JP3524938B2

JP3524938B2 - りん翅目昆虫の病原ウイルスのウイルス封入体の生産方法

Info

Publication number: JP3524938B2
Application number: JP02721093A
Authority: JP
Inventors: 明宏友田; かほり大角; 勝小池
Original assignee: 農薬バイオテクノロジー開発技術研究組合
Priority date: 1993-01-25
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 2004-05-10
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: JPH06217766A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、りん翅目の一つの種の
昆虫を本来の固有な宿主とする病原ウィルスを、当該宿
主昆虫の大量飼育される幼虫に接種して罹病させ、飼育
後にウィルス病で病死した幼虫虫体から該ウィルスの多
角体または顆粒体を回収することによりウィルス多角体
または顆粒体を生産する方法において、幼虫に与える飼
料に混入された幼若ホルモンまたは幼若ホルモン様活性
物質を幼虫の終令期中に当該幼虫に投与することにより
蛹化を抑制しながら幼虫を飼育して幼虫の体重の増加を
継続させ、しかも前記の飼料中には、当該昆虫またはそ
の幼虫を本来の固有な宿主とするウィルスの多角体また
は顆粒体を飼料中の適当な接種濃度で混入して置いてあ
り、こうして該ウィルスで幼虫を感染させ、罹病させ、
飼育した幼虫体内で増殖したウィルスを病死幼虫からウ
ィルス多角体または顆粒体の形で収穫することにより、
当該ウィルスの感染性を保有するウィルス多核体または
顆粒体（ウィルス封入体と総称される）を高収量で効率
良く生産する方法に関する。

【０００２】本発明の方法は、この方法で生産されたウ
イルスを、当該ウイルスが宿主とする害虫に人工的に感
染させて行う害虫の防除に有効に使用し得る。

【０００３】

【従来技術】りん翅目昆虫はそれの天敵微生物であるウ
イルスに感染すると、罹病死するので人工的にウイルス
を該昆虫の幼虫に感染させ害虫の防除を行うことは知ら
れている。この病原ウイルスは、病死幼虫の虫体の細胞
内部に、タンパク質の結晶に包埋されたウイルス粒子の
集りである多角体または顆粒体として残留し、このよう
な多角体、顆粒体はウイルス封入体と総称される。

【０００４】これまで、ハスモンヨトウ、ヨトウガ、モ
ンシロチョウ、ハマキムシ類、マツカレハ、クワゴマダ
ラヒトリなどの、りん翅目昆虫のウイルス封入体（例え
ば、バキュロウイルスのグループである核多角体病ウイ
ルス、ならびに顆粒病ウイルスやレオウイルスのグルー
プである細胞多角体病ウイルスなどのウイルス封入体を
包含する）の生産は、当該ウイルスの宿主である昆虫の
幼虫にウイルスを注射することにより、あるいはウイル
ス粒子を含むウイルス封入体を飼料とともに摂食させる
ことにより幼虫をウイルスに感染、罹病させ、その罹病
した幼虫を飼育し、蛹化せずに病死した幼虫体内に形成
したウイルス封入体を回収する方法で行われることが知
られている（「微生物と農業」、１９５頁〜２０１頁、
昭和６２年全国農村教育協会発行；「果樹試験場報
告」、Ａ３８７頁〜９９頁、昭和５１年農水省発行；
「農業及び園芸」、４０巻第１１号、１７５６頁〜１７
６０頁、昭和４０年養賢堂発行）。

