JP3536079B2 - デタージェントで簡易化された薬剤の免疫検定 - Google Patents
デタージェントで簡易化された薬剤の免疫検定Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野：
本発明は、免疫検定において薬剤の定量分析を容易に
するための試薬及び方法に関する。特に本発明は、標準
化試薬を用いる検定及び免疫検定の所望の検定感度を得
るためのデタージェントの使用に関する。本発明は、所
望の、あらかじめ選択された薬剤、例えばコカイン、ア
セタミノフェン、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバ
ルビタールなどの濃度の測定に用いられる。
するための試薬及び方法に関する。特に本発明は、標準
化試薬を用いる検定及び免疫検定の所望の検定感度を得
るためのデタージェントの使用に関する。本発明は、所
望の、あらかじめ選択された薬剤、例えばコカイン、ア
セタミノフェン、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバ
ルビタールなどの濃度の測定に用いられる。
発明の背景：
免疫検定は、個人が薬剤、病原体、または濫用物質
（例えばコカイン、アヘン類など）にさらされたかどう
かを確定するための手段を提供する。このような決定は
医学及び法の執行において非常に重要である。
（例えばコカイン、アヘン類など）にさらされたかどう
かを確定するための手段を提供する。このような決定は
医学及び法の執行において非常に重要である。
免疫検定は、抗体の有する、特定の標的分子を特異的
に認識し、これに結合する能力を利用する検定システム
である。抗体は、動物体内で異物（“抗原”）の検出に
応答して産生する免疫グロブリンである、抗体によって
認識され、抗体が結合する抗原領域は“エピトープ”と
呼ばれる、タンパク質やその他の大きな分子は複数のエ
ピトープを有するが、大部分の薬剤のような低分子量分
子は単一のエピトープのみを有する。このような低分子
量分子は“ハプテン”と呼ばれる。免疫検定は現代の診
断に広く用いられている（ファックレル（Fackrell）J.
Clin.Immunoassay ８巻、213〜219ページ、（198
5））。多数の異なる免疫検定フォーマットが記述され
ている（ヨルケン（Yolken,R.H.）、Rev.Infect.Dis.4
巻、35ページ、（1982）；コリンズ（Collins,W.P.）、
抗体免疫検定（Alternative Immunoassays）、John Wil
ey ＆ Sons,NY,（1985）；ニョら（Ngo,T.T.et al.）、
酵素仲介免疫検定（Enzyme Medicated Immunoassay）、
Plenum Press、NY（1985））。大規模用途に適した免疫
検定フォーマットが開発されている（参照、リー（Lee,
T.T.T.）ら、欧州特許出願公開公報第203,238号、参照
してここに取り込まれる）。
に認識し、これに結合する能力を利用する検定システム
である。抗体は、動物体内で異物（“抗原”）の検出に
応答して産生する免疫グロブリンである、抗体によって
認識され、抗体が結合する抗原領域は“エピトープ”と
呼ばれる、タンパク質やその他の大きな分子は複数のエ
ピトープを有するが、大部分の薬剤のような低分子量分
子は単一のエピトープのみを有する。このような低分子
量分子は“ハプテン”と呼ばれる。免疫検定は現代の診
断に広く用いられている（ファックレル（Fackrell）J.
Clin.Immunoassay ８巻、213〜219ページ、（198
5））。多数の異なる免疫検定フォーマットが記述され
ている（ヨルケン（Yolken,R.H.）、Rev.Infect.Dis.4
巻、35ページ、（1982）；コリンズ（Collins,W.P.）、
抗体免疫検定（Alternative Immunoassays）、John Wil
ey ＆ Sons,NY,（1985）；ニョら（Ngo,T.T.et al.）、
酵素仲介免疫検定（Enzyme Medicated Immunoassay）、
Plenum Press、NY（1985））。大規模用途に適した免疫
検定フォーマットが開発されている（参照、リー（Lee,
T.T.T.）ら、欧州特許出願公開公報第203,238号、参照
してここに取り込まれる）。
最も簡単な免疫検定は、所定の分子（すなわち“被検
体”）に結合することができる抗体をその被検体を含む
疑いのあるサンプルとともに単にインキュベートするこ
とを含んでなる。標的分子の存在は、抗体と被検体との
結合によって形成される免疫複合体の存在によって測定
され、その免疫複合体の濃度に比例する。このような免
疫複合体を最初に存在する未結合抗体から容易に分離す
るために、典型的には固相が用いられる。より複雑な免
疫検定では、抗体を支持体に結合させ、その後その結合
抗体を、被検体含有サンプルの存在下でインキュベート
することによって標的分子の濃度を測定する。
体”）に結合することができる抗体をその被検体を含む
疑いのあるサンプルとともに単にインキュベートするこ
とを含んでなる。標的分子の存在は、抗体と被検体との
結合によって形成される免疫複合体の存在によって測定
され、その免疫複合体の濃度に比例する。このような免
疫複合体を最初に存在する未結合抗体から容易に分離す
るために、典型的には固相が用いられる。より複雑な免
疫検定では、抗体を支持体に結合させ、その後その結合
抗体を、被検体含有サンプルの存在下でインキュベート
することによって標的分子の濃度を測定する。
固定した抗体に結合した標的分子は種々の方法で検出
することができる。例えば、標的分子の第２のエピトー
プに結合することができる標識された第２の抗体の存在
下で前記支持抗体がインキュベートされる（すなわち
“サンドイッチ”免疫検定）。こうして標識抗体の支持
体への固定は標的の存在を必要とし、サンプル中の標的
の濃度に比例する。別の検定では、サンプルを既知量の
標識された標的及び抗体結合部位とともにインキュベー
トする。サンプル中に存在する標的分子は標識された標
的分子と抗体結合部位を競争する。こうして抗体と結合
できる標識された標的分子の量はサンプル中の標的分子
の濃度に反比例する。これは競合的免疫検定として知ら
れている。
することができる。例えば、標的分子の第２のエピトー
プに結合することができる標識された第２の抗体の存在
下で前記支持抗体がインキュベートされる（すなわち
“サンドイッチ”免疫検定）。こうして標識抗体の支持
体への固定は標的の存在を必要とし、サンプル中の標的
の濃度に比例する。別の検定では、サンプルを既知量の
標識された標的及び抗体結合部位とともにインキュベー
トする。サンプル中に存在する標的分子は標識された標
的分子と抗体結合部位を競争する。こうして抗体と結合
できる標識された標的分子の量はサンプル中の標的分子
の濃度に反比例する。これは競合的免疫検定として知ら
れている。
種々の免疫検定フォーマットは、その検定が結合した
種の未結合種からの分離を必要とするかどうかによっ
て、さらに２つの群に大別される。不均質免疫検定はこ
のような精製を必要とし、したがって分離または単離工
程を含む。それに対して均質検定は、未結合種からの結
合種の除去が必要ないように設計されている。均質検定
は分離工程がなく、より自動化しやすいから、多数の患
者のスクリーニングを含む用途に用いることができる。
種の未結合種からの分離を必要とするかどうかによっ
て、さらに２つの群に大別される。不均質免疫検定はこ
のような精製を必要とし、したがって分離または単離工
程を含む。それに対して均質検定は、未結合種からの結
合種の除去が必要ないように設計されている。均質検定
は分離工程がなく、より自動化しやすいから、多数の患
者のスクリーニングを含む用途に用いることができる。
免疫検定の感度を低下させる１つの要因は、検定され
ている被検体の接近しにくさの程度である。膜結合性タ
ンパク質またはリポ糖のような被検体は抗体に非常に接
近しにくいことが多く、したがって生物学的サンプル中
にそれらが存在しても、検出を逃すかも知れない。この
問題の１つの部分的解決は、このような不溶性分子をデ
タージェントを用いて抽出することである。例えばボー
デン（Bowden,R.A.）らは、ブルセラ（Brucella）ワク
チン製剤の評価手段として、デタージェントで可溶化さ
れたリポ多糖のための濁度測定ラテックス阻止検定を論
じている（ボーデンら、J.Microbiol.Meth.16巻、297〜
306ページ、（1992））。酵素結合イムノソルベント検
定法におけるデタージェントの使用はゴールドリング
（Goldring,O.L.）が研究した（Immunoassay Techno
l.、２巻、189〜214ページ、（1986））。デタージェン
トはヒト免疫不全ウィルス（HIV）及びＢ型肝炎ウィル
スの免疫検定において、それらウィルスを不活性化し、
ヘルスケア専門家に対するその検定の危険性をより少な
くするためにも用いられている（ビブ（Bibb,W.）ら、A
bstr.Gen.Meet.Amer Soc.Microbiol.91巻、396ページ、
（1991））。デタージェントは凝集免疫検定において抗
原の固定を容易にするためにも用いられている（ドルセ
ット（Dorsett,P.H.）、米国特許第4,695,537号）。
ている被検体の接近しにくさの程度である。膜結合性タ
ンパク質またはリポ糖のような被検体は抗体に非常に接
近しにくいことが多く、したがって生物学的サンプル中
にそれらが存在しても、検出を逃すかも知れない。この
問題の１つの部分的解決は、このような不溶性分子をデ
タージェントを用いて抽出することである。例えばボー
デン（Bowden,R.A.）らは、ブルセラ（Brucella）ワク
チン製剤の評価手段として、デタージェントで可溶化さ
れたリポ多糖のための濁度測定ラテックス阻止検定を論
じている（ボーデンら、J.Microbiol.Meth.16巻、297〜
306ページ、（1992））。酵素結合イムノソルベント検
定法におけるデタージェントの使用はゴールドリング
（Goldring,O.L.）が研究した（Immunoassay Techno
l.、２巻、189〜214ページ、（1986））。デタージェン
トはヒト免疫不全ウィルス（HIV）及びＢ型肝炎ウィル
スの免疫検定において、それらウィルスを不活性化し、
ヘルスケア専門家に対するその検定の危険性をより少な
くするためにも用いられている（ビブ（Bibb,W.）ら、A
bstr.Gen.Meet.Amer Soc.Microbiol.91巻、396ページ、
（1991））。デタージェントは凝集免疫検定において抗
原の固定を容易にするためにも用いられている（ドルセ
ット（Dorsett,P.H.）、米国特許第4,695,537号）。
残念なことに、デタージェントの存在は被検体への接
近性を高めるとはいえ、それは免疫複合体形成の速度及
び程度を低下させる（ゴールドリング、Immunoassay Te
chnol.、２巻、189〜214ページ、（1986）；マッケイブ
（McCabe.J.P.）ら、J.Immunol.Meth.108巻、129〜135
ページ、（1988）；ヌールディン（Noorduyn,L.A.）、
J.Immunoassay、10巻、429〜448ページ、（1989））。
こうしてデタージェントの使用は著しく不都合な結果を
もたらす。
近性を高めるとはいえ、それは免疫複合体形成の速度及
び程度を低下させる（ゴールドリング、Immunoassay Te
chnol.、２巻、189〜214ページ、（1986）；マッケイブ
（McCabe.J.P.）ら、J.Immunol.Meth.108巻、129〜135
ページ、（1988）；ヌールディン（Noorduyn,L.A.）、
J.Immunoassay、10巻、429〜448ページ、（1989））。
こうしてデタージェントの使用は著しく不都合な結果を
もたらす。
免疫検定フォーマットには無関係に、被検体の検出に
おける免疫検定の有用性は、使用する抗体と、その存在
または濃度が測定されている被検体との間の免疫複合体
形成の程度を知らせる能力に依存する。一般的に、この
能力を高めるために２つの独立的アプローチが存在す
る。第１のアプローチは１つ以上の試薬の標識化を含
む。第２のアプローチは免疫複合体のサイズを大きくす
ることを含む。
おける免疫検定の有用性は、使用する抗体と、その存在
または濃度が測定されている被検体との間の免疫複合体
形成の程度を知らせる能力に依存する。一般的に、この
能力を高めるために２つの独立的アプローチが存在す
る。第１のアプローチは１つ以上の試薬の標識化を含
む。第２のアプローチは免疫複合体のサイズを大きくす
ることを含む。
免疫複合体の検出を容易にするために、広範囲の標識
（例えば放射性同位元素、酵素、蛍光基、化学ルミネセ
ンス基、またはビーズなどの肉眼的標識）が用いられて
いる（参照：リチャード（Chard,T.）ら：分子生物学の
