JP3484584B2 - 一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤 - Google Patents
一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一酸化窒素の消去剤、
検出剤及び定量剤に関し、特に生体内の一酸化窒素を消
去、検出、定量する薬剤に関するものである。
検出剤及び定量剤に関し、特に生体内の一酸化窒素を消
去、検出、定量する薬剤に関するものである。
【０００２】医学、生物学の分野において、一酸化窒素
を消去、検出、定量する薬剤は、基礎医学、生物学の分
野のみならず、臨床医学、製薬等の分野にも極めて有用
なものである。
を消去、検出、定量する薬剤は、基礎医学、生物学の分
野のみならず、臨床医学、製薬等の分野にも極めて有用
なものである。
【０００３】
【従来の技術】近年、一酸化窒素は、生体における血管
拡張因子、神経伝達物質、免疫調節分子などとして、重
要な働きを演じていることが明らかになり、医学、生物
学の分野で注目されている。これらの研究及び、臨床応
用においては、一酸化窒素を検出、定量することは必要
不可欠のことであるが、一酸化窒素は、非常に不安定な
物質であり、これを高感度に、しかも再現性良くモニタ
ーすることは非常に困難である。
拡張因子、神経伝達物質、免疫調節分子などとして、重
要な働きを演じていることが明らかになり、医学、生物
学の分野で注目されている。これらの研究及び、臨床応
用においては、一酸化窒素を検出、定量することは必要
不可欠のことであるが、一酸化窒素は、非常に不安定な
物質であり、これを高感度に、しかも再現性良くモニタ
ーすることは非常に困難である。
【０００４】また、敗血症ショックなどに代表される、
過度の一酸化窒素産生に基づく様々な重篤な病態が知ら
れており、その際、この一酸化窒素を消去することは、
非常に重要なことであるが、生体内においてこれを効率
良く消去することは極めて困難である。
過度の一酸化窒素産生に基づく様々な重篤な病態が知ら
れており、その際、この一酸化窒素を消去することは、
非常に重要なことであるが、生体内においてこれを効率
良く消去することは極めて困難である。
【０００５】一酸化窒素の測定には、これが変化して出
来る亜硝酸イオンの測定を利用するグリース法がある
が、感度が低い上、間接的であり、正確な方法ではな
い。
来る亜硝酸イオンの測定を利用するグリース法がある
が、感度が低い上、間接的であり、正確な方法ではな
い。
【０００６】一酸化窒素を直接検出、定量するために
は、電極法や化学発光法があるが、前者は、再現性に乏
しく、使用に高度の熟練を要する。また、後者の化学発
光法は、一酸化窒素をオゾンと反応させて発光させる方
法であり、オゾン発生器から窒素酸化物が同時に発生し
て誤差を生じる。また、両法とも、使用できる系が限ら
れるという制約がある。
は、電極法や化学発光法があるが、前者は、再現性に乏
しく、使用に高度の熟練を要する。また、後者の化学発
光法は、一酸化窒素をオゾンと反応させて発光させる方
法であり、オゾン発生器から窒素酸化物が同時に発生し
て誤差を生じる。また、両法とも、使用できる系が限ら
れるという制約がある。
【０００７】また、一酸化窒素を消去するためには、生
体内における一酸化窒素発生源である一酸化窒素合成酵
素の阻害剤を用いる方法がある。これは、治療的にもあ
る程度の効果を有するが、投与量の規定が困難であり、
過度の投与は血圧の異常を招くなど、副作用も大きい。
また、生体外では、ヘモグロビン誘導体が一酸化窒素消
去能を有するが、体内への投与は困難である。
体内における一酸化窒素発生源である一酸化窒素合成酵
素の阻害剤を用いる方法がある。これは、治療的にもあ
る程度の効果を有するが、投与量の規定が困難であり、
過度の投与は血圧の異常を招くなど、副作用も大きい。
また、生体外では、ヘモグロビン誘導体が一酸化窒素消
去能を有するが、体内への投与は困難である。
【０００８】一方、フェニルテトラメチルイミダゾリン
−Ｎオキシル−Ｎ’オキシド誘導体（以下ＰＴＩＯ誘導
体と略記する）は、本発明者らの研究により、血管拡張
因子（弛緩因子）や炎症性組織障害因子である一酸化窒
素（ＮＯ）に対して中和作用（消去能）を有することが
見いだされ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，ｐ８２
