JP3485658B2 - 蛍光性分子の定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は溶液中の蛍光性分子の定
量方法に関する。詳しくは、蛍光性分子からの発光強度
より蛍光性分子の定量を行う定量方法において、蛍光性
分子と結合可能な蛍光性会合体を共存させ且つ該蛍光性
会合体に光を照射することによって、より高感度な蛍光
性分子の定量を可能にする蛍光性分子の定量方法であ
る。 【０００２】 【従来の技術】特定の物質を定量することが必要な最も
重要な分野の１つとして臨床検査がある。現代の臨床医
学は診察、検査、治療の３つの柱で支えられている。と
りわけ、臨床検査は得られるデータの客観性が最も高い
ため、他に科学的根拠を与え、それらの指針となるもの
である。臨床検査の中でも電解質、酵素等の生化学検
査、抗原、抗体等の免疫血清検査は分析化学の一分野で
あり、近年の分析化学の進歩に伴って生体液中の微量生
理活性物質の定量が可能となってきている。また、分子
生物学の発展により分子レベルでの生理活性物質の機能
が解明されてきており、微量生理活性物質の定量によ
り、従来不可能であった疾病の診察や治療が可能になり
つつある。 【０００３】生理活性物質の分析において、原子吸光法
による金属イオンの定量の如く特別な分離を必要とせず
直接分析可能なものは希である。一般には対象物質をな
んらかの手段で分離した後、適当な手段で定量する必要
がある。多くの生理活性物質は生体内において認識され
ることによりその機能を発現する。即ち、生体内には天
然に物質を認識する分子が存在し、これを利用すること
により目的成分を特異的に測定可能となる。生体由来の
物質の認識分子としては免疫反応に関与する物質、即ち
抗原、抗体等が実際の臨床検査用の分析に用いられてい
る。 【０００４】抗原、抗体等の入手については、最近の遺
伝子操作技術の進歩により有用な手段が確立されつつあ
る。即ち、従来用いられてきた天然の生体由来のポリク
ローナルな抗体に替り、遺伝子操作によってモノクロー
ナルな抗体が容易に作製可能となっている。該抗体を用
いることにより特定の分析対象物質を、抗体と結合させ
ることができる。臨床検査においてはこれらの分析対象
物質と抗体の結合体を標識して定量することが一般に行
われている。標識方法としては様々なものが実用化され
ているが、高感度分析に用いる方法としては放射性同位
体を用いるラジオイムノアッセイ法（以下ＲＩＡ法と略
記する）が用いられてきた。しかし、ＲＩＡ法は放射線
を用いる特殊な設備が必要であるため、近年、これに代
わるイムノアッセイ法として色素による標識法が浸透し
つつある。 【０００５】色素による標識では特別の施設を必要とせ
ず、また取扱いも簡便であることが特徴となっている。
しかし、一般に色素法はＲＩＡ法と比較して感度が低い
という点が問題となっており、感度の良い色素法の開発
が切望されているのが現状である。 【０００６】色素濃度の測定方法としては、吸光度法、
蛍光法、発光法の３種類が主なものであり、それぞれの
測定方法に使用可能な色素が用いられている。吸光度法
については感度は色素のモル吸光系数に依存しており、
検出限界が比較的低いという問題点がある。発光法につ
いては特別な光源を用いないため、バックグランドが低
く感度が良いという特徴があるが、使用可能な色素が限
られており、色素が不安定といった問題点を有してい
る。蛍光法については吸光度法と比較して感度が良いた
めに測定方法として広く用いられていが、感度の点でＲ
ＩＡ法にはおよばないという問題点がある。 【０００７】蛍光法の感度を向上させる目的で、蛍光の
異方性を測定する方法や、特定の金属錯体を用いて遅延
蛍光を測定する方法が報告されてるがその感度は未だ不
十分である。シーグムントらは、２種類の色素を用いて
エネルギー移動を起こさせることにより感度を向上させ
ることを報告している（シンソリッドフィルムズ、１９
９２年、２１０／２１１巻、４８０ページ［Thin Solid
Films,210/211(1992),480］）。しかし、その感度はエ
ネルギー移動を用いない場合と比較して３倍程度であ
り、さらなる感度の向上が望まれていた。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】従って、蛍光色素で標
識された分析対象物と認識分子の結合体を、高感度にか
つ簡便に測定する方法の開発が望まれていた。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、かかる問
題点を解決し得る蛍光性分子の定量方法を開発すべく鋭
意研究を重ねた。その結果、特定の色素分子が配向した
会合体を共存させることにより、分析対象とする蛍光性
色素の蛍光が著しく増強され、検出感度が向上すること
を見出し本発明を完成するに至った。 【００１０】即ち、本発明は、蛍光性分子と該蛍光性分
子と結合可能な平均分子量（重量平均）が１万〜１億の
範囲の蛍光性会合体との共存下に蛍光性会合体に吸収可
能な光を照射し、蛍光性会合体からのエネルギー移動に
帰因する蛍光性分子からの発光を測定することにより蛍
光性分子の量を決定することを特徴とする蛍光性分子の
定量方法である。 【００１１】本発明中で用いる検出感度とは、検出しう
