JP3532945B2 - 抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトチロシナーゼ検知
に有用な抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体及びそ
の製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】チロシナーゼは生体内でメラニン色素を
生合成する上で最も重要な酵素であり、チロシナーゼの
生合成が阻害されると、重大な皮膚障害が起こることが
知られている。例えば、チロシナーゼは粗面小胞体のリ
ボソームで生成され、次いでゴルジ器官関連小胞体で濃
縮、活生化され、ゴルジ器官より生成されるプレメラノ
ソームへ選択的に転送されると考えられている。 【０００３】チロシナーゼの生合成が阻害されると、重
大な皮膚障害が起こることが知られている。例えば、色
素異常症は、チロシナーゼ自身の構造の変異やその生合
成過程での異常により起こることが知られており、チロ
シナーゼのプレメラノソームへの選択的転送の異常が関
与している可能生もある。 【０００４】このような疾病の診断あるいは原因の究明
には、生体或は細胞に於けるチロシナーゼの挙動を知る
ことがたいへん有益であると考えられ、かかる観点か
ら、従来よりチロシナーゼの挙動を知るための努力がな
されてきた。特に抗原・抗体反応を用いた方法は、感度
も高いことから種々の検討がなされてきており、チロシ
ナーゼに対するポリクローナル抗体の作製が古くからな
されてきた。 【０００５】しかしながらポリクローナル抗体は、その
都度動物を免疫してその血中より取り出して作るため、
ロットごとの抗体価のバラツキが大きく、再現性に乏し
いと言う大きな欠点があるため、実用的ではなく製品化
には至っていない。そのため、チロシナーゼを抗原とし
て動物を免疫した後、この動物のリンパ球とミエローマ
等の培養細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、こ
れに抗チロシナーゼモノクローナル抗体を作らせる試み
がなされてきた。（Margherita Cuo-mo et.al.,J. Inve
st. Dermato. ,96(4),446-451 (1991); Yasushi Tomita
et. al., J. Invest. Dermato.,85(5),426-430 (198
5)） 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の報告で
抗チロシナーゼモノクローナル抗体とされたものは、チ
ロシナーゼ関連蛋白に対するモノクローナル抗体であっ
たことが、その後明らかにされた（Yasushi Tomita et.
al., J. Invest. Dermato., 96(4), 500-504, 199
1）。これは、生体に於いて、アミノ酸配列及び分子量
がチロシナーゼと極めて類似したチロシナーゼ関連蛋白
（以下、「ＴＲＰ」という）と呼ばれている蛋白が存在
しているため、チロシナーゼをＴＲＰから完全に分離す
ることが極めて困難であり、細胞あるいは組織より精製
したチロシナーゼを抗原として動物を免疫するという従
来技術では、混入しているＴＲＰが抗原となり、抗チロ
シナーゼ関連蛋白抗体が生成してしまうためである。 【０００７】したがって、チロシナーゼを抗原として特
異的に認識するモノクローナル抗体は、未だ得られてい
ないのが現状である。本発明はこのような観点からなさ
れたものであり、ＴＲＰを抗原として認識せず、ヒトチ
ロシナーゼを抗原として特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を提供することを課題とする。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトチロシナー
ゼのアミノ酸配列のうちＴＲＰの配列と相同性が低い配
列を有するペプチドを抗原に用いることにより、ＴＲＰ
に結合せず、ヒトチロシナーゼに特異的に結合するモノ
クローナル抗体が得られることを見いだし、本発明を完
成させた。 【０００９】すなわち、本発明は、ヒトチロシナーゼの
アミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸
配列と相同性の低い領域を抗原として認識する抗ヒトチ
ロシナーゼモノクローナル抗体、及びヒトチロシナーゼ
のアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ
酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも
一部を有するペプチドと担体との結合物を用いて哺乳動
物を免疫した後、その動物の脾細胞を取り出し、培養細
胞と融合してハイブリドーマを作製し、このハイブリド
ーマを培養してその培養物から抗体蛋白を採取すること
を特徴とするヒトチロシナーゼに特異的なモノクローナ
ル抗体の製造法である。 【００１０】なお、本明細書において、「ヒトチロシナ
ーゼに特異的に結合する」とは、ヒトチロシナーゼを抗
原として特異的に認識することをいい、特にＴＲＰには
結合しないことをいう。 【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。ヒトチロ
シナーゼのｃＤＮＡ配列は既に知られており（Hiroaki
Yamamoto et.al., Jpn. J. Genet, 64, 121-135(198
9)）、ヒトＴＲＰのｃＤＮＡ配列も既に知られている
（Sigeki Shibahara et. al., Tohoku J. exp. Med., 1
56, 403-414(1988)）。本発明者らはこれらのｃＤＮＡ
配列をアミノ酸配列に翻訳し、比較した（図１）。図１
において、上のレーンはヒトチロシナーゼのアミノ酸配
列を、下のレーンはＴＲＰのアミノ酸配列を１文字記号
で示したものである。レーンとレーンの間に示してある
（：）は、アミノ酸が完全に一致している部分であり、
（．）は同種のアミノ酸（疎水性、親水性、塩基性等）
として一致している部分である。その結果、ヒトチロシ
ナーゼのアミノ酸配列のうち、配列番号１に示したアミ
ノ酸配列を有する部分（図１中アンダライン部）が、Ｔ
ＲＰと相同性が低い部分の１つであることを見出した。 【００１２】本発明者らは、この点に注目し、上記配列
を有する合成ペプチド（以下、「ヒトチロシナーゼに特
異的なペプチド」ともいう）を合成した（（株）ペプチ
ド研究所に合成を依頼）。入手したペプチドを用いて哺
乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培養細
胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、この
ハイブリドーマにチロシナーゼに特異的なモノクローナ
ル抗体を生産させることに成功した。以下に、ヒトチロ
シナーゼに特異的なモノクローナル抗体及びその製造法
を製造手順に沿って説明する。 【００１３】＜１＞抗原 哺乳動物を免疫する際に用いるヒトチロシナーゼに特異
的なペプチドは、そのアミノ酸配列として配列番号１に
示す配列が挙げられるが、ヒトチロシナーゼのアミノ酸
配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相
同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有し
ていれば、本発明に使用することができる。このような
ペプチドは、例えばチロシナーゼの酵素分解物から単離
することにより、部分的に得ることができるが、常法に
より化学合成することが好ましい。例えば、市販されて
いるペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入力
すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプチ
ドの受託合成サービスを行っている会社に依託して入手
してもよい。 【００１４】かくして得られるペプチド（以下、「合成
ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いる
ことができるし、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ：Keyhole Limpet Hemocyanin)、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ：Bovine SerumAlbumin）、卵白アルブ
ミン（ＯＶＡ：Ovalbumin）等の担体と結合させて用い
ることもできる。このような担体を用いると、ペプチド
のみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合
でも抗原性を上げることができる。尚、この場合は担体
に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマを選
択する段階で取り除くことができる。 【００１５】＜２＞哺乳動物の免疫 上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いら
れている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラ
ット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、
通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペ
プチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、０．５
ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、フロイントの完
全アジュバントまたは不完全アジュバントとともに１〜
２週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２週間以上
後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法
が挙げられる。 【００１６】このときの合成ペプチドあるいは担体に結
合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５ｍ
ｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度が適当である。投与量が
０．５ｍｇ／ｋｇ未満では抗体を十分に生成しないこと
がある。また、５０ｍｇ／ｋｇを越えても更なる免疫効
果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目
的とする抗体が得られない恐れがある。 【００１７】＜３＞ハイブリドーマの作製 上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日
後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細
胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下
で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細
胞−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。 【００１８】融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融
合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエ
ローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融
合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにす
るために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが
好ましい。 【００１９】例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられ
る。このような細胞は、ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育
できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ
培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別で
きる。具体的には、P3X63Ag8.653株、P3/NSI/1-AG4-1
株、FO株、SP2/0-Ag14株等のミエローマ細胞の市販株が
挙げられるが、これらには限定されない。 【００２０】細胞融合は通常ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ
等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細
胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤ととも
に混合することにより行われる。融合促進剤としては、
細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に
制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子
量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示で
きる。また電気パルスによって融合させてもよい。細胞
融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいは
ＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞
をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート
等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育さ
せる 【００２１】＜４＞ハイブリドーマの選別 上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用
いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク
ローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを株の混合体であるの
で、これらの中から前記合成ペプチド、すまわちヒトチ
ロシナーゼに特異的なペプチドに特異的に結合するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。 【００２２】この選別の方法としては、抗原に用いた合
成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレ
ート等に固相化しておきこれにハイブリドーマ培養上
清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質の結合量から合
成ペプチドに結合する抗体量を知ることができる。或
は、ハイブリドーマが産生する抗体を固相化し、これに
合成ペプチド、酵素等で標識 第２抗体と順次インキュベートしてもよい。 【００２３】このようにして得られたハイブリドーマの
１株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３９３７として寄託されている。 【００２４】＜５＞ヒトチロシナーゼに特異的に結合す
