好ましい例
としては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキ
シダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−またはＬ−ア
ミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼおよびコリンオキシダーゼからなる群
から選択されるものが挙げられる。また、メディエータ
の好ましい例としては、フェロセン、フェロセン誘導
体、ｐ−ベンゾキノン、フェリシアン化カリウム、フェ
ナジンメトサルファート、２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）などが
挙げられる。特にフェロセンまたはその誘導体が好まし
い。好ましいフェロセン誘導体としては、例えば１，
１’−ジメチルフェロセン、フェロセン酢酸、ヒドロキ
シエチルフェロセン、１，１’−ビス（ヒドロキシメチ
ル）フェロセン、フェロセンモノカルボン酸、フェロセ
ン１，１’−ジカルボン酸、クロロフェロセン、メチル
トリメチルアミノフェロセンなどが挙げられる。

【００１７】酵素とメディエータの組み合わせとして
は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）とフェロセンま
たはフェロセン誘導体との組み合わせが挙げられる。よ
り具体的にはＧＯＤは次の反応：

【００１８】

【化２】 を触媒し、ＧＯＤとフェロセンの組み合わせは、電子を
次のように運ぶ。

【００１９】

【化３】 （式中、ＦＡＤはフラビンアデニンジヌクレオチドであ
る） メディエータのフェロセンは過酸化水素と比較して低い
電極電位でも測定可能であり、過酸化水素と類似した電
位で還元される多くの物質（例えば、アスコルビン酸な
ど）からの影響を受けることがない。

【００２０】オキシダーゼへのメディエータの導入は、
オキシダーゼの酵素本体（例えば、リジン残基のアミノ
基）および／または側鎖（例えば、糖鎖、アルキル鎖、
主鎖より枝分れしたペプチド鎖など）に行われてよい。
さらにこの導入は適当なスペーサーを介して行われても
よい。特に、側鎖へのメディエータの導入はスペーサー
を介して行われるのが好ましい。スペーサーとしては、
イソプレン、ブタジエン、アセチレン、およびこれらの
誘導体並びに各々のコポリマー等が挙げられるが、スペ
ーサーの好ましい具体例としては、下記の式（Ｉ）で表
されるスペーサーが挙げられる。

【００２１】

【化４】 （ここで、ｎは０〜８の整数を表す） 好ましい修飾酵素の具体例としては、オキシダーゼの酵
素本体にリジン残基のアミノ基にフェロセンカルボン酸
を酸アミド結合によって導入し、および／または、酵素
の糖鎖を修飾して形成したアルデヒド基を利用して上記
式（Ｉ）で表されるスペーサーを介してフェロセンカル
ボン酸を導入したものが挙げられる。最も好ましくは、
オキシダーゼの酵素本体および糖鎖の両方に上記のよう
にフェロセンが導入されたものが挙げられる。この酵素
本体および糖鎖にメディエータが導入された修飾酵素は
新規であり、後記する酵素固定化電極において特に好ま
しい特性を有することから、本発明の一態様を構成す
る。

【００２２】酵素に導入されるメディエータ量は特に限
定されないが、酵素１分子に対するメディエータ分子の
比が１：５０程度であるのが好ましく、特に酵素がオキ
シダーゼであり、メディエータがフェロセンである場
合、その比は１：５〜２０程度が好ましく、より好まし
くは１：１０〜１５程度である。図１は、酵素の本体お
よび／または側鎖にメディエータが導入された状態の模
式図である。図中、（Ａ）は酵素の側鎖にメディエータ
ーを共有結合させたモデル、（Ｂ）は酵素本体及び酵素
の側鎖にメディエーターを共有結合させたモデル、
（Ｃ）は酵素本体のみにメディエーターを共有結合させ
たモデルを表す。親水性樹脂としては、ポリビニルピロ
リドンを用いるのが好ましいが、水及びアルコールに可
溶な樹脂であれば、特に限定されない。具体的に例示す
ると、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸、ポ
リビニルメトキシアセタール（アセタール化48％）、ポ
リビニルアミン（75％Rh）、ポリビニルアルコール、ビ
スコースフィルム、酢酸セルロース（置換度ＤＳ＝0.8
）、ポリエチレングリコール、ポリビニルメトキシア
セタール（アセタール化86％）等を挙げることができ
る。