る最低限の濃度を示す検出下限と分析時の信号強度と濃
度の比を示す分析感度を合わせた意味を示す。 【００１２】本発明の蛍光性分子の定量方法において、
対象となる蛍光性分子は蛍光性を有するものであれば公
知の分子が特に限定されることなく使用可能である。蛍
光性分子を定量する際の感度は用いる蛍光性分子の蛍光
量子収率に大きく影響されるため、望ましくは蛍光量子
収率が０．００１以上、更に高感度な測定のためには
０．０１以上の蛍光量子収率を有する蛍光性分子が望ま
しい。 【００１３】蛍光性性分子の吸収極大波長としては、用
いる蛍光性会合体にもよるが２５０ｎｍ以上８００ｎｍ
以下の吸収極大を有する分子が望ましい。吸収極大波長
が２５０ｎｍ以下であると十分な感度が得られない場合
がある。また、８００ｎｍ以上である場合特殊な測定装
置が必要になる。 【００１４】蛍光性分子の発光極大波長としては、３０
０ｎｍ以上９００ｎｍ以下が望ましい。吸収極大波長が
３００ｎｍ以下である場合、十分な感度が得られない場
合が多い。また、９００ｎｍ以上である場合、強度の測
定に特殊な装置が必要となる。発光極大波長が４００ｎ
ｍ以上であると、測定用のセルの材料として安価なガラ
スやポリスチレンなどが使用可能となるため特に好適で
ある。 【００１５】本発明の定量方法は特に水溶液中の蛍光性
分子の定量に適しているため、生体成分の定量に好適で
ある。特に好適に用いられる生体成分由来の蛍光性分子
としては以下の２種類が挙げられる。 【００１６】（１）蛍光性を有する生理活性物質あるい
は生体由来物質。 【００１７】（２）蛍光性色素で標識された生理活性物
質あるいは生体由来物質 （１）の蛍光性を有する生理活性物質あるいは生体由来
物質（以下蛍光性生体分子と略記する）の場合、分子自
体が蛍光性を有しているため、試料の前処理等の煩雑な
操作が不要となるため本発明の定量方法が特に好適に使
用可能である。一般に好適に用いられる蛍光性生体分子
としては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸、ビタミンＢ2（リボフラビン）、クロロフィル、葉
酸等が挙げられる。 【００１８】（２）の蛍光性色素で標識された生理活性
物質あるいは生体由来物質（以下蛍光標識生体分子と略
記する）は、測定対象の生体成分を適当な反応性基を有
する蛍光性色素（以下蛍光標識化試薬と略記する）で標
識することにより得られる。本発明の蛍光性分子の定量
方法において、蛍光標識生体分子も好適な蛍光性分子で
ある。 【００１９】上記蛍光標識化試薬としては公知のものが
使用可能であるが、アミノ基反応性蛍光標識化試薬、カ
ルボキシル基反応性蛍光標識化試薬、アルデヒド基反応
性蛍光標識化試薬、水酸基反応性蛍光標識化試薬、また
はチオール基反応性蛍光標識化試薬が好適に使用され
る。アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸基
およびチオール基は、一般に生理活性物質あるいは生体
由来分子内に存在するため特にこれらの標識化試薬が好
適に用いられる。 【００２０】アミノ基反応性蛍光標識化試薬としては、
フルオレセイン−４−イソチオシアネート、３−クロロ
カルボニル−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１
Ｈ）−キノキザリノン、フルオレセイン−４−イソチオ
シアネート、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン、
４ーフルオロ−７−ニトロベンゾフラゾン、スルフォロ
ーダミン１０１酸クロリド、フルオレスカミン、ｏ−フ
タルアルデヒド、ダンシルクロリド等が好適に使用され
る。 【００２１】カルボキシル基反応性蛍光標識化試薬とし
ては、３−ブロモメチル−６，７−ジメトキシ−１−メ
チル−１，２−ジヒドロキノキザリン−２−オン、４−
ブルモメチル−７−メトキシクマリン、１，２−ジアミ
ノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン・２塩酸塩等が
好適に使用される。 【００２２】アルデヒド基反応性蛍光標識化試薬として
は、１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼン・
２塩酸塩、２，２’−ジチオビス（１−アミノナフタレ
ン）、４ーアミノ−３−ペンテン−２−オン等が好適に
使用される。 【００２３】水酸基反応性蛍光標識化試薬としては、３
−クロロカルボニル−６，７−ジメトキシ−１−メチル
−２（１Ｈ）−キノキザリノン、２−（５−クロロカル
ボニル−２−オキサゾリル）−５，６−メチレンジオキ
シベンゾフラン等が好適に使用される。 【００２４】チオール基反応性蛍光標識化試薬として
は、４−フルオロ−７−スルファモイルベンゾフラザ
ン、Ｎ−［４−（６−ジメチルアミノ−２−ベンゾフラ
ニル）フェニル］マレイミド、２，２’−ジヒドロキシ
−６，６’−ジナフチルジスルフィド、Ｎ−［４−
（５，６−メチレンジオキシ−２−ベンゾフラニル）フ
ェニル］マレイミド、Ｎ−（９−アクリジニル）マレイ
ミド、４−クロロ−７−スルフォベンゾフラザン・アン
モニウム塩、４−フルオロ−７−スルフォベンゾフラザ
