JP3497175B2

JP3497175B2 - 一価の（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）抗体フラグメント

Info

Publication number: JP3497175B2
Application number: JP52636598A
Authority: JP
Inventors: キング，デビッド，ジョン; チャップマン，アンドリュー，ポール
Original assignee: セルテックセラピューティックスリミテッド
Priority date: 1996-12-10
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2017-12-10
Also published as: CA2269115A1; DK0948544T3; AU5404998A; EP0948544B1; WO1998025971A1; JP2001506990A; ES2197373T3; GB9625640D0; EP0948544A1; GB9913228D0; GB2334957B; AU733251B2; CA2269115C; EP1160255A1; NZ335689A; GB2334957A; PT948544E; DE69721564D1; ATE239040T1; DE69721564T2

Description

【発明の詳細な説明】本願発明は、修飾された一価の抗体フラグメント，そ
れらの製造方法，それらを含む組成物及びそれらの医薬
における使用に関する。

抗体は、診断及び治療目的での医療において、その使
用が増大している。各事例における目的は、抗体−抗原
相互作用の高い特異性と親和性との組合せを利用するこ
と、ある特定の病変の検出及び／または治療を可能とす
ることである。抗体は単独で使用されたり、またはラジ
オアイソトープや細胞毒性をもつ薬剤などの他の原子ま
たは分子を付帯させる。

抗体の薬物動態及び生体内分布は、医療での抗体の使
用が成功するかどうかを決定するのに重要な役割を果た
す。ゆえに抗体は、作用部位に送達でき、その目的を達
するのに適した時間、そこに留まるものでなければなら
ない。その抗体はまた、標的の外側では毒性を示すレベ
ル以下で存在すべきであり、明瞭な機構で代謝されるも
のでなければならない。

多くの使用において、抗体の薬物動態は理想的ではな
い。この事実は、抗体−ラジオアイソトープまたは薬物
との接合体を用いた腫瘍の診断及び治療においては特に
現実的なものである。治療において、半減期が長い場
合、正常組織が抗体接合体に長時間曝されることにな
り、従って用量限定的な毒性に繋がることになる。

多くのアプローチが、抗体の薬物動態を操作する上で
利用でき、これらのアプローチは通常、抗体の生体内分
布にも影響する。最も単純で最も一般的に適用されるア
プローチは、抗体フラグメントの使用である。抗体フラ
グメントは抗体全部に比べて循環系から素早く排除さ
れ、血液から組織へより速やかに分布し、このことが幾
つかの適用、例えば腫瘍のイメージング及び治療におい
て特別な利点となる。

抗体フラグメントの薬物動態を改善するため、さらに
我々はポリマーの使用を研究した。ポリエチレングリコ
ール（PEG）などのポリマー材のタンパク質分子への結
合はよく確立されており、ポリマーの結合が本質的にタ
ンパク質分子の薬物動態の性質を変化させ得ることが実
証されている。例えば、タンパク質のPEG修飾はイン・
ビボ（in vivo）のタンパク質の循環における半減期，
抗原性、及び免疫原性，溶解性，物理的安定性及びタン
パク質分解に対する抵抗性を変化させることができる
（Abuchowski,A.ら,J.Biol.Chem.（1977）252,3578−35
81及び3582−3586;Nucci,M.L.ら,Adv.Drug Delivery Re
views（1991）６,133−151;Francis,G.ら,Pharmaceutic
al Biotechnology Vol.3.（Borchardt,R.T.編集）;Stab
ility of Protein Pharmaceuticals:in vivo Pathways
of Degradation and Strategies for Protein Stabiliz
ation（1991）pp235−263（Ahem,T.J及びManning,M.編
集）Plenum,New York）。

PEGのタンパク質分子への結合は、多くの異なった化
学的方法を用いて達成され、これらの方法の大部分はPE
Gをランダムに、タンパク質表面のリジン残基または他
のアミノ酸残基に結合させるものである（Zalipsky,S.
＆ Lee,C.Poly（ethylene glycol）Chemistry:Biotechn
ical and Biomedical Applications（1992）pp347−370
（Harris,J.M.編集）,Plenum,New York）。このような
結合はしばしば、タンパク質の機能の部分的損傷、例え
ば酵素の触媒活性を減じることに繋がる（Nucci,M.L.
ら，同書中）。

PEGの結合部位を導入するための部位特異的なタンパ
ク質の修飾が報告されている。例えばインターロイキン
−２は突然変異によって修飾され、通常グリコシル化さ
れるスレオニンをPEGが接着できるようにシステインに
変換されている（Goodson,R.J.＆ Katre,N.V.,Bio/Tech
nology（1990）８,343−346）。通常グリコシル化され
る部位が、その部位はタンパク質構造を乱すことなしに
PEG修飾を許容できると考えられるという理由で、選択
された。別の例として、酵素・プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼが、アルギニン残基を選択的にリジンに変換
するように修飾され、この場合には酵素１分子当り18個
までの付加的なPEG結合可能部位が提供されている（Her
shfield,M.S.ら,P.N.A.S.（1991）88,7185−7189）。抗
体及び抗体フラグメントを用いた以前の研究では、リジ
ン残基を介したランダムなPEGの結合（例えば、Ling,T.
G.I.＆ Mattiasson,B.,J.Immunol.Methods（1983）59,3
27−337;Wilkinson,I.ら,Immunol.Letters（1987）15,1
7−22;Kitamura,K.ら,Cancer Res.（1991）51,4310−43
15;Delgado,C.ら,Br.J.Cancer（1996）73,175−182）及
びチオール化誘導体（Pedley,R.B.ら,Br.J.Cancer（199
4）70,1126−1130）を用いている。ランダムな結合はし
ばしば、親和性や特異性が減少した状態でしか標的抗原
に結合できなくなった修飾抗体を生じさせる。これを克
服するための一つの試みとして、抗原結合（CDR）ルー
プにおける、非常に重要なリジン基をアルギニンに変換
することにより、免疫反応性をほとんど減じることなく
修飾することができる（Benhar,I.ら,Bioconjugate Che
mistry（1994）５,321−326）。

抗体の定常及びヒンジ領域における特定の部位を、あ
る範囲のエフェクター及びレポーターと部位特異的に結
合できるように改変することができる（Lyons,A.ら,Pro
t.Eng.（1990）３,703−709;欧州特許明細書No.348442
及び347433）。我々は今、ポリマーの一価の抗体フラグ
メントへの部位特異的な結合を、以前のランダムな結合
工程に関連した免疫反応性の欠損を避けるために用いる
ことができると判断した。さらに、このように修飾され
たフラグメントでは、同数かつ同形のポリマー分子でラ
ンダムに修飾されたフラグメントと比較したとき、結合
性及び／または薬物動態性が著しく改善している。

ゆえに本願発明の一つの側面として我々は、各システ
イン残基の少なくとも１個がポリマー分子に結合してい
るという条件で、抗体フラグメント中の該フラグメント
の可変領域ドメインの外側に位置する該システイン残基
がその硫黄原子を介してポリマー分子に共有結合する
か、該フラグメントに位置するもう一つのシステイン残
基にジスルフィド結合することを特徴とする、共有結合
状態にある、一価の抗体フラグメントと少なくとも一つ
のポリマー分子からなる、修飾された一価の抗体フラグ
メントを提供する。

本願発明による修飾された抗体フラグメントは本質的
に、１個以上、例えば１個、２個または３個のポリマー
分子に、該フラグメント中の可変領域ドメインの外側に
位置する、１個以上、例えば１個、２個または３個のシ
ステイン残基を通して共有結合している一価の抗体フラ
グメントである。該フラグメントは、以下に記載するよ
うに、１以上のエフェクターまたはリポーター分子を付
加的に結合していてもよい。