【００２３】疎水性樹脂としては、ポリビニルブチラー
ルを用いるのが好ましいが、水に不溶でアルコールに可
溶な樹脂であれば、特に限定されない。具体的に例示す
ると酢酸セルロース（置換度ＤＳ＝2.3 ）、ポリ酢酸ビ
ニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリイソブチルエーテ
ル等を挙げることができる。親水性樹脂及び疎水性樹脂
の混合比は、用いる樹脂に応じて任意に設定することが
できる。例えば、ポリビニルピロリドンとポリビニルブ
チラールを用いる場合であれば、混合比を15：1 〜１：
５、特に、５：１〜１：１とするのが好ましい。また、
樹脂に混合した修飾酵素の溶出を無視できる場合であれ
ば、親水性樹脂を単独で用いることも可能であり、ま
た、例えば、重合度の低い（ＤＰ＝１０００未満）ポリ
ビニルブチラールなどであれば、疎水性樹脂を単独で用
いることも可能である。本発明による組成物はこれらの
成分を適当な混合手段、例えば、アジテーター、ホモミ
クサー、三本ロールなどで混合して製造することができ
る。

【００２４】酵素固定化電極の製造およびその用途 本発明による酵素電極用組成物は、それを基材に担持さ
せることによって酵素固定化電極とすることができる。
すなわち、組成物を基材に適用して、そのビヒクル成分
を蒸発させて除くことによって、組成物を基材に担持さ
せる。組成物の基材への適用方法は特に限定されない
が、印刷技術に応用することができる。例えば、スクリ
ーン印刷法、ローラーコーティング法、ディスペンサー
法などの手法によって、組成物を基材に適用することが
できる。スクリーン印刷は、種々のパターンを比較的容
易に印刷できる方法であることから特に好ましいといえ
る。

【００２５】こうして得られた酵素固定化電極は、その
基質の存在量を測定するためのセンサー用電極として利
用することができる。酵素固定化電極は、固定化された
酵素を介して検体試料中の基質の存在量に依存してその
導電性を変化させる。従って、その導電性の変化を基質
の濃度が既知の系で予め標準化しておき、その結果に基
づいて基質濃度が未知の試料の基質濃度を測定すること
ができる。具体的には、本発明によって得られた酵素固
定化電極と、対向電極と、参照電極を用いた系によっ
て、基質濃度と酵素固定化電極の導電率の変化とを測定
すればよい。

【００２６】図２は、センサー用電極の好ましい態様を
示したものである。図２（ａ）は、基材１の上にスクリ
ーン印刷の手法によって酵素電極用組成物を適用して、
酵素固定化電極２を形成して得られた一極系電極であ
り、図２（ｂ）はその斜視図である。また、図２（ｃ）
は、基材１の上に同様にスクリーン印刷の手法によって
酵素電極用組成物を適用して酵素固定化電極２を形成
し、さらに導電性酵素を含まない以外は酵素電極用組成
物と同一の組成の組成物を同様の手法で適用して形成し
た対向電極３を同一の基材１上に設けた二極系電極であ
り、図２（ｄ）はその斜視図である。図２（ｃ）および
（ｄ）の態様の場合、基材は絶縁性の物質であることが
必要である。

【００２７】さらにそれらのセンサー用電極を備えたセ
ンサーの模式図は図３（Ａ）および（Ｂ）に示される通
りである。電極５は本体部４と分離可能であり、電極５
は使い捨て型とすることができる。図４は、センサー用
電極の他の好ましい態様を示したものである。このセン
サー用電極は、本発明の酵素電極用組成物６をウエル７
の内部に有するものであり、使用するにはウエル７の中
に検体試料を滴下し、対向電極及び参照電極を上部より
設置すればよい。このようなウエルタイプの電極は、図
２に示されるような短冊タイプの電極と比較して、用い
る検体試料の量が少量で済むという点で優れている。ま
た、本態様のように複数のウエルを設けることにより、
連続的に測定することもできる。なお、各ウエルの電極
は、一回きりの使用でよく、使い捨て型とすればよい。