ン・アンモニウム塩、ダンシルアジリジン、５−（ヨー
ドアセトアミドエチル）アミノナフタレン−１−スルホ
ン酸、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、Ｎ−
（１−アニリノナフチル−４）マレイミド、Ｎ−（３−
ピレン）マレイミド、エオシン−５−ヨードアセトアミ
ド等が好適に使用される。 【００２５】上述の蛍光標識化試薬で標識される記生理
活性物質または生体由来成分としては、当該分野で定量
することが一般的に行われている生体成分がなんら制限
なく用いられるが、一般に本発明の定量方法に用いられ
る好適な生体成分を例示すれば以下のとおりである。即
ち、アルブミン等の非免疫性タンパク、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリン、レク
チン、レセプター、アビジン等の非免疫特異的結合パー
トナー、グルタミ酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、
グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、乳酸脱水
素酵素、γ−グルタミルトランスフェナーゼ、コリンエ
ステラーゼ等の酵素、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、甲
状腺刺激ホルモン等のホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核
酸等である。 【００２６】前記蛍光標識生体分子を作製する方法は、
当該分野で公知の方法が特に制限なく使用可能である
が、一般的に好適に用いいられる方法を具体的に例示す
れば以下のとおりである。即ち、生理活性物質または生
体由来成分をトリス緩衝液などの緩衝液中に溶解させ、
そこに蛍光標識化試薬を添加する。この時、ピリジン、
ジメチルホルムアミド等の触媒を少量存在させることに
より収率が向上する。室温で数時間反応させた後、反応
液をゲルクロマトグラフィーにより数回精製することに
より、目的の蛍光標識生体分子が得られる。 【００２７】本発明の定量方法は、対象の蛍光性分子と
結合可能な蛍光性会合体との共存下に蛍光性会合体に吸
収可能な光を照射し、蛍光性会合体からのエネルギー移
動に帰因する蛍光性分子からの発光を測定することによ
り蛍光性分子の量を決定することを特徴とする。ここ
で、蛍光性会合体とは蛍光性を有する両親媒性化合物
（以下、蛍光性両親媒性化合物と略記する）よりなる会
合体であり、高感度に定量するために必須の成分であ
る。 【００２８】会合体とは、同一分子間に水素結合、電荷
移動結合、疎水結合などの比較的弱い結合が働き、溶媒
中で形成された比較的規則性の良い分子集合体のことで
ある。 また、本発明において、蛍光性分子と蛍光性会
合体との結合とは、相互作用により蛍光性分子と蛍光性
会合体とがエネルギー移動可能な距離に接近することを
表わす。ここでいう相互作用としては当該分野で公知の
分子間に生じる相互作用が特に制限することなく採用さ
れる。相互作用として特に好ましいものを例示すれば、
クーロン力相互作用、疎水性相互作用、水素結合的相互
作用、配位結合的相互作用、π電子／ＣＨ相互作用等で
ある。 【００２９】本発明に用いる蛍光性会合体の平均分子量
（重量平均）としては１万〜１億の範囲である。蛍光性
会合体の平均分子量が１万以下であると定量時の感度が
不十分となる。また、１億以上であると、会合体の溶媒
中での安定性が悪くなる。また、さらに好ましくは、蛍
光性会合体の平均分子量が５万〜１千万であると定量時
の感度が著しく良好でかつ溶液の安定性が良いため好適
である。 【００３０】蛍光性会合体が形成される溶媒としては、
両親媒性化合物よりなる会合体が形成される溶媒であれ
ば特に限定されないが、一般に安定な会合体が形成され
やすい水が好適に用いられる。 【００３１】前記蛍光性両親媒性化合物としては溶媒中
で会合体を形成する性質を有するものであれば特に限定
されず公知の化合物が使用可能であるが、蛍光性を有す
る剛直性部分を連鎖中に含む少なくとも１つの直鎖疎水
基を有し、かつ親水性基を有する有機化合物（以下、蛍
光性直鎖両親媒性化合物と略記する）が好適に用いられ
る。該蛍光性直鎖両親媒性化合物を用いることにより、
定量時の感度が著しく向上する。 【００３２】本発明において剛直性部分とは、例えば次
の（ａ），（ｂ）および（ｃ）等の基をいう。 【００３３】（ａ） 直結あるいは、炭素−炭素多重結
合を介して連結された少なくとも２個の芳香環で構成さ
れた２価の基 このような基を具体的に示せば、例えば、 【００３４】 【化１】 【００３５】等の２価の基が挙げられる。 【００３６】（ｂ） ２個の芳香環の結合が複数である
か、複数原子間の単結合であって、その結合がエネルギ
ー的に束縛を受けている２価の基 このような基を具体的に示せば、例えば、 【００３７】 【化２】 【００３８】等の２価の基が挙げられる。 【００３９】（ｃ） 芳香環が縮合環を形成しているも
ので、この縮合環が多分子間で積層した場合に、その回
転が互いに立体的に束縛を受けている２価の基 このような基を具体的に示せば、例えば、 【００４０】 【化３】 【００４１】等の２価の基が挙げられる。 【００４２】本発明において直鎖疎水基とは直鎖状のア