本願発明の修飾された抗体フラグメントは一般に、選
択的に一つの抗原に結合することができる。その抗原は
細胞結合型抗原、例えばＴ細胞，内皮細胞または腫瘍細
胞マーカーのような細胞表面抗原であってもよく、ま
た、可溶性の抗原であってもよい。細胞表面抗原の例と
しては特に、接着分子、例えば、VLA−４などのβ１イ
ンテグリン類のようなインテグリン類,E−セレクチン,P
−セレクチンやＬ−セレクチン,CD2,CD3,CD4,CD5,CD7,C
D8,CD11a,CD11b,CD18,CD19,CD20,CD23,CD25,CD33,CD38,
CD40,CD45,CDW52,CD69,胎児性抗原（CEA），ヒト乳脂肪
グロブリン（HMFG1及び２）,MHCクラスＩ及びMHCクラス
II抗原，及びVEGF、そしてそれらの適当な受容体などが
含まれる。可溶性抗原には、IL−1,IL−2,IL−3,IL−4,
IL−5,IL−6,IL−8,またはIL−12のようなインターロイ
キン類、例えばRSウイルスやサイトメガロウイルス抗原
のようなウイルス抗原、IgEのようなイムノグロブリ
ン、インターフェロン−α，インターフェロン−β，イ
ンターフェロン−γなどのインターフェロン類、腫瘍壊
死因子−α，腫瘍壊死因子−β,G−CSFやGM−CSFのよう
なコロニー刺激因子、PDGF−α及びPDGF−βのような血
小板由来成長因子、そしてこれらの適当な受容体などが
含まれる。

本願発明によるフラグメントに関連して、ここで使用
されている可変領域ドメインという語は、抗原結合部位
を含む抗体フラグメントのその部分を意味するものであ
る。可変領域ドメインはどのような大きさでも、アミノ
酸組成でもよく、一般的に、構造配列にはめ込まれた抗
原結合を担う、少なくても一つの超可変のアミノ酸配列
からなる。一般用語において、可変（Ｖ）領域ドメイン
は、イムノグロブリンの重（V_H）鎖及び／または軽
（V_L）鎖の可変ドメインのいかなる適当な配置でもよ
い。ゆえに、例えばＶ領域ドメインは単量体でもよく、
また、抗原に許容可能な親和性をもって単独で結合でき
るところのV_HまたはV_Lでもよい。また、Ｖ領域ドメイン
は二量体でも、V_H及びV_L鎖が非共有結合的に会合してい
るV_H−V_H,V_H−V_LまたはV_L−V_Lの二量体を含んでいても
よい。しかし必要ならば、該鎖が、単一鎖ドメインを形
成するため、例えば二つの可変ドメイン間のジスルフィ
ド結合を通して直接的に、もしくは、例えばペプチド結
合子（linker）などの結合子を通して共有結合されてい
てもよい。

可変領域ドメインは、自然発生の可変ドメインでも、
それに工学技術を施したものでもよい。工学技術を施し
たものとは、可変領域ドメインが組換えDNA工学技術を
用いて創作されたものであることを意味する。このよう
な工学技術を施したものには、例えば、本来の抗体可変
領域から本来の抗体のアミノ酸配列における挿入，欠失
または置換によって創作されたものなどがある。このタ
イプの例としては特に、少なくても１つのCDRを含み、
１つの抗体から１以上の構造アミノ酸類及びもう１つの
抗体からの可変領域の残部（remainder）を含んでいて
もよい、工学技術を施した可変領域ドメインがある。

可変領域ドメインは通常、各々が硫黄原子を介してポ
リマー分子に共通結合している、少なくとも１つのシス
テイン残基、特に２つまたは３つのシステイン残基で共
有結合されている。

各システイン残基の位置が、要求される抗体フラグメ
ントの大きさ及び性質によって変化してもよい。ゆえ
に、１つの極端な例として、その硫黄原子を通してポリ
マーに結合しているシステイン残基は可変領域ドメイン
のＣ末端アミノ酸に直接結合していてもよい。これは例
えば、上記のようなV_HまたはV_L鎖のＣ末端であってもよ
い。必要ならば、この例において、更なるシステイン−
結合ポリマーを含んでいる、更なるアミノ酸が、第一の
システイン残基のＣ末端に共有結合していてもよい。

しかしながら実際、可変領域ドメインはＣ末端アミノ
酸で、各々がその硫黄原子を通してポリマー分子に共有
結合している、１個,2個,3個またはそれ以上のシステイ
ン残基を含むか、もしくはそれらに結合している、少な
くとも１つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメント
に共有結合していることが一般的に望ましい。ゆえにV_H
ドメインが可変領域ドメインに存在する場合は、これが
イムノグロブリンC_H1ドメインまたはそのフラグメント
に結合していてもよい。同様に、V_LドメインがC_Kドメイ
ンまたはそのフラグメントに結合していてもよい。この
ように例えば、本願発明によるフラグメントは、抗原結
合ドメインが、Ｃ末端でそれぞれCH1及びC_Kドメインに
共有結合している、会合したV_H及びV_Lドメインを含んで
いることを特徴とする、Fabフラグメントであってもよ
い。CH1ドメインは、例えばヒンジ領域ドメインがFab'
フラグメント中に見出せるようにするために、または抗
体のCH2及びCH3ドメインなどの更なるドメインを提供す
るために、更なるアミノ酸で伸張されてもよい。上記の
各例において、１以上、例えばそれぞれがポリマー分子
に結合している１個,2個または３個のシステイン残基
が、いずれのドメインのいずれの点に位置していてもよ
い。

本願発明によるフラグメント中のポリマー分子は一般
に、合成でも天然由来のポリマーでもよく、例えば任意
に置換された直鎖または分枝鎖のポリアルキレン（poly
alkylene），ポリアルケニレン（polyalkenylene）また
はポリオキシアルキレン（polyoxyalkylene）ポリマ
ー、もしくはホモまたはヘテロのポリサッカライドなど
の、直鎖または分枝鎖のポリサッカライドなどである。

上記の合成ポリマー上に存在する可能性がある任意の
置換基には特に、１以上の水酸基，メチル基またはメト
キシ基が含まれる。合成ポリマーの例としては特に、任
意に置換された直鎖または分枝鎖のポリ（エチレングリ
コール）、ポリ（プロピレングリコール）もしくはポリ
（ビニルアルコール）及びその誘導体、特に、メトキシ
（ポリエチレングリコール）及びその誘導体のような、
任意に置換されたポリ（エチレングリコール）が含まれ
る。天然由来のポリマーには特に、ラクトース，アミロ
ース，デキストラン、またはグリコーゲン及びその誘導
体が含まれる。ここで使用される「誘導体」とは、反応
性誘導体、例えばマレイミド類などのチオール選択的な
反応性基を含むことを意味する。反応性基は、直接また
は接合子セグメント（segment）を介してポリマーに結
合していてもよい。このような残基は幾つかの場合にお
いて、抗体フラグメントとポリマーとの間の結合基とし
て本願発明の生産物の一部を形成することが認識される
だろう。

ポリマーの大きさはどのような範囲にわたってもよい
が、一般には平均分子量が約500Daから50000Da、例えば
5000から40000Da、そして25000から40000Daなどが考え
られる。ポリマーの大きさは特に、生産物の使用目的を
もとに選択されてもよい。ゆえに、例えば腫瘍の治療に
使用する目的など、生産物が循環系を離れ、組織内に移
行するように意図される場合は、例えば5000Da付近の、
少分子量のポリマーを使用する方が有利であろう。生産
物が循環系に残ることを特徴とする適用においては、例
えば25000Daから40000Daの範囲のより高分子量のポリマ
ーを用いる方が有利であろう。

上記に説明したように、本願発明による修飾された抗
体フラグメント中の各ポリマー分子は、フラグメントに
位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合する。共
有結合は一般に、ジスルフィド結合または、特に硫黄−
炭素結合である。

本願発明による特に有用なフラグメントは、フラグメ
ント中の可変領域ドメインの外側に位置する２つまたは
特に３つのシステイン残基が各々、その硫黄原子を介し
てポリマー分子に共有結合し、フラグメント中の可変領
域ドメインの外側に位置する他のシステイン残基はフラ
グメントに位置するもう１つのシステイン残基とのジス
ルフィド結合内にあるものである。これらの特別なフラ
グメントにおいては、ポリマーは特に、合成ポリマー、
特にポリ（エチレングリコール）のようなポリアルキレ
ンポリマー、特にメトキシポリ（エチレングリコール）
やその誘導体であり、特に約25000Daから40000Daの分子
量範囲のものであってもよい。