るモノクローナル抗体の調製及びその利用法 上記のようにして得られたハイブリドーマからヒトチロ
シナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を得る
には、例えば、抗体産生ハイブリドーマを常法に従って
硫安分画、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィ
ー等で精製すれば、ヒトチロシナーゼに特異的なモノク
ローナル抗体が得られる。 【００２５】本発明のヒトチロシナーゼに特異的に結合
するモノクローナル抗体は、ヒトチロシナーゼと特異的
に反応するので、ヒト由来の培養細胞、皮膚組織等の免
疫染色における染色体用抗体、さらにはウェスタンブロ
ットあるいはミクロオートラジオグラフィーにおける染
色用抗体として使用可能であり、ヒトチロシナーゼの定
性あるいは定量のための検知用試薬として利用すること
ができる。 【００２６】 【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。 ＜１＞ハイブリドーマの作製 ペプチドの合成および担体（ＫＬＨ）への結合は、株式
会社ペプチド研究所に依頼した。 【００２７】上記の担体結合合成ペプチド１００μｇを
生理食塩水１００μｌに溶かし、完全フロイントアジュ
バント（ＳＩＧＭＡ製）１００μｌと混合乳化したもの
を、８週令のBALB/cマウス（日本クレア）の腹腔内に投
与した。その後１週間目と２週間目に、上記担体結合合
成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混合乳
化液２００μｌを腹腔内投与した。更に、３回目の投与
から２週間後に、５０μｇの合成ペプチドを溶解した生
理食塩水１００μｌを静脈注射した。 【００２８】３日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾
細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。
一方、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8.653（大日本製
薬よから購入）を、細胞融合に合わせて対数増殖期にな
るように培養し、遠心分離により集めた。 【００２９】１０8個の脾細胞に対し、２×１０7個のミ
エローマを上記培地中で混合し、遠心分離により細胞を
ペレットにした。上清を除いた後、３７℃に保温した５
０％ＰＥＧ４０００（ＳＩＧＭＡ製）を含むＲＰＭＩ１
６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、１分間穏や
かに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６４０培地２
ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌しながら滴
下する。 【００３０】滴下終了後、遠心分離により上清を除いた
後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌ
に懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベー
クライト製）に、１ウェルにつき１００μｌずつ分注し
た。翌日２５μｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後２
５μｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、培
養上清を半分除き、１００μｌのＧＩＴ培地を添加し
た。 【００３１】細胞融合から約２週間後、ミエローマと脾
細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成し
たが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培
養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、
上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ
＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製）を用いたサンドウィッチＥ
ＬＩＳＡ法により検定した。このうち、抗体価の高かっ
たウェル中のハイブリドーマを限界希釈法によるクロー
ニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
株を得た。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３９３７として寄託されてい
る。 【００３２】＜２＞ヒトチロシナーゼに特異的に結合す
るモノクローナル抗体の調製 上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、ヒトチ
ロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の採
取を行った。 【００３３】上記ハイブリドーマをＧＩＴ培地で培養
し、細胞濃度が約５×１０6個／ｍｌになったところで
培養上清を遠心分離により回収し、これをポアーサイズ
０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテイン
Ａカラムキット（アマシャム・ジャパン製）により精製
し抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を得た。 【００３４】＜３＞抗ヒトチロシナーゼモノクローナル
抗体の評価 （１）抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体のヒトチ
ロシナーゼとの反応性 上記で得られたモノクローナル抗体について、ＭｅＷｏ
細胞（ヒト悪性黒色腫由来培養細胞）およびＨｅＬａ細
胞（ヒト子宮頚ガン由来培養細胞）の抽出物を用いて、
特異性の評価をエンザイムイムノブロット法により行っ
た。 【００３５】培養フラスコで培養したＭｅＷｏおよびＨ
ｅＬａ細胞の培養上清を除き、ＰＢＳで数回洗浄した
後、細胞をラバーポリスマンを使用して回収した。回収
した細胞を、再びＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％含んだ０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液,ｐＨ６．９）に懸濁した。 【００３６】この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電
機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１
０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタン
パク濃度を測定し、細胞抽出液とした。これを、５〜２
０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（パジェル：Ａ
ＴＴＯ製）を用いた電気泳動に供した。アプライ量は、
１レーン当りタンパク量として１０μｇ／レーンであ
る。なお、電気泳動は常法に従って行った。電気泳動終
了後、ゲルを取り出し１レーンを切り取り、チロシナー
ゼの活性染色（ＤＯＰＡ染色）を行いゲル上のチロシナ
ーゼの位置を検出した。 【００３７】一方、ゲルの残りのレーンをトランスファ
ーバッファー（１００ｍＭ，Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ，ｇ
ｌｙｃｉｎ）に浸漬した後、ブロッティング装置（セミ