実験法及び生化学（Laboratory Techniques and Bioche
mistry in Molecular Biology）（Wark.T.S.編）、Nort
h Holland Publishing Company,NY,（1978）；ケメニー
（Kemeny,D.M.）ら（編集）、ELISA及びその他の固相免
疫検定（ELISA and Other Solid Phase Immunoassay
s）、John Wiley ＆ Sons,N.Y,（1988））。放射性同位
元素は長い間免疫検定に用いられてきた。例えばオレア
リー（O'Leary,T.D.）らはジゴキシン血清濃度のための
放射性免疫検定（“RIA"）を記述した（オレアリーら、
Chin.Chem.,25巻、332〜334ページ、（1979））。RIAは
簡単、鋭敏及び使用し易いという利点をもつ。放射性標
識は比較的小さい原子寸法のものであり、通常は反応動
態に影響しない。しかしながらこのような検定では放射
性同位元素崩壊によって試薬の保存寿命が短く、特殊な
操作及び廃棄を必要とし、複雑で高価な分析用機器の使
用を伴うという欠点を有する。このような危険な材料を
取り扱う難しさ、及び放射性物質崩壊の問題が、その他
の標識を使用する免疫検定を発達させた。
（例えば放射性同位元素、酵素、蛍光基、化学ルミネセ
ンス基、またはビーズなどの肉眼的標識）が用いられて
いる（参照：リチャード（Chard,T.）ら：分子生物学の
実験法及び生化学（Laboratory Techniques and Bioche
mistry in Molecular Biology）（Wark.T.S.編）、Nort
h Holland Publishing Company,NY,（1978）；ケメニー
（Kemeny,D.M.）ら（編集）、ELISA及びその他の固相免
疫検定（ELISA and Other Solid Phase Immunoassay
s）、John Wiley ＆ Sons,N.Y,（1988））。放射性同位
元素は長い間免疫検定に用いられてきた。例えばオレア
リー（O'Leary,T.D.）らはジゴキシン血清濃度のための
放射性免疫検定（“RIA"）を記述した（オレアリーら、
Chin.Chem.,25巻、332〜334ページ、（1979））。RIAは
簡単、鋭敏及び使用し易いという利点をもつ。放射性標
識は比較的小さい原子寸法のものであり、通常は反応動
態に影響しない。しかしながらこのような検定では放射
性同位元素崩壊によって試薬の保存寿命が短く、特殊な
操作及び廃棄を必要とし、複雑で高価な分析用機器の使
用を伴うという欠点を有する。このような危険な材料を
取り扱う難しさ、及び放射性物質崩壊の問題が、その他
の標識を使用する免疫検定を発達させた。
特に、酵素は免疫検定フォーマットの標識として今や
広く用いられている。酵素結合免疫検定法（“ELISA"）
は、安価な装置を用いて、無数の異なる酵素で行うこと
ができ、したがって多数の検出法−−比色、pH、ガス発
生など−−を用いてその検定を定量化することができる
という利点を有する。加えて、酵素試薬は比較的長い保
存寿命をもち、RIA使用に存在する放射能汚染のリスク
がない。ELISAは、ここに参照して取り込まれる、“ELI
SA及びその他の固相免疫検定”（ケメニーら編）、John
Wiley ＆ Sons,NY,（1988）、に記載されている。生物
学的流体中の被検体の存在を分析するために多元酵素免
疫検定技術（EMIT 、Syva Co.）が用いられている。そ
の方法は，限られた量で存在する抗体上の結合部位への
被検体と被検体−酵素複合体との競争に基づく（コーン
（Cone,E.J.）ら、J.Forens.Sci.35巻、786〜781ペー
ジ、（1990）；ボー（Baugh,L.D.）ら、J.Forens.Sci.3
6巻、79〜85ページ、（1991）；スタンドファー（Stand
efer,J.C.）ら、Clin.Chem.37巻、733〜738ページ、（1
991）；シュワルツ（Schwartz,J.G.）ら、Amer.J.Emer
g.Med.9巻、166〜170ページ、（1991）；ヘルパー（Hel
per,B.）ら、Amer.J.Clin.Pathol.81巻、602〜610ペー
ジ、（1984）：キャンベル（Cambell,R.S.）ら、J.Cli
n.Chem.Clin.Biochem.24巻、155〜159ページ、（198
6）；カンナ（Khanna,P.）、米国特許第5,103,021
号）。
広く用いられている。酵素結合免疫検定法（“ELISA"）
は、安価な装置を用いて、無数の異なる酵素で行うこと
ができ、したがって多数の検出法−−比色、pH、ガス発
生など−−を用いてその検定を定量化することができる
という利点を有する。加えて、酵素試薬は比較的長い保
存寿命をもち、RIA使用に存在する放射能汚染のリスク
がない。ELISAは、ここに参照して取り込まれる、“ELI
SA及びその他の固相免疫検定”（ケメニーら編）、John
Wiley ＆ Sons,NY,（1988）、に記載されている。生物
学的流体中の被検体の存在を分析するために多元酵素免
疫検定技術（EMIT 、Syva Co.）が用いられている。そ
の方法は，限られた量で存在する抗体上の結合部位への
被検体と被検体−酵素複合体との競争に基づく（コーン
（Cone,E.J.）ら、J.Forens.Sci.35巻、786〜781ペー
ジ、（1990）；ボー（Baugh,L.D.）ら、J.Forens.Sci.3
6巻、79〜85ページ、（1991）；スタンドファー（Stand
efer,J.C.）ら、Clin.Chem.37巻、733〜738ページ、（1
991）；シュワルツ（Schwartz,J.G.）ら、Amer.J.Emer
g.Med.9巻、166〜170ページ、（1991）；ヘルパー（Hel
per,B.）ら、Amer.J.Clin.Pathol.81巻、602〜610ペー
ジ、（1984）：キャンベル（Cambell,R.S.）ら、J.Cli
n.Chem.Clin.Biochem.24巻、155〜159ページ、（198
6）；カンナ（Khanna,P.）、米国特許第5,103,021
号）。
酵素の他に、蛍光基が標識としてよく用いられる。蛍
光偏光免疫検定フォーマット（TDx 、Abbott Laborato
ries.Inc.）はEMIT フォーマットにほぼ等価であるこ
とが判明した（シュワルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、
166〜170、（1991）；コイズミ（Koizumi,F.）ら、Toho
ku J.Exper.Med.155巻、159ページ〜、（1988）；エジ
ンボロ（Edinboro,L.E.）ら、Clin.Toxicol.29巻、241
ページ〜、（1991）；オクロズズ（Okurodudu,A.O.）
ら、Clin.Chem.38巻、1040ページ、（1992）；オクロズ
ズら、Clin.Chem.38巻、1040ページ、（1992）；クロツ
（Klotz,U.）、Ther.Drug.Monitor.15巻、462〜464ペー
ジ、（1993））。ウォング（Wong,S.H.Y.）らは、自動
（OPUSTM）分析器を用いて、モノクローナル抗体により
仲介された、蛍光に基づく検定プロトコルにおいてジゴ
キシン濃度を測定したことを記述している（ウォング
ら、Clin.Chem.38巻、996ページ、（1992））。リーら
もジゴキシンレベルを検定するための蛍光偏光検定及び
化学ルミネッセンス検定フォーマットの使用を開示した
（リーら、Clin.Chem.36巻、1121ページ、（1990））。
光偏光免疫検定フォーマット（TDx 、Abbott Laborato
ries.Inc.）はEMIT フォーマットにほぼ等価であるこ
とが判明した（シュワルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、
166〜170、（1991）；コイズミ（Koizumi,F.）ら、Toho
ku J.Exper.Med.155巻、159ページ〜、（1988）；エジ
ンボロ（Edinboro,L.E.）ら、Clin.Toxicol.29巻、241
ページ〜、（1991）；オクロズズ（Okurodudu,A.O.）
ら、Clin.Chem.38巻、1040ページ、（1992）；オクロズ
ズら、Clin.Chem.38巻、1040ページ、（1992）；クロツ
（Klotz,U.）、Ther.Drug.Monitor.15巻、462〜464ペー
ジ、（1993））。ウォング（Wong,S.H.Y.）らは、自動
（OPUSTM）分析器を用いて、モノクローナル抗体により
仲介された、蛍光に基づく検定プロトコルにおいてジゴ
キシン濃度を測定したことを記述している（ウォング
ら、Clin.Chem.38巻、996ページ、（1992））。リーら
もジゴキシンレベルを検定するための蛍光偏光検定及び
化学ルミネッセンス検定フォーマットの使用を開示した
（リーら、Clin.Chem.36巻、1121ページ、（1990））。
前述のように、免疫検定において検定される免疫複合
体のサイズを大きくすることによって免疫検定感度を高
めることができる。免疫複合体が十分に大きい場合、そ
れは光を散乱することができ、または自発的に沈殿する
ことができる。このような場合、凝集または比濁または
濁度測定免疫検定法を用いることができる。比濁法は、
粒子の懸濁によって散乱される光、または光の直進路に
ない検出器の方に反射される光を測定する（スターンバ
ーグ（Sternberg,J.C.）、Clin.Chem.23巻、1456〜1464
ページ、（1977））。これに対して、濁度測定法は、粒
子または凝集物の懸濁液を透過する光の減少を測定す
る。その減少は凝集物による光の反射、散乱及び吸収に
よって起きる。比濁法でも濁度測定法でも、光散乱の変
化率も測定され、存在する抗原の量の指標となる。凝集
検定法は、抗体−抗原複合体の沈殿を測定する。このよ
うな検定は極めて鋭敏で、自動化しやすい。比濁法及び
濁度測定法では最初に存在する抗体を検定において形成
された免疫複合体から分離する必要がないから、このよ
うな検定は均質免疫検定である。コカインの凝集阻止検
定物は市販されているが（OnTrakTM,Hoffman−LaRoch
e）、上記の方法よりは実質的に非効率であるようであ
る（シュワルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166〜170ペ
ージ、（1991））。
体のサイズを大きくすることによって免疫検定感度を高
めることができる。免疫複合体が十分に大きい場合、そ
れは光を散乱することができ、または自発的に沈殿する
ことができる。このような場合、凝集または比濁または
濁度測定免疫検定法を用いることができる。比濁法は、
粒子の懸濁によって散乱される光、または光の直進路に
ない検出器の方に反射される光を測定する（スターンバ
ーグ（Sternberg,J.C.）、Clin.Chem.23巻、1456〜1464
ページ、（1977））。これに対して、濁度測定法は、粒
子または凝集物の懸濁液を透過する光の減少を測定す
る。その減少は凝集物による光の反射、散乱及び吸収に
よって起きる。比濁法でも濁度測定法でも、光散乱の変
化率も測定され、存在する抗原の量の指標となる。凝集
検定法は、抗体−抗原複合体の沈殿を測定する。このよ
うな検定は極めて鋭敏で、自動化しやすい。比濁法及び
濁度測定法では最初に存在する抗体を検定において形成
された免疫複合体から分離する必要がないから、このよ
うな検定は均質免疫検定である。コカインの凝集阻止検
定物は市販されているが（OnTrakTM,Hoffman−LaRoch
e）、上記の方法よりは実質的に非効率であるようであ
る（シュワルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166〜170ペ
ージ、（1991））。
大きい免疫複合体を産生する必要から、比濁、濁度測
定または凝集免疫検定の応用は、数個のエピトープを所
有する例えばタンパク質のような高分子量分子に限定さ
れていた。特に、多くの薬剤は一つのエピトープしかも
たないから、それらはこのような免疫検定に必要な大き
い免疫複合体を形成することができない。
定または凝集免疫検定の応用は、数個のエピトープを所
有する例えばタンパク質のような高分子量分子に限定さ
れていた。特に、多くの薬剤は一つのエピトープしかも
たないから、それらはこのような免疫検定に必要な大き
い免疫複合体を形成することができない。
この問題への１つのアプローチは、少なくとも２つの
共有結合したハプテン同族体（例えばウシ血清アルブミ
ン（“BSA"）のようなタンパク質担体）を含む多エピト
ープ種（またはデベロッパー抗原）により、抗体で被覆
された粒子を凝集することを含む（モングコルシリチャ
イカル（Mongkolsirichaikul,D.）ら、J.Immunol.Meth.