【００２８】このセンサー用電極の製造工程の一例を図
５に示す。まず、基板８を用意し（ａ）、その表面に金
電極９をスクリーン印刷等により印刷し、焼成する
（ｂ）。次いで、金電極９の先端部に酵素電極用組成物
６をスクリーン印刷等により印刷する（ｃ）。一方、基
板に形成された酵素電極用組成物６の位置に対応して孔
１０が設けられたプレート１１を用意し、前記基板８に
積層する（ｄ）。このセンサー用電極における酵素電極
用組成物に用いる樹脂は、前述した親水性樹脂及び／又
は疎水性樹脂のいずれであってもよいが、好ましくは、
親水性樹脂のみを用いる。このようなウエルタイプのセ
ンサー用電極では、修飾酵素が溶出しても何ら問題はな
く、また溶出した方がかえって反応が早くなるととも
に、感度が良好になるからである。

【００２９】導電性酵素の製造 それ自体が導電性を有しない酵素の場合、メディエータ
を導入することにより導電性酵素とすることが出来る。
酵素へのメディエータの導入は、上記したように酵素本
体および側鎖のいずれに行ってもよく、またその導入は
酵素本体または側鎖に存在する官能基（この官能基は酵
素を酸化または還元して、もしくは酵素に存在する官能
基と置換反応させることによって形成されたものであっ
てもよい）と、メディエータに存在する官能基（この官
能基もメディエータを酸化または還元して、もしくは酵
素に存在する官能基と置換反応させることによって形成
されたものであってもよい）とを反応させることによっ
て行うことができる。さらにメディエータのスペーサー
を介しての導入も、そのスペーサーが有する官能基を利
用して行うことができる。

【００３０】酵素がオキシダーゼである場合の反応の具
体例を以下に示す。 （１）酵素の側鎖へのメディエーターの導入 まず、オキシダーゼの糖鎖を、酵素の性質を変化させな
いような溶媒（例えばリン酸緩衝液）中において、適当
な酸化剤（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）で酸化し、
糖鎖にアルデヒド基を形成する。次いでスペーサーとし
て次の式(II)：

【００３１】

【化５】 で表されるジヒドラジドを、そのアルデヒド基に導入す
る。この反応物とメディエーターとしてのフェロセンカ
ルボン酸とを適当な還元剤（例えば、シアノボロハイド
ライドナトリウム）または縮合剤（例えば、カルボジイ
ミド）の存在下で反応させる。

【００３２】（２）酵素の本体および側鎖へのメディエ
ーターの導入（Ａ法） まず前記（１）と同様の方法で酵素の側鎖にメディエー
ターを導入する。ついで酵素を変性剤（例えば、尿素）
で処理してタンパク質内部を露出させ、Y.DeganiとA.He
ller(J.Physical Chemistry,91,1285-1289(1987)) によ
るカルボジイミド法に類似の方法で、フェロセンカルボ
ン酸を酵素の本体と側鎖とに導入する。

【００３３】（３）酵素の本体および側鎖へのメディエ
ーターの導入（Ｂ法） まず前記（１）と同様の方法で酵素の側鎖を酸化し、側
鎖にアルデヒド基を形成する。次いで変性剤および縮合
剤の存在下で前記式(II)で表されるジヒトラジドを酵素
の側鎖に導入する。更に、変性されて側鎖にスペーサー
が導入された酵素と、フェロセンカルボン酸と反応させ
る。

【００３４】（４）酵素の本体へのメディエーターの導
入 前記（２）に準じて行うことができる。すなわち、酵素
を変性剤で処理してタンパク質内部を露出させ、ついで
カルボジイミド法に類似の方法で、フェロセンカルボン
酸を酵素本体に導入する。

【００３５】

【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。以下では次の略号を使用する。ＧＯＤ：グルコー
スオキシダーゼ、ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸。

【００３６】実施例１ ＧＯＤ側鎖へのフェロセンの導
入（その１） （ａ） ＧＯＤ（シグマ社製、TypeII、EC1.1.3.4.,Asp
ergillus niger、１００mg) を０．１Ｍ、pH６．０のリ
ン酸緩衝液（１ml）に溶かし、予め前記と同様の緩衝液
に溶かしておいた２０mM過ヨウ素酸ナトリウムと混合
し、４℃で１時間放置した。続いてエチレングリコール
（１００μｌ）を加えて酸化反応を停止させた。その
後、更に４℃で３０分放置してから、pH６．０、０．１
Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しなが
ら反応混合物を４８時間以上かけて透析した。

【００３７】（ｂ） アジピルジヒドラジド（１００mg
乾燥粉末）を上記の透析の済んだ溶液に溶かし、その溶
液を室温下、暗所にて一晩放置した。この溶液を、pH
６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を
４回交換しながら透析し、未反応のアジピルジヒドラジ
ドを除いた。