ドライブロッティング装置：ＡＴＴＯ製）を用い、泳動
物をゲルから、予めトランスファーバッファーに浸漬し
たメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；ミリポア社製）へ
転写した。 【００３８】泳動物を転写したメンブレンを、ＴＢＳバ
ッファー（２０ｍＭ，Ｔｒｉｓ；５００ｍＭ，ＮａＣｌ
ｐＨ７．５）に１５分間浸漬した後、ブロッキングバ
ッファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳバッファー）に浸
し、２５℃で１時間緩やかに振とうした。 【００３９】その後、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳバッファー（ＴＴＢＳバッファー）を
用いて洗浄（１５分１回，５分２回）し、前記＜２＞で
得られたモノクローナル抗体溶液（１０倍希釈駅を約２
ｍｌ）に浸漬し、約１時間２５℃で緩やかに振盪した。
メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶液
（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マ
ウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製、１０，０
００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬し、２５℃で約１時間
緩やかに振盪した。 【００４０】メンブレンをＴＴＢＳバッファーにより洗
浄（１５分１回，５分４回）した後、、市販のＨＲＰ検
出キット（アマシャム製ＥＣＬキット）を使用して、抗
ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体が結合した泳動物
のバンドを検出した。尚、ＨＲＰが結合したバンドは、
４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用しても検
出する事ができる。 【００４１】前記活性染色の結果及びエンザイムイムノ
ブロット法の結果を図２に示す。この結果から明らかな
ように、上記で得られたモノクローナル抗体は、ヒトチ
ロシナーゼ活性を有する蛋白のバンド、すなわちヒトチ
ロシナーゼに結合する。さらにこのモノクローナル抗体
は、ＨｅＬａ細胞の抽出物には結合しない。 【００４２】（２）抗ヒトチロシナーゼモノクローナル
抗体に結合する抗原の解析 上記で得られたモノクローナル抗体について、ＭｅＷｏ
抽出物を用いて、特異性の評価を免疫沈降法により行っ
た。 【００４３】培養フラスコで培養したＭｅＷｏ細胞の培
養上清を除き、ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞をラバー
ポリスマンを使用して回収した。回収した細胞を、再
び、ＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液に懸濁した。 【００４４】この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電
機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１
０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタン
パク濃度を測定し、細胞抽出液とした。 【００４５】プロテインＡ−セファロース（Protein A-
sepharose：シグマ社製)２０μｌをマイクロチューブに
とり、結合緩衝液（binding buffer：１．５Ｍグリシ
ン，３ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．９)を使用して洗浄した。 【００４６】この洗浄したプロテインＡ−セファロース
に、上記で得られたモノクローナル抗体の溶液と結合緩
衝液の等量混合液を添加し、４℃で１時間緩やかに転倒
混和することでモノクローナル抗体をプロテインＡ−セ
ファロースに結合させた。これを細胞溶解緩衝液で３回
洗浄し、上記の細胞抽出液(約２５μｇ タンパク)を添
加した後、４℃で２時間以上緩やかに混和した。混和終
了後、１０，０００×ｇで１分間遠心分離し上清（これ
により得られた上清を、以後、抗体処理ＭｅＷｏ抽出液
という。）のチロシナーゼ活性を測定した。 【００４７】なお、チロシナーゼ活性は、ＭＢＴＨ（３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）法によ
り調べた。方法を以下に示す。上記の抗体処理ＭｅＷｏ
抽出液およびＭｅＷｏ抽出液３０μｌを３７℃で１０分
間加温した後、あらかじめ３７℃に加温しておいたＤＯ
ＰＡ液（１２ｍＭ，ＭＢＴＨ；４％，ｄｉｍｅｔｈｙｌ
ｆｏｒｍａｍｉｄｅ；２ｍＭ，Ｌ−ＤＯＰＡ）３０μｌ
をそれぞれに添加することで反応を開始した。反応は３
７℃で行い、３０分後、氷上に移すことにより反応を止
めた。反応が進めば反応液の５０５ｎｍにおける吸光度
が増大するので、この値を測定することによりチロシナ
ーゼ活性を調べた。この結果を表１に示す。 【００４８】 【表１】 【００４９】この表からわかるように、上記で得られた
モノクローナル抗体は細胞抽出液中のチロシナーゼ活性
を約半分に減少させている。すなわち、上記で得られた
モノクローナル抗体はヒトチロシナーゼに結合すること
が明らかである。 【００５０】一方、上記で得られたモノクローナル抗体
とＴＲＰとの反応性を調べるために、上記の抗体処理Ｍ
ｅＷｏ抽出液および無処理ＭｅＷｏ抽出液を抗原とし、
従来技術の抗チロシナーゼモノクローナル抗体（抗ＴＲ
Ｐモノクローナル抗体）および実施例＜１＞記載の市販
の二次抗体を用いたサンドウイッチＥＬＩＳＡ法を行っ
た。この結果を表２に示した。 【００５１】 【表２】【００５２】表より、抗体処理ＭｅＷｏ抽出液および無
処理ＭｅＷｏ抽出液を抗原としたＥＬＩＳＡでの値に違
いがないことから、上記で得られたモノクローナル抗体
に結合する抗原は、従来技術の抗チロシナーゼモノクロ
ーナル抗体（抗ＴＲＰモノクローナル抗体）とは結合し
ないことがわかった。 【００５３】すなわち、上記で得られたモノクローナル
抗体は、従来技術の抗チロシナーゼモノクローナル抗体
とは全く異なった抗体であり、ＴＲＰと結合しないこと
が明らかとなった。 【００５４】 【発明の効果】本モノクローナル抗体は、ヒトチロシナ
ーゼに特異的に結合する。このモノクローナル抗体は、
本発明の方法により得られる。 【００５５】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His Leu 1 5 10 【００５６】
に有用な抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体及びそ
の製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】チロシナーゼは生体内でメラニン色素を
生合成する上で最も重要な酵素であり、チロシナーゼの
生合成が阻害されると、重大な皮膚障害が起こることが
知られている。例えば、チロシナーゼは粗面小胞体のリ
ボソームで生成され、次いでゴルジ器官関連小胞体で濃
縮、活生化され、ゴルジ器官より生成されるプレメラノ
ソームへ選択的に転送されると考えられている。 【０００３】チロシナーゼの生合成が阻害されると、重
大な皮膚障害が起こることが知られている。例えば、色
素異常症は、チロシナーゼ自身の構造の変異やその生合
成過程での異常により起こることが知られており、チロ
シナーゼのプレメラノソームへの選択的転送の異常が関
与している可能生もある。 【０００４】このような疾病の診断あるいは原因の究明
には、生体或は細胞に於けるチロシナーゼの挙動を知る
ことがたいへん有益であると考えられ、かかる観点か
ら、従来よりチロシナーゼの挙動を知るための努力がな