【０００５】例えば、ハスモンヨトウを宿主とする核多
角体病ウイルスの多角体の生産は幼虫の５齢（終齢の１
齢前）の時期に幼虫に核多角体病ウイルスを感染させ、
６齢（終齢）で発病死亡させて病死幼虫から多角体を回
収する方法が知られている（「中国農業試験場報告」、
Ｅ第１２号、４６頁〜６２頁、昭和５２年農水省発
行）。当該ウイルス病に罹病した幼虫が蛹になると、蛹
体からのウイルス多角体の回収は効率が悪いので余り行
われない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな状況に鑑み、多くの種のりん翅目昆虫の病原ウィル
スのウィルス封入体を効率よく多収量で生産し得る方法
について種々検討した。その結果、りん翅目昆虫の幼虫
に、当該昆虫を本来の宿主とする病原ウィルスと、幼若
ホルモンまたは幼若ホルモン様活性物質（以下、但し書
きがない限りこれらをＪＨと略称する）とを幼虫の終令
期中の適当な時期に飼料と共に投与して幼虫を飼育する
と、ウィルス病の罹病後も蛹化が抑制されて個々の幼虫
の体重増加を継続させながら幼虫を飼育でき、しかも終
令期末期に幼虫のまま病死する幼虫の病死率を増加で
き、またウィルス封入体の回収し易い病死幼虫の全数の
総体重を増加できることを知見し、そのようにして病死
した幼虫の全数から、感染性を保有するウィルス封入体
を多収量で効率的に回収できることを見いだした。

【０００７】すなわち、本発明の第１の要旨とするとこ
ろは、りん翅目昆虫の幼虫の終令期中で終令期の初期
に、飼料に蛹化抑制有効量で混入された幼若ホルモンま
たは幼若ホルモン様活性物質を該幼虫に投与して、幼虫
の蛹化を抑制しながら幼虫の体重増加が継続するように
幼虫を飼育し、しかもこの飼育中の幼虫に与える飼料中
には、幼若ホルモンまたは幼若ホルモン様活性物質と共
に、該りん翅目昆虫の幼虫を本来の固有な宿主とする天
敵の病原ウィルスの多角体もしくは顆粒体を混入してあ
るものであり、飼料とともに該多角体もしくは顆粒体を
飼育中の幼虫に摂食させることにより飼育中の幼虫を罹
病させ、その後に、幼虫に与える飼料を、幼若ホルモン
または幼若ホルモン様活性物質も該多角体または顆粒体
も含有しない飼料に切り換えて与えて、このように飼育
した幼虫を、蛹化を抑制して幼虫終令期末期まで体重増
加を継続させながら飼育し続け、さらに、終令期末期に
病死した病死幼虫の虫体より、当該病原ウィルスのウィ
ルス封入体を収穫することを特徴とする、りん翅目昆虫
の病原ウィルスの感染性を保有するウィルス封入体の高
収量生産方法にある。

【０００８】次に、第１の要旨の本発明によるりん翅目
昆虫のウィルス封入体の生産方法について詳しく説明す
る。

【０００９】第１の要旨の本発明の方法に用いるりん翅
目昆虫としては、ハスモンヨトウ、ヨトウガ、モンシロ
チョウ、コカクモンハマキ、ハマキ、チャハマキ、クワ
ゴマダラヒトリ等が挙げられる。

【００１０】これらの昆虫の卵塊を滅菌した後、ふ化し
た幼虫を通常行われている無菌飼育法、すなわち温度、
湿度を共試昆虫に適した状態で飼育する。

【００１１】ウィルスに罹病させる幼虫の時期は幼虫の
終令期中であり、JHを与える時期は幼虫終齢期中であ
り、ウイルス接種と JH 投与とは同時または実質的に同時
である。例えば、ハスモンヨトウでは、25〜27℃、湿度
40〜80％に保ち、人工飼料（インセクタLFなど）により
終令期末期まで飼育管理する。

【００１２】このようにして得たりん翅目昆虫の幼虫
に、その飼育中の幼虫の終令期中の初期に下記により得
られたウイルスを接種する。

【００１３】接種源として用いる多角体または顆粒体
（ウイルス封入体）は、どのような精製状態のものでも
使用できるが、他の原因で死亡したり他の病気に感染し
ないように飼育されて、ウイルス病で死亡した幼虫を用
い、そのような幼虫を脱イオン水と共に磨砕してホモジ
エナイズし、そのホモジエナイズ液を常法で５００〜１
０μｍのフィルターでろ過し、３００〜１５，０００×
ｇの遠心加速度で遠心分離を行ない、精製したウイルス
封入体懸濁液を接種源として用いればよい。遠心分離の
遠心加速度は好ましくは、多角体では３００〜４，００
０×ｇ、顆粒体では２，５００〜１５，０００×ｇであ
る。例えば、ハスモンヨトウでは、１００〜２０μｍの
フィルターでろ過し、６００〜３，０００×ｇで遠心分
離を行ない精製したものを使用すればよい。