ルキル基またはそのハロゲン置換体である。剛直性部分
を連鎖中に含む直鎖疎水基を有する蛍光性直鎖両親媒性
化合物の炭素数は前記剛直性部分の炭素数を除いて８〜
３０の範囲が望ましい。８以下であると溶媒中で会合体
を形成しない場合があり、３０以上の場合溶媒に分散し
ない場合があるので望ましくない。上記、剛直性部分と
直鎖疎水基との結合部分は、一般に炭素−炭素結合，エ
ステル結合，エーテル結合が好適である。 【００４３】剛直性部分を連鎖中に含む直鎖疎水基は、
溶媒中での会合体形成能を勘案して該蛍光性直鎖両親媒
性化合物中に１つ含まれている場合が最も好ましい。２
つ以上含まれる場合には、溶媒中で会合体を形成しない
場合がある。 【００４４】本発明の蛍光性直鎖両親媒性化合物におけ
る親水性基は、該蛍光性直鎖両親媒性化合物が溶媒中で
安定な会合体を形成するために必須である。親水性基と
しては、一般に界面活性剤の親水性基として公知の親水
性基が使用可能であるが、イオン性基またはポリエチレ
ングリコール基を用いることにより、会合体の安定性が
著しく向上するために望ましい。 【００４５】ここでイオン性基とは酸性基または塩基性
基の総称として定義される。ここで酸性または塩基性と
はブレンステッド酸またはブレンステッド塩基を意味
し、酸性基としては一般にスルホン酸基，カルボキシル
基，リン酸基およびこれらが塩となったもの、塩基性基
としては一般にアミノ基，置換アミノ基，第４アンモニ
ウム基，ホスフォニウム基，およびこれらが塩となった
ものが好適に使用される。 【００４６】前記ポリエチレングリコール基としてはエ
チレングリコール単位の繰り返しが６〜３０の範囲であ
ることが望ましい。６より少ない場合には溶媒中で会合
体を形成しない場合がある。また、３０より多い場合に
は定量時の感度が十分に向上しない場合がある。ここで
本発明の蛍光性直鎖両親媒性化合物中に含まれる親水性
基の数は得られる蛍光性会合体の安定性の点から、１つ
または２つであることが好ましい。 【００４７】本発明の蛍光性直鎖両親媒性化合物は、上
記を満たすものであれば特に限定されず公知のものが用
いられる。一般に好適に使用される代表的なものを以下
に具体的に示す。 【００４８】 【化４】 【００４９】｛但し、構造式（ａ）〜（ｅ）において、
ｎは６〜１２の整数、ｍは２〜１２の整数、Ｚは 【００５０】 【化５】 【００５１】（但し、Ｘはハロゲンイオンまたは安定な
陰イオンを形成する原子団、Ｍはアルカリ金属、水素、
または安定な陽イオンを形成する原子団を示し、ｌは６
〜３０の整数を示す。）のいずれかを示す。｝ 上記好適な蛍光性直鎖両親媒性化合物において、Ｍで示
されるアルカリ金属としては、具体的にはリチウム、ナ
トリウム、カリウムであり、安定な陽イオンを形成する
原子団としてはアンモニウムイオン、テトラメチルアン
モニウムイオンである。Ｘで示されるハロゲンイオンと
しては、具体的にはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素であ
り、安定な陰イオンを形成する原子団は硝酸イオン、リ
ン酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンである。 【００５２】本発明の蛍光性会合体の製造方法としては
一般に公知の会合体の製造方法であれば特に限定され
ず、どのような方法であってもよい。一般に、蛍光性直
鎖両親媒性化合物を適量モルフォリノプロパンスルホン
酸等の緩衝液に入れ、超音波照射する方法が好適に用い
られる。 【００５３】該蛍光性会合体の形成は、溶液の光散乱の
増加、溶液のプロトンＮＭＲ測定時のピークのブロード
ニング、または酢酸ウラニルにより染色された溶液のキ
ャスト膜の電子顕微鏡による会合体の直接観察等により
確認できる。また、会合体の分子量は低角光散乱分析、
ゲルクロマトグラフィー等により測定される。 【００５４】蛍光性会合体を形成させる溶媒としては、
当該分野で公知の溶媒が使用可能であるが、蛍光性会合
体の安定性および定量時の検出感度を勘案すると水であ
ることが好ましい。また、水系の緩衝液を用いることに
より、ｐＨ変化の影響を無視できるために特に水系の緩
衝液が好適に用いられる。 【００５５】前記緩衝液における緩衝成分としては、特
に限定されないが、リン酸、トリスヒドロキシアミノメ
タン、酢酸、クエン酸、トリエタノールアミン、ホウ
酸、マレイン酸、炭酸、Ｎ−（２−アセトアミド）−２
−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）
イミノジ酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）グリシン、ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−シ
クロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シ
クロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンス
ルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスル
ホン酸、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）
アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、３−
［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］
プロパンスルホン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、２−ヒド
ロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピ
ペラジニル］プロパンスルホン酸、２−モルフォリノエ
タンスルホン酸、３−モルフォリノプロパンスルホン
酸、２−ヒドロキシエチル−３−モルフォリノプロパン
スルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンス
ルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキ
シ−３−プロパンスルホン酸）、Ｎ−トリス（ヒドロキ
シ）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、２−ヒド
ロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−
アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン等が好適に
使用される。 【００５６】該蛍光性会合体の濃度としては、用いる蛍
光性調査両親媒性化合物の臨界会合体形成濃度以上であ
ることが、感度よく定量するために必要である。該臨界
会合体形成濃度は一般に１０^-6〜１０^-3の範囲であり、
この濃度以上で用いることが望ましい。該会合体の濃度
は、溶媒中に蛍光性直鎖両親媒性化合物の不溶物が存在
しない濃度、即ち、使用する溶媒に対する飽和濃度以下
で使用することが望ましい。 【００５７】本発明の定量方法においては、蛍光性分子
と該蛍光性分子と結合可能な蛍光性会合体との共存下に
蛍光性会合体に吸収可能な光を照射し、蛍光性会合体か
らのエネルギー移動に帰因する蛍光性分子からの発光を
測定することにより蛍光性分子の量を決定する。公知の
蛍光分析法においては分析対象の蛍光性分子が吸収可能
な光を照射し、該蛍光性分子からの発光を測定する。し
かし、本発明の方法においては、蛍光性会合体に吸収可
能な光を照射することを特徴とする。 【００５８】本発明において、蛍光性分子と蛍光性会合
体との結合とは、前記した相互作用により蛍光性分子と
蛍光性会合体とがエネルギー移動可能な距離に接近する
ことを表わす。蛍光性分子と蛍光性会合体の結合は、一
般にそれぞれを適当な溶媒中で混合することにより自発
的に形成される。該溶媒としては、会合体の安定性を勘
案すると水が好適に採用される。 【００５９】本発明において、一般に好適な定量方法を
具体的に例示すれば以下のとおりである。即ち、 （Ａ） （１）既知濃度の測定対象蛍光性分子の溶液を蛍光セル
中に数種類用意する。 【００６０】（２）上記溶液に蛍光性会合体の溶液を一
定量添加する。 【００６１】（３）溶液を攪拌する。 【００６２】（４）蛍光性会合体の吸収極大波長の光を
励起波長、蛍光性分子の発光極大波長を発光波長として
蛍光強度を測定する。 【００６３】（５）上記の結果より検量線を作製する。 【００６４】（６）未知濃度試料に対して既知濃度溶液
と同様な操作をして蛍光強度を求める。 【００６５】（７）上記蛍光強度を検量線に外挿し未知
濃度の蛍光性分子の濃度を求める。 【００６６】（Ｂ） （１）既知量の測定対象蛍光性分子が吸着された固体を
数種類用意する。 【００６７】（２）上記固体を蛍光セル中の蛍光性会合
体の溶液に浸漬する。 【００６８】（３）溶液を攪拌する。 【００６９】（４）蛍光性会合体の吸収極大波長の光を
励起波長、蛍光性分子の発光極大波長を発光波長として
蛍光強度を測定する。 【００７０】（５）上記の結果より検量線を作製する。 【００７１】（６）未知濃度試料に対して既知濃度溶液
と同様な操作をして蛍光強度を求める。 【００７２】（７）上記蛍光強度を検量線に外挿し未知
濃度の蛍光性分子の濃度を求める。 【００７３】以上の操作により蛍光性分子が定量可能で
あり、蛍光性会合体が存在しない場合と比較して、その
検出感度は１０〜１００倍向上する。 【００７４】検出感度が向上する機構については明らか
ではないが、本発明の会合体内においては、蛍光発色団
が密に配向しているため、蛍光性会合体に光を照射する
ことによって生成した励起子が会合体を形成する分子間
を自由に移動可能となることが知られている。この結
果、蛍光性会合体から蛍光性分子へのエネルギー移動が
効率的に起ることが感度向上に関与しているものと考え
られる。 【００７５】上記好適な定量方法（Ｂ）に記載の測定対
象蛍光性分子が吸着された固体としては、ガラスビー
ズ、ガラス板、石英板、磁性粒子、多孔性セルロースフ
ィルム、多孔性ポリカーボネートフィルム、ポリスチレ
ンフィルム等が用いられる。 【００７６】本発明の定量方法において蛍光性分子と蛍
光性会合体の組合わせは、蛍光性会合体から蛍光性分子