必要であれば、本願発明による抗体フラグメントは、
それに結合した１以上のエフェクター（effector）また
はリポーター（reporter）分子を有していてもよく、本
願発明はこのような修飾抗体にまで及ぶものである。エ
フェクターまたはリポーター分子は抗体フラグメント
に、フラグメント中に位置する使用可能なアミノ酸側鎖
や末端アミノ酸官能基、例えば遊離のアミノ基，イミノ
基，水酸基またはカルボキシル基を介して結合していて
もよい。

エフェクター分子は例えば、抗腫瘍性剤，（菌体や植
物由来の酵素活性トキシン及びそのフラグメント、例え
ばリシン（ricin）及びそのフラグメントなどの）トキ
シン，酵素などの生物学的活性タンパク質,DNA,RNA及び
そのフラグメントなどの核酸及びそのフラグメント，放
射性核種、特に放射性ヨウ素，そしてキレート金属であ
る。適切なリポーター基には、キレート金属，螢光化合
物、もしくはNMRやESRスペクトロスコピーによって検出
され得る化合物が含まれる。

抗腫瘍性剤には特に、細胞毒性因子及び静菌剤、例え
ばナイトロジェンマスタード類（nitrogen mustards）
（例えばクロランブシル（chlorambucil），メルファラ
ン（melphalan），メクロレタミン（mechlorethamin
e），シクロホスファミド（cyclophosphamide）または
ウラシルマスタード（uracil mustard））などのアルキ
ル化剤及びその誘導体、トリエチレンホスホラミド（tr
iethylenephosphoramide），トリエチレンチオホスホラ
ミド（triethylenethiophosphoramide），ブサルファン
（busulphan）またはシスプラチン；抗代謝剤、例えば
メトトレキセート，フルオロウラシル，フロキシウリジ
ン（floxuridine），シタラビン（cytarabine），メル
カプトプリン，チオグアニン，フルオロ酢酸またはフル
オロクエン酸、抗生物質、例えばブレオマイシン類（硫
酸ブレオマイシン），ドキソルビシン（doxorubici
n），ダウノルビシン（daunorubicin），マイトマイシ
ン類（マイトマイシンＣなど），アクチノマイシン類
（ダクチノマイシン（dactinomycin）など），プリカマ
イシン（plicamycin），カリカエミシン（calichaemici
n）及びその誘導体、またはエスペラミシン（esperamic
in）及びその誘導体；有糸分裂阻害剤、エトポシド（et
oposide），ビンクリスチン（vincristine）またはビン
ブラスチン（vinblastine）とその誘導体；アルカロイ
ド類、例えばエリプティシン（ellipticine）；ポリオ
ール類、例えばタキシン−Ｉ（taxicin−Ｉ）またはタ
キシン−II（taxicin−II）；ホルモン類、例えばアン
ドロジェン類（ドロモスタノロン（dromostanolone）や
テストラクトン（testolactone）など）、プロジェスチ
ン（progestin）類（酢酸メジェストロール（megestrol
acetate）や酢酸メドロキシプロゲステロン（medeoxyp
rogesterone acetate））、エストロジェン類（ジメチ
ルスチルベステロール二リン酸（dimethylstilbestrol
diphosphate）、ポリエストラジオールリン酸（polyest
radiol phosphate）やエストラムスチンリン酸（estram
ustine phosphate）など）または抗エストロジェン類
（タモキシフェン（tamoxifen）など）；アントラキノ
ン類、例えばミトキサントロン（mitoxantrone）、ウレ
ア類、例えばヒドロキシウレア；ヒドラジン類、例えば
プロカルバジン（procarbazine）；またはイミダゾール
類、例えばダカルバジン（dacarbazine）が含まれる。

特に有用なエフェクター基はカリカエミシン（calich
aemicin）及びその誘導体である（例えば南アフリカ特
許明細書No.85/8794,88/8127及び90/2839）。

キレート金属には、配位数が２から８である、２また
は３価の金属のキレートが含まれる。このような金属の
例としては例えば、テクネチウムTc,レニウムRe,コバル
トCo,銅Cu,金Au,銀Ag,鉛Pb,ビスマスBi,インジウムIn,
ガリウムGa,イットリウムY,テルビウムTb,ガドリニウム
Gd及びスカンジウムScが含まれる。一般に金属は放射性
核種が望ましい。放射性核種には特に、^99mTc,¹⁸⁶Re,
¹⁸⁸Re,⁵⁸Co,⁶⁰Co,⁶⁷Cu,¹⁹⁵Au,¹⁹⁹Au,¹¹⁰Ag,²⁰³Pb,²⁰⁶B
i,²⁰⁷Bi,¹¹¹In,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁸⁸Y,⁹⁰Y,¹⁶⁰Tb,¹⁵³Gd及び⁴⁷S
cが含まれる。

キレート金属は、例えば上記の金属のタイプの１つ
で、適当な多配位座キレート剤、例えば非環式または環
式ポリアミン類やポリエーテル類（クラウン（crown）
エーテル類及びその誘導体）；ポリアミド類；ポルフィ
リン類；及びカルボサイクリック（carbocyclic）誘導
体などにキレートしているものでもよい。

一般に、キレート剤のタイプは使用される金属に依存
している。しかし、本願発明による接合体におけるキレ
ート剤の特に有用な１群は、非環式または環式ポリアミ
ン類、特に、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（diethy
lenetriaminepentaacetic acid）とその誘導体などのポ
リアミノカルボン酸、及び、（例えば国際出願特許明細
書No.WO 92/22583に記載されるような）環式トリアザ及
びテトラアザ誘導体などのマクロサイクリック（macroc
yclic）アミン類；及びポリアミド類、特にデスフェリ
オキシアミン（desferrioxamine）とその誘導体であ
る。

本願発明による修飾された抗体フラグメントは、少な
くとも１つの活性システイン残基を有する抗体フラグメ
ントとチオール選択的な活性化ポリマーを反応させるこ
とによって調製されてもよい。その反応は一般に、溶
媒、例えば、酢酸やリン酸バッファなどで、約pH4.5か
ら約pH8.0の中性付近のpHで、例えば室温の水性緩衝液
中で行われてもよい。その活性化ポリマーは一般に、抗
体フラグメントの濃度に比較して過剰濃度で作用させ
る。幾つかの場合、適度に活性なシステイン残基を生じ
させるためには、（例えば実施例１の後に記載されてい
るような）β−メルカプトエチルアミンなどの試薬を含
む、抗体の開始材料を少なくする必要があるかもしれな
い。必要であれば、望まれる数のポリマー分子を有する
望まれる生産物を、生産工程中に生成する、所望の数で
はないポリマー分子を有する他の生産物から、クロマト
グラフィーなどの通常法によって分離してもよい。

抗体フラグメントの出発材料は、抗体全部、特に（慣
用の免疫及び融合手段によって調製される）モノクロー
ナル抗体全部から、ペプシン処理などの適当な標準的酵
素による切断及び／または消化技術を用いて取得しても
よい。または、抗体フラグメントの出発材料を抗体の可
変及び／または定常領域をコードするDNAの操作及び再
発現（re−expression）を含む組換えDNA技術を用いて
調製してもよい。このようなDNAは、例えばファージ−
抗体ライブラリー（Chiswell D.J.及びMcCafferty,J.Ti
btech.10 80−84（1992）参照）を含むDNAライブラリー
から既知であり、及び／またはすぐに利用できるもので
あるか、所望により合成することができる。標準的な分
子生物学的及び／または化学的手法が、例えばシステイ
ン残基を生成するためのコドンを導入したり、他のアミ
ノ酸やドメインを所望により修飾し、付加し、または削
除するために、DNAを配列決定したり操作するのに用い
られてもよい。