されてきた。特に抗原・抗体反応を用いた方法は、感度
も高いことから種々の検討がなされてきており、チロシ
ナーゼに対するポリクローナル抗体の作製が古くからな
されてきた。 【０００５】しかしながらポリクローナル抗体は、その
都度動物を免疫してその血中より取り出して作るため、
ロットごとの抗体価のバラツキが大きく、再現性に乏し
いと言う大きな欠点があるため、実用的ではなく製品化
には至っていない。そのため、チロシナーゼを抗原とし
て動物を免疫した後、この動物のリンパ球とミエローマ
等の培養細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、こ
れに抗チロシナーゼモノクローナル抗体を作らせる試み
がなされてきた。（Margherita Cuo-mo et.al.,J. Inve
st. Dermato. ,96(4),446-451 (1991); Yasushi Tomita
et. al., J. Invest. Dermato.,85(5),426-430 (198
5)） 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の報告で
抗チロシナーゼモノクローナル抗体とされたものは、チ
ロシナーゼ関連蛋白に対するモノクローナル抗体であっ
たことが、その後明らかにされた（Yasushi Tomita et.
al., J. Invest. Dermato., 96(4), 500-504, 199
1）。これは、生体に於いて、アミノ酸配列及び分子量
がチロシナーゼと極めて類似したチロシナーゼ関連蛋白
（以下、「ＴＲＰ」という）と呼ばれている蛋白が存在
しているため、チロシナーゼをＴＲＰから完全に分離す
ることが極めて困難であり、細胞あるいは組織より精製
したチロシナーゼを抗原として動物を免疫するという従
来技術では、混入しているＴＲＰが抗原となり、抗チロ
シナーゼ関連蛋白抗体が生成してしまうためである。 【０００７】したがって、チロシナーゼを抗原として特
異的に認識するモノクローナル抗体は、未だ得られてい
ないのが現状である。本発明はこのような観点からなさ
れたものであり、ＴＲＰを抗原として認識せず、ヒトチ
ロシナーゼを抗原として特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を提供することを課題とする。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトチロシナー
ゼのアミノ酸配列のうちＴＲＰの配列と相同性が低い配
列を有するペプチドを抗原に用いることにより、ＴＲＰ
に結合せず、ヒトチロシナーゼに特異的に結合するモノ
クローナル抗体が得られることを見いだし、本発明を完
成させた。 【０００９】すなわち、本発明は、ヒトチロシナーゼの
アミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸
配列と相同性の低い領域を抗原として認識する抗ヒトチ
ロシナーゼモノクローナル抗体、及びヒトチロシナーゼ
のアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ
酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも
一部を有するペプチドと担体との結合物を用いて哺乳動
物を免疫した後、その動物の脾細胞を取り出し、培養細
胞と融合してハイブリドーマを作製し、このハイブリド
ーマを培養してその培養物から抗体蛋白を採取すること
を特徴とするヒトチロシナーゼに特異的なモノクローナ
ル抗体の製造法である。 【００１０】なお、本明細書において、「ヒトチロシナ
ーゼに特異的に結合する」とは、ヒトチロシナーゼを抗
原として特異的に認識することをいい、特にＴＲＰには
結合しないことをいう。 【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。ヒトチロ
シナーゼのｃＤＮＡ配列は既に知られており（Hiroaki
Yamamoto et.al., Jpn. J. Genet, 64, 121-135(198
9)）、ヒトＴＲＰのｃＤＮＡ配列も既に知られている
（Sigeki Shibahara et. al., Tohoku J. exp. Med., 1
56, 403-414(1988)）。本発明者らはこれらのｃＤＮＡ
配列をアミノ酸配列に翻訳し、比較した（図１）。図１
において、上のレーンはヒトチロシナーゼのアミノ酸配
列を、下のレーンはＴＲＰのアミノ酸配列を１文字記号
で示したものである。レーンとレーンの間に示してある
（：）は、アミノ酸が完全に一致している部分であり、
（．）は同種のアミノ酸（疎水性、親水性、塩基性等）
として一致している部分である。その結果、ヒトチロシ
ナーゼのアミノ酸配列のうち、配列番号１に示したアミ
ノ酸配列を有する部分（図１中アンダライン部）が、Ｔ
ＲＰと相同性が低い部分の１つであることを見出した。 【００１２】本発明者らは、この点に注目し、上記配列
を有する合成ペプチド（以下、「ヒトチロシナーゼに特
異的なペプチド」ともいう）を合成した（（株）ペプチ
ド研究所に合成を依頼）。入手したペプチドを用いて哺
乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培養細
胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、この
ハイブリドーマにチロシナーゼに特異的なモノクローナ
ル抗体を生産させることに成功した。以下に、ヒトチロ
シナーゼに特異的なモノクローナル抗体及びその製造法
を製造手順に沿って説明する。 【００１３】＜１＞抗原 哺乳動物を免疫する際に用いるヒトチロシナーゼに特異
的なペプチドは、そのアミノ酸配列として配列番号１に
示す配列が挙げられるが、ヒトチロシナーゼのアミノ酸
配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相
同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有し
ていれば、本発明に使用することができる。このような
ペプチドは、例えばチロシナーゼの酵素分解物から単離
することにより、部分的に得ることができるが、常法に
より化学合成することが好ましい。例えば、市販されて
いるペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入力
すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプチ
ドの受託合成サービスを行っている会社に依託して入手
してもよい。 【００１４】かくして得られるペプチド（以下、「合成
ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いる
ことができるし、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ：Keyhole Limpet Hemocyanin)、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ：Bovine SerumAlbumin）、卵白アルブ
ミン（ＯＶＡ：Ovalbumin）等の担体と結合させて用い
ることもできる。このような担体を用いると、ペプチド
のみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合
でも抗原性を上げることができる。尚、この場合は担体
に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマを選
択する段階で取り除くことができる。 【００１５】＜２＞哺乳動物の免疫 上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いら