【００１４】幼虫へのウイルスの接種は、エサとともに
ウイルス多角体または顆粒体（ウイルス封入体）を摂食
させる方法により、もしくは幼虫にウイルス粒子を注射
することにより行なう。例えば、ハスモンヨトウで多角
体を摂食により接種する場合に、エサに混ぜる多角体の
適当な濃度範囲は多角体数で０．５×１０⁷ 〜１×１０
⁹ 個／ｇである。好ましくは２×１０⁷ 〜１×１０⁹ 個
／ｇである。

【００１５】またＪＨの投与は、エサとともにＪＨを摂
食させる方法により、あるいは幼虫またはエサにＪＨの
溶液を噴霧する方法により行なう。例えば、ハスモンヨ
トウではＪＨとしてのメトプレンを１０〜１００ｐｐｍ
好ましくは５０ｐｐｍの濃度で含んだエサを摂食させる
のがよい。ＪＨの投与量は、幼虫の蛹化を高率で抑制す
るに足る量であって、しかもウイルス罹病後の幼虫が幼
虫終令末期まで体重増加を続けながら飼育、生存できる
がそのあとに病死するに適する量である。

【００１６】ウイルスの接種と、JHの投与とは、幼虫の
終令期中の初めに同時または実質的に同時に行うことが
でき、その後には終令期末期に幼虫がウイルス病により
死亡するまで、共試幼虫に適した温度、湿度に管理しな
がら通常の飼育条件で幼虫終令末期まで体重増加を継続
させながら飼育を続ければよい。

【００１７】本発明の方法に用い得るＪＨとしては、
「生化学辞典」、１３０８頁（昭和６３年東京化学同人
発行）に記載の、幼若ホルモンであるＪＨ−Ｉ、ＪＨ−
ＩＩ、ＪＨ−ＩＩＩ、ＪＨ−Ｏ、また「新農薬の開発と
市場展望」、９７頁〜９９頁（昭和６２年シーエムシー
発行）に記載の幼若ホルモン様活性物質であるメトプレ
ン、フエノキシカルブ、キノプレン、ピリプロキシフェ
ンなどが挙げられる。ＪＨの効果が持続するため投与が
１回で済み、昆虫体内で代謝されないと考えられている
幼若ホルモン様活性物質を用いることが好ましい。

【００１８】これらのＪＨは、市販品でもよいが、ある
いは昆虫組織より分離するか、合成してもよい。

【００１９】前記の方法により得た病死虫体を回収、脱
イオン水と共に磨砕してウイルス封入体を含む懸濁液を
得、これを分離精製することにより、感染性を有するウ
イルス封入体を効率的に回収することができる。

【００２０】第１の要旨の本発明を特定の昆虫、ハスモ
ンヨトウに応用した場合の好適な実施態様として、第２
の要旨の本発明においては、ハスモンヨトウの幼虫の終
令期すなわち６令期中で終令期の初期に、飼料に蛹化抑
制有効量で混入された幼若ホルモンまたは幼若ホルモン
様活性物質を該幼虫に投与して、幼虫の蛹化を抑制しな
がら幼虫の体重増加が継続するように幼虫を飼育し、し
かもこの飼育中の幼虫に与える飼料中には、幼若ホルモ
ンまたは幼若ホルモン様活性物質と共に、ハスモンヨト
ウ核多角体病の病原ウィルスの多角体もしくは顆粒体を
飼料に0.5×10⁷個／ｇ〜１×10⁹個／ｇの濃度で混入し
てあるものであり、飼料とともに該多角体または顆粒体
を飼育中の幼虫に摂食させることにより飼育中の幼虫を
罹病させ、その後に、幼虫に与える飼料を、幼若ホルモ
ンまたは幼若ホルモン様活性物質も該多核体または顆粒
体も含有しない飼料に切り換えて与えて、このように飼
育したハスモンヨトウ幼虫を、蛹化を抑制して幼虫終令
期末期まで体重増加を継続させながら飼育し続け、さら
に、終令期末期に病死した幼虫の幼虫病死率が65〜100
％に達した後に、その病死幼虫の虫体より、当該病原ウ
ィルスのウィルス封入体を収穫することを特徴とする、
ハスモンヨトウ核多角体病ウィルスの感染性を保有する
ウィルス封入体の高収量生産方法が提供される。この第
２の要旨の本発明方法は、第１の本発明方法と同じ要領
で実施できる。以下に実施例を挙げて本発明を詳述する
が、これは単なる例示であって、本発明の方法を制限す
るものではない。