これから、上記のようなDNAを含む、１以上の複製可
能な発現ベクターは、抗体の産生が起こるであろう適当
な細胞系、例えば、マウスNSO系などの非生産性のミエ
ローマ細胞系、または大腸菌などの菌類系を形質転換す
るために調製され、用いられてもよい。効率的な転写及
び翻訳を得るために、各ベクター中のDNA配列には、適
当な制御を司る配列、特に、操作によって可変領域ドメ
イン配列にリンクできるプロモーター及びリーダー配列
を導入すべきである。抗体のこのような生産方法は、一
般によく知られており、慣例的に使用されている。例え
ば、基礎分子生物学の手法がManiatisら（Molecular Cl
oning,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,198
9）によって記されている。またDNA配列決定はSangerら
の記載（PNAS 74,5463,（1977））及びAmersham Intern
ational plc配列決定ハンドブックに従って行われる。
そして部位指向性の変異は、Kramerらの方法（Nucl.Aci
ds Res.12,9441,（1984））及びAnglian Biotechnology
Ltdハンドブックに従って行うことができる。加えて、
例えばMountain A and Adair,J R in Biotechnology an
d Genetic Engineering Reviews（Tombs,M P,10,Chapte
r 1,1992,Intercept,Andover,UK）によって、及び国際
特許出願明細書No.WO 91/09967において引用されている
ように、DNA操作、発現ベクターの作成及び適当な細胞
の形質転換による抗体調製のために適した技術を詳述す
る、特許明細書を含む、多くの刊行物がある。

本願発明による抗体フラグメントの調製に使用するた
めの、活性化されたポリマーの出発原料は、ヨードアセ
タミドなどのα−ハロカルボン酸またはエステル、マレ
イミドなどのイミド、ビニルスルフォン、またはジスル
フィドのようなチオール活性基を含む、如何なるポリマ
ーであってもよい。このような出発原料は、市販品（例
えばShearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USAか
ら）として取得してもよいし、市販品で利用できる出発
材料から、Zalipsky,S ＆ Lee,C,同書中によって及び以
下の実施例中に記載されているような、通常の化学的手
法を用いて調製してもよい。

エフェクターまたはリポーター分子に結合した、本願
発明による抗体フラグメントを取得することが望まれる
場合、これは、抗体フラグメントが直接的またはカップ
リング剤を通して、適当に活性化されたポリマーとの反
応前か後に、エフェクターまたはリポーター分子に結合
することにおいて、標準的な化学的または組換えDNA手
法によって調製されてもよい。化学的な手法には特に、
例えば国際特許出願明細書No.WO 93/06231,WO 92/2258
3,WO90/09195,WO 89/01476に記載されるものが含まれ
る。または、エフェクターまたはリポーター分子はタン
パク質またはポリペプチドである場合は、その結合は、
例えば国際特許出願明細書No.WO 86/01533及び欧州特許
出願明細書No.392745に記載されるような組換えDNAの手
法を用いて行われてもよい。

本願発明による抗体フラグメントは、多くの疾患や機
能障害の検出や治療に有用である。このような疾患や機
能障害には、ウイルス感染などの感染症、リウマチ，変
形性関節症，炎症性腸疾患などの炎症性及び／または自
己免疫、癌、喘息，湿疹などのアレルギー／アトピー疾
患、嚢胞性線維症，鎌状赤血球貧血などの先天性疾患、
幹癬などの皮膚疾患、多発性硬化症などの神経疾患、移
植臓器拒絶，対宿主性移植片病などの移植に伴う疾患及
び糖尿病などの代謝性／特発性疾患の、一般的な項目と
して記載されているようなものが含まれる。

本願発明による修飾した抗体フラグメントは、治療及
び／または診断での使用のために考案されてもよく、更
なる本願発明の側面によれば、我々は、一価の抗体フラ
グメントと少なくとも１つのポリマー分子が、各共有結
合が抗体フラグメント中の可変領域の外側に位置するシ
ステイン残基の硫黄原子を介してのものであることを特
徴とする共有結合であることからなる、修飾された一価
の抗体フラグメント及び、１以上の医薬的に適用可能な
添加剤，希釈剤や担体からなる医薬組成物を提供する。

以上に説明したように、発明のこの側面における、修
飾された抗体フラグメントは、１以上のエフェクターや
リポーター基と結合していてもよい。

医薬組成物は、如何なる適当な投与形態をとってもよ
く、好ましくは、例えば大容量（bolus）注射や継続的
注射などの注射や点滴などの非経口的投与に適した形態
がよい。該組成物が注射や点滴用の場合、油性や水性の
粒子中の懸濁液，溶液またはエマルジョンの形態をとっ
てもよく、懸濁剤，保存剤，安定剤及び／または分散剤
のような処方剤を含んでいてもよい。

または、抗体組成物は適当な滅菌液で使用前に再構成
するため、乾燥した形態でもよい。

抗体組成物が経口投与に適するものにするには、処方
は活性成分に加えて、次のような添加剤を含んでいても
よい。澱粉類：ジャガイモ，トウモロコシまたは小麦澱
粉や、微結晶セルロースなどのセルロースや澱粉誘導
体；シリカ；ラクトースなどの様々な糖類；炭酸マグネ
シウム及び／またはリン酸カルシウム。処方を経口投与
に適するものにするには、患者の消化系に耐え得るもの
であることが望まれる。この目的のために、処方に粘液
形成物及びレジンが含まれることが望まれる。胃液で不
溶性のカプセルに抗体を処方して、寛容性を改良するこ
とが望まれる。また好ましくは、制御された放出の処方
で抗体または組成物を含んでいてもよい。

抗体組成物が直腸投与に適するものにするには、処方
には結合及び／または潤滑剤、例えば重合体グリコール
類，ゼラチン類，ココア−バターまたは他の植物性ワッ
クスや脂肪を含んでもよい。

本願発明によるフラグメントの治療的及び診断的使用
は典型的なものとして、有効量の抗体フラグメントのヒ
ト患者への投与からなる。投与すべき的確な量は抗体の
使用及び年齢，性別及び患者の体調によって変化する
が、典型的には約0.1mgから1000mg、例えば約1mgから50
0mgである。抗体は単回用量として、またはある期間継
続的な方式で投与してもよい。用量は適当に繰り返され
てもよい。典型的な量は例えば単回治療用量当り0.1−5
0mg/kg体重、特に単回用量当り0.1−20mg/kg体重であ
る。

以下の実施例は本願発明を説明するものである。実施
例中、以下の抗体フラグメントが、各例において以下に
与えられた略名で使用され、同定されている。各実例に
おいて、国際特許出願明細書No.WO92/01059（A5B7）に
記載されるように、または同様な方法（hTNF40及びcTN
3）を用いて、マウスモノクローナル抗体から調製され
た。

hA5B7−これは胎児性抗原を認識する、工学技術的に作
製されたヒト抗体である。ここで使用される抗体フラグ
メントは、β−メルカプトエチルアミンとの活性化後
に、ペジレーション（pegylation）に有効で、そのヒン
ジ領域に位置する１つのシステイン残基を有する。

hTNF40−これはヒトTNFαを認識する、工学技術的に作
製されたヒト抗体である。２つのhTNF40抗体フラグメン
トが実施例中で使用され、その１つ（実施例２）はヒン
ジ領域に単一のシステイン残基を有し（上記hA5B7参
照）、もう１つ（実施例３）はペジレーションに有効
な、２つのヒンジシステイン残基を有する。

cTN3−これはマウスTNFαを認識し、マウスIgG2a定常領
域を有するキメラハムスター／マウス抗体である。その
抗体は、ペジレーションに有効な３つのヒンジシステイ
ン残基を有する。

hg162−これはヒトPDGFβレセプターを認識する、工学
技術的に作製されたヒト抗体である。ここで使用される
抗体フラグメントはペジレーションに有効な、そのヒン
ジ領域に存在する単一のシステイン残基を有する。