れている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラ
ット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、
通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペ
プチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、０．５
ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、フロイントの完
全アジュバントまたは不完全アジュバントとともに１〜
２週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２週間以上
後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法
が挙げられる。 【００１６】このときの合成ペプチドあるいは担体に結
合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５ｍ
ｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度が適当である。投与量が
０．５ｍｇ／ｋｇ未満では抗体を十分に生成しないこと
がある。また、５０ｍｇ／ｋｇを越えても更なる免疫効
果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目
的とする抗体が得られない恐れがある。 【００１７】＜３＞ハイブリドーマの作製 上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日
後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細
胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下
で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細
胞−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。 【００１８】融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融
合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエ
ローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融
合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにす
るために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが
好ましい。 【００１９】例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられ
る。このような細胞は、ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育
できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ
培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別で
きる。具体的には、P3X63Ag8.653株、P3/NSI/1-AG4-1
株、FO株、SP2/0-Ag14株等のミエローマ細胞の市販株が
挙げられるが、これらには限定されない。 【００２０】細胞融合は通常ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ
等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細
胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤ととも
に混合することにより行われる。融合促進剤としては、
細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に
制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子
量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示で
きる。また電気パルスによって融合させてもよい。細胞
融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいは
ＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞
をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート
等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育さ
せる 【００２１】＜４＞ハイブリドーマの選別 上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用
いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク
ローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを株の混合体であるの
で、これらの中から前記合成ペプチド、すまわちヒトチ
ロシナーゼに特異的なペプチドに特異的に結合するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。 【００２２】この選別の方法としては、抗原に用いた合
成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレ
ート等に固相化しておきこれにハイブリドーマ培養上
清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質の結合量から合
成ペプチドに結合する抗体量を知ることができる。或
は、ハイブリドーマが産生する抗体を固相化し、これに
合成ペプチド、酵素等で標識 第２抗体と順次インキュベートしてもよい。 【００２３】このようにして得られたハイブリドーマの
１株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３９３７として寄託されている。 【００２４】＜５＞ヒトチロシナーゼに特異的に結合す
るモノクローナル抗体の調製及びその利用法 上記のようにして得られたハイブリドーマからヒトチロ
シナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を得る
には、例えば、抗体産生ハイブリドーマを常法に従って
硫安分画、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィ
ー等で精製すれば、ヒトチロシナーゼに特異的なモノク
ローナル抗体が得られる。 【００２５】本発明のヒトチロシナーゼに特異的に結合
するモノクローナル抗体は、ヒトチロシナーゼと特異的
に反応するので、ヒト由来の培養細胞、皮膚組織等の免
疫染色における染色体用抗体、さらにはウェスタンブロ
ットあるいはミクロオートラジオグラフィーにおける染
色用抗体として使用可能であり、ヒトチロシナーゼの定
性あるいは定量のための検知用試薬として利用すること
ができる。 【００２６】 【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。 ＜１＞ハイブリドーマの作製 ペプチドの合成および担体（ＫＬＨ）への結合は、株式
会社ペプチド研究所に依頼した。 【００２７】上記の担体結合合成ペプチド１００μｇを