【００２１】

【実施例１】ハスモンヨトウの卵塊を７０％エタノール
に２分間、さらに５％ホルマリンに２分間浸漬すること
により滅菌し、ふ化した後の幼虫を２５〜２７℃、湿度
６０〜８０％に保ち、人工飼料（インセクタＬＦ−日本
農産工業（株）製）を与え、終齢まで飼育した。

【００２２】次いで、ハスモンヨトウ核多角体病に罹病
し死亡した幼虫を磨砕し、病死幼虫の総体重の約５倍量
のイオン交換水を加え、このように調製されたウイルス
封入体（本実施例においては、ハスモンヨトウ核多角体
病ウイルスのウイルス封入体を「多角体」という）を含
有する懸濁液を、孔径２０μｍのフィルターを用いて濾
過して残渣を除いた。濾液は３０００×ｇで遠心分離を
行ない上澄み液を除き、沈澱物を得た。得られた沈澱物
を沈澱物体積の約５倍のイオン交換水に懸濁し、血球計
算板を用いて多角体数を計測した。このようにして得ら
れた多角体濃度に基づき、イオン交換水で希釈すること
により１×１０⁹個／ｍｌの多角体懸濁液を調製した。

【００２３】このようにして得られた多角体を幼虫の接
種源として使用した。

【００２４】そして、人工飼料（インセクタＬＦ−日本
日本農産工業（株）製）に、５０ｐｐｍのメトプレンと
所定濃度の多角体を均一になるように混ぜた。このよう
にして多角体を配合された人工飼料をハスモンヨトウの
終令幼虫２０頭に２日間、２７℃、６０％湿度で摂食さ
せた後、メトプレン及び多角体を含有しない前記同組成
の人工飼料を与えて同温度、同湿度条件で１０日間飼育
した。

【００２５】なお、対照試験Ａとしては、当初から、メ
トプレンと多角体を配合してない飼料で幼虫を飼育し
（対照区Ａ）、また対照試験Ｂとしては、多角体を配合
したがメトプレンを配合しない飼料で幼虫を飼育した
（対照区Ｂ）。

【００２６】メトプレンを配合したが多角体を含有しな
い飼料で飼育された終令幼虫の各個の体重変化を、終令
期１日目〜１０日目にわたって測定した結果を下記の表
１に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】前記の多角体接種試験において、飼料に配
合した多角体濃度、病死幼虫一匹当りから収穫できた多
角体の数、飼育１０日間に蛹化せずに病死した幼虫の病
死率、病死幼虫の全体から収穫できた多角体の総収量の
関連を調査して、その試験結果を次の表２に示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】調査は、幼虫終令期における前記の人工飼
料の供餌による飼育の４日後から１０日後まで行ない、
ウイルス病の罹病により死亡した病死幼虫体を１頭ず
つ、５ｍｌのイオン交換水と共に磨砕懸濁し、得られた
懸濁液の１滴を血球計算板にのせ、１頭当たりの多角体
数を測定した。また幼虫の病死率を下記式（１）により
算出した。病死幼虫の１頭当たり多角体数の最大値と最
小値とは、試験を行った各区２０頭のうち、最大の多角
体生産量を示した幼虫から得られた多角体数、最小の多
角体数を示した幼虫から得られた多角体数を示すものと
して記載した。