７〜８３２，１９９３）、しかも、一酸化窒素合成酵素
阻害剤と異なり、血圧の異常な上昇などの副作用も認め
られず、敗血症ショックなどに対し、有効な治療効果が
あることが認められた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２，ｐ９２３〜９３
０）。更に、一酸化窒素を消去するにあたって、自らの
電子スピン共鳴スペクトル（ＥＳＲ スペクトル）が変
化することを利用して、上記の既存法の欠点を補った理
想的なＮＯの検出と連続定量用の試薬としても期待され
た。
−Ｎオキシル−Ｎ’オキシド誘導体（以下ＰＴＩＯ誘導
体と略記する）は、本発明者らの研究により、血管拡張
因子（弛緩因子）や炎症性組織障害因子である一酸化窒
素（ＮＯ）に対して中和作用（消去能）を有することが
見いだされ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，ｐ８２
７〜８３２，１９９３）、しかも、一酸化窒素合成酵素
阻害剤と異なり、血圧の異常な上昇などの副作用も認め
られず、敗血症ショックなどに対し、有効な治療効果が
あることが認められた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２，ｐ９２３〜９３
０）。更に、一酸化窒素を消去するにあたって、自らの
電子スピン共鳴スペクトル（ＥＳＲ スペクトル）が変
化することを利用して、上記の既存法の欠点を補った理
想的なＮＯの検出と連続定量用の試薬としても期待され
た。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このＰ
ＴＩＯ誘導体は、生体内に存在する還元剤に影響を受
け、その薬効を失う傾向があり、そのため、実際の生体
試料への応用は、血中濃度を保つための持続投与や細胞
と試薬を接触させないなどの工夫が必要で、使用法が著
しく制限されている。
ＴＩＯ誘導体は、生体内に存在する還元剤に影響を受
け、その薬効を失う傾向があり、そのため、実際の生体
試料への応用は、血中濃度を保つための持続投与や細胞
と試薬を接触させないなどの工夫が必要で、使用法が著
しく制限されている。
【００１０】本発明は、前述したＰＴＩＯ誘導体の欠点
を無くし、安定で取り扱い易く、各種の使用法での簡便
かつ高感度、高再現性の消去、検出及び定量が可能な優
れた一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤を得ることを
目的とする。
を無くし、安定で取り扱い易く、各種の使用法での簡便
かつ高感度、高再現性の消去、検出及び定量が可能な優
れた一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤を得ることを
目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記一酸化窒
素消去、検出及び定量成分の担体として数多くの生体親
和性を有する物質について研究したところ、一連の脂質
化合物、特にホスファチジルコリン及びその類縁体が極
めて優れた性状を有し、上記の目的に合致し、生体試料
に対し、安定に投与できる一酸化窒素消去剤、検出剤及
び定量剤を作成し得ることを発見したものである。
素消去、検出及び定量成分の担体として数多くの生体親
和性を有する物質について研究したところ、一連の脂質
化合物、特にホスファチジルコリン及びその類縁体が極
めて優れた性状を有し、上記の目的に合致し、生体試料
に対し、安定に投与できる一酸化窒素消去剤、検出剤及
び定量剤を作成し得ることを発見したものである。
【００１２】すなわち本発明は、一酸化窒素消去成分、
検出成分及び定量成分が、下記一般式で表わされるフェ
ニルテトラメチルイミダゾリン−Ｎオキシル−Ｎ’オキ
シド誘導体であり、これを脂質２分子膜からなるリポソ
ームに内蔵させた一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量
剤。
検出成分及び定量成分が、下記一般式で表わされるフェ
ニルテトラメチルイミダゾリン−Ｎオキシル−Ｎ’オキ
シド誘導体であり、これを脂質２分子膜からなるリポソ
ームに内蔵させた一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量
剤。
【００１３】
【化４】
ここで、式中Ｒは、Ｈ 或はフェニル基の４位或は３位