生理食塩水１００μｌに溶かし、完全フロイントアジュ
バント（ＳＩＧＭＡ製）１００μｌと混合乳化したもの
を、８週令のBALB/cマウス（日本クレア）の腹腔内に投
与した。その後１週間目と２週間目に、上記担体結合合
成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混合乳
化液２００μｌを腹腔内投与した。更に、３回目の投与
から２週間後に、５０μｇの合成ペプチドを溶解した生
理食塩水１００μｌを静脈注射した。 【００２８】３日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾
細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。
一方、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8.653（大日本製
薬よから購入）を、細胞融合に合わせて対数増殖期にな
るように培養し、遠心分離により集めた。 【００２９】１０8個の脾細胞に対し、２×１０7個のミ
エローマを上記培地中で混合し、遠心分離により細胞を
ペレットにした。上清を除いた後、３７℃に保温した５
０％ＰＥＧ４０００（ＳＩＧＭＡ製）を含むＲＰＭＩ１
６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、１分間穏や
かに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６４０培地２
ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌しながら滴
下する。 【００３０】滴下終了後、遠心分離により上清を除いた
後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌ
に懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベー
クライト製）に、１ウェルにつき１００μｌずつ分注し
た。翌日２５μｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後２
５μｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、培
養上清を半分除き、１００μｌのＧＩＴ培地を添加し
た。 【００３１】細胞融合から約２週間後、ミエローマと脾
細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成し
たが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培
養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、
上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ
＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製）を用いたサンドウィッチＥ
ＬＩＳＡ法により検定した。このうち、抗体価の高かっ
たウェル中のハイブリドーマを限界希釈法によるクロー
ニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
株を得た。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３９３７として寄託されてい
る。 【００３２】＜２＞ヒトチロシナーゼに特異的に結合す
るモノクローナル抗体の調製 上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、ヒトチ
ロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の採
取を行った。 【００３３】上記ハイブリドーマをＧＩＴ培地で培養
し、細胞濃度が約５×１０6個／ｍｌになったところで
培養上清を遠心分離により回収し、これをポアーサイズ
０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテイン
Ａカラムキット（アマシャム・ジャパン製）により精製
し抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を得た。 【００３４】＜３＞抗ヒトチロシナーゼモノクローナル
抗体の評価 （１）抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体のヒトチ
ロシナーゼとの反応性 上記で得られたモノクローナル抗体について、ＭｅＷｏ
細胞（ヒト悪性黒色腫由来培養細胞）およびＨｅＬａ細
胞（ヒト子宮頚ガン由来培養細胞）の抽出物を用いて、
特異性の評価をエンザイムイムノブロット法により行っ
た。 【００３５】培養フラスコで培養したＭｅＷｏおよびＨ
ｅＬａ細胞の培養上清を除き、ＰＢＳで数回洗浄した
後、細胞をラバーポリスマンを使用して回収した。回収
した細胞を、再びＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％含んだ０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液,ｐＨ６．９）に懸濁した。 【００３６】この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電
機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１
０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタン
パク濃度を測定し、細胞抽出液とした。これを、５〜２
０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（パジェル：Ａ
ＴＴＯ製）を用いた電気泳動に供した。アプライ量は、
１レーン当りタンパク量として１０μｇ／レーンであ
る。なお、電気泳動は常法に従って行った。電気泳動終
了後、ゲルを取り出し１レーンを切り取り、チロシナー
ゼの活性染色（ＤＯＰＡ染色）を行いゲル上のチロシナ
ーゼの位置を検出した。 【００３７】一方、ゲルの残りのレーンをトランスファ
ーバッファー（１００ｍＭ，Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ，ｇ
ｌｙｃｉｎ）に浸漬した後、ブロッティング装置（セミ
ドライブロッティング装置：ＡＴＴＯ製）を用い、泳動
物をゲルから、予めトランスファーバッファーに浸漬し
たメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；ミリポア社製）へ
転写した。 【００３８】泳動物を転写したメンブレンを、ＴＢＳバ
ッファー（２０ｍＭ，Ｔｒｉｓ；５００ｍＭ，ＮａＣｌ
ｐＨ７．５）に１５分間浸漬した後、ブロッキングバ
ッファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳバッファー）に浸
し、２５℃で１時間緩やかに振とうした。 【００３９】その後、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳバッファー（ＴＴＢＳバッファー）を
用いて洗浄（１５分１回，５分２回）し、前記＜２＞で
得られたモノクローナル抗体溶液（１０倍希釈駅を約２
ｍｌ）に浸漬し、約１時間２５℃で緩やかに振盪した。
メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶液
（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マ
ウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製、１０，０