以下の略語は実施例１で使用される。

実施例２〜７において、PEGの略号は、指示されるよ
うにポリ（エチレングリコール）とチオール活性基との
間の接合子セグメントを有するまたは有しない、直鎖ま
たは分枝鎖状のメトキシポリ（エチレングリコール）に
参照するために用いられる。各実施例において、抗体に
対する結合は上記のように−Ｓ−Ｃ−結合を通して、ま
たは実施例５においては−Ｓ−Ｓ−結合を通して生じ
る。

全ての実施例において、以下の略号が用いられる。

DTDP−4,4'−ジチオジピリジン（dithiodipyridine） PBS −リン酸緩衝食塩水 HPLC−高性能液体クロマトグラフィー AUC −曲線下領域（area under the curve）実施例１ hA5B7 Fab'の精製 hA5B7 Fab'を、大腸菌W3110細胞を1.5リットルの培養
装置（fermenter）で培養して発現させた。細胞は遠心
分離により回収し、回収前と同容量の10mM EDTAを含む1
00mMトリスpH7.4に再懸濁し、55℃で一晩インキュベー
トした。そして生じた細胞抽出物は遠心分離により清澄
にし、グリシンを1Mになるように加えて、pHを50％（w/
v）グリシン酸ナトリウムで7.5に調整する。このサンプ
ルを、1Mグリシン／グリシン酸pH8.0で平衡化したスト
リームライン（Streamline）Ａカラム（ファルマシア
（Pharmacia）社製）にアプライした。平衡化バッファ
で洗浄後、hA5B7 Fab'を0.1Mクエン酸pH3.0で溶出し
た。そして溶出されたhA5B7 Fab'を2MトリスpH8.5でpH
6.0に調整し、超遠心分離により濃縮した。

PEG−マレイミド試薬の調製 PEGのマレイミド誘導体を、以前の記述に従い調製し
た。メトキシポリオキシエチレンアミン（平均分子量約
5000,シグマ（Sigma）社製）を0.1Mリン酸ナトリウムバ
ッファ,pH7.0に溶解し、モル数で1.2倍過量の３−マレ
イミド−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルと室温で１時間インキュベートした。反応の進行
度は反応混合液の少量（aliquots）を薄相板（TLC plat
e）（Kieselgel 60）にスポットし、ニンヒドリンで発
色して決定される。紫色の着色（アミンのニンヒドリン
との反応）が残らなくなったとき、反応が完結したと考
えた。PEG−マレイミドの生成物を、セファデックス（S
ephadex）Ｇ−25（PD−10）カラム（ファルマシア社
製）を用いて脱イオン水に脱塩し、凍結乾燥した。活性
マレイミド基の存在は、β−メルカプトエチルアミンと
のバックタイトレーション（back titration）によって
実証された。

hA5B7 Fab'−PEG（部位特異的）の調製濃度約11mg/mlの精製されたhA5B7 Fab'を、バイオ−
スピン（Bio−Spin）カラム（バイオ−ラッド（Bio−Ra
d）社製）を用いて、0.1M酢酸バッファpH6.0に脱塩し
た。そしてヒンジのチオール基を、β−メルカプトエチ
ルアミンとの還元によって活性化した。hA5B7 Fab'を、
5mMβ−メルカプトエチルアミン・0.1M酢酸バッファpH
6.0で37℃,30分間インキュベートした。そのサンプル
を、バイオ−スピン６カラムを用いて、0.1Mリン酸バッ
ファpH6.0に脱塩した。Fab'分子当りのチオール基の数
を、以前の記載（Lyonsら，（1990）同書中）に従っ
て、DTDPを用いた滴定によって測定した。そしてサンプ
ルを、モル数で10倍以上過量の、前記のように生産され
たPEG−マレイミドと共に室温,2.5時間インキュベート
した。そのPEG修飾したFab'を、バイオ−スピン６カラ
ムでリン酸バッファ食塩水pH6.8に脱塩し、チオール基
がPEG−マレイミド試薬と十分に反応したことを確認す
るためにチオール滴定を行った。

ランダムに修飾したhA5B7 Fab'−PEGの調製濃度約11mg/mlのhA5B7 Fab'を、バイオ−スピン６カ
ラムを用いて、0.1Mリン酸pH8.0に脱塩した。チオール
を、モル数で７倍過量の２−イミノチオラン（２−imin
othiolane）（トラウト（Traut's）試薬）との室温,1時
間の反応によって、リジン残基にランダムに導入した。
バイオ−スピン６カラムを用いて0.1Mのリン酸pH6.0に
脱塩後、導入されたチオール基の数をDTDPでの滴定を用
いて決定した。そしてチオール化hA5B7 Fab'を、PEG−
マレイミドと反応させ、前記した部位特異的な修飾の場
合と同様に脱塩した。

PEG修飾したサンプルの分析２種類（部位特異的及びランダム）のPEG結合法を比
較するため、同様な修飾程度のサンプルを得た。前記の
条件を用いて、ヒンジでの部位特異的結合では、Fab'分
子当り平均0.98PEG分子であるのに対して、トラウト試
薬によるランダム結合ではFab'当り平均1.18PEG分子で
あった。非還元条件下でのSDS−PAGEによる分析（Figur
e 1）では、非修飾hA5B7 Fab'サンプルの主バンド（レ
ーン１）は予想通り約50kDaの分子量であることが明ら
かであった。PEGが部位特異的な手法によりヒンジに結
合されたサンプル（レーン２）は、より大きいサイズの
他の２つの特徴的な種と同様に、幾つかの残りの非修飾
Fab'を含み、その最も主となるものは、明確な約66kDa
の分子量であった。同様な量の残りの非反応Fab'がラン
ダムに修飾したサンプルでも検出される。このサンプル
は、幾つかに分離したバンドの部位特異的修飾サンプル
よりもずっとヘテロである（heterogeneous）と見える
が、比較的広い分子量範囲に亘るバンドの拡散した染色
であるとも見える。PEGの結合は、標準蛋白質に比較し
て電気泳動上のタンパク質のバンドの移動を変化させる
ことが知られているから、PEG修飾タンパク質の正確な
サイズをこの技術から推定することはできない。しか
し、両調製物ともPEGで修飾されており、異なった分子
種が各例で生成していることは認識することができる。

PEG修飾のhA5B7 Fab'の活性に及ぼす影響を評価する
ために、キネティックな（kinetic）アッセイを、ビア
コア（Biacore）2000装置（ファルマシアバイオセンサ
ー（Pharmacia Biosensor）社製）を用い、表面プラズ
モン（plasmon）共鳴によって行った。このアッセイは
以前記載した方法（Abrahamら,J.Immunol.Methods（199
5），183,119−125）を改変したものによって実行し
た。

胎児性抗原（CEA）（100ml,0.92μg/ml）を、バイオ
スピン６カラム（バイオラッド社製）を用いて0.1M酢酸
ナトリウムpH5.5にバッファ交換した。過ヨウ素酸ナト
リウム（２μl,0.1M酢酸ナトリウムpH5.5中で50mM,用事
調製）を加え、混合物を氷上,20分間インキュベートし
た。反応を、バイオスピン６カラムで10mM酢酸ナトリウ
ムpH4.0にバッファ交換することによって停止し、100μ
ｌの酸化CEA約0.89mg/mlを得た。そして酸化CEAを、製
造者の解説に記載された標準的なアルデヒドカップリン
グ法を用いて、CM5センサーチップ（ファルマシアバイ
オセンサー社製）に固定した。手早くこれを、EDC/NHS
試薬（15μl,アミンカップリングキット，ファルマシア
バイオセンサー社製）を５μl/分の流速で注入すること
によって表面を活性化し、続いて35μｌの5mMヒドラジ
ンを注入し、その後に35μｌの1Mエタノールアミンを注
入した。続けて35μｌの酸化CEAをそれぞれ5,1,0.2また
は0.05μg/ml・10mM酢酸ナトリウムpH4.0溶液として注
入した。最終的に40μｌの0.1Mシアノ硼水素化ナトリウ
ム（sodium cyanoborohydride）を表面上に通過させ、
使用に先立ち、センサーチップを適当量の10mM塩酸で４
回連続洗浄した。各hA5B7 Fab'サンプルを、HBSバッフ
ァ（ファルマシアバイオセンサー社製）で20μg/mlから
８回の倍々希釈を行った。結合及び解離を観察するため
に、サンプルをCEA表面に注入した。サンプルが1:1結合
のキネティックであると仮定し、かつ製造者の分析プロ
グラムに提供された非直線的な比率式に適用して、会合
及び解離率定数を算出した。