に導入された炭素数１〜１８のアルキル基、ＣＯＯＨ、
ＣＨ2ＣＯＯＨ 若しくはそれらの塩、Ｎ（ＣＨ3 ）3
+、
に導入された炭素数１〜１８のアルキル基、ＣＯＯＨ、
ＣＨ2ＣＯＯＨ 若しくはそれらの塩、Ｎ（ＣＨ3 ）3
+、
【００１４】
【化５】
又は
【００１５】
【化６】
である。
【００１６】本発明において用いられる脂質としてはリ
ン脂質が二層配向したリポソームであり、ホスファチジ
ルコリン及びその合成類縁体のほか、ホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルグリセロール及びそれらの合成類縁体、並びにこれら
脂質の混合物を用いることができる。
ン脂質が二層配向したリポソームであり、ホスファチジ
ルコリン及びその合成類縁体のほか、ホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルグリセロール及びそれらの合成類縁体、並びにこれら
脂質の混合物を用いることができる。
【００１７】このような脂質により構成される２分子膜
リポソームに一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤成分
が内包された本発明の一酸化窒素消去剤、検出剤及び定
量剤は、生体内においても安定性のある剤型で、各種の
生体投与の可能性のある剤型を形成することができる。
リポソームに一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤成分
が内包された本発明の一酸化窒素消去剤、検出剤及び定
量剤は、生体内においても安定性のある剤型で、各種の
生体投与の可能性のある剤型を形成することができる。
【００１８】本発明の一酸化窒素消去剤、検出剤、定量
剤において用いる油性溶媒として特に好ましいのは、ホ
スファチジルコリンと１，２−ジミリストイルアミド−
１，２−デオキシホスファチジルコリン（以下ＤＤＰＣ
と略記する）の混合物である。このような脂質２分子膜
リポソームを用いると、ＰＴＩＯ誘導体を有効成分とす
る優れた一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤が得られ
る。
剤において用いる油性溶媒として特に好ましいのは、ホ
スファチジルコリンと１，２−ジミリストイルアミド−
１，２−デオキシホスファチジルコリン（以下ＤＤＰＣ
と略記する）の混合物である。このような脂質２分子膜
リポソームを用いると、ＰＴＩＯ誘導体を有効成分とす
る優れた一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤が得られ
る。
【００１９】ＰＴＩＯ誘導体をリポソーム内に内包する
には、幾つかの方法があるが、例えば、脂質を有機溶媒
に溶解したのち、これを揮散させて作成した脂質薄膜あ
るいはこれを再度エーテル等に溶解して作った逆ミセル
とＰＴＩＯ誘導体及びＰＴＩＯ誘導体の水溶液とを振盪
又は超音波処理することによって成し遂げられる。エー
テル等に再溶解した場合は、その後これを減圧下で揮散
させる。このようにして得られるＰＴＩＯ誘導体を含有
する本発明の薬剤は、例えば、一酸化窒素消去剤、検出
剤及び定量剤として、各種の投与が可能である。
には、幾つかの方法があるが、例えば、脂質を有機溶媒
に溶解したのち、これを揮散させて作成した脂質薄膜あ
るいはこれを再度エーテル等に溶解して作った逆ミセル
とＰＴＩＯ誘導体及びＰＴＩＯ誘導体の水溶液とを振盪
又は超音波処理することによって成し遂げられる。エー
テル等に再溶解した場合は、その後これを減圧下で揮散
させる。このようにして得られるＰＴＩＯ誘導体を含有
する本発明の薬剤は、例えば、一酸化窒素消去剤、検出
剤及び定量剤として、各種の投与が可能である。
【００２０】
【実施例】以下、本発明の特徴をさらに明らかにするた
め実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施
例によって限定されるものではない。
め実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施
例によって限定されるものではない。
【００２１】実施例 1
（トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯのリポソーム化）
ナス型フラスコ中で、ホスファチジルコリン３５ｍｇと