157巻、189〜195ページ、（1993））。凝集反応は多エ
ピトープ種またはデベロッパー抗原の使用を必要とす
る、なぜならばエピトープ部位を１つしかもたない分子
は２つの抗体を結合することができず、したがって２つ
の抗体を一緒に架橋することはできないからである。こ
のような架橋は大きい免疫複合体の形成には必須の工程
である。第２のアプローチはハプテンで被覆された粒子
の凝集を含む。
共有結合したハプテン同族体（例えばウシ血清アルブミ
ン（“BSA"）のようなタンパク質担体）を含む多エピト
ープ種（またはデベロッパー抗原）により、抗体で被覆
された粒子を凝集することを含む（モングコルシリチャ
イカル（Mongkolsirichaikul,D.）ら、J.Immunol.Meth.
157巻、189〜195ページ、（1993））。凝集反応は多エ
ピトープ種またはデベロッパー抗原の使用を必要とす
る、なぜならばエピトープ部位を１つしかもたない分子
は２つの抗体を結合することができず、したがって２つ
の抗体を一緒に架橋することはできないからである。こ
のような架橋は大きい免疫複合体の形成には必須の工程
である。第２のアプローチはハプテンで被覆された粒子
の凝集を含む。
どちらの方法でも、サンプル中のハプテンまたは薬剤
は抗体結合部位に競合的に結合し、免疫凝集の阻止また
は減少をおこす。ハプテンで被覆された粒子を用いる治
療薬及び濫用薬の粒子凝集検定物は市販されている。こ
のような検定物の例はPETINIATM（デュポン（Du Pon
t））及びアブスクリーンTM（AbuScreenTM）（ロッシュ
（Roche））、アドバイザーTM（AdvisorTM）（アボット
（Abbott））及びミツビシ（Mitsubishi）のものであ
る。
は抗体結合部位に競合的に結合し、免疫凝集の阻止また
は減少をおこす。ハプテンで被覆された粒子を用いる治
療薬及び濫用薬の粒子凝集検定物は市販されている。こ
のような検定物の例はPETINIATM（デュポン（Du Pon
t））及びアブスクリーンTM（AbuScreenTM）（ロッシュ
（Roche））、アドバイザーTM（AdvisorTM）（アボット
（Abbott））及びミツビシ（Mitsubishi）のものであ
る。
この問題の解決は最近、オー（Oh,C.S.）らの米国特
許第5,168,057号、ハリス（Harris,P,C,）らの米国特許
第5,196,351号，及びオーら：非同位体免疫検定（Nonis
otopic Immunoassay）、Ngo,T.T.（編）、Plenum Pres
s,NY,457〜476ページ（1988）（これらはすべて参照し
てここに取り込まれる）に記載され、二座配位子または
三座配位子被検体試薬の使用を含む。二座配位子免疫検
定法では、免疫複合体は２つの異なる結合反応によって
生成する。一方の反応は二座配位子のビオチンメンバー
の、抗ビオチン抗体（またはこのような抗体の断片）へ
の結合、またはストレプトアビジンまたはアビジンへの
結合を含む。もう一方の反応は抗被検体抗体の、二座配
位子の被検体メンバーに対する免疫反応である。抗体は
２つのハプテン結合部位をもち、アビジンは４つのビオ
チン結合部位をもつから、前記抗体、二座配位子試薬、
及びアビジンを一緒に混合した時に免疫複合体が形成さ
れる。免疫複合体の形成は速やかで、アビジンとビオチ
ンとの強い結合に加えて、アビジンの約35のリシン末端
の陽性電荷（pI 10）と関連するようである。この特異
的電荷促進−免疫沈降素反応がビオチン−アビジン法の
特異的特徴である。同様な条件下で、ストレプトアビジ
ン（pI ５）、または電荷が中和されたアビジンは高速
度で免疫沈降素反応を起こすことができない。
許第5,168,057号、ハリス（Harris,P,C,）らの米国特許
第5,196,351号，及びオーら：非同位体免疫検定（Nonis
otopic Immunoassay）、Ngo,T.T.（編）、Plenum Pres
s,NY,457〜476ページ（1988）（これらはすべて参照し
てここに取り込まれる）に記載され、二座配位子または
三座配位子被検体試薬の使用を含む。二座配位子免疫検
定法では、免疫複合体は２つの異なる結合反応によって
生成する。一方の反応は二座配位子のビオチンメンバー
の、抗ビオチン抗体（またはこのような抗体の断片）へ
の結合、またはストレプトアビジンまたはアビジンへの
結合を含む。もう一方の反応は抗被検体抗体の、二座配
位子の被検体メンバーに対する免疫反応である。抗体は
２つのハプテン結合部位をもち、アビジンは４つのビオ
チン結合部位をもつから、前記抗体、二座配位子試薬、
及びアビジンを一緒に混合した時に免疫複合体が形成さ
れる。免疫複合体の形成は速やかで、アビジンとビオチ
ンとの強い結合に加えて、アビジンの約35のリシン末端
の陽性電荷（pI 10）と関連するようである。この特異
的電荷促進−免疫沈降素反応がビオチン−アビジン法の
特異的特徴である。同様な条件下で、ストレプトアビジ
ン（pI ５）、または電荷が中和されたアビジンは高速
度で免疫沈降素反応を起こすことができない。
実際、抗体のＦ（ab）部分（すなわち抗体のハプテン
結合部位）とアビジンとの間の立体障害がアビジンの４
つのビオチン結合部位のいくつかをブロックすることが
できる。このようなブロックは免疫複合体形成の速度及
び程度を制限する。例えば、もしハプテンとビオチンと
の間のスペーサーの長さが約27Åよりも短かければ、ア
ビジンと抗体のFab部分との間の立体障害がアビジンの
４つのビオチン結合部位の２つをブロックする（オー
ら：非同位体免疫検定、Ngo,T.T.（編）、Plenum Pres
s,NY.457〜476ページ、（1988））。このようなブロッ
クは免疫複合体を直線状にする。上記直線状ポリマーは
濁度変化または光散乱をおこし、それはそれぞれ濁度測
定計または比濁計でモニターできる。もしサンプル中に
ハプテンが存在するならば、それは二座配位子試薬のハ
プテンメンバーと抗体を競合する。このような競合は免
疫複合体形成速度の低下に通ずる。こうして比濁測定ま
たは濁度測定応答の速度はサンプル中のハプテン濃度に
反比例する。オーら（米国特許第5,168,057号）及びハ
リスら（米国特許第5,196,351号）の方法の成功にもか
からわず、免疫検定の免疫複合体形成速度及びその結果
としての使用量に対する応答を両方ともさらに改善する
方法が、医学的に重要な薬剤の濃度測定のためのより効
率的及び効果的免疫検定法となるであろう。本発明は、
このような改良された免疫検定を行うための試薬及び方
法を提供する。
結合部位）とアビジンとの間の立体障害がアビジンの４
つのビオチン結合部位のいくつかをブロックすることが
できる。このようなブロックは免疫複合体形成の速度及
び程度を制限する。例えば、もしハプテンとビオチンと
の間のスペーサーの長さが約27Åよりも短かければ、ア
ビジンと抗体のFab部分との間の立体障害がアビジンの
４つのビオチン結合部位の２つをブロックする（オー
ら：非同位体免疫検定、Ngo,T.T.（編）、Plenum Pres
s,NY.457〜476ページ、（1988））。このようなブロッ
クは免疫複合体を直線状にする。上記直線状ポリマーは
濁度変化または光散乱をおこし、それはそれぞれ濁度測
定計または比濁計でモニターできる。もしサンプル中に
ハプテンが存在するならば、それは二座配位子試薬のハ
プテンメンバーと抗体を競合する。このような競合は免
疫複合体形成速度の低下に通ずる。こうして比濁測定ま
たは濁度測定応答の速度はサンプル中のハプテン濃度に
反比例する。オーら（米国特許第5,168,057号）及びハ
リスら（米国特許第5,196,351号）の方法の成功にもか
からわず、免疫検定の免疫複合体形成速度及びその結果
としての使用量に対する応答を両方ともさらに改善する
方法が、医学的に重要な薬剤の濃度測定のためのより効
率的及び効果的免疫検定法となるであろう。本発明は、
このような改良された免疫検定を行うための試薬及び方
法を提供する。
発明の要約：
本発明は、免疫複合体形成の速度を改善し、それによ
って処理量を改善し、且つ使用量に対する応答を所望の
検定感度に改善するために、免疫検定に組み込むことの
できるデタージェント及びその他の試薬に関するもので
ある。本発明はこのような改良された免疫検定法を行う
ための検定組成物及び方法をも包含する。
って処理量を改善し、且つ使用量に対する応答を所望の
検定感度に改善するために、免疫検定に組み込むことの
できるデタージェント及びその他の試薬に関するもので
ある。本発明はこのような改良された免疫検定法を行う
ための検定組成物及び方法をも包含する。
詳細には、本発明は試験サンプル中の標的被検体の存
在を測定する免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検抗体と、可溶
性の二座配位子試薬と、アビジン及びストレプトアビジ
ンからなるグループから選択されるビオチン結合剤と、
デタージェントとに試験サンプルを接触させることによ
り反応混合物を形成するステップであって、前記デター
ジェントは前記反応混合物中に約１％より高い選択され
た濃度で存在し、前記可溶性の二座配位子試薬は、ビオ
チンメンバーと、被検体メンバーと、スペーサーメンバ
ーとを含み、（ｉ）前記試薬のビオチンメンバーは、固
体支持体に固定された前記ビオチン結合剤と結合可能で
あり、（ii）前記二座配位子試薬の被検体メンバーは前
記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能であり、（ii
i）前記中間スペーサーメンバーは、前記被検体メンバ
ーが前記抗標的被検体抗体と結合し、同時に、前記ビオ
チンメンバーが前記ビオチン結合剤と結合することを可
能にするのに十分な長さがある、反応混合物形成するス
テップと、 （２）前記二座配位子試薬と、前記ビオチン結合剤と、
前記抗標的被検体抗体との間で複合体を形成することが
できるのに十分な条件下で前記反応混合物をインキュベ
ーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記試験サンプル中の前記標的被検体の存在を測定するス
テップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを異なる試験デタージェン
ト濃度で実施することにより決定される、試験サンプル
中の標的被検体の存在を測定する免疫検定方法を提供す
る。
在を測定する免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検抗体と、可溶
性の二座配位子試薬と、アビジン及びストレプトアビジ
ンからなるグループから選択されるビオチン結合剤と、
デタージェントとに試験サンプルを接触させることによ
り反応混合物を形成するステップであって、前記デター
ジェントは前記反応混合物中に約１％より高い選択され
た濃度で存在し、前記可溶性の二座配位子試薬は、ビオ
チンメンバーと、被検体メンバーと、スペーサーメンバ
ーとを含み、（ｉ）前記試薬のビオチンメンバーは、固
体支持体に固定された前記ビオチン結合剤と結合可能で
あり、（ii）前記二座配位子試薬の被検体メンバーは前
記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能であり、（ii
i）前記中間スペーサーメンバーは、前記被検体メンバ
ーが前記抗標的被検体抗体と結合し、同時に、前記ビオ
チンメンバーが前記ビオチン結合剤と結合することを可
能にするのに十分な長さがある、反応混合物形成するス
テップと、 （２）前記二座配位子試薬と、前記ビオチン結合剤と、
前記抗標的被検体抗体との間で複合体を形成することが
できるのに十分な条件下で前記反応混合物をインキュベ
ーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記試験サンプル中の前記標的被検体の存在を測定するス
テップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを異なる試験デタージェン
ト濃度で実施することにより決定される、試験サンプル
中の標的被検体の存在を測定する免疫検定方法を提供す
る。
また、本発明は、試験サンプル中の標的被検体の存在
を測定する免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、二
座配位子試薬と、デタージェントとに試験サンプルを接
触させることにより反応混合液を形成するステップであ
って、前記デタージェントは約１％より高い選択された
濃度で反応混合液中に存在し、前記可溶性の二座配位子
試薬は、ビオチンメンバーと、被検体メンバーと、該ビ
オチンメンバー及び被検体メンバーとの間のスペーサメ
ンバーとを含み、（ｉ）前記試薬のビオチンメンバー
は、アビジン及びストレプトアビジンからなるグループ
から選択され、固体支持体に固定された、ビオチン結合
剤と結合可能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検
体メンバーは前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能
であり、（iii）中間にある前記スペーサメンバーは、
前記被検体メンバーが前記抗標的被検体抗体と結合し、
同時に、前記ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤に
結合するのに十分な長さであり、（iv）前記二座配位子
試薬は前記ビオチン結合剤に結合している、反応混合液
を形成するステップと、 （２）前記二座配位子試薬と前記抗標的被検体抗体との
間で複合体が形成可能となるのに十分な条件下で、前記
反応混合液をインキュベーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記標的被検体の存在を測定するステップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを異なる試験デタージェン
ト濃度で実施することにより決定される、試験サンプル
中の標的被検体の存在を測定する免疫検定方法を提供す