へのエネルギー移動が起る組み合わせであれば特に制限
されない。一般に、２種類の蛍光性色素間のエネルギー
移動のためには、ドナー色素発光スペクトルとアクセプ
ター色素の吸収スペクトルに重なりが必要であることが
知られており、本発明においても、蛍光性会合体の発光
スペクトルと蛍光性分子の吸収スペクトルに重なりがあ
ることが高感度測定のために必須である。各スペクトル
の重なりの有無は、蛍光性会合体の蛍光スペクトル、蛍
光性分子の吸光スペクトルを測定することにより確認さ
れる。 【００７７】前記組合わせにおいて、蛍光性分子の発光
極大波長と蛍光性会合体の吸収極大波長の差が１００ｎ
ｍ以上ある場合、励起光の散乱光の影響が小さくなり感
度が向上するために好ましい。更に、２００ｎｍ以上差
があるとより散乱光の影響が小さくなるため好適であ
る。 【００７８】蛍光性会合体への光の照射、並びに蛍光性
分子からの発光量（強度）の測定には、市販の蛍光分光
光度計が簡便に採用される。 【００７９】本発明の定量方法において、前記した蛍光
性分子と蛍光性会合体の組合わせであれば特に制限され
ないが、特に好適な組合わせを具体的に例示すれば以下
のとおりである。 【００８０】即ち、蛍光性直鎖両親媒性化合物としては
下記化合物が挙げられる。 【００８１】 【化６】 【００８２】蛍光性分子としては、生理活性物質あるい
は生体由来物質をフルオレセイン−４−イソチオシアネ
ートと反応させることにより得られる蛍光標識生体分子
を用いた場合、特に高感度な蛍光標識生体分子の定量が
可能となる。 【００８３】 【発明の効果】本発明の蛍光性分子の定量方法は、該蛍
光性分子とエネルギー移動可能な蛍光性会合体を用いて
いるため、蛍光性分子の定量を極めて感度よく行うこと
が可能である。更に、蛍光性分子としては蛍光色素で標
識した生理活性物質または生体由来分子が使用可能であ
るため、特に臨床検査の分野において必要な高感度測定
に利用可能である。以上の点より、本発明の蛍光性分子
の定量方法の工業的価値は極めて大きい。 【００８４】 【実施例】以下に本発明をさらに具体的に説明するため
に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例に限定され
るものではない。 【００８５】尚、本実施例中低角光散乱分析により求め
た会合体の分子量は重量平均分子量でポリスチレンスル
ホン酸換算にて求めた値である。 【００８６】実施例１ 下記化合物 【００８７】 【化７】【００８８】５０ｍｇを１０ｍＭの３−モルフォリノプ
ロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略記する）緩衝液
（水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを７．２に調
整したもの）１０ｍｌ中に入れ、超音波照射機により均
一で透明な分散液を作製した。作製した蛍光性会合体溶
液を用いて、下記蛍光性分子の定量を行った。 【００８９】 【化８】 【００９０】上記蛍光性分子の吸収極大波長は４９１ｎ
ｍ、発光極大波長は５２５ｎｍ、また、蛍光量子収率は
０．７５であった。 【００９１】蛍光性分子の１ピコｍｏｌ／ｌ（以下ｐＭ
と略記する）から１００ナノｍｏｌ／ｌ（以下ｎＭと略
記する）の既知濃度の溶液（ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．
２）を作製した。最初に蛍光性色素溶液１ｍｌを蛍光セ
ルにとり、蛍光分光光度計にて励起波長４９０ｎｍで５
２５ｎｍの発光強度を測定した。続いて、蛍光性会合体
が５０マイクロｍｏｌ／ｌ（以下μＭと略記する）とな
るように添加して、励起波長２８０ｎｍで５２５ｎｍの
発光強度を測定した。 【００９２】この時、得られた溶液のプロトンＮＭＲ
は、上記化合物の重クロロホルム溶液中で観測された
６．７〜８．７ｐｐｍのピーク（芳香環のプロトン由
来）がブロードニングしており、会合体を形成している
ことが示された。更に、この溶液の低角光散乱分析によ
り会合体の分子量を測定したところ５×１０⁶ダルトン
であった。 【００９３】蛍光性色素を含まない緩衝液について、励
起波長４９０ｎｍで５２５ｎｍの発光強度を１０回測定
し濃度０での蛍光強度の平均値（以下Ｙと略記する）と
標準偏差（以下σ1と略記する）を求めた。同様にして
蛍光性会合体を含有し蛍光性分子を含有しない緩衝液に
ついて、励起波長２８０ｎｍで５２５ｎｍの発光強度を
測定し濃度０での蛍光強度のＹとσを求めた。本法にお
ける検出限界を発光強度がＹ＋２σ以上となる最も希薄
な溶液濃度として求めた。更に検出限界以上の各濃度に
おける蛍光強度を濃度に対してプロットし、１次の線形
回帰により傾きを求め、これを本法における分析感度と
して求めた。 【００９４】表１に蛍光性会合体存在下と非存在下にお
ける蛍光性分子の検出限界と分析感度をまとめて示し
た。 【００９５】 【表１】 【００９６】表１からわかるように、本発明の定量方法
を用いることにより検出限界、分析感度共に５０倍以上
向上しており、本発明の定量方法の有用性は明らかであ
る。 【００９７】実施例２ 表２に示す蛍光性分子（定量対象）を用いて実施例１と
同様にして検出感度および分析感度を求めた。結果を表