【００３１】幼虫が蛹化して幼虫の病死率が低下する
と、その割合だけ多角体の総収量が低下するので、下記
式（２）により多角体の総収量を算出した。

【００３２】なお、対照区Ｂは「中国農業試験場報
告」、Ｅ第12号、46頁〜62頁（昭和52年農水省発行）に
記載の方法に準じて行った。対照区Ｂでは、５令死亡と
蛹化が起ることにより多核体の総収量が低下するので、
対照区の病死の病死幼虫数は６令死亡の幼虫のみとし
た。

【００３３】その結果が表１に示したものである。

【００３４】

【００３５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、従来技術に比べ
ほぼ同程度の労力で、りん翅目昆虫の病原ウイルスのウ
イルス封入体を大量に得ることができるため、当該ウイ
ルスが宿主とする昆虫の防除に用いる天敵ウイルスの生
産に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平３−236747（ＪＰ，Ａ) 特開平１−132324（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＫａｎｓａｓＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，1981，Ｖｏｌ. 54，Ｎｏ．３，ｐ．489−495 中国農業試験場報告Ｅ，1977年，第12 号，ｐ．46−52 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】りん翅目昆虫の幼虫の終令期中で終令期
の初期に、飼料に蛹化抑制有効量で混入された幼若ホル
モンまたは幼若ホルモン様活性物質を該幼虫に投与し
て、幼虫の蛹化を抑制しながら幼虫の体重増加が継続す
るように幼虫を飼育し、しかもこの飼育中の幼虫に与え
る飼料中には、幼若ホルモンまたは幼若ホルモン様活性
物質と共に、該りん翅目昆虫の幼虫を本来の固有な宿主
とする天敵の病原ウィルスの多角体もしくは顆粒体を混
入してあるものであり、飼料とともに該多角体もしくは
顆粒体を飼育中の幼虫に摂食させることにより飼育中の
幼虫を罹病させ、その後に、幼虫に与える飼料を、幼若
ホルモンまたは幼若ホルモン様活性物質も該多角体また
は顆粒体も含有しない飼料に切り換えて与えて、このよ
うに飼育した幼虫を、蛹化を抑制して幼虫終令期末期ま
で体重増加を継続させながら飼育し続け、さらに、終令
期末期に病死した病死幼虫の虫体より、当該病原ウィル
スのウィルス封入体を収穫することを特徴とする、りん
翅目昆虫の病原ウィルスの感染性を保有するウィルス封
入体の高収量生産方法。
【請求項２】ハスモンヨトウの幼虫の終令期すなわち
６令期中で終令期の初期に、飼料に蛹化抑制有効量で混
入された幼若ホルモンまたは幼若ホルモン様活性物質を
該幼虫に投与して、幼虫の蛹化を抑制しながら幼虫の体
重増加が継続するように幼虫を飼育し、しかもこの飼育
中の幼虫に与える飼料中には、幼若ホルモンまたは幼若
ホルモン様活性物質と共に、ハスモンヨトウ核多角体病
の病原ウィルスの多角体もしくは顆粒体を飼料に0.5×1
0⁷個／ｇ〜１×10⁹個／ｇの濃度で混入してあるもので
あり、飼料とともに該多角体または顆粒体を飼育中の幼
虫に摂食させることにより飼育中の幼虫を罹病させ、そ
の後に、幼虫に与える飼料を、幼若ホルモンまたは幼若
ホルモン様活性物質も該多核体または顆粒体も含有しな
い飼料に切り換えて与えて、このように飼育したハスモ
ンヨトウ幼虫を、蛹化を抑制して幼虫終令期末期まで体
重増加を継続させながら飼育し続け、さらに、終令期末
期に病死した幼虫の幼虫病死率が65〜100％に達した後
に、その病死幼虫の虫体より、当該病原ウィルスのウィ
ルス封入体を収穫することを特徴とする、ハスモンヨト
ウ核多角体病ウィルスの感染性を保有するウィルス封入
体の高収量生産方法。