る。
を測定する免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、二
座配位子試薬と、デタージェントとに試験サンプルを接
触させることにより反応混合液を形成するステップであ
って、前記デタージェントは約１％より高い選択された
濃度で反応混合液中に存在し、前記可溶性の二座配位子
試薬は、ビオチンメンバーと、被検体メンバーと、該ビ
オチンメンバー及び被検体メンバーとの間のスペーサメ
ンバーとを含み、（ｉ）前記試薬のビオチンメンバー
は、アビジン及びストレプトアビジンからなるグループ
から選択され、固体支持体に固定された、ビオチン結合
剤と結合可能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検
体メンバーは前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能
であり、（iii）中間にある前記スペーサメンバーは、
前記被検体メンバーが前記抗標的被検体抗体と結合し、
同時に、前記ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤に
結合するのに十分な長さであり、（iv）前記二座配位子
試薬は前記ビオチン結合剤に結合している、反応混合液
を形成するステップと、 （２）前記二座配位子試薬と前記抗標的被検体抗体との
間で複合体が形成可能となるのに十分な条件下で、前記
反応混合液をインキュベーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記標的被検体の存在を測定するステップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを異なる試験デタージェン
ト濃度で実施することにより決定される、試験サンプル
中の標的被検体の存在を測定する免疫検定方法を提供す
る。
また、本発明は、試験サンプル中の標的被検体の存在
を測定する均質免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、二
座配位子試薬と、該二座配位子試薬に結合可能でラテッ
クス粒子上に固定された二座配位子結合剤と、デタージ
ェントとに試験サンプルを接触させることにより反応混
合液を形成するステップであって、前記デタージェント
は約１％より高い選択された濃度で反応混合液中に存在
し、前記二座配位子試薬は、ビオチンメンバーと、被検
体メンバーと、スペーサメンバーとを含み、（ｉ）前記
試薬のビオチンメンバーは前記ビオチン結合剤に結合可
能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検体メンバー
は前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能であり、
（iii）中間にある前記スペーサメンバーは、前記被検
体メンバーが前記抗標的被検体抗体と結合し、同時に、
前記ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤に結合する
のに十分な長さである、反応混合液を形成するステップ
と、 （２）前記二座配位子試薬と、ラテックス粒子上に固定
された前記二座配位子結合剤と、前記抗標的被検体抗体
との複合体が形成可能となるのに十分な条件下で、前記
反応混合液をインキュベーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記標的被検体の存在を測定するステップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを少なくとも２つの異なる
試験デタージェント濃度で実施することにより決定さ
れ、 前記デタージェントは、アルキルポリオキシエチレン
エーテルと、アルキルフェニルポリオキシエチレンエー
テルと、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル
とからなるグループから選択される、試験サンプル中の
標的被検体の存在を測定する均質免疫検定方法を提供す
る。
を測定する均質免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、二
座配位子試薬と、該二座配位子試薬に結合可能でラテッ
クス粒子上に固定された二座配位子結合剤と、デタージ
ェントとに試験サンプルを接触させることにより反応混
合液を形成するステップであって、前記デタージェント
は約１％より高い選択された濃度で反応混合液中に存在
し、前記二座配位子試薬は、ビオチンメンバーと、被検
体メンバーと、スペーサメンバーとを含み、（ｉ）前記
試薬のビオチンメンバーは前記ビオチン結合剤に結合可
能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検体メンバー
は前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能であり、
（iii）中間にある前記スペーサメンバーは、前記被検
体メンバーが前記抗標的被検体抗体と結合し、同時に、
前記ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤に結合する
のに十分な長さである、反応混合液を形成するステップ
と、 （２）前記二座配位子試薬と、ラテックス粒子上に固定
された前記二座配位子結合剤と、前記抗標的被検体抗体
との複合体が形成可能となるのに十分な条件下で、前記
反応混合液をインキュベーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記標的被検体の存在を測定するステップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを少なくとも２つの異なる
試験デタージェント濃度で実施することにより決定さ
れ、 前記デタージェントは、アルキルポリオキシエチレン
エーテルと、アルキルフェニルポリオキシエチレンエー
テルと、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル
とからなるグループから選択される、試験サンプル中の
標的被検体の存在を測定する均質免疫検定方法を提供す
る。
前記デタージェントは約２％より高い濃度で存在する
場合がある。
場合がある。
前記デタージェントは、非イオン性デタージェント、
例えばアルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキル
フェニルポリオキシエチレンエーテル（特にトリトン−
XTM（Triton−XTM））、アシルポリオキシエチレンソル
ビタンエステル（特にツイーン−20TM（Tween−2
0TM））などである場合がある。
例えばアルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキル
フェニルポリオキシエチレンエーテル（特にトリトン−
XTM（Triton−XTM））、アシルポリオキシエチレンソル
ビタンエステル（特にツイーン−20TM（Tween−2
0TM））などである場合がある。
前記固定支持体は、ラテックス支持体、例えば直径約
60nmの、カルボキシレートで改質されたラテックス粒子
などである場合がある。
60nmの、カルボキシレートで改質されたラテックス粒子
などである場合がある。
前記免疫検定方法は自動化または半自動化サンプル希
釈能力のない検定処理装置を用いて行われる場合があ
る。
釈能力のない検定処理装置を用いて行われる場合があ
る。
前記標的被検体は、フェニトインまたはフェノバルビ
タールなどの薬剤である場合があり、前記検定はサンプ
ル中の前記薬剤を検出できるような検定である場合があ
る。
タールなどの薬剤である場合があり、前記検定はサンプ
ル中の前記薬剤を検出できるような検定である場合があ
る。
本発明は、ｉ）前記標的被検体がフェニトインで、i
i）前記第１の較正濃度が約2.5μg/mlで、iii）前記第
２の較正濃度が約40μg/mlである、免疫検定方法の実施
態様にも向けられる。
i）前記第１の較正濃度が約2.5μg/mlで、iii）前記第
２の較正濃度が約40μg/mlである、免疫検定方法の実施
態様にも向けられる。
本発明は、ｉ）前記標的被検体がフェノバルビタール
で、ii）前記第１の較正濃度が約５μg/mlで、iii）前
記第２の較正濃度が約80μg/mlである、免疫検定方法の
実施態様にも向けられる。
で、ii）前記第１の較正濃度が約５μg/mlで、iii）前
記第２の較正濃度が約80μg/mlである、免疫検定方法の
実施態様にも向けられる。
本発明は、前記固体支持体が、約38nmから約100nmま
での直径を有する粒子である、免疫検定方法の実施態様
にも向けられる。
での直径を有する粒子である、免疫検定方法の実施態様
にも向けられる。
本発明は、前記粒子が約60nmの直径を有する、免疫検
定方法の実施態様にも向けられる。
定方法の実施態様にも向けられる。
本発明は、前記固体支持体がラテックスである、免疫
検定方法の実施態様にも向けられる。
検定方法の実施態様にも向けられる。
本発明は、前記ラテックス粒子に熱応力が加えられて
いる、免疫検定方法の実施態様にも向けられる。
いる、免疫検定方法の実施態様にも向けられる。
本発明は前記二座配位子結合剤が、アビジン及びスト
レプトアビジンからなるグループから選択される、免疫
検定方法の実施態様にも向けられる。
レプトアビジンからなるグループから選択される、免疫
検定方法の実施態様にも向けられる。
図面の簡単な説明：
図１はフェニトイン−ビオチン二座配位子の合成を示
す説明図である。
す説明図である。
好ましい実施態様の説明：
本発明は、サンプル中のあらかじめ選択された剤の濃
度を最適な感度及びより速い速度で測定するための免疫
検定フォーマットに使用することができ、それによりよ
り効率的な免疫検定を提供する、改良された検定法及び
試薬に関するものである。本発明は薬剤などの低分子量
被検体を検出及び定量する免疫検定に特に適する。本発
明の方法は、そのため、小ハプテン被検体、例えばベン
ゾイルエクゴニン、コカイン、ジゴキシゲニン、プリミ
ドン、アセタミノフェン、バンコマイシン、アヘン類、
カンナビノイド類、テオフィリン、フェノバルビトー
ル、ミノグリコシド抗生物質、フェニトイン、キニジ
ン、カルバマゼピンなどの検定に特に適している。
度を最適な感度及びより速い速度で測定するための免疫
検定フォーマットに使用することができ、それによりよ
り効率的な免疫検定を提供する、改良された検定法及び
試薬に関するものである。本発明は薬剤などの低分子量
被検体を検出及び定量する免疫検定に特に適する。本発
明の方法は、そのため、小ハプテン被検体、例えばベン
ゾイルエクゴニン、コカイン、ジゴキシゲニン、プリミ
ドン、アセタミノフェン、バンコマイシン、アヘン類、
カンナビノイド類、テオフィリン、フェノバルビトー
ル、ミノグリコシド抗生物質、フェニトイン、キニジ
ン、カルバマゼピンなどの検定に特に適している。
本発明の免疫検定を用いて、生物学的サンプル（例え
ば血液、血清、痰、尿、脳脊髄液（CSF）など）並びに
法廷サンプル（例えば衣服、化学的残留物、埃または粉
末など）中の被検体の存在又は濃度を検定することがで
きる。
ば血液、血清、痰、尿、脳脊髄液（CSF）など）並びに
法廷サンプル（例えば衣服、化学的残留物、埃または粉
末など）中の被検体の存在又は濃度を検定することがで
きる。
最も好ましい実施態様において、本発明の免疫検定は
モノクローナル抗体を用いる。最も好適には、抗原性タ
ンパク質に結合させた関心とする被検体、またはアジュ
バントと組み合わせた関心とする被検体でマウスを免疫
し、その動物の脾臓白血球を収穫し、それらを適当な骨
髄腫細胞と融合させることによってこのような抗体を生
成する。一実施態様では、このようなモノクローナル抗
体を免疫検定フォーマットに直接用いることができる。
別法として、このような抗体を開裂または処理して、被
検体に結合する能力が保持されているフラグメントを形
成してもよい。このようなフラグメントの例には（Ｆ
（ab'）、Ｆ（ab'）２フラグメントが含まれる。
モノクローナル抗体を用いる。最も好適には、抗原性タ
ンパク質に結合させた関心とする被検体、またはアジュ
バントと組み合わせた関心とする被検体でマウスを免疫
し、その動物の脾臓白血球を収穫し、それらを適当な骨
髄腫細胞と融合させることによってこのような抗体を生
成する。一実施態様では、このようなモノクローナル抗
体を免疫検定フォーマットに直接用いることができる。
別法として、このような抗体を開裂または処理して、被
検体に結合する能力が保持されているフラグメントを形
成してもよい。このようなフラグメントの例には（Ｆ
（ab'）、Ｆ（ab'）２フラグメントが含まれる。
デタージェント、またはデタージェントの混合物を免
疫検定反応へ組み合わせたことによって、本発明の検定
使用量に対する応答の改善及びそれに伴う反応速度の増
加が予期せずに起こる。上記のように、これまでデター
ジェントは例えば膜結合及びその他の不溶性抗原を可溶
化するために免疫検定に用いられていたが、このような
使用は検定効率を低下させることがわかった（ゴールド
リング（Goldring,O.L.）、Immunoassay Technol.2巻、
189〜214ページ、（1986））。マッケイブら（J.Immuno
l.Meth.108巻、129〜135ページ、（1988））は、免疫検
定におけるトリトンXTMまたはオクチルｂ−グルコシド
デタージェントの過剰の存在は、マイクロタイタープレ
ートの結合部位のブロックによってELISAを妨害すると
報告した。その研究では、デタージェント濃度を約3mM
から約300mMに増加すると、検定感度は85分の１に低下
した。特に、ミセル形成の促進に必要な濃度（“CMC"濃
度）よりも可剰のデタージェント濃度は不都合であるこ
とがわかった。トリトンXTMのような非イオン性デター
ジェントでは水中または緩衝液（2Mトリス、pH10.2）中
のCMCは約23mMである（マッケイブら、J.Immunol.Meth.