この分析の結果（Table 1）は、このアッセイにおい
てヒンジでの部位特異的な結合の結果として、いくらか
の強度の損失（非修飾hA5B7 Fab'は56％へ）があったこ
とを示している。しかし、同様な数のPEG分子のランダ
ムな結合では29％の免疫活性しかもたない物質が生じ
た。解離率がわずかに増加しているようであるが、強度
の損失は主に会合率の減少によるものであろう。

薬物動態分析のために、Fab'サンプルをボルトン−ハ
ンター（Bolton−Hunter）試薬を用い、標準的な方法論
に沿って¹²⁵Iで標識化し、反応していない¹²⁵Iを除去す
るためリン酸バッファ食塩水pH6.8に脱塩した。６匹の
雄ウイスター（Wistar）ラットからなる群に、尾の血管
から20μｇの標識化Fab'を投与した。選択しておいた時
点で、血液サンプルを採取し、ガンマカウンターでカウ
ントし、血液グラム当りの投与量のパーセントを算出し
た。クリアランス率及び曲線下領域（AUC）の値をSIPHA
Rソフトウエアパッケージを用いて決定した。

hA57B Fab'及び２つのPEG修飾調製物に対するクリア
ランス曲線をFigure 2に示す。これらの曲線からPEG修
飾hA5B7 Fab'のクリアランスは非修飾hA5B7 Fab'より著
しく遅いことが明確に認められる。加えて、部位特異的
な修飾Fab'のクリアランスは予想に反してランダムに修
飾したものより遅い。算出された薬物動態のパラメータ
ー（Table 2）は、PEGでの修飾がhA5B7 Fab'のクリアラ
ンス率をα相でもβ相でも約２倍減少させていることを
示している。これらの改善はPEG結合の顕著な効果を示
すAUC値に反映している。PEGの部位特異的な結合は非修
飾Fab'に比べて約18倍のAUC値に増加させている。一
方、ランダムに結合したPEGは非修飾Fab'に比べて６倍
の増加しかしていない。

実施例２ PEGのhTNF40 Fab'への部位特異的な結合 hTNF40 Fab'の精製 hTNF40 Fab'を、1.5リットル培養装置で生育された大
腸菌W3110細胞で発現し、細胞抽出物を実施例１に記載
したように調製した。細胞抽出物を電導度3.5μS/cmに
希釈し、pH4.5に調整し、50mM酢酸バッファpH4.5で平衡
化したストリームラインSP（ファルマシア社製）にア
プライした。平衡化バッファでの洗浄後、Fab'を200mM
塩化ナトリウム・50mM酢酸バッファpH4.5で溶出した。
溶出物のpHを６に調整し、Fab'をPBSで平衡化したプロ
テインＧセファロースカラムにアプライしてさらに精製
した。PBSでの洗浄後、Fab'を0.1Mグリシン−塩酸pH2.7
で溶出し、直ちにpHを６に調整した。そして精製したFa
b'を超遠心分離により10mg/ml以上に濃縮した。

ヒンジチオールを通してPEGを結合したhTNF40 Fab'−PE
G（25kDa）及びhTNF40 Fab'−PEG（40kDa）の調製精製したFab'を2mM EDTAを含む0.1Mリン酸バッファpH
6にバッファ交換した。そしてそのヒンジチオール基を
実施例１に記載されるように5mMβ−メルカプトエチル
アミンでの還元によって活性化した。これによってDTDP
での滴定で決定されるように、Fab'当り平均1.1チオー
ル基が導入された。そしてFab'−PEGサンプルを、シェ
アウォーターポリマーズ社（Shearwater Polymers Inc.
Huntsville,AL,USA）が提供するPEG−マレイミド誘導体
を用いて25kDa及び40kDa PEGで生成した。25kDaのPEG−
マレイミド誘導体はマレイミド基に直接結合した単一の
PEG鎖であり、40kDaのPEG−マレイミド誘導体はリジン
誘導体を通してマレイミド基に結合した２つの20kDaのP
EG鎖からなる分枝状構造から調製した。用事に還元し、
脱塩したFab'をモル数で３倍過剰の25kDaのPEG−マレイ
ミド、またはモル数で９倍過剰の40kDaのPEG−マレイミ
ドと共に室温で一晩インキュベートし、生成したFab'−
PEG接合体をゾルバックス（Zorbax）GF−250カラムの0.
2Mリン酸バッファpH7.0での操作を用いたゲルろ過HPLC
によって精製した。比較のためにランダムにPEG修飾し
たhTNF40 Fab'も、実施例１での5kDaのPEGのA5B7 Fab'
への結合について記載したように25kDaのPEGを用いて調
製した。Fab'当り平均1.5のPEG分子を含む接合体が調製
された。

Fab'−PEG接合体の分析精製したサンプルを非還元条件下でのSDS−PAGEで分
析した。PEG接合体は予想通り、非修飾Fab'よりもゆっ
くりした移動性を示し、非修飾Fab'から分離する形で表
わされた（Figure 3）。加えて、ヒンジの修飾Fab'−PE
G接合体はSDS−PAGEにおいて、ランダムなPEG接合体よ
り明確な形で示された。

PEG接合体の抗原TNFへの結合能力をL929のバイオアッ
セイで分析し、非修飾Fab'及びIgGの両方に対して比較
した。L929は付着性マウス線維芽細胞であり、タンパク
質合成阻害剤アクチノマイシンＤ存在下でTNFの細胞毒
性作用に鋭敏である。そのためこの細胞系を用いて、抗
TNF抗体などのTNFアンタゴニスト類の活性を比較するこ
とができる。L929細胞の単層を植え付けた96穴プレート
を、グルタミンを添加したRPMI培地で100ng/mlのヒトTN
F,1μg/mlアクチノマイシンＤ中、18時間培養する。こ
れらの条件下では細胞の95−100％が死に、組織培養の
プラスチックから剥れてしまう。そして残った細胞を10
0％メタノール,1分間で固定化し、５％のクリスタルバ
イオレットで染色した。次にプレートを洗浄し、染色さ
れた細胞をプレートリーダーでの分析前に30％の酢酸で
溶解した。この実験をまた抗体サンプルをTNFと同時に
順次希釈して加えて行った。結果をTNF濃度が低けれ
ば、阻害が大きくなるように、残存TNFに対してTNFアン
タゴニスト濃度をプロットする。そして阻害性をもつ抗
体を、各々が90％のTNF活性を阻害するために必要とさ
れる濃度を算出してIC90値を求めることによって、比較
することができる。

hTNF40抗体及びそのFab'フラグメントはこのL929アッ
セイにおいて3ng/mlのIC90である。25kDa及び40kDaのヒ
ンジ修飾PEG接合体の結果も、3ng/mlのIC90を示し、こ
れらの接合体がTNFをhTNF40 Fab'及びIgGと同程度まで
中和することを示していた（Figure 4）。ランダムに接
合したhTNF40 Fab'−PEGは、ヒンジに接合した調製物の
IC90値10ng/mlより強力ではなかった。

接合体の薬物動態分析を実施例１で記載したようにラ
ットにおいて、¹²⁵I標識化物を用いて行った。その結果
（Figure 5）は、全てのPEG修飾Fab'フラグメントに対
して、非修飾Fab'に比較して増大した循環の半減期を実
証するものである。より大きいPEG分子のヒンジ領域で
の結合は、より小さいPEG分子よりも循環の半減期を増
加した。Fab'当り平均1.5の25kDaのPEG分子（Fab'当り
平均37.5kDaのPEG）をもつ、ランダムに修飾したFab'
は、ヒンジ領域のFab'接合体の25kDaと40kDaのPEGの間
の中間的な循環の半減期を示した。