００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬し、２５℃で約１時間
緩やかに振盪した。 【００４０】メンブレンをＴＴＢＳバッファーにより洗
浄（１５分１回，５分４回）した後、、市販のＨＲＰ検
出キット（アマシャム製ＥＣＬキット）を使用して、抗
ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体が結合した泳動物
のバンドを検出した。尚、ＨＲＰが結合したバンドは、
４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用しても検
出する事ができる。 【００４１】前記活性染色の結果及びエンザイムイムノ
ブロット法の結果を図２に示す。この結果から明らかな
ように、上記で得られたモノクローナル抗体は、ヒトチ
ロシナーゼ活性を有する蛋白のバンド、すなわちヒトチ
ロシナーゼに結合する。さらにこのモノクローナル抗体
は、ＨｅＬａ細胞の抽出物には結合しない。 【００４２】（２）抗ヒトチロシナーゼモノクローナル
抗体に結合する抗原の解析 上記で得られたモノクローナル抗体について、ＭｅＷｏ
抽出物を用いて、特異性の評価を免疫沈降法により行っ
た。 【００４３】培養フラスコで培養したＭｅＷｏ細胞の培
養上清を除き、ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞をラバー
ポリスマンを使用して回収した。回収した細胞を、再
び、ＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液に懸濁した。 【００４４】この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電
機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１
０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタン
パク濃度を測定し、細胞抽出液とした。 【００４５】プロテインＡ−セファロース（Protein A-
sepharose：シグマ社製)２０μｌをマイクロチューブに
とり、結合緩衝液（binding buffer：１．５Ｍグリシ
ン，３ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．９)を使用して洗浄した。 【００４６】この洗浄したプロテインＡ−セファロース
に、上記で得られたモノクローナル抗体の溶液と結合緩
衝液の等量混合液を添加し、４℃で１時間緩やかに転倒
混和することでモノクローナル抗体をプロテインＡ−セ
ファロースに結合させた。これを細胞溶解緩衝液で３回
洗浄し、上記の細胞抽出液(約２５μｇ タンパク)を添
加した後、４℃で２時間以上緩やかに混和した。混和終
了後、１０，０００×ｇで１分間遠心分離し上清（これ
により得られた上清を、以後、抗体処理ＭｅＷｏ抽出液
という。）のチロシナーゼ活性を測定した。 【００４７】なお、チロシナーゼ活性は、ＭＢＴＨ（３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）法によ
り調べた。方法を以下に示す。上記の抗体処理ＭｅＷｏ
抽出液およびＭｅＷｏ抽出液３０μｌを３７℃で１０分
間加温した後、あらかじめ３７℃に加温しておいたＤＯ
ＰＡ液（１２ｍＭ，ＭＢＴＨ；４％，ｄｉｍｅｔｈｙｌ
ｆｏｒｍａｍｉｄｅ；２ｍＭ，Ｌ−ＤＯＰＡ）３０μｌ
をそれぞれに添加することで反応を開始した。反応は３
７℃で行い、３０分後、氷上に移すことにより反応を止
めた。反応が進めば反応液の５０５ｎｍにおける吸光度
が増大するので、この値を測定することによりチロシナ
ーゼ活性を調べた。この結果を表１に示す。 【００４８】 【表１】 【００４９】この表からわかるように、上記で得られた
モノクローナル抗体は細胞抽出液中のチロシナーゼ活性
を約半分に減少させている。すなわち、上記で得られた
モノクローナル抗体はヒトチロシナーゼに結合すること
が明らかである。 【００５０】一方、上記で得られたモノクローナル抗体
とＴＲＰとの反応性を調べるために、上記の抗体処理Ｍ
ｅＷｏ抽出液および無処理ＭｅＷｏ抽出液を抗原とし、
従来技術の抗チロシナーゼモノクローナル抗体（抗ＴＲ
Ｐモノクローナル抗体）および実施例＜１＞記載の市販
の二次抗体を用いたサンドウイッチＥＬＩＳＡ法を行っ
た。この結果を表２に示した。 【００５１】 【表２】【００５２】表より、抗体処理ＭｅＷｏ抽出液および無
処理ＭｅＷｏ抽出液を抗原としたＥＬＩＳＡでの値に違
いがないことから、上記で得られたモノクローナル抗体
に結合する抗原は、従来技術の抗チロシナーゼモノクロ
ーナル抗体（抗ＴＲＰモノクローナル抗体）とは結合し
ないことがわかった。 【００５３】すなわち、上記で得られたモノクローナル
抗体は、従来技術の抗チロシナーゼモノクローナル抗体
とは全く異なった抗体であり、ＴＲＰと結合しないこと
が明らかとなった。 【００５４】 【発明の効果】本モノクローナル抗体は、ヒトチロシナ
ーゼに特異的に結合する。このモノクローナル抗体は、
本発明の方法により得られる。 【００５５】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His Leu 1 5 10 【００５６】
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】 ヒトチロシナーゼ及びＴＲＰのアミノ酸配列
のホモロジーを示す図。 【００５８】 【図２】 チロシナーゼの活性染色及びエンザイムイム
ノブロットにより電気泳動の結果を表した写真。
のホモロジーを示す図。 【００５８】 【図２】 チロシナーゼの活性染色及びエンザイムイム
ノブロットにより電気泳動の結果を表した写真。
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ.
64（1989）ｐ．121−135
Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ
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414
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
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Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
266［２］（1991）ｐ．1147−1156
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 16/40
C12P 21/08
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列からなる
ペプチドを抗原として認識する抗ヒトチロシナーゼモノ
クローナル抗体。
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|---|---|---|---|
| JP28686093A JP3532945B2 (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体 |
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1993
- 1993-11-16 JP JP28686093A patent/JP3532945B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07138300A (ja) | 1995-05-30 |
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