108巻、129〜135ページ、（1988））。ヌールディン
（J.Immunoassay 10巻、429〜448ページ、（1989））
は、約0.5％（w/v）を中心とした狭い濃度範囲で用いた
場合に限りオクチルｂ−グルコシドは免疫検定感度を２
〜４倍増加させる、と報告した。約0.07％（w/v）を中
心とする濃度のデゾキシコール酸ナトリウムを用いて、
同様な改善が観察された。
疫検定反応へ組み合わせたことによって、本発明の検定
使用量に対する応答の改善及びそれに伴う反応速度の増
加が予期せずに起こる。上記のように、これまでデター
ジェントは例えば膜結合及びその他の不溶性抗原を可溶
化するために免疫検定に用いられていたが、このような
使用は検定効率を低下させることがわかった（ゴールド
リング（Goldring,O.L.）、Immunoassay Technol.2巻、
189〜214ページ、（1986））。マッケイブら（J.Immuno
l.Meth.108巻、129〜135ページ、（1988））は、免疫検
定におけるトリトンXTMまたはオクチルｂ−グルコシド
デタージェントの過剰の存在は、マイクロタイタープレ
ートの結合部位のブロックによってELISAを妨害すると
報告した。その研究では、デタージェント濃度を約3mM
から約300mMに増加すると、検定感度は85分の１に低下
した。特に、ミセル形成の促進に必要な濃度（“CMC"濃
度）よりも可剰のデタージェント濃度は不都合であるこ
とがわかった。トリトンXTMのような非イオン性デター
ジェントでは水中または緩衝液（2Mトリス、pH10.2）中
のCMCは約23mMである（マッケイブら、J.Immunol.Meth.
108巻、129〜135ページ、（1988））。ヌールディン
（J.Immunoassay 10巻、429〜448ページ、（1989））
は、約0.5％（w/v）を中心とした狭い濃度範囲で用いた
場合に限りオクチルｂ−グルコシドは免疫検定感度を２
〜４倍増加させる、と報告した。約0.07％（w/v）を中
心とする濃度のデゾキシコール酸ナトリウムを用いて、
同様な改善が観察された。
このような研究に対して、デタージェント（１つまた
は複数）との組み合わせが、反応速度に悪影響を与える
ことなく検定の使用量に対する応答を改善し、それによ
って標準化試薬を用いることができる自動免疫検定の開
発を容易にすることが見出された。本発明の方法によっ
て用いられるデタージェントには陰イオン性デタージェ
ント、陽イオン性デタージェント（１つまたは複数）、
両性イオン性デタージェント及び非イオン性デタージェ
ントが含まれる。それらデタージェントは検定緩衝液ま
たは抗体希釈液またはその他の免疫検定試薬の希釈液に
加えられてもよい。
は複数）との組み合わせが、反応速度に悪影響を与える
ことなく検定の使用量に対する応答を改善し、それによ
って標準化試薬を用いることができる自動免疫検定の開
発を容易にすることが見出された。本発明の方法によっ
て用いられるデタージェントには陰イオン性デタージェ
ント、陽イオン性デタージェント（１つまたは複数）、
両性イオン性デタージェント及び非イオン性デタージェ
ントが含まれる。それらデタージェントは検定緩衝液ま
たは抗体希釈液またはその他の免疫検定試薬の希釈液に
加えられてもよい。
適した陰イオン性デタージェントはドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）（プラムリー（Plumley,F.G.）ら、Anal.
Biochem.134巻、86〜95ページ、（1983）；カンマー（K
ammer,K.,Immunol.48巻:799〜808ページ、（1983））、
ドデシルスルホン酸ナトリウム（ヘレニウス（Heleniu
s,A.）ら、Biochem.Biophys.Acta 415巻、28〜79ペー
ジ、（1975））、デゾキシコール酸ナトリウム（ヘレニ
ウスら、Enzymol.56巻、734〜749ページ、（1979）；な
ど）を含む。適した陽イオン性デタージェントはセチル
トリメチルアンモニウム ブロミド（CTAB）（カンマ
ー、Immunol.48巻、799〜808ページ、（1983））などを
含む。適した両性イオン性デタージェントの例は：ツウ
ィッタージェントTM（ZwittergentTM）（カルビオケム
−ベーリング ディアグノスティックス社（Calbiochem
−Behring Diagnostics,Inc.））、CHAPS（パーデュー
（Pardew,G.H.）ら、Anal.Biochem.135巻、453〜455ペ
ージ、（1985））、リゾホスホリピド類（ヘレニウス
ら、Enzymol、56巻、734〜749ページ、（1979））など
である。
リウム（SDS）（プラムリー（Plumley,F.G.）ら、Anal.
Biochem.134巻、86〜95ページ、（1983）；カンマー（K
ammer,K.,Immunol.48巻:799〜808ページ、（1983））、
ドデシルスルホン酸ナトリウム（ヘレニウス（Heleniu
s,A.）ら、Biochem.Biophys.Acta 415巻、28〜79ペー
ジ、（1975））、デゾキシコール酸ナトリウム（ヘレニ
ウスら、Enzymol.56巻、734〜749ページ、（1979）；な
ど）を含む。適した陽イオン性デタージェントはセチル
トリメチルアンモニウム ブロミド（CTAB）（カンマ
ー、Immunol.48巻、799〜808ページ、（1983））などを
含む。適した両性イオン性デタージェントの例は：ツウ
ィッタージェントTM（ZwittergentTM）（カルビオケム
−ベーリング ディアグノスティックス社（Calbiochem
−Behring Diagnostics,Inc.））、CHAPS（パーデュー
（Pardew,G.H.）ら、Anal.Biochem.135巻、453〜455ペ
ージ、（1985））、リゾホスホリピド類（ヘレニウス
ら、Enzymol、56巻、734〜749ページ、（1979））など
である。
非イオン性デタージェントは本発明の好ましいデター
ジェントである。適した非イオン性デタージェントの例
はアルキルポリオキシエチレンエーテル類（例えばBRIJ
TM（アトラス ケミカル インダストリーズ社（Atlas
Chemical Industries,Inc.））；エマルフォジェン
TM（emulphogeneTM）（GAF Corp.）、PXTM（Lubrol 12
A9:ICI）、WXTM（Lubrol 17 A17:ICI）など）、ア
ルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル類（例えば
トリトンXTM（Triton XTM）（ロームアンドハース社（R
ohm and Haas Company））、オクチルｂ−グルコシド
類、Nonided 40TM（Schlesinger Chemical Mfg.Compan
y）、TergitolTM（ユニオンカーバイド社（Union Carbi
de Corp.））;IgepalTM（GAF Corp.）など）、及びアシ
ルポリオキシエチレンソルビタンエステル類（例えばツ
イーン20TM（Tween 20TM）アトラス ケミカル インダ
ストリーズ社）など）を含む。アルキルフェニルポリオ
キシエチレンエーテル類は特に好ましい。トリトンXTM
（ロームアンドハース社）は本発明の最も好ましいデタ
ージェントである。
ジェントである。適した非イオン性デタージェントの例
はアルキルポリオキシエチレンエーテル類（例えばBRIJ
TM（アトラス ケミカル インダストリーズ社（Atlas
Chemical Industries,Inc.））；エマルフォジェン
TM（emulphogeneTM）（GAF Corp.）、PXTM（Lubrol 12
A9:ICI）、WXTM（Lubrol 17 A17:ICI）など）、ア
ルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル類（例えば
トリトンXTM（Triton XTM）（ロームアンドハース社（R
ohm and Haas Company））、オクチルｂ−グルコシド
類、Nonided 40TM（Schlesinger Chemical Mfg.Compan
y）、TergitolTM（ユニオンカーバイド社（Union Carbi
de Corp.））;IgepalTM（GAF Corp.）など）、及びアシ
ルポリオキシエチレンソルビタンエステル類（例えばツ
イーン20TM（Tween 20TM）アトラス ケミカル インダ
ストリーズ社）など）を含む。アルキルフェニルポリオ
キシエチレンエーテル類は特に好ましい。トリトンXTM
（ロームアンドハース社）は本発明の最も好ましいデタ
ージェントである。
このようなデタージェントを含むことにより、免疫検
定の感度を調節でき、それによってより望ましい反応速
度及び使用量に対する応答を示す検定法を得ることがで
きる。免疫検定のために特に“望ましい検定パラメータ
ー”のセットは、次のように表されるものである； （１）被検体濃度 ０μg/mlで、約0.2Δ（O.D.単位）
／分より大きい速度（用語“O.D."は光学濃度または吸
光度を意味する）。
定の感度を調節でき、それによってより望ましい反応速
度及び使用量に対する応答を示す検定法を得ることがで
きる。免疫検定のために特に“望ましい検定パラメータ
ー”のセットは、次のように表されるものである； （１）被検体濃度 ０μg/mlで、約0.2Δ（O.D.単位）
／分より大きい速度（用語“O.D."は光学濃度または吸
光度を意味する）。
（２）最大較正濃度で、約0.02Δ（O.D.単位）／分より
大きい反応速度。
大きい反応速度。
（３）ゼロでない最低較正濃度で約75〜85％、最高較正
濃度では25％より小さい使用量に対する応答（“％B/
B0"によって表される）。用語“％B/B0"は特定濃度にお
ける速度の初速度に対する比のパーセントを示す。
濃度では25％より小さい使用量に対する応答（“％B/
B0"によって表される）。用語“％B/B0"は特定濃度にお
ける速度の初速度に対する比のパーセントを示す。
（４）生理的またはその他の関係した検定測定範囲全域
にわたって被検体濃度を測定する能力。
にわたって被検体濃度を測定する能力。
デタージェント（１または複数）を免疫検定反応に含
めると、これらの所望のパラメーターを示す免疫検定を
規定することができる。
めると、これらの所望のパラメーターを示す免疫検定を
規定することができる。
デタージェントの使用による改善はすべての免疫検定
フォーマットに適用される一般的なものであるとはい
え、デタージェント（１または複数）の使用は比濁及び
濁度測定免疫検定、例えばオーら（米国特許第5,168,05
7号）、ハリスら（米国特許第5,196,351号）の検定法な
どに特に適している。このような比濁及び濁度測定検定
では、分析される被検体とは関係なく、比較できる速度
及び使用量に対する応答を与える反応条件を用いるのが
望ましい。自動処理器を用いる場合は特にこのようなも
のが所望である。
フォーマットに適用される一般的なものであるとはい
え、デタージェント（１または複数）の使用は比濁及び