別々の実験において、hTNF40のIgG,Fab'及びFab'−PE
G（25kDaのヒンジへの結合）の薬物動態を、¹¹¹In標識
後のラットで比較した。IgG及びFab'を記載（Turnerら,
Br.J.Cancer 70,35−41（1994））通りに¹¹¹Inで標識化
するため、9N3マクロサイクリック（macrocyclic）キレ
ーターに接合した。PEG接合体のために、同様な方法を
用いてFab'−9N3接合体を調製して¹¹¹Inで標識化し、そ
の後、25kDaのPEGを前記通りにヒンジ領域に結合した。
そして標識化接合体をゲルろ過HPLCで精製した。これら
の¹¹¹In標識化接合体を用いたラットの薬物動態実験の
結果（Figure 6）はまた、非修飾Fab'に比較して、PEG
修飾Fab'についての循環における増大した半減期を実証
し、144時間では血中レベルがIgGより高かった。

実施例３ hTNF40 Fab'−（PEG）_２の生成本実施例において、ヒンジのシステイン残基を含むIg
Gからの消化によって生成されるFab'フラグメントに本
法が適用できることが実証される。

hTNF40 Fab'−（PEG）_２の調製 hTNF40抗体全部をNSO細胞で発現し、プロテインＡセ
ファロースクロマトグラフィーで精製し、Ｆ（ab'）_２
を標準的な技術を用いてペプシンでの消化によって生成
した。Ｆ（ab'）_２をセファクリル（Sephacryl）Ｓ−20
0HRのゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。5mM EDT
Aを含む0.1Mリン酸pH8にバッファ交換後、Ｆ（ab'）_２
を5mMβ−メルカプトエチルアミンとの37℃,30分間のイ
ンキュベーションでFab'に還元した。そしてPEG−マレ
イミド（25kDaのPEG,実施例２参照）をFab'濃度のモル
数で３倍過量加え、反応を一晩進行させた。生成した混
合物をゲルろ過HPLCで分析し、非修飾Fab',Fab'−PEG及
びFab'−（PEG）_２の混合物であることがわかった（Fig
ure 7）。PEG修飾物をゲルろ過HPLCで精製し、Fab'−PE
G:Fab'−（PEG）_２＝1:1.2の混合物を生成した。

抗原の結合と薬物動態分析抗原の結合活性を、TNF結合の親和性を測定するビア
コアアッセイで評価した。Fab'またはPEG修飾サンプル
を、固定化した抗Fab'抗体に捕獲し、ヒトTNFをその表
面に通した。そしてTHF結合のキネティックを解析し
た。結果はFab'−PEGとFab'−（PEG）_２の混合物の結合
親和性K_Dは0.14nMであることを示した。これは、同様な
アッセイにおける非修飾Fab'のK_Dが0.28nMであるのと好
対照であり、PEG結合による抗原結合活性の損失はなか
ったことを示した。

Fab'−PEGとFab'−（PEG）_２の混合物を含む精製物の
薬物動態を¹²⁵I標識後のラットで評価した。結果（Figu
re 8）は、実施例２に記載したように調製される単一の
ヒンジのシステインをもつ大腸菌発現物質から生成され
たFab'−PEGのみと比較して改善した循環の半減期を実
証する。

実施例４ cTN3 Fab'−PEG,Fab'−（PEG）_２及びFab'−（PEG）_３
の調製標準的技術を用いて、cTN3抗体をNSO細胞で発現し、
精製し、そしてペプシンで消化してＦ（ab'）_２を生成
した。実施例３に記載するように、精製したＦ（ab'）
_２を5mM EDTAを含む0.1Mリン酸バッファpH8にバッファ
交換し、その後9mMβ−メルカプトエチルアミンで還元
し、ヒンジ領域でPEGにより修飾した。Fab'−PEG,Fab'
−（PEG）_２及びFab'−（PEG）_３の混合物を得た。ゲル
ろ過HPLCにより、Fab'及びFab'−PEGをFab'−（PEG）_２
及びFab'−（PEG）_３から分離した。Fab'−（PEG）_２及
びFab'−（PEG）_３の精製サンプルはFab'−（PEG）_２及
びFab'−（PEG）_３を1.6:1で含んでいた。

抗原結合及び薬物動態分析 cTN3 Fab',Fab'−PEG,Fab'−（PEG）_２＋Fab'−（PE
G）_３の抗原結合分析を、前記したL929のバイオアッセ
イ変法で行った。TN3抗体をマウスTNFとインキュベート
した。このアッセイにおいてcTN3 IgGは約1000pg/mlのI
C90であった。同様なアッセイにおいてFab'とFab'−PEG
の両方で同様な阻害プロファイル及びIC90値である。そ
のため結果はPEG修飾後の抗原結合機能の損失はないこ
とを実証した（Figure 9）。

精製Fab'−PEG物質、及びFab'−（PEG）_２とFab'−
（PEG）_３の混合物の薬物動態を、¹²⁵Iと放射ラベル後
のラットで評価した。cTN3 Fab'及びIgGもまた同様な実
験において比較した。結果（Figure 10）は、非修飾Fa
b'のクリアランスが非常に速いのに対して、PEG修飾Fa
b'はずっと長い循環の半減期を有することを実証する。
これはFab'−（PEG）_２＋Fab'−（PEG）_３のサンプルに
よって実証されるようにより多くのPEGの付加によって
さらに改善される。このサンプルはIgGに比べて増大し
たAUCを有していた（Figure 10）。

実施例５及び６において、選び得るチオール選択的な
試薬の使用が実証された。

実施例５ hTNF40 Fab'−PEGのビニルスルフォンを用いた調製ビニルスルフォン類はpH8以下で使用するとチオール
特異的であると報告されている（Morpurgo,M.ら,Biocon
jugate Chem.（1996），７,363−368）。この実施例に
おいて、PEGは、PEGが直接スルフォン基に結合すること
を特徴とする5kDaのPEGビニルスルフォン誘導体（Shear
water Polymers Inc.,同書中）を用いて、部位特異的に
Fab'に結合する。

hTNF40 Fab'を、実施例２に記載したようにフリーの
ヒンジのチオールを生成するように調製し、還元した。
この調製において、DTDPとの滴定によって決定されるよ
うに、Fab'当り平均1.1のチオールという結果であっ
た。2mM EDTAを含む0.1Mリン酸バッファpH7.0に脱塩
後、モル数で30倍過量のPEG−ビニルスルフォンを加
え、反応混合物を一晩インキュベートした。SDS−PAGE
分析はPEGのFab'分子の接合の収率が約30％であること
を表わしていた（Figure 11）。

Fab'をフェニルセファロース（Phenyl−Sepharose）H
Pハイトラップ（Hi Trapカラム）（ファルマシア社製）
を用いるハイドロフォービックな相互作用のクロマトグ
ラフィーによって精製した。架橋結合混合物を硫酸アン
モニウムで1.5Mとし、1.5M硫酸アンモニウムを含む50mM
リン酸バッファpH7.0で予め平衡化しておいたフェニル
セファロースHPカラムに装填した。Fab'−PEGを、50mM
リン酸pH7まで50カラム体積分の直線的濃度勾配により
溶出した。抗原の結合親和性を、実施例３に記載したよ
うにビアコア分析により非修飾Fab'と比較した。この分
析の結果（Table 3）は、Fab'−PEG接合体の結合親和性
がIgGと類似しているように、ビニルスルフォン試薬を
経たPEGの接合により抗原の結合活性の損失がないこと
を実証していた。