【００３８】（ｃ） フェロセンカルボキシアルデヒド
（濃度１mg／ml、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液２m
l）を前記（ｂ）で得たＧＯＤヒドラジド溶液（２ml）
に混合し、４℃暗所にて一晩反応させた。シアノボロハ
イドライドナトリウムを１０mMの最終濃度になるように
混合し、１時間反応させた。次いでpH６．０、０．１Ｍ
リン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら
反応混合物を透析して、過剰のフェロセンカルボキシア
ルデヒドを除き側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを
得た。

【００３９】実施例２ ＧＯＤ側鎖へのフェロセンの導
入（その２） （ａ） ＧＯＤ（シグマ社製、TypeII、EC1.1.3.4.,Asp
ergillus niger、５００mg) を０．１Ｍ、pH６．０のリ
ン酸緩衝液（５ml）に溶かし、泡立てないように４℃で
よく攪拌した。予め前記と同様の緩衝液に溶かしておい
た２０mM過ヨウ素酸ナトリウムを加え、４℃で１時間放
置した。続いて反応を停止させるためにエチレングリコ
ール（５００μｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。
この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液と
し、その外液を４回交換しながら反応混合物を４８時間
以上かけて透析した。

【００４０】（ｂ） アジピルジヒドラジド（５００mg
乾燥粉末）を上記の透析の済んだ溶液に溶かし、その溶
液を４℃で、一晩暗所で攪拌した。この溶液を、pH６．
０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回
交換しながら４８時間以上透析し、未反応のアジピルジ
ヒドラジドを除いた。

【００４１】（ｃ） あらかじめ１−エチル−３−（ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（５００mg）お
よびフェロセンカルボン酸（４５０mg）を０．１５Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ml）に溶かしておき、pH７．３
に調整した。このフェロセン溶液に、先の透析が完了し
た酵素溶液を混合し、途中２〜３回pHが７．３であるこ
とを確認しつつ４℃暗所にて一晩攪拌した。この酵素液
について、リン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回以
上交換しながら４８時間以上かけて再び透析を行なっ
た。続いて未反応のフェロセンカルボン酸および他の低
分子成分を除き、側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤ
を得た。

【００４２】実施例３ ＧＯＤ本体および側鎖へのフェ
ロセンの導入（その１） Y.DeganiとA.Heller(J.Physical Chemistry,91,1285-12
89(1987)) による手法を参考にした。すなわち、フェロ
センカルボン酸と酵素自身の遊離アミノ基とをカルボジ
イミド法にて反応させることにより、ＧＯＤ本体にフェ
ロセンを結合させた。

【００４３】（ａ） 実施例１（ａ）と同様にして過ヨ
ウ素酸ナトリウムでＧＯＤの側鎖を酸化した。 （ｂ） 実施例１（ｂ）と同様にしてアジピルジヒドラ
ジドを酸化したＧＯＤに反応させた。 （ｃ） 尿素（８１０mg）、水溶性カルボジイミド（１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミドヒドロクロリド；１００mg）およびフェロセン
カルボン酸（８０mg）をpH７．３、０．１５Ｍ ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液（４ml）中でソニケーションし、pH７．２〜
７．３に再び合わせた。このpHでフェロセンカルボン酸
を飽和させた。前記（ｂ）で得たＧＯＤヒドラジト溶液
（２ml）を加え、必要に応じてpHを確認し、調整し、反
応物を０℃下暗所にて一晩放置した。過剰量の試薬は、
pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液
を４回交換しながら反応物を透析して、本体および側鎖
にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。

【００４４】また、アジピルジヒドラジド（ｎ＝４）に
代えてスクシニルヒドラジド（ｎ＝２）を用いた以外は
同様の方法で調製することによって、スペーサーがスク
シニルヒドラジドである導電性酵素を得た。

【００４５】比較例１ 実施例３のアジピルジヒドラジド（ｎ＝４）に代えてオ
キサリルヒドラジド（ｎ＝０）およびセバシルヒドラジ
ド（ｎ＝８）をスペーサーとして用いて導電性酵素の調
製を試みた。しかしスペーサーがＧＯＤリン酸緩衝液に
溶解しなかったため導電性酵素を調製することができな
かった。