濁度測定免疫検定、例えばオーら（米国特許第5,168,05
7号）、ハリスら（米国特許第5,196,351号）の検定法な
どに特に適している。このような比濁及び濁度測定検定
では、分析される被検体とは関係なく、比較できる速度
及び使用量に対する応答を与える反応条件を用いるのが
望ましい。自動処理器を用いる場合は特にこのようなも
のが所望である。
“薬剤の迅速定量検定のための試薬及び方法（REAGEN
TS AND METHODS FOR THE RAPID AND QUANTITATIVE ASSA
Y OF PHARMACOLOGICAL AGENTS）”と題して1994年５月2
3日に出願されたチェング ヤン（Cheng Yan）、チャン
エス． オー（Chan S.Oh）及びアンソニー チェン
グ（Anthony Cheng）の米国特許出願第248,479号（参照
してここに完全に取り込まれる）に記載されているよう
に、オー（Oh,C.S.）ら（米国特許第5,168,057号）及び
ハリスら（米国特許第5,196,351号）の免疫検定の効率
は、アビジンのようなビオチン結合剤で標識した粒子の
使用によってさらに改善できる。本発明の方法を用いて
このような免疫検定を改善することができる。特に、そ
れらを用いてヤン（Yan,C.）らが記載したようなハプテ
ン被検体のための新規な２−部位または“サンドイッ
チ”免疫検定の検定パラメーターを改善することができ
る。サンドイッチ検定では、反応の一成分（抗原、また
はその抗原に結合する抗体のどちらか）が第２の抗体に
よって結合するようになる（すなわち“サンドイッチを
形成する”）。ヤンらのサンドイッチ検定では、二座配
位子試薬は（その被検体メンバー及びそのビオチンメン
バーの結合によって）抗被検体抗体及びビオチン結合分
子によって“サンドイッチ”になる。重要なことは、こ
のような構造が単一の抗体種のみを用いて形成される、
という点で従来の“サンドイッチ”検定で生成する構造
とは異なることである。
TS AND METHODS FOR THE RAPID AND QUANTITATIVE ASSA
Y OF PHARMACOLOGICAL AGENTS）”と題して1994年５月2
3日に出願されたチェング ヤン（Cheng Yan）、チャン
エス． オー（Chan S.Oh）及びアンソニー チェン
グ（Anthony Cheng）の米国特許出願第248,479号（参照
してここに完全に取り込まれる）に記載されているよう
に、オー（Oh,C.S.）ら（米国特許第5,168,057号）及び
ハリスら（米国特許第5,196,351号）の免疫検定の効率
は、アビジンのようなビオチン結合剤で標識した粒子の
使用によってさらに改善できる。本発明の方法を用いて
このような免疫検定を改善することができる。特に、そ
れらを用いてヤン（Yan,C.）らが記載したようなハプテ
ン被検体のための新規な２−部位または“サンドイッ
チ”免疫検定の検定パラメーターを改善することができ
る。サンドイッチ検定では、反応の一成分（抗原、また
はその抗原に結合する抗体のどちらか）が第２の抗体に
よって結合するようになる（すなわち“サンドイッチを
形成する”）。ヤンらのサンドイッチ検定では、二座配
位子試薬は（その被検体メンバー及びそのビオチンメン
バーの結合によって）抗被検体抗体及びビオチン結合分
子によって“サンドイッチ”になる。重要なことは、こ
のような構造が単一の抗体種のみを用いて形成される、
という点で従来の“サンドイッチ”検定で生成する構造
とは異なることである。
ヤンらの方法にしたがって用いられる粒子は、好まし
くはラテックスから作られる巨視（肉眼）的粒子であ
る。このような巨視的粒子の使用により、光散乱または
反射の認識できる変化を得るために必要な複合体形成の
程度を低下させる。こうして、巨視的粒子が存在するこ
とにより、さもなければ小さすぎて検出できない免疫複
合体が容易に測定できる。前記粒子の存在は、検出可能
な複合体形成の速度にも、比濁法または濁度測定法を用
いて検出できる被検体の下限にも影響を与える。
くはラテックスから作られる巨視（肉眼）的粒子であ
る。このような巨視的粒子の使用により、光散乱または
反射の認識できる変化を得るために必要な複合体形成の
程度を低下させる。こうして、巨視的粒子が存在するこ
とにより、さもなければ小さすぎて検出できない免疫複
合体が容易に測定できる。前記粒子の存在は、検出可能
な複合体形成の速度にも、比濁法または濁度測定法を用
いて検出できる被検体の下限にも影響を与える。
ラテックス粒子のサイズは50nm未満から100μｍより
大きいサイズまで変動し得る。小さい粒子（38〜100n
m）の使用は、比濁法または濁度測定法により被検体濃
度を測定する免疫検定には好ましい。このような免疫検
定においては60〜100nm粒子の使用が特に好ましい。こ
のような粒子はセラジン社（Seradyn,Inc.）（Indianap
olis,IN,US）から購入できる。各60nm粒子は平均約10,0
00のカルボキシル基を含み、各100nm粒子は共有結合に
使用できる約25,000の基を含む。
大きいサイズまで変動し得る。小さい粒子（38〜100n
m）の使用は、比濁法または濁度測定法により被検体濃
度を測定する免疫検定には好ましい。このような免疫検
定においては60〜100nm粒子の使用が特に好ましい。こ
のような粒子はセラジン社（Seradyn,Inc.）（Indianap
olis,IN,US）から購入できる。各60nm粒子は平均約10,0
00のカルボキシル基を含み、各100nm粒子は共有結合に
使用できる約25,000の基を含む。
カルボキシル化されたラテックス粒子へのアビジンの
最適な結合は、アビジンのラテックスに対する比、反応
媒体のpHのモニター、及びデタージェントを含むことに
よって達成される。好ましい結合手段は２つの工程を含
む：カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド
でカルボキシル基を活性化し、その後アビジンと反応さ
せる。アビジンの等電点（pI）は10であるから、反応の
第２工程のpHは若干塩基性に保持するのが好ましい（pH
8.5〜９）。このような条件は、十分な数のアビジン分
子が遊離塩基型のままであり、したがってラテックス粒
子上の活性化されたカルボキシル化された基との求核反
応に確実に利用できる。pH8以下では、ラテックス粒子
はアビジンを加えるやいなや凝集し始める。低pHでは、
多分アビジンとラテックス粒子との間の電荷の相互作用
のために、または物理的吸着によりアビジンで粒子が捕
捉されるために、若干の凝集が起こる。pH8.5〜９にお
ける粒子のアビジンによる過負荷も粒子の凝集をおこし
得る。デタージェントとしてツイーン−20を反応混合物
中0.13％で用いる場合、セラジン社から入手した60nm粒
子に結合させるためには、ラテックス粒子１個あたり総
計150分子のアビジンが最適であることが判明した。よ
り多いツイーン−20を用いない限り、この量を超えるア
ビジンは不都合にも粒子の凝集を引きおこすことがあ
る。100nm粒子はより大きい表面積をもち、ラテックス
単位重量あたりのカルボキシル含量がより低いにもかか
わらず、60nm粒子の約２倍の数のカルボキシル基を有す
る。100nm粒子では、粒子あたり700ものアビジン分子を
結合反応に使用することができる。
最適な結合は、アビジンのラテックスに対する比、反応
媒体のpHのモニター、及びデタージェントを含むことに
よって達成される。好ましい結合手段は２つの工程を含
む：カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド
でカルボキシル基を活性化し、その後アビジンと反応さ
せる。アビジンの等電点（pI）は10であるから、反応の
第２工程のpHは若干塩基性に保持するのが好ましい（pH
8.5〜９）。このような条件は、十分な数のアビジン分
子が遊離塩基型のままであり、したがってラテックス粒
子上の活性化されたカルボキシル化された基との求核反
応に確実に利用できる。pH8以下では、ラテックス粒子
はアビジンを加えるやいなや凝集し始める。低pHでは、
多分アビジンとラテックス粒子との間の電荷の相互作用
のために、または物理的吸着によりアビジンで粒子が捕
捉されるために、若干の凝集が起こる。pH8.5〜９にお
ける粒子のアビジンによる過負荷も粒子の凝集をおこし
得る。デタージェントとしてツイーン−20を反応混合物
中0.13％で用いる場合、セラジン社から入手した60nm粒
子に結合させるためには、ラテックス粒子１個あたり総
計150分子のアビジンが最適であることが判明した。よ
り多いツイーン−20を用いない限り、この量を超えるア
ビジンは不都合にも粒子の凝集を引きおこすことがあ
る。100nm粒子はより大きい表面積をもち、ラテックス
単位重量あたりのカルボキシル含量がより低いにもかか
わらず、60nm粒子の約２倍の数のカルボキシル基を有す
る。100nm粒子では、粒子あたり700ものアビジン分子を
結合反応に使用することができる。
ラテックス粒子をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び
カルボジイミドの存在下で４℃でインキュベートするこ
とにより、アビジン標識された粒子を作ることができ
る。それから混合物のpHを約9.0に高め、アビジンを加
える。ラテックス−アビジン複合体は、好ましくは透析
により結合試薬を除去した後に、クロマトグラフィー手
段（例えばセファロース（Sepharose）CL−6B精製、ま
たは孔の大きい膜を用いる限外濾過など）によって回収
される。
カルボジイミドの存在下で４℃でインキュベートするこ
とにより、アビジン標識された粒子を作ることができ
る。それから混合物のpHを約9.0に高め、アビジンを加
える。ラテックス−アビジン複合体は、好ましくは透析
により結合試薬を除去した後に、クロマトグラフィー手
段（例えばセファロース（Sepharose）CL−6B精製、ま
たは孔の大きい膜を用いる限外濾過など）によって回収
される。
これらの試薬を結合するための特に好適な方法では、
カルボキシル化ラテックスを約0.1M［３（Ｎ−モルフォ
リノ）］プロパンスルホン酸（“MOPS"）（pH6.0）、約
0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタン（“ツイー
ン−20"）（pH6）の溶液に懸濁する。その懸濁液を約４
℃に冷やし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 63mg/ml
を含む冷0.1M MOPS（pH6）を1/9容量加える。それから
水溶液カルボジイミド46mg/mlを含む0.1M MOPS（pH6）
を1/10容量加える。得られる混合物をその後pH5.5〜６
に調節し、約４℃で約１時間撹拌する。その後pHを約９
に高め、それら反応物と溶解アビジン約0.6mg/mlを含む
冷0.02Mホウ酸塩緩衝液（pH9）約２容量とをさらに５時
間反応させる。
カルボキシル化ラテックスを約0.1M［３（Ｎ−モルフォ
リノ）］プロパンスルホン酸（“MOPS"）（pH6.0）、約
0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタン（“ツイー