実施例６ヨードアセタアミド（iodoacetamide）試薬を用いたhTN
F40 Fab'−PEGの調製この実施例において、PEGは、PEGが直接アセタミド基
に結合している5kDaのPEGヨードアセタミド誘導体（シ
ェアウォーターポリマーズ社，同書中）を用いて、部位
特異的にFab'に結合する。

hTNF40 Fab'−PEGを実施例５に記載するように、モル
数で30倍過量のPEG−ヨードアセタミドを用いて調製
し、精製した。生産物の抗原結合親和性を、実施例３に
記載するようにビアコア分析により非修飾Fab'に比較し
た。この分析の結果（Table 3）は、Fab'−PEG接合体の
結合親和性がIgGと類似しているように、ヨードアセタ
ミド試薬を経たPEGの接合により抗原の結合活性の損失
がないことを実証していた。

実施例７抗PDGFβR Fab'−PEGの調製この実施例において、部位特異的なPEG結合の適用
が、更なる組換えFab'フラグメントを用いて実証され
る。

遺伝工学的に操作されたヒト抗体hg162からのFab'はP
DGFβ受容体を認識するが、hTNF40のFab'フラグメント
について記載されたように（実施例２参照）大腸菌で発
現された。細胞を組織培養液から遠心分離によって回収
し、Fab'を、10mM EDTAを含む100mMトリスpH7.4に細胞
を再懸濁して60℃，一晩インキュベートすることによっ
て抽出した。そしてFab'を、1Mグリシン／グリシン酸pH
8.0で予め平衡化したストリームラインA^TMカラム（ファ
ルマシア社製）を用いるエキスパンドした（expanded）
ベッドのクロマトグラフィーによって精製した。サンプ
ルをエキスパンドしたベッド様式のカラムにアプライす
る前に、グリシンで1Mとし、50％（w/v）グリシン酸ナ
トリウムでpHを7.5に調製した。平衡化バッファで洗浄
後、カラム担体をパックしたベッドとし、Fab'を0.1Mク
エン酸pH3.0で溶出した。

更なる精製を、溶出液のpHを2Mトリスで7.5に調節
し、リン酸バッファ食塩水pH7.4で予め平衡化したプロ
テインＧセファロースカラムにアプライすることによっ
て行った。平衡化バッファで洗浄後、Fab'を0.1Mグリシ
ン塩酸pH2.7で溶出した。そして溶出したFab'のpHを2M
トリスで6.0に調節した。

精製抗PDGFβR Fab'を2mM EDTAを含む0.1Mリン酸バッ
ファpH6.0に透析ろ過した。ヒンジのチオールをβ−メ
ルカプトエチルアミンでの還元によって活性化した。Fa
b'を、5mMβ−メルカプトエチルアミン・2mM EDTAを含
む0.1Mリン酸バッファpH6.0で37℃,30分間インキュベー
トした。そしてサンプルを、セファデックスＧ−25（PD
10）カラムを用いて2mM EDTAを含む0.1リン酸バッファp
H6.0に脱塩した。Fab'分子当りのチオール基の数を、DT
DPでの滴定により測定し、1.08であることがわかった。
そしてPEG−マレイミド（40kDa,実施例２参照）をモル
数で３倍過量に加えて、一晩反応させた。Fab'−PEGへ
の変換を約60％の収率で行った（Figure 12）。そしてF
ab'−PEG接合体を実施例２に記載するようにゲルろ過HP
LCにより精製した。

抗PDGFβR Fab'−PEGの抗原親和性を、ビアコア分析
により非修飾Fab'と比較した。抗PDGFβR Fab'−PEGのP
DGFβＲへの結合についてのオン・オフ率を決定するた
めのキネティック分析をビアコア2000（ビアコアAB社
製）を用いて行った。マウスIgG Fc−PDGFβＲ融合分子
を固定化抗マウスIgGによってセンサーチップ表面に捕
獲した。これに続いて抗PDGFβR Fab'−PEGの注入を行
った。ヤギ抗マウスIgのアフィニピュア（Affinipure）
Ｆ（ab）_２フラグメント，特異的Fcフラグメント（ジャ
クソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）社
製）をセンサーチップCM5上にアミンカップリング化学
を経て11500RUのレベルまで固定化した。ブランクの表
面を、捕獲分子の注入を行わない固定化法を行うことに
より調製した。HBSバッファ（10mM HEPES,pH7.4,0.15M
塩化ナトリウム,3mM EDTA,0.005％サーファクタント（S
urfactant）P20,ビアコアAB社製）をランニングバッフ
ァとして10μl/分の流速で用いた。組換えCOS細胞上清
で発現されたマウスIgG Fc−PDGFβＲを固定化抗マウス
IgGに200−250RUの間のレベルまで捕獲した。抗PDGFβR
Fab'またはFab'−PEG分子を、捕獲したマウスIgG Fc−
PDGFβＲ表面上で2mg/mlから0.52mg/mlに亘って滴定し
た。表面を30mM塩酸10mlを注入することによって再生し
た。コントロールとして、マウスIgG Fc−PDGFβＲ及び
各濃度の抗PDGFβR Fab'またはFab'−PEGの注入をブラ
ンク表面で繰り返した。各抗PDGFβR Fab'またはFab'−
PEG濃度に対するセンサーグラム（sensorgram）マウスI
gG Fc−PDGFβＲ注入及び再生ステップの消去後のブラ
ンク表面に対応するセンサーグラムで修正した。キネテ
ィックのパラメーターをビアエバリュエーション（BIAe
valuation）2.1ソフトウェアを用いて算出した。

Fab'及びFab'−PEGについての結果をTable 4に示す。
決定されたキネティックのパラメーター値にほとんど差
はなく、ヒンジ領域におけるPEGの結合は抗原結合親和
性をほとんど損失しないことを実証した。

抗PDGFβR Fab'及びFab'−PEGの薬物動態を、実施例
１に記載するように¹²⁵I標識サンプルを用いたラットの
実験において検討した。結果はFab'に比べてFab'−PEG
のについての血液からのずっと遅いクリアランスを実証
した（Figure 13）。これはTable 5に示された薬物動態
のパラメーターの算出に反映された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 17/10 Ａ６１Ｐ 17/10 19/02 19/02 25/00 25/00 29/00 29/00 31/12 31/12 35/00 35/00 37/00 37/00 37/08 37/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献国際公開96／009325（ＷＯ，Ａ１) Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ. 70，ｐ．1126−1130（1994) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/00 C12N 15/00 A61K 39/395 A61P 1/00 A61P 11/06 A61P 17/10 A61P 19/02 A61P 25/00 A61P 29/00 A61P 31/12 A61P 35/00 A61P 37/00 A61P 37/08 ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】重鎖及び軽鎖を含む修飾された一価の抗体
フラグメントであって、該重鎖は、Ｃ末端でC_H1ドメインに共有結合されたV_Hド
メインからなり、該軽鎖は、V_Hドメインに相補性であってかつＣ末端でC_L
ドメインに共有結合されたV_Lドメインからなり、該C_H1ドメインは、唯一のシステイン残基を含有するヒ
ンジドメインを提供するように伸張され、 V_H、C_H1、V_L及びC_Lドメイン中のシステイン残基は、互
いにジスルフィド結合しており、及びヒンジドメイン中のシステイン残基は、その硫黄原子を
介してポリマー分子に共有結合している、上記抗体フラグメント。
【請求項２】該ポリマーが、置換されていてもよい直鎖
状もしくは分枝状のポリアルキレン、ポリアルケニレン
もしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝状
もしくは非分枝状のポリサッカライドである請求項１記
載の抗体フラグメント。
【請求項３】該ポリマーが、置換されていてもよい直鎖
状もしくは分枝状のポリ（エチレングリコール）、ポリ
（プロピレングリコール）もしくはポリ（ビニルアルコ
ール）、またはそれらの誘導体である請求項２記載の抗
体フラグメント。
【請求項４】該ポリマーがメトキシ（ポリエチレングリ
コール）またはその誘導体である請求項３記載の抗体フ
ラグメント。
【請求項５】１以上のエフェクターまたはリポーター分
子に共有結合している請求項１〜４のいずれか一項に記
載の抗体フラグメント。
【請求項６】１以上の医薬的に適用可能な添加剤、希釈
剤または担体を伴った請求項１〜５のいずれか一項に記
載の一価の抗体フラグメントを含む医薬組成物。