ＤＤＰＣ９ｍｇをクロロホルム ５ｍｌに溶解し、減圧
留去して薄膜とした。これをエーテル３ｍｌに溶解し
て、トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯのＰＢＳ溶液
（ＰＴＩＯが２ｍＭとなるように１０ｍＭＰＢＳ（ＰＨ
７．４）に溶解したもの）１ｍｌを添加して、１５分間
超音波照射した。次いでエーテルを減圧留去してゲルを
得、ボルテックスミキサーで振盪した後、減圧にしてエ
ーテルを完全に除いた。これを１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ
７．４）で希釈し，１４，０００ｇで遠心分離してＰＴ
ＩＯ含有リポソームをペレットとして沈降させ、上澄み
を除いた。この操作を、上澄みにＰＴＩＯが検出されな
くなるまで続け、純粋なトリメチルアンモニム型ＰＴＩ
Ｏを含むリポソームを得た。トリメチルアンモニウム型
ＰＴＩＯの標準ＰＢＳ溶液とトリメチルアンモニウム型
ＰＴＩＯ内包リポソームＰＢＳ溶液のＥＳＲシグナル強
度の比較から、リポソーム内のトリメチルアンモニウム
型ＰＴＩＯは１ｍＭであった。
ＤＤＰＣ９ｍｇをクロロホルム ５ｍｌに溶解し、減圧
留去して薄膜とした。これをエーテル３ｍｌに溶解し
て、トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯのＰＢＳ溶液
（ＰＴＩＯが２ｍＭとなるように１０ｍＭＰＢＳ（ＰＨ
７．４）に溶解したもの）１ｍｌを添加して、１５分間
超音波照射した。次いでエーテルを減圧留去してゲルを
得、ボルテックスミキサーで振盪した後、減圧にしてエ
ーテルを完全に除いた。これを１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ
７．４）で希釈し，１４，０００ｇで遠心分離してＰＴ
ＩＯ含有リポソームをペレットとして沈降させ、上澄み
を除いた。この操作を、上澄みにＰＴＩＯが検出されな
くなるまで続け、純粋なトリメチルアンモニム型ＰＴＩ
Ｏを含むリポソームを得た。トリメチルアンモニウム型
ＰＴＩＯの標準ＰＢＳ溶液とトリメチルアンモニウム型
ＰＴＩＯ内包リポソームＰＢＳ溶液のＥＳＲシグナル強
度の比較から、リポソーム内のトリメチルアンモニウム
型ＰＴＩＯは１ｍＭであった。
【００２２】実施例２
（トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームの
アスコルビン酸に対する抗還元剤効果） 実施例１に従って作成したリポソームを１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．４）で５倍に希釈し、１００ｍＭのアスコル
ビン酸水溶液を最終濃度が２ｍＭとなるように加え、時
間によるＥＳＲシグナルの減少を測定し、同一濃度のト
リメチルアンモニウム型ＰＴＩＯのＰＢＳ溶液に同様に
アスコルビン酸を添加したときと比較して、還元剤に対
する抵抗性を調べた。結果を図１に示す。
アスコルビン酸に対する抗還元剤効果） 実施例１に従って作成したリポソームを１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．４）で５倍に希釈し、１００ｍＭのアスコル
ビン酸水溶液を最終濃度が２ｍＭとなるように加え、時
間によるＥＳＲシグナルの減少を測定し、同一濃度のト
リメチルアンモニウム型ＰＴＩＯのＰＢＳ溶液に同様に
アスコルビン酸を添加したときと比較して、還元剤に対
する抵抗性を調べた。結果を図１に示す。
【００２３】図１より明らかなように、リポソームに内
包されないトリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、ア
スコルビン酸添加により直ちにシグナルは完全に消失
し、還元によりＰＴＩＯが消失したが、リポソームに内
包されたトリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、ＥＳ
Ｒシグナルは測定した３時間の間ほとんど変化せず、還
元剤に対し極めて安定化されている。
包されないトリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、ア
スコルビン酸添加により直ちにシグナルは完全に消失
し、還元によりＰＴＩＯが消失したが、リポソームに内
包されたトリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、ＥＳ
Ｒシグナルは測定した３時間の間ほとんど変化せず、還
元剤に対し極めて安定化されている。
【００２４】実施例３
（トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームの
スーパーオキシドに対する抗還元剤効果） 実施例１に従って作成したリポソームを１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．４）で４０倍に希釈し、キサンチンオキシダ
ーゼを最終濃度が０．２Ｕ／ｍｌ、ヒポキサンチンが最
終濃度２００μＭとなるように加え、時間によるＥＳＲ
シグナルの減少を測定し、同一濃度のトリメチルアンモ
ニウム型ＰＴＩＯのＰＢＳ溶液に同様にキサンチンオキ
シダーゼを最終濃度が０．２Ｕ／ｍｌ、ヒポキサンチン
が最終濃度２００μＭ を添加したときと比較して、ス
ーパーオキシドに対する抵抗性を調べた。結果を図２に
示す。
スーパーオキシドに対する抗還元剤効果） 実施例１に従って作成したリポソームを１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．４）で４０倍に希釈し、キサンチンオキシダ
ーゼを最終濃度が０．２Ｕ／ｍｌ、ヒポキサンチンが最
終濃度２００μＭとなるように加え、時間によるＥＳＲ
シグナルの減少を測定し、同一濃度のトリメチルアンモ
ニウム型ＰＴＩＯのＰＢＳ溶液に同様にキサンチンオキ
シダーゼを最終濃度が０．２Ｕ／ｍｌ、ヒポキサンチン
が最終濃度２００μＭ を添加したときと比較して、ス
ーパーオキシドに対する抵抗性を調べた。結果を図２に
示す。
【００２５】図２より明らかなように、リポソームに内
包されないトリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、キ
サンチンオキシダーゼ、ヒポキサンチン添加によりＰＴ
ＩＯ由来のＥＳＲシグナルは迅速に消失し、１０分で完
全に消失するのに対し、リポソームに内包されたトリメ
チルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、ＥＳＲシグナルは１
０分後になお半分以上のＰＴＩＯユニットが残存してい
た。
包されないトリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、キ
サンチンオキシダーゼ、ヒポキサンチン添加によりＰＴ
ＩＯ由来のＥＳＲシグナルは迅速に消失し、１０分で完
全に消失するのに対し、リポソームに内包されたトリメ
チルアンモニウム型ＰＴＩＯでは、ＥＳＲシグナルは１
０分後になお半分以上のＰＴＩＯユニットが残存してい
た。
【００２６】実施例４
（トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯを含むリポソーム
の保存安定性） 実施例１に従って作成したリポソームを冷蔵庫（４℃）
にて保存し、所定日数後に２００μｌを採取し、１ｍｌ
のＰＢＳバッファーで２回以上洗浄してリポソーム外に
漏れ出たアンモニウム型ＰＴＩＯを除いてからＥＳＲス
ペクトルを測定し、シグナル強度からリポソーム内に残
存するＰＴＩＯの濃度を見積もった。結果を図３に示
す。
の保存安定性） 実施例１に従って作成したリポソームを冷蔵庫（４℃）
にて保存し、所定日数後に２００μｌを採取し、１ｍｌ
のＰＢＳバッファーで２回以上洗浄してリポソーム外に
漏れ出たアンモニウム型ＰＴＩＯを除いてからＥＳＲス
ペクトルを測定し、シグナル強度からリポソーム内に残
存するＰＴＩＯの濃度を見積もった。結果を図３に示
す。
【００２７】最初にＰＴＩＯが若干量急激に減少してい
るのは、リポソーム外側に物理的に吸着したＰＴＩＯに
由来すると考えられる。従って、ここで得られたＰＴＩ
Ｏ内包リポソームは、１ヶ月の保存でも約９０％以上の
活性を保つことができたと見ることができ、使用時に
は、アンモニウム型ＰＴＩＯの標準溶液のＥＳＲシグナ
ル強度から、簡単にリポソーム内のＰＴＩＯ濃度を計算
して用いることができる。
るのは、リポソーム外側に物理的に吸着したＰＴＩＯに
由来すると考えられる。従って、ここで得られたＰＴＩ
Ｏ内包リポソームは、１ヶ月の保存でも約９０％以上の
活性を保つことができたと見ることができ、使用時に
は、アンモニウム型ＰＴＩＯの標準溶液のＥＳＲシグナ