ン−20"）（pH6）の溶液に懸濁する。その懸濁液を約４
℃に冷やし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 63mg/ml
を含む冷0.1M MOPS（pH6）を1/9容量加える。それから
水溶液カルボジイミド46mg/mlを含む0.1M MOPS（pH6）
を1/10容量加える。得られる混合物をその後pH5.5〜６
に調節し、約４℃で約１時間撹拌する。その後pHを約９
に高め、それら反応物と溶解アビジン約0.6mg/mlを含む
冷0.02Mホウ酸塩緩衝液（pH9）約２容量とをさらに５時
間反応させる。
それからBSAを最終濃度約2mg/mlになるように加え、
その溶液を約４℃で１晩撹拌する。このインキュベーシ
ョン後、ラテックス−アビジン混合物を0.2％ツイーン
−20を含む0.02M トリス（pH9）緩衝液（３回交換）に
対して1.5日間透析し、セファロースCL−6Bカラム通過
により、またはその他の手段（ペリコン カセット シ
ステム（Pellicon Cassette System）（PCS）など）及
び分子量カットオフ（MWCO）300kをもつ膜によって精製
する。このようなアビジン標識粒子を、ビオチニル化二
座配位子試薬を用いるここに記載される免疫検定フォー
マットのいづれかと組み合わせて用いてもよい。
その溶液を約４℃で１晩撹拌する。このインキュベーシ
ョン後、ラテックス−アビジン混合物を0.2％ツイーン
−20を含む0.02M トリス（pH9）緩衝液（３回交換）に
対して1.5日間透析し、セファロースCL−6Bカラム通過
により、またはその他の手段（ペリコン カセット シ
ステム（Pellicon Cassette System）（PCS）など）及
び分子量カットオフ（MWCO）300kをもつ膜によって精製
する。このようなアビジン標識粒子を、ビオチニル化二
座配位子試薬を用いるここに記載される免疫検定フォー
マットのいづれかと組み合わせて用いてもよい。
二座配位子に結合する前のラテックス−アビジンまた
はラテックス−アビジン−二座配位子複合体そのものに
３〜６日間45℃で熱応力を加えると、使用量に対する応
答がより大きくなるという点から、免疫反応性及び検定
感度は高まる。
はラテックス−アビジン−二座配位子複合体そのものに
３〜６日間45℃で熱応力を加えると、使用量に対する応
答がより大きくなるという点から、免疫反応性及び検定
感度は高まる。
ヤンらが米国特許出願第248,479号に記載したよう
に、粒子強化免疫検定の２つの実施態様が特に好まし
い:3−試薬系、及び２−試薬系。これらの実施態様はア
ビジンに関して記載されているが、上記のようにその他
のビオチン結合剤を用いてもよい。
に、粒子強化免疫検定の２つの実施態様が特に好まし
い:3−試薬系、及び２−試薬系。これらの実施態様はア
ビジンに関して記載されているが、上記のようにその他
のビオチン結合剤を用いてもよい。
“３−試薬系”実施態様では、３成分を用いて免疫検
定を行う：アビジン標識粒子、二座配位子、及び抗−被
検体抗体。免疫複合体の形成は、ラテックス−アビジン
粒子の二座配位子のビオチン部分への結合、及び抗−被
検体抗体の二座配位子の被検体部分上のその結合部位へ
の結合に依存する。抗体及びラテックス−アビジン粒子
が両方ともに複数の二座配位子分子に結合できるから広
範囲の複合体形成がおこり得る。被検体は１つのエピト
ープのみをもつから、評価すべきサンプル中に被検体が
存在すると、抗体結合部位を二座配位子と競争すること
によって免疫複合体形成が阻害（ブロック）される。複
合体形成の程度はこうしてサンプル中の被検体濃度に反
比例する。
定を行う：アビジン標識粒子、二座配位子、及び抗−被
検体抗体。免疫複合体の形成は、ラテックス−アビジン
粒子の二座配位子のビオチン部分への結合、及び抗−被
検体抗体の二座配位子の被検体部分上のその結合部位へ
の結合に依存する。抗体及びラテックス−アビジン粒子
が両方ともに複数の二座配位子分子に結合できるから広
範囲の複合体形成がおこり得る。被検体は１つのエピト
ープのみをもつから、評価すべきサンプル中に被検体が
存在すると、抗体結合部位を二座配位子と競争すること
によって免疫複合体形成が阻害（ブロック）される。複
合体形成の程度はこうしてサンプル中の被検体濃度に反
比例する。
“２−試薬系”実施態様においては、免疫検定は２成
分のみを用いて行われる：全てのビオチン結合部位が二
座配位子ビオチン−被検体試薬のビオチンメンバーで飽
和されたアビジン標識粒子、及び抗−被検体抗体。この
実施態様では、ラテックス−アビジン粒子を二座配位子
過剰の条件下で二座配位子とともにあらかじめインキュ
ベートし、ビオチン結合部位の実質的に全てが二座配位
子のビオチンメンバーで満たされるようにする。過剰の
二座配位子をサイズ排除カラムクロマトグラフィー、透
析、またはその他の手段によって除去した後、生成した
ラテックス−アビジン−被検体粒子は二座配位子と複合
体化する；その複合体化は、結合した二座配位子の被検
体部分がその後の抗−被検体抗体との結合に接近するよ
うに行われる。この試薬は阻止免疫検定において従来の
“デベロッパー抗原”として働き、そのため抗被検体抗
体の存在下でインキュベートすると免疫複合体を形成す
ることができる。３−試薬系におけるのと同様に、評価
すべきサンプル中の被検体の存在は被検体結合部位を競
合し、複合体形成の程度を減少させる。免疫複合体形成
の程度はサンプル中の被検体濃度に反比例する。
分のみを用いて行われる：全てのビオチン結合部位が二
座配位子ビオチン−被検体試薬のビオチンメンバーで飽
和されたアビジン標識粒子、及び抗−被検体抗体。この
実施態様では、ラテックス−アビジン粒子を二座配位子
過剰の条件下で二座配位子とともにあらかじめインキュ
ベートし、ビオチン結合部位の実質的に全てが二座配位
子のビオチンメンバーで満たされるようにする。過剰の
二座配位子をサイズ排除カラムクロマトグラフィー、透
析、またはその他の手段によって除去した後、生成した
ラテックス−アビジン−被検体粒子は二座配位子と複合
体化する；その複合体化は、結合した二座配位子の被検
体部分がその後の抗−被検体抗体との結合に接近するよ
うに行われる。この試薬は阻止免疫検定において従来の
“デベロッパー抗原”として働き、そのため抗被検体抗
体の存在下でインキュベートすると免疫複合体を形成す
ることができる。３−試薬系におけるのと同様に、評価
すべきサンプル中の被検体の存在は被検体結合部位を競
合し、複合体形成の程度を減少させる。免疫複合体形成
の程度はサンプル中の被検体濃度に反比例する。
粒子強化二座配位子検定は液体処方の二座配位子法に
比較していくつかの利点を有する。粒子の使用は、液体
を−ベース法に比べて感度が良く、必要な試薬量及びサ
ンプル容量がより少ない。同じかまたはより急勾配の使
用量に対する応答では、抗体使用係数が10以上改善さ
れ、サンプル容量が1.3分の１〜５分の１に減少する。
より希釈した抗体及びより少ないサンプルの使用はま
た、これら材料に起因するバックグラウンドシグナル、
及びサンプル間基質（matrix）変動の寄与を小さくす
る。このような使用は、非特異的沈殿を含めた、サンプ
ル及び抗体基質による妨害をさらに減少させ、適切な較
正基質の選択に関してより大きな柔軟性を提供する。例
えば、脂肪血サンプルまたは富トリグリセリドサンプル
は液体処方の二座配位子検定を実質的に妨害する。250m
g/dl以上のトリグリセリド濃度では、被検体濃度の測定
において10％より大きい定量誤差が認められた。このよ
うな妨害はラテックス処方では認められなかった。
比較していくつかの利点を有する。粒子の使用は、液体
を−ベース法に比べて感度が良く、必要な試薬量及びサ
ンプル容量がより少ない。同じかまたはより急勾配の使
用量に対する応答では、抗体使用係数が10以上改善さ
れ、サンプル容量が1.3分の１〜５分の１に減少する。
より希釈した抗体及びより少ないサンプルの使用はま
た、これら材料に起因するバックグラウンドシグナル、
及びサンプル間基質（matrix）変動の寄与を小さくす
る。このような使用は、非特異的沈殿を含めた、サンプ
ル及び抗体基質による妨害をさらに減少させ、適切な較
正基質の選択に関してより大きな柔軟性を提供する。例
えば、脂肪血サンプルまたは富トリグリセリドサンプル
は液体処方の二座配位子検定を実質的に妨害する。250m
g/dl以上のトリグリセリド濃度では、被検体濃度の測定
において10％より大きい定量誤差が認められた。このよ
うな妨害はラテックス処方では認められなかった。
本発明の方法の１つの顕著な特徴は、これらの方法で
は種々の被検体の検定に共通サイズの粒子を使用できる
ということである。以前には、所望の速度及び使用量に
対する応答標準を満足する免疫検定を得るためには、異
なる薬剤の各々を検定するためには異なるサイズの粒子
を用いなければならないことが多かった。多種類のサイ
ズの粒子の使用は分析の複雑さ並びに粒子の製造及び検
査コストを増加させる。それに対して、評価すべき被検
体には関係なく同一サイズ及び同一電荷密度の粒子を使
用できれば、均質性は大きくなり、検定に伴うコストは
低下する。この特徴は、自動または半自動サンプル希釈
能力のない例えばシンクロン（Synchron）（ベックマン
インスツルメンツ（Beckman Instruments））などの
サンプル処理装置に関して特に重要である。なぜならば
それにより、サンプルまたは被検体濃度を調節または希
釈する必要がなく、多数の免疫検定を行うことができる
からである。
は種々の被検体の検定に共通サイズの粒子を使用できる
ということである。以前には、所望の速度及び使用量に
対する応答標準を満足する免疫検定を得るためには、異
なる薬剤の各々を検定するためには異なるサイズの粒子
を用いなければならないことが多かった。多種類のサイ
ズの粒子の使用は分析の複雑さ並びに粒子の製造及び検
査コストを増加させる。それに対して、評価すべき被検
体には関係なく同一サイズ及び同一電荷密度の粒子を使
用できれば、均質性は大きくなり、検定に伴うコストは
低下する。この特徴は、自動または半自動サンプル希釈
能力のない例えばシンクロン（Synchron）（ベックマン
インスツルメンツ（Beckman Instruments））などの
サンプル処理装置に関して特に重要である。なぜならば
それにより、サンプルまたは被検体濃度を調節または希
釈する必要がなく、多数の免疫検定を行うことができる
からである。
フォーマットに関係なく、免疫検定の処理操作は自動
サンプル処理装置を用いて自動化するのが最も好まし
い。本発明の二座配位子試薬を用いると適切ないかなる
装置でも用いることができるとはいえ、米国特許第5,16
2,236号（参照してここに取り込まれる）に記載されて
いるパング（Pang,W.S）らの自動化法が特に好ましい。
一般に、パングらの方法は試薬の温度及び容量をコント
ロールする機器を用いる。免疫検定は比濁光学モジュー
ル内のキュベット中で行われる。装置のセンサーがキュ
ベットに流入する反応緩衝液の温度を感知し、熱交換器
が緩衝液の温度を必要に応じて高めたり低めたりする。
温度センサーに反応するコントロール回路が熱交換器を