【００４６】実施例４ ＧＯＤ本体および側鎖へのフェ
ロセンの導入（その２） 酵素の酸化された側鎖のアルデヒド基（−ＣＨＯ）と、
酵素本体の遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）との両方
にアジピルジヒドラジドを反応させた。そしてフェロセ
ンアルデヒドをヒドラジドと反応させた。

【００４７】（ａ） 実施例１（ａ）と同様にして過ヨ
ウ素酸ナトリウムでＧＯＤ側鎖の一部を酸化した。

【００４８】（ｂ） ０．５Ｍアジピルジヒドラジド
（pH５に調製：２ml）、塩化ナトリウム（９mg）、前記
（ａ）で得た酸化ＧＯＤ溶液（２ml）、１Ｍ水溶性カル
ボジイミド（１ml）および３Ｍ尿素を混合し、pHを５に
調整した。室温下暗所にて４時間放置して反応を進め
た。３０分おきにpHを５に調整した。４時間後、反応液
をpH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外
液を４回交換しながら反応液を透析した。

【００４９】（ｃ） 前記（ｂ）で得たＧＯＤヒドラジ
ド溶液（２．５ml）を０．４mg／mlフェロセンカルボキ
シアルデヒド（２．５ml）と混合し、４℃暗所にて４時
間反応させた。最終濃度が０．１mMになるようにシアノ
ボロハイドライドナトリウムを加え、次いでpH６．０、
０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換
しながら反応液を透析して、本体および側鎖にフェロセ
ンが導入されたＧＯＤを得た。

【００５０】実施例５ ＧＯＤ本体および側鎖へのフェ
ロセンの導入（その３） （ａ） ＧＯＤ（５００mg）を０．１Ｍ、pH６．０のリ
ン酸緩衝液（５ml）に溶かし、泡立てないように４℃で
よく攪拌した。予め前記と同様の緩衝液に溶かしておい
た２０mM過ヨウ素酸ナトリウムを加え、４℃で１時間放
置した。続いて反応を停止させるためにエチレングリコ
ール（５００μｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。
この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液と
し、その外液を４回交換しながら反応混合物を４８時間
以上かけて透析した。

【００５１】（ｂ） アジピルジヒドラジド（５００mg
乾燥粉末）を上記の透析の済んだ溶液に溶かし、その溶
液を４℃で、一晩暗所で攪拌した。この溶液を、pH６．
０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回
交換しながら４８時間以上透析し、未反応のアジピルジ
ヒドラジドを除いた。

【００５２】（ｃ） 尿素（４０５０mg）、１−エチル
−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５
００mg）およびフェロセンカルボン酸（４５０mg）を
０．１５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ml）に溶かし、pH
７．３に調整した。このフェロセン溶液に、先の透析が
完了した溶液を混合し、途中２〜３回pHを確認しつつ４
℃暗所にて一晩攪拌した。この酵素液について、リン酸
緩衝液を外液とし、その外液を４回以上交換しながら４
８時間以上かけて再び透析を行なった。続いて未反応の
フェロセンカルボン酸および他の低分子成分を除き、本
体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。

【００５３】実施例６ ＧＯＤ本体へのフェロセンの導
入（その１） ＧＯＤ（１００mg）を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝
液（１ml）に溶かし、４℃でよく攪拌した。尿素（８１
０mg）、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロ
リド；１００mg）およびフェロセンカルボン酸（８０m
g）をpH７．３、０．１５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（４m
l）中でソニケーションし、pH７．２〜７．３に再び合
わせた。このpHでフェロセンカルボン酸を飽和させた。
前記ＧＯＤ溶液を加え、必要に応じてpHを確認し、調整
し、反応物を０℃下暗所にて一晩放置した。過剰量の試
薬は、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、そ
の外液を４回交換しながら反応物を透析して、本体にフ
ェロセンが導入されたＧＯＤを得た。

【００５４】実施例７ ＧＯＤ本体へのフェロセンの導
入（その２） ＧＯＤ（５００mg）を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝
液（５ml）に溶かし、４℃でよく攪拌した。尿素（４０
５０mg）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドヒドロクロリド（５００mg）およ
びフェロセンカルボン酸（４５０mg）を０．１５Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（２５ml）中に溶かし、pHを７．３に調
整した。この溶液に前記ＧＯＤ溶液を加え、途中２〜３
回pHを確認しつつ、４℃下暗所にて一晩放置した。過剰
量の試薬は、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液と
し、その外液を４回交換しながら反応物を透析して、本
体にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。