ル強度から、簡単にリポソーム内のＰＴＩＯ濃度を計算
して用いることができる。
【００２８】実施例５
（トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯを含むリポソーム
によるＮＯアミン錯体から発生する一酸化窒素の検出定
量） 実施例１で得られたリポソームを用いて、下記に示すＮ
Ｏアミン化合物から放出される一酸化窒素の定量を試み
た。このアミン化合物は、ラビー（Ｈｒａｂｉｅ）らに
より報告された一酸化窒素発生剤であり、１分子から２
分子の一酸化窒素を放出する（Ｈｒａｂｉｅ ｅｔ ａ
ｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８，１４７２（１９９
３））。
によるＮＯアミン錯体から発生する一酸化窒素の検出定
量） 実施例１で得られたリポソームを用いて、下記に示すＮ
Ｏアミン化合物から放出される一酸化窒素の定量を試み
た。このアミン化合物は、ラビー（Ｈｒａｂｉｅ）らに
より報告された一酸化窒素発生剤であり、１分子から２
分子の一酸化窒素を放出する（Ｈｒａｂｉｅ ｅｔ ａ
ｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８，１４７２（１９９
３））。
【００２９】
【化７】
【００３０】実施例１で得られたリポソームを１０ｍＭ
のＰＢＳバッファーで４０倍に希釈し、これに所定量の
ＮＯアミン化合物を加えて１５分間インキュベートし
て、完全に一酸化窒素を放出させてしまってから、この
一酸化窒素とアンモニウム型ＰＴＩＯの反応で発生した
生成物（アンモニウム型ＰＴＩ）の生成量をＥＳＲシグ
ナル強度から測定した。
のＰＢＳバッファーで４０倍に希釈し、これに所定量の
ＮＯアミン化合物を加えて１５分間インキュベートし
て、完全に一酸化窒素を放出させてしまってから、この
一酸化窒素とアンモニウム型ＰＴＩＯの反応で発生した
生成物（アンモニウム型ＰＴＩ）の生成量をＥＳＲシグ
ナル強度から測定した。
【００３１】ＰＴＩＯ化合物は、一酸化窒素と１：１で
反応するから、生成したアンモニウム型ＰＴＩの濃度
は、発生した一酸化窒素の量と等しくなり、一酸化窒素
の定量が可能である。結果を図４に示す。
反応するから、生成したアンモニウム型ＰＴＩの濃度
は、発生した一酸化窒素の量と等しくなり、一酸化窒素
の定量が可能である。結果を図４に示す。
【００３２】加えたＮＯアミン化合物の量と、生成した
アンモニウム型ＰＴＩの量（すなわち一酸化窒素の量）
の間に傾き２の直線関係が得られ、発生した一酸化窒素
消去効率は１００％であった。また、これを一酸化窒素
定量剤として用いる場合その量を正確に測定できてい
た。最低検出感度は、一酸化窒素０．０１μＭであっ
た。
アンモニウム型ＰＴＩの量（すなわち一酸化窒素の量）
の間に傾き２の直線関係が得られ、発生した一酸化窒素
消去効率は１００％であった。また、これを一酸化窒素
定量剤として用いる場合その量を正確に測定できてい
た。最低検出感度は、一酸化窒素０．０１μＭであっ
た。
【００３３】実施例６
（トリメチルアンモニウム型ＰＴＩＯを含むリポソーム
による活性化マクロファージから発生する一酸化窒素の
消去、検出定量） 実施例１で得られたリポソームを、実際に細胞から発生
する一酸化窒素の測定に応用した。
による活性化マクロファージから発生する一酸化窒素の
消去、検出定量） 実施例１で得られたリポソームを、実際に細胞から発生
する一酸化窒素の測定に応用した。
【００３４】マウス由来のマクロファージ（ＲＡＷ264
ＭΦ）を、細胞数が１０6個となるようにマイクロタイ
タープレートのウェルの中に取り、１０％ＰＢＳを含む
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地中で、２４時間インキュベー
トし、その後、培地を除き、１ｍｇ／ｍｌのＣｕ，Ｚｎ
ＳＯＤと１ｍＭのＬ−アルギニンの入ったＫｒｅｂｓＲ
ｉｎｇｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 緩衝液で４０倍に希
釈した実施例１で得られたリポソームを加えて、ＬＰＳ
（内毒素）あるいは、一酸化窒素合成酵素阻害剤の有る
無しでＥＳＲスペクトルから一酸化窒素消去能力及び測
定能力を評価した。図５に結果を示す。
ＭΦ）を、細胞数が１０6個となるようにマイクロタイ
タープレートのウェルの中に取り、１０％ＰＢＳを含む