２にまとめて示す。 【００９８】 【表２】【００９９】実施例３ 下記化合物 【０１００】 【化９】 【０１０１】５０ｍｇを１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（水
酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを７．２に調整し
たもの）１０ｍｌ中に入れ、超音波照射機により均一で
透明な分散液を作製した。 【０１０２】ヒト血清アルブミン１ｇを１００ｍｌのＭ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解させ、そこにフルオ
レセイン−４−イソチオシアネート（以下ＦＩＴＣと略
記する）１ｇのアセトン溶液を滴下して、室温で１２時
間反応させた。反応後、ゲル濾過により高分子量成分を
分取してＦＩＴＣ標識ヒト血清アルブミンを得た。 【０１０３】得られた蛍光標識生体分子の吸収極大波長
は５００ｎｍ、発光極大波長は５２０ｎｍ、また、蛍光
量子収率は０．３１であった。 【０１０４】ＦＩＴＣ標識ヒト血清アルブミンの１ピコ
ｍｏｌ／ｌ（以下ｐＭと略記する）から１００ナノｍｏ
ｌ／ｌ（以下ｎＭと略記する）の既知濃度の溶液（ＭＯ
ＰＳ緩衝液、ｐＨ７．２）を作製した。最初に蛍光性色
素溶液１ｍｌを蛍光セルにとり、蛍光分光光度計にて励
起波長４９０ｎｍで５２０ｎｍの発光強度を測定した。
続いて、蛍光性会合体が５０μＭとなるように添加し
て、励起波長２８０ｎｍで５２０ｎｍの発光強度を測定
した。 【０１０５】更に、この溶液の低角光散乱分析により会
合体の分子量を測定したところ１０⁷ダルトンであっ
た。 【０１０６】蛍光性色素を含まない緩衝液について、励
起波長５００ｎｍで５２０ｎｍの発光強度を１０回測定
し濃度０での蛍光強度のＹとσを求めた。同様にして蛍
光性会合体を含有し蛍光性分子を含有しない緩衝液につ
いて、励起波長２８０ｎｍで５２０ｎｍの発光強度を測
定し濃度０での蛍光強度のＹとσを求めた。本法におけ
る検出限界を発光強度がＹ＋２σ以上となる最も希薄な
溶液濃度として求めた。更に検出限界以上の各濃度にお
ける蛍光強度を濃度に対してプロットし、１次の線形回
帰により傾きを求め、これを本法における分析感度とし
て求めた。 【０１０７】表３に蛍光性会合体存在下と非存在下にお
ける蛍光性分子の検出限界と分析感度をまとめて示し
た。 【０１０８】 【表３】 【０１０９】実施例４ 蛍光標識化試薬としてＦＩＴＣに代えて表４，表５に示
す化合物を用いて、実施例３と同様にして検出限界と分
析感度を求めた。結果を表４，表５にまとめて示す。 【０１１０】 【表４】【０１１１】 【表５】 【０１１２】実施例５ 生体由来物質としてヒト血清アルブミンに代えて表６に
示す化合物を用いて、実施例３と同様にして検出限界と
分析感度を求めた。結果を表６にまとめて示す。 【０１１３】 【表６】 【０１１４】実施例６ 表７に示す両親媒性蛍光化合物３０ｍｇを１０ｍＭの３
−モルフォリノプロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略
記する）緩衝液（水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐ
Ｈを７．２に調整したもの）１０ｍｌ中に入れ、超音波
照射機により均一で透明な分散液を作製した。作製した
蛍光性会合体溶液を用いて、下記蛍光性分子の定量を行
った。 【０１１５】 【化１０】 【０１１６】上記蛍光性分子の吸収極大波長は４９１ｎ
ｍ、発光極大波長は５２５ｎｍ、また、蛍光量子収率は
０．７５であった。 【０１１７】蛍光性分子の１ｐＭから１００ｎＭの既知
濃度の溶液（ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．２）を作製し
た。最初に蛍光性色素溶液１ｍｌを蛍光セルにとり、続
いて、蛍光性会合体が５０マイクロｍｏｌ／ｌ（以下μ
Ｍと略記する）となるように添加して、表７に示す励起
波長で５２５ｎｍの発光強度を測定した。また、得られ
た溶液の低角光散乱分析により会合体の分子量を測定し
た。結果を表７に合わせて示す。 【０１１８】蛍光性色素を含まない緩衝液について、同
じ励起波長で５２５ｎｍの発光強度を１０回測定し濃度
０での蛍光強度のＹとσを求めた。本法における検出限
界を発光強度がＹ＋２σ以上となる最も希薄な溶液濃度
として求めた。更に検出限界以上の各濃度における蛍光
強度を濃度に対してプロットし、１次の線形回帰により
傾きを求め、これを本法における分析感度として求め
た。 【０１１９】表７に蛍光性会合体存在での蛍光性分子の
検出限界と分析感度をまとめて示した。また、比較例と
して蛍光性を持たない会合体の存在下（Ｎｏ.１１）お
よび会合体を形成しない蛍光性両親媒性化合物を使用し
た場合（Ｎｏ.１０）での検出限界と分析感度も表７に
まとめて示した。 【０１２０】 【表７】【０１２１】表７からわかるように本発明の蛍光性会合
体を用いることにより、蛍光性分子の検出限界と分析感
度は著しく向上しており、その効果は明白である。 【０１２２】実施例７ 表８に示す両親媒性蛍光化合物６０ｍｇを１０ｍＭの２
−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニ
ル］プロパンスルホン酸（以下ＨＥＰＥＳと略記する）
緩衝液（水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを７．
２に調整したもの）１０ｍｌ中に入れ、超音波照射機に
より均一で透明な分散液を作製した。作製した蛍光性会
合体溶液を用いて、以下に示す蛍光性分子の定量を行っ
た。 【０１２３】 【化１１】 【０１２４】上記蛍光性分子の吸収極大波長は４２５ｎ
ｍ、発光極大波長は５００ｎｍ、また、蛍光量子収率は
０．１１であった。 【０１２５】蛍光性分子の１ｐＭから１００ｎＭの既知
濃度の溶液（ＨＥＰＳ緩衝液、ｐＨ７．２）を作製し
た。最初に蛍光性色素溶液１ｍｌを蛍光セルにとり、続
いて、蛍光性会合体が１００μＭになるように添加し
て、表８に示す励起波長で５００ｎｍの発光強度を測定
した。得られた溶液の低角光散乱分析により会合体の分
子量を測定した。結果を表８に合わせて示す。 【０１２６】蛍光性色素を含まない緩衝液について、同
じ励起波長で５００ｎｍの発光強度を１０回測定し濃度
０での蛍光強度のＹとσを求めた。本法における検出限
界を発光強度がＹ＋２σ以上となる最も希薄な溶液濃度
として求めた。更に検出限界以上の各濃度における蛍光
強度を濃度に対してプロットし、１次の線形回帰により
傾きを求め、これを本法における分析感度として求め
た。 【０１２７】表８に蛍光性会合体存在での蛍光性分子の
検出限界と分析感度をまとめて示した。また、比較例と
して蛍光性を持たない会合体の存在下（Ｎｏ.５，６）
での検出限界と分析感度も表８にまとめて示した。 【０１２８】 【表８】 【０１２９】表８からわかるように、蛍光性を持たない
両親媒性化合物よりなる会合体では、検出感度および分
析感度とも向上していないのに対して、本発明の蛍光性
会合体を用いることにより、検出限界と分析感度は著し
く向上しており、その効果は明白である。 【０１３０】実施例８ 下記化合物 【０１３１】 【化１２】 【０１３２】５０ｍｇを１０ｍＭの３−モルフォリノプ
ロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略記する）緩衝液
（水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを７．２に調
整したもの）１０ｍｌ中に入れ、超音波照射機により均
一で透明な分散液を作製した。続いて、下記蛍光性分子 【０１３３】 【化１３】【０１３４】をラングミュア・ブロジェット法により石
英基板上に１０^-15ｍｏｌ〜１０^-13ｍｏｌの範囲で固定
化した。上記蛍光性分子の吸収極大波長は４９３ｎｍ、
発光極大波長は５２５ｎｍ、また、蛍光量子収率は０．
３３であった。 【０１３５】ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．２）２ｍｌを満
たした石英セル中に蛍光性分子を固定化した石英板を入
れ、蛍光分光光度計にて励起波長４９０ｎｍで５２５ｎ
ｍの発光強度を測定した。続いて、蛍光性会合体が５０
マイクロｍｏｌ／ｌ（以下μＭと略記する）となるよう
に添加して、励起波長２８０ｎｍで５２５ｎｍの発光強
度を測定した。 【０１３６】この時、得られた溶液の低角光散乱分析に
より会合体の分子量を測定したところ５×１０⁶ダルト
ンであった。 【０１３７】蛍光性分子を固定化していない石英板につ
いて、ＭＯＰＳ緩衝液中で励起波長４９３ｎｍで５２５
ｎｍの発光強度を１０回測定し濃度０での蛍光強度の平
均値（以下Ｙと略記する）と標準偏差（以下σ1と略記
する）を求めた。同様にして蛍光性会合体溶液中で蛍光
性分子を固定化していない石英板を入れ、励起波長２８
０ｎｍで５２５ｎｍの発光強度を測定し濃度０での蛍光
強度のＹとσを求めた。本法における検出限界を発光強
度がＹ＋２σ以上となる最も希薄な溶液濃度として求め
た。更に検出限界以上の各濃度における蛍光強度を濃度
に対してプロットし、１次の線形回帰により傾きを求
め、これを本法における分析感度として求めた。 【０１３８】表９に蛍光性会合体存在下と非存在下にお
ける蛍光性分子の検出限界と分析感度をまとめて示し
た。 【０１３９】 【表９】 【０１４０】表９からわかるように、本発明の定量方法
は基板表面に固定化された蛍光性分子についても有効で
あり、検出限界、分析感度共に５０倍以上向上した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/75 - 21/83 G01N 21/62 - 21/74 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) 実用ファイル（ＰＡＴＯＬＩＳ) 特許ファイル（ＰＡＴＯＬＩＳ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 蛍光性分子と該蛍光性分子と結合可能な
   平均分子量（重量平均）が１万〜１億の範囲の蛍光性会
   合体との共存下に蛍光性会合体に吸収可能な光を照射
   し、蛍光性会合体からのエネルギー移動に帰因する蛍光
   性分子からの発光を測定することにより蛍光性分子の量
   を決定することを特徴とする蛍光性分子の定量方法。