【００５５】実施例８ 導電性酵素の評価（１） 金作用電極（直径１mm）、プラチナ対向電極、Ａｇ／Ａ
ｇＣｌ参照電極を用いたサイクリックボルタモメトリ
で、前記実施例で調製した導電性酵素を評価した。使用
前に酸化アルミニウム（０．０７５μｍ）で作用電極を
研磨した。測定は北斗電工ポテンシオシュタット／ガル
バノシュタットモデルＨＡＢ−１５１とグラフテックＷ
Ｘ１２００記録計を用いて行なった。修飾酵素溶液は実
施例で得られたものを希釈することなく用いた。過酸化
水素の妨害を避けるために、最終濃度で０．１mg／mlの
カタラーゼを加えた。最初に、導電性酵素のサイクリッ
クボルタモグラムを基質非存在下で測定した。次に最終
濃度で１０mMになるようにグルコースを加えてから、同
一条件下でサイクリックボルタモグラムを測定した。測
定中は酸素の影響を除くため、窒素によるバブリングを
充分に行なった。

【００５６】実施例１、２、３（スペーサーがアジピル
ジヒドラジド）、５、６および７の導電性酵素について
の結果は、それぞれ図６、７、８、９、１０および１１
に示される通りである。これらの図から明らかなよう
に、基質としてグルコースが加えられることにより導電
率の上昇が認められた。なお、実施例２、５および７に
おいては、金電極は直径５mmのものを用い、最終濃度
８．２５×１０^-2ｍＭになるようグルコース溶液を加え
た。

【００５７】実施例９ 導電性酵素の評価（２） 実施例３において調製した２種類の導電性酵素（スペー
サーがアジピルジヒドラジド（ｎ＝４）である場合およ
びスクシニルヒドラジド（ｎ＝２）である場合）を評価
した。最終濃度で１．０mg／mlになるようにグルコース
溶液を加えた以外は、実施例１１と同様の方法でサイク
リックボルタモグラムを測定した。結果は図１２に示さ
れるとおりである。スペーサーとしてアジピルジヒドラ
ジドを用いた導電性酵素の方が、スクシニルヒドラジド
を用いたものよりも高い応答を示した。

【００５８】実施例１０ 導電性酵素の評価（３） 実施例３の導電性酵素（スペーサーがアジピルジヒドラ
ジド）を、グルコースの最終濃度が０、０．０２、０．
０６、０．０８mg／mlの時のサイクリックボルタモグラ
ムを測定することによって評価した。グルコースの濃度
を変化させた以外は実施例１１と同様の方法で測定を行
った。結果は図１３に示されるとおりである。導電性酵
素が存在する溶液系におけるグルコース濃度と導電率の
増加には、正の相関関係が見い出された。

【００５９】実施例１１ 導電性酵素の評価（４） ＩＣＰ（inductively coupled plasma atomic emission
spectroscopy)分析によって、実施例２、５および７で
調製された導電性酵素について、ＧＯＤ１分子あたり導
入されているフェロセンの平均分子数を測定した。結果
は、実施例２、５、７の導電性酵素に対してそれぞれ１
１．８個、１４．２個、９．２個であった。これらの結
果は導電率の増加（図７、９、１１）と非常によく相関
した。

【００６０】比較例２ ＧＯＤとメディエータとを単に混在させた系を実施例１
１と同様に評価した。すなわち、実施例１１と同一の評
価装置で、次のような混合物の導電率の変化を測定し
た。 ＧＯＤ（未修飾） １００mg フェロセン １mg リン酸緩衝液（pH６．０、０．１Ｍ） ３０ml カタラーゼ ３mg グルコース １０mM又は
０mM その結果は図１４に示される通りである。この図から明
らかなように、ＧＯＤとメディエータであるフェロセン
は、単に混在しているだけでは、ＧＯＤの導電率の変化
にはほとんど寄与しないといえる。