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地中で、２４時間インキュベー
トし、その後、培地を除き、１ｍｇ／ｍｌのＣｕ，Ｚｎ
ＳＯＤと１ｍＭのＬ−アルギニンの入ったＫｒｅｂｓＲ
ｉｎｇｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 緩衝液で４０倍に希
釈した実施例１で得られたリポソームを加えて、ＬＰＳ
（内毒素）あるいは、一酸化窒素合成酵素阻害剤の有る
無しでＥＳＲスペクトルから一酸化窒素消去能力及び測
定能力を評価した。図５に結果を示す。
【００３５】図５において、ＬＰＳ無しでは、一酸化窒
素は発生しないから、ＥＳＲスペクトルは純粋にアンモ
ニウム型ＰＴＩのみのものであるが、これに５μｇ／ｍ
ｌのＬＰＳを添加すると、マクロファージから発生する
一酸化窒素が、ＥＳＲスペクトル中に発生するアンモニ
ム型ＰＴＩの生成により、明確に捉えられた。これは、
同時に細胞から発生した一酸化窒素を消去したことを意
味する。また、これに、一酸化窒素合成酵素阻害剤であ
るＬ−ＮＭＭＡやアミノグアニジンを添加すると、ＥＳ
Ｒスペクトルより、アンモニウム型ＰＴＩの生成は認め
られなくなり、確かにマクロファージ由来の一酸化窒素
が測定できていることが確かめられた。
素は発生しないから、ＥＳＲスペクトルは純粋にアンモ
ニウム型ＰＴＩのみのものであるが、これに５μｇ／ｍ
ｌのＬＰＳを添加すると、マクロファージから発生する
一酸化窒素が、ＥＳＲスペクトル中に発生するアンモニ
ム型ＰＴＩの生成により、明確に捉えられた。これは、
同時に細胞から発生した一酸化窒素を消去したことを意
味する。また、これに、一酸化窒素合成酵素阻害剤であ
るＬ−ＮＭＭＡやアミノグアニジンを添加すると、ＥＳ
Ｒスペクトルより、アンモニウム型ＰＴＩの生成は認め
られなくなり、確かにマクロファージ由来の一酸化窒素
が測定できていることが確かめられた。
【００３６】
【発明の効果】ＰＴＩＯ化合物は、一酸化窒素消去法及
び測定法としては他法と比べ、非常に優れた特徴を有す
るが、還元剤に大きな影響を受けるため、実用が困難で
あった。前記の実施例で示すとおり、本発明化合物は保
存安定性もよく、ＰＴＩＯ化合物に対する還元物質の影
響を高度に排除でき、しかも、一酸化窒素の捕捉効率は
１００％であり、これらを用いることにより、生体試料
等の一酸化窒素を効率よく消去或は精度よく定量でき
る。また、本発明化合物を、マクロファージから発生す
る一酸化窒素の測定に用いたところ、感度よく測定でき
る。この様に、安定で、高感度にマクロファージ由来の
一酸化窒素を測定した例は他にない。以上のことから、
本発明化合物は一酸化窒素定量用及び、消去用組成物と
して極めて有効である。
び測定法としては他法と比べ、非常に優れた特徴を有す
るが、還元剤に大きな影響を受けるため、実用が困難で
あった。前記の実施例で示すとおり、本発明化合物は保
存安定性もよく、ＰＴＩＯ化合物に対する還元物質の影
響を高度に排除でき、しかも、一酸化窒素の捕捉効率は
１００％であり、これらを用いることにより、生体試料
等の一酸化窒素を効率よく消去或は精度よく定量でき
る。また、本発明化合物を、マクロファージから発生す
る一酸化窒素の測定に用いたところ、感度よく測定でき
る。この様に、安定で、高感度にマクロファージ由来の
一酸化窒素を測定した例は他にない。以上のことから、
本発明化合物は一酸化窒素定量用及び、消去用組成物と
して極めて有効である。
【図１】アンモニウム型ＰＴＩＯ溶液とアンモニウム型
ＰＴＩＯ内包リポソームのアスコルビン酸による還元的
消去効果の比較。
ＰＴＩＯ内包リポソームのアスコルビン酸による還元的
消去効果の比較。
【図２】アンモニウム型ＰＴＩＯ溶液とアンモニウム型
ＰＴＩＯ内包リポソームのヒポキサンチン／キサンチン
オキシダーゼ系より発生したスーパオキシドによる還元
的消去効果の比較。
ＰＴＩＯ内包リポソームのヒポキサンチン／キサンチン
オキシダーゼ系より発生したスーパオキシドによる還元
的消去効果の比較。
【図３】アンモニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームの４℃
における保存安定性。
における保存安定性。
【図４】ＮＯアミン化合物から発生する一酸化窒素を利
用してのアンモニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームを用い
た一酸化窒素の検量線。
用してのアンモニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームを用い
た一酸化窒素の検量線。
【図５】マクロファージから発生した一酸化窒素のアン
モニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームによる検出。
モニウム型ＰＴＩＯ内包リポソームによる検出。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｄ 233/26 Ｃ０７Ｄ 233/26
(56)参考文献 特開 平６−247936（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−179024（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−1562（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 31/00
C07H 15/26
G01N 31/22 122
G01N 33/50
C07D 233/06
C07D 233/26
Claims (2)
- 【請求項１】 一酸化窒素消去成分、検出成分及び定量
成分が、下記一般式で表わされるフェニルテトラメチル
イミダゾリン−Ｎオキシル−Ｎ’オキシド誘導体であ
り、これを脂質２分子膜からなるリポソームに内蔵させ
た一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤。 【化１】 （式中 Rは、H 或はフェニル基の 4位或は 3位に導入さ
れた炭素数 l〜18のアルキル基、COOH、CH2COOH 若しく
はそれらの塩、N(CH3)3 +、 【化２】 又は 【化３】 である。） - 【請求項２】 リポソーム構成成分に1,2-ジミリストイ
ルアミド-1,2- デオキシホスファチジルコリンを含有す
る、請求項１に記載の一酸化窒素消去剤、検出剤及び定
量剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09942895A JP3484584B2 (ja) | 1995-04-03 | 1995-04-03 | 一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09942895A JP3484584B2 (ja) | 1995-04-03 | 1995-04-03 | 一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08278301A JPH08278301A (ja) | 1996-10-22 |
| JP3484584B2 true JP3484584B2 (ja) | 2004-01-06 |
Family
ID=14247187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09942895A Expired - Lifetime JP3484584B2 (ja) | 1995-04-03 | 1995-04-03 | 一酸化窒素消去剤、検出剤及び定量剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3484584B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100404513C (zh) * | 2004-09-03 | 2008-07-23 | 首都医科大学 | 2-取代-4,4,5,5-四甲基-1-氧咪唑啉、及其合成和应用 |
| CN1326839C (zh) * | 2004-09-03 | 2007-07-18 | 首都医科大学 | 2－取代－4,4,5,5－四甲基－1－羟基咪唑啉，及其合成和应用 |
-
1995
- 1995-04-03 JP JP09942895A patent/JP3484584B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08278301A (ja) | 1996-10-22 |
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