【００６１】実施例１２ センサー用電極の調製（その
１） 実施例３で得られた導電性酵素と、次表に示される成分
とを混合して、組成物Ａ、Ｂ、Ｃを得た。

【００６２】 表 １ ─────────────────────────────────── Ａ Ｂ Ｃ ─────────────────────────────────── 導電性酵素 １４．３ １．５ １．８ カーボンパウダー − ３６．５ １３．９ バッファー ¹⁾ − １５．０ ２９．６ 樹 脂 ²⁾ ８５．７ ２０．０ １．２ 界面活性剤（花王スパン２０） − ２．０ １０．０ ブチルセロソルブ − １５．０ ２７．８ アミルアルコール − １０．０ １５．８ ─────────────────────────────────── １００．０ １００．０ １００．０

【００６３】¹⁾：クエン酸３０ｇ、クエン酸ナトリウム
１２０ｇ及びアミルアルコール５０４ｇをボールミルポ
ットに入れ３０時間以上かけてよく混合し、スラリー状
にしたものを使用した。²⁾ ：ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦコリドン９０）５
０．４ｇ、ポリビニルブチラール（積水化学Ｂｘ−１）
９．０ｇおよびアミルアルコール２８２．６ｇをアジテ
ータでよく攪拌した後、一晩以上静置したものを使用し
た。 組成物Ａ及びＢについて電位＋450 mVの時の各グルコー
ス濃度における電流値を次表に示す。

【００６４】 表 ２ ───────────────────────────────── グルコース濃度（mM） ０ ５ １０ 組成物Ａ（一極系電極） 220nA 310nA 460nA 組成物Ｂ（一極系電極） 79nA 130nA 176nA ─────────────────────────────────

【００６５】組成物Ｂに比べ組成物Ａは、グルコース濃
度の増加による電流の変化が大きく、検量線を作成する
のに適している。次に組成物ＡおよびＣを基材に塗布
し、サイクリックボルタモグラムでその特性を評価し
た。組成物Ａの結果を図１５に、組成物Ｃの結果を図１
６に示す。組成物Ａを用いた場合は、溶液系で観測され
るようなグルコースの増加に伴う導電率の増加が観測さ
れたが、組成物Ｃを用いた場合にはそのような導電率の
増加が観測されなかった。

【００６６】実施例１３ センサー用電極の調製（その
２） 実施例２で得られた導電性酵素と、親水性樹脂（ポリビ
ニルピロリドン；ＢＡＳＦコリドン９０）と、エタノー
ル（和光社製）とを次表に示す配合量で混合して、酵素
電極用組成物を得た。なお、実施例２で得られた導電性
酵素は、得られたままの状態、即ち溶液の状態で使用し
た。

【００６７】 表 ３ ─────────────────────────── 配合量 ─────────────────────────── 導電性酵素 ９００μl ＰＶＰ ０．１２３ｇ エタノール １００μl ───────────────────────────

【００６８】基板としてガラス板を用意し、図５（ｂ）
のように、ゴールドペースト（有機ペースト，N.E.Chem
Cat Ltd. 社製）をスクリーン印刷し、焼成した。その
後、、形成した金電極の先端部に、得られた酵素電極用
組成物を直径３mm、厚さ１０μｍとなるようにスクリー
ン印刷した。次いで、直径９mmの孔が設けられた厚さ３
mmの塩化ポリビニルプレートの裏に接着剤を塗布し、図
５（ｄ）のようにして基板に重ね、接着した。

【００６９】このようにして作製した酵素電極センサー
を用い、グルコースの最終濃度が０、０．５、１．０mg
/ml の時のサイクリックボルタモグラムを測定した。な
お、対向電極としてはプラチナ、参照電極対極としては
Ａｇ／ＡｇＣｌを用いた。結果を図１７のグラフに示
す。また、電位＋700 mVの時の各グルコース濃度におい
て測定した電流値を図１８のグラフに示す。

【００７０】

【発明の効果】本発明の酵素電極用組成物は、基材に固
定化した場合でも導電率の変化量が減少しないので、検
量線の作成が容易になり、操作が簡易でかつ精度の高い
酵素センサーを提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素の本体および／または側鎖にメディエータ
が導入された状態の模式図である。

【図２】本発明によるセンサー用電極の好ましい態様を
示す。図２（ａ）は基材１の上に酵素固定化電極２を形
成して得られた一極系電極であり、図２（ｂ）はその斜
視図である。また、図２（ｃ）は酵素固定化電極２を形
成し、さらに導電性酵素を含まない以外は酵素電極用組
成物と同一の組成の組成物を同様の手法で適用して形成
した対向電極３を同一の基材１上に設けた二極系電極で
あり、図２（ｄ）はその斜視図である。

【図３】本発明によるセンサー用電極を備えたセンサー
の模式図である。

【図４】本発明によるセンサー用電極の他の好ましい態
様を示す。

【図５】図４におけるセンサー用電極の製造工程の一例
を示す概略図である。

【図６】実施例１で得られた側鎖にフェロセンが導入さ
れたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。

【図７】実施例２で得られた側鎖にフェロセンが導入さ
れたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。

【図８】実施例４で得られた本体および側鎖にフェロセ
ンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムで
ある。

【図９】実施例５で得られた本体および側鎖にフェロセ
ンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムで
ある。

【図１０】実施例６で得られた本体にフェロセンが導入
されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。

【図１１】実施例７で得られた本体にフェロセンが導入
されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。

【図１２】スペーサーの炭素数がｎ＝２またはｎ＝４で
ある場合の、実施例３で得られた本体および側鎖のフェ
ロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラ
ムである。

【図１３】実施例３で得られた本体および側鎖にフェロ
センが導入されたＧＯＤの、グルコース濃度を変化させ
た時の、サイクリックボルタモグラムである。

【図１４】ＧＯＤとメディエータとを単に混在させた系
のサイクリックボルタモグラムである。

【図１５】導電性酵素と樹脂からなる組成物のサイクリ
ックボルタモグラムである。なお、グルコースの添加量
は40μｌである。

【図１６】導電性酵素と、カーボンパウダー、バッファ
ー、樹脂、界面活性剤、ブチルセロスルブ、アミルアル
コールからなる組成物のサイクリックボルタモグラムで
ある。なお、グルコースの添加量は40μｌである。

【図１７】実施例２で得られた導電性酵素を用いた酵素
電極センサーによるサイクリックボルタモグラムであ
る。

【図１８】実施例２で得られた導電性酵素を用いた酵素
電極センサーによる、電位＋700mVの時の各グルコース
濃度における電流値のグラフである。

【符号の説明】

１…基材 ２，６…酵素固定化電極 ３…対向電極 ４…本体部 ５…電極 ７…ウエル ８…基板 ９…金電極 １０…孔 １１…プレート

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−264246（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−78791（ＪＰ，Ａ) 永田良平、横山恵二、軽部征夫，印刷 技術を用いるグルコースセンサーの開 発，本化学会第66秋季年会（含連合討論 会）、化学関係学協会連合協議会研究発 表会合同大会 講演予稿集，日本，1993 年 ９月13日，145 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/327 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素がグルコースオキシダーゼ又はガラ
   クトースオキシダーゼであり、メディエータがフェロセ
   ン又はフェロセン誘導体であって、該酵素が該メディエ
   ータにより修飾されたものである導電性酵素と、親水性
   樹脂及び／又は疎水性樹脂を含む樹脂組成物のみからな
   る、酵素電極用組成物。
2. 【請求項２】 親水性樹脂がポリビニルピロリドンであ
   り、かつ、疎水性樹脂がポリビニルブチラールである、
   請求項１記載の酵素電極用組成物。
3. 【請求項３】 導電性酵素が、酵素に共有結合を介して
   メディエータを維持させてなるものである、請求項１又
   は２記載の酵素電極用組成物。
4. 【請求項４】 メディエータが酵素の側鎖および／また
   は酵素本体に導入されてなる、請求項３記載の酵素電極
   用組成物。
5. 【請求項５】 メディエータが下記式（Ｉ）で表される
   スペーサーを介して酵素の側鎖に導入されてなる、請求
   項４記載の酵素電極用組成物。 【化１】 （ここで、ｎは１〜７の整数を表す。）
6. 【請求項６】 酵素がグルコースオキシダーゼであり、
   メディエータがフェロセンまたはフェロセン誘導体であ
   り、該メディエータが、酵素本体と、請求項５で定義さ
   れた式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して酵素の側鎖
   とに導入されてなるものである、請求項５記載の酵素電
   極用組成物。
7. 【請求項７】 請求項１〜６いずれか一項記載の酵素電
   極用組成物を基材に担持させてなる、酵素固定化電極。
8. 【請求項８】 請求項１〜６いずれか一項記載の酵素電
   極用組成物をウエルの内部に有する、酵素固定化電極。