コントロールして緩衝液及びキュベットの温度を選択さ
れた温度範囲内に維持する。前記装置は好適には、サン
プルピックアップステーション、サンプルピックアップ
ステーションから選択されたサンプルを引き出すための
サンプルプローブ、サンプル調製ステーション、及び前
記サンプルをサンプル調製ステーションから反応キュベ
ットに運ぶためのサンプル運搬機を含む。好ましい実施
態様では、装置は、抗体ピックアップステーション、抗
体ピックアップステーションから抗体を引き出すための
抗体プローブ、抗体調製ステーション、及び抗体を抗体
調製ステーションから反応キュベットに運ぶための抗体
運搬機をも含む。
サンプル処理装置を用いて自動化するのが最も好まし
い。本発明の二座配位子試薬を用いると適切ないかなる
装置でも用いることができるとはいえ、米国特許第5,16
2,236号（参照してここに取り込まれる）に記載されて
いるパング（Pang,W.S）らの自動化法が特に好ましい。
一般に、パングらの方法は試薬の温度及び容量をコント
ロールする機器を用いる。免疫検定は比濁光学モジュー
ル内のキュベット中で行われる。装置のセンサーがキュ
ベットに流入する反応緩衝液の温度を感知し、熱交換器
が緩衝液の温度を必要に応じて高めたり低めたりする。
温度センサーに反応するコントロール回路が熱交換器を
コントロールして緩衝液及びキュベットの温度を選択さ
れた温度範囲内に維持する。前記装置は好適には、サン
プルピックアップステーション、サンプルピックアップ
ステーションから選択されたサンプルを引き出すための
サンプルプローブ、サンプル調製ステーション、及び前
記サンプルをサンプル調製ステーションから反応キュベ
ットに運ぶためのサンプル運搬機を含む。好ましい実施
態様では、装置は、抗体ピックアップステーション、抗
体ピックアップステーションから抗体を引き出すための
抗体プローブ、抗体調製ステーション、及び抗体を抗体
調製ステーションから反応キュベットに運ぶための抗体
運搬機をも含む。
ここに、一般的に本発明を述べたが、これは下記の例
を参照してより容易に理解されるであろう。これらの例
は実例として提供され、特に記載がない限り本発明を制
限することを意図されたものではない。
を参照してより容易に理解されるであろう。これらの例
は実例として提供され、特に記載がない限り本発明を制
限することを意図されたものではない。
例１
フェニトイン−ビオチン二座配位子の合成
フェニトインはてんかん及びその他の情動性疾患の治
療に用いられる抗けいれん剤である（フィリップ（Phil
ip,J.）ら、薬物の分析的プロフィール（Analytical Pr
ofiles of Drug Substances）、13巻、Florey,K.ら編、
Academic Press,NY（417〜445ページ、（1984））；ド
レフス（Dreifus）ら、Amer.Heart J.80巻、709〜713ペ
ージ、（1970）；どちらも参照してここに取り込まれ
る）。フェニトインは潜在的発癌物質であるから（IARC
Monogr.13巻、201〜225ページ、（1977））、過量投与
を避けるために患者のフェニトインレベルをモニターす
ることが重要である。
療に用いられる抗けいれん剤である（フィリップ（Phil
ip,J.）ら、薬物の分析的プロフィール（Analytical Pr
ofiles of Drug Substances）、13巻、Florey,K.ら編、
Academic Press,NY（417〜445ページ、（1984））；ド
レフス（Dreifus）ら、Amer.Heart J.80巻、709〜713ペ
ージ、（1970）；どちらも参照してここに取り込まれ
る）。フェニトインは潜在的発癌物質であるから（IARC
Monogr.13巻、201〜225ページ、（1977））、過量投与
を避けるために患者のフェニトインレベルをモニターす
ることが重要である。
ヤンらの方法（米国特許出願第248,479号）を用いて
フェニトイン−ビオチン二座配位子を製造した。デター
ジェントで簡易化され、ラテックスで強化された均質免
疫検定を明らかにするためにこの新規な二座配位子を用
い、このような検定をデタージェントを使用しない均質
免疫検定に対して、血液サンプルまたは血清サンプル中
でのフェニトインの存在をスクリーニングする相対的な
能力について比較した。
フェニトイン−ビオチン二座配位子を製造した。デター
ジェントで簡易化され、ラテックスで強化された均質免
疫検定を明らかにするためにこの新規な二座配位子を用
い、このような検定をデタージェントを使用しない均質
免疫検定に対して、血液サンプルまたは血清サンプル中
でのフェニトインの存在をスクリーニングする相対的な
能力について比較した。
新規なフェニトイン−ビオチン二座配位子の合成を図
１に示す。図１によれば、フェニトイン（Ｉ）をｗブロ
モバレレートでＮ−アルキル化し、次いでNaOH中で加水
分解して、フェニトイン酸誘導体（II）を得た。フェニ
トイン酸誘導体（II）を次いでカルボニルジイミダゾー
ル（CDI）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を
用いてヘキサンジアミンと結合させ、フェニトインアミ
ン誘導体（III）を得た。次いで、フェニトインアミン
誘導体（III）をCDI及びNHSを用いてカルボン酸ビオチ
ン誘導体（IV）に結合し、所望のフェニトイン−ビオチ
ン二座配位子（Ｖ）を得た。
１に示す。図１によれば、フェニトイン（Ｉ）をｗブロ
モバレレートでＮ−アルキル化し、次いでNaOH中で加水
分解して、フェニトイン酸誘導体（II）を得た。フェニ
トイン酸誘導体（II）を次いでカルボニルジイミダゾー
ル（CDI）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を
用いてヘキサンジアミンと結合させ、フェニトインアミ
ン誘導体（III）を得た。次いで、フェニトインアミン
誘導体（III）をCDI及びNHSを用いてカルボン酸ビオチ
ン誘導体（IV）に結合し、所望のフェニトイン−ビオチ
ン二座配位子（Ｖ）を得た。
例２
フェニトインのラテックス粒子強化−均質免疫検定にお
ける100Nmラテックス粒子の使用 前記フェニトイン−ビオチン二座配位子を用いて血清
サンプル中のフェニトインを検出した；その際上記の３
−試薬系方法及び２試薬系方式を両方用いた。両検定に
おいて分析はシンクロン（Synchron）分析器を用いて行
われた。
ける100Nmラテックス粒子の使用 前記フェニトイン−ビオチン二座配位子を用いて血清
サンプル中のフェニトインを検出した；その際上記の３
−試薬系方法及び２試薬系方式を両方用いた。両検定に
おいて分析はシンクロン（Synchron）分析器を用いて行
われた。
フェニトイン検出は、ハイブリドーマクローンAS3ま
たはAS8から産生した抗−フェニトインモノクローナル
抗体を用いて行われた。これらのクローンから産生した
抗体は実質的に等価（equivalent）である。これらに代
わる適したモノクローナル抗体は、ビオスペシフィック
社（BioSpecific,Inc.）及びビオデザイン社（BioDesig
n,Inc.）から、またはその他の出所、例えばリンスコッ
トの商工名簿（Linscott's Directory）に記載されてい
る会社から市販されており、入手できる。
たはAS8から産生した抗−フェニトインモノクローナル
抗体を用いて行われた。これらのクローンから産生した
抗体は実質的に等価（equivalent）である。これらに代
わる適したモノクローナル抗体は、ビオスペシフィック
社（BioSpecific,Inc.）及びビオデザイン社（BioDesig
n,Inc.）から、またはその他の出所、例えばリンスコッ
トの商工名簿（Linscott's Directory）に記載されてい
る会社から市販されており、入手できる。
３−試薬系方式では、二座配位子（Ｖ）そのものを用
いて免疫反応を誘発した（すなわちトリガー試薬とし
て）。したがって検定は３つの試薬成分からなるもので
あった： a.フェニトイン−ビオチン二座配位子−アビジン複合体
（トリス緩衝液（0.02M、0.2％ツイーン−20、0.2％BS
A、pH9.0）で希釈した） b.モノクローナル抗−フェニトイン抗体（クローンAS8
によって産生した）、ARRAY抗体希釈液で1:50に希釈し
た） c.ラテックス−アビジン粒子（トリス緩衝液（0.02M、
0.2％BSA、pH9.0）で希釈した）。ラテックス材料（100
nm）はセラジンから購入した。0.3mgアビジン対1mgラテ
ックスの質量比を用いてラテックス粒子をアビジンに結
合させ、ラテックス−アビジン材料を得た。
いて免疫反応を誘発した（すなわちトリガー試薬とし
て）。したがって検定は３つの試薬成分からなるもので
あった： a.フェニトイン−ビオチン二座配位子−アビジン複合体
（トリス緩衝液（0.02M、0.2％ツイーン−20、0.2％BS
A、pH9.0）で希釈した） b.モノクローナル抗−フェニトイン抗体（クローンAS8
によって産生した）、ARRAY抗体希釈液で1:50に希釈し
た） c.ラテックス−アビジン粒子（トリス緩衝液（0.02M、
0.2％BSA、pH9.0）で希釈した）。ラテックス材料（100
nm）はセラジンから購入した。0.3mgアビジン対1mgラテ
ックスの質量比を用いてラテックス粒子をアビジンに結
合させ、ラテックス−アビジン材料を得た。
検定緩衝液は80％アポ希釈液（Apo Diluent）（ベッ
クマンインスツルメンツ）及び20％リューマトイド緩衝
液（Rheumatoid Buffer）（ベックマン インスツルメ
ンツ）の混合液であった。較正曲線は脱脂ヒト血清で作
成した。シンクロン分析器を以下のように３−試薬検定
のために組み立てた： a.試薬カートリッジコンパートメントＡ中の検定緩衝
液:220μｌ b.コンパートメントＢ中の、抗体（1/50）／ラテックス
アビジン混合物（1:1（v/v））:62μｌ c.サンプル:3μｌ（希釈していない） d.コンパートメントＣ中の、トリガーとしてのフェニト
イン−ビオチン二座配位子（1.5μg/ml）:20μｌ e.トリガー添加時間：サンプルの添加後16秒間 f.反応リードウィンドウ：トリガー添加８秒間後、36秒
間 g.検出波長:340nm 標準曲線を作成するために検定はいくつかの標準を用
いて行われた。標準曲線の数値を表１に示す（O.D.＝光
学濃度（吸光度）;Min＝分；％B/B0は最初の反応速度に
対する指示された速度の比のパーセントである）。
クマンインスツルメンツ）及び20％リューマトイド緩衝
液（Rheumatoid Buffer）（ベックマン インスツルメ
ンツ）の混合液であった。較正曲線は脱脂ヒト血清で作
成した。シンクロン分析器を以下のように３−試薬検定
のために組み立てた： a.試薬カートリッジコンパートメントＡ中の検定緩衝
液:220μｌ b.コンパートメントＢ中の、抗体（1/50）／ラテックス
アビジン混合物（1:1（v/v））:62μｌ c.サンプル:3μｌ（希釈していない） d.コンパートメントＣ中の、トリガーとしてのフェニト
イン−ビオチン二座配位子（1.5μg/ml）:20μｌ e.トリガー添加時間：サンプルの添加後16秒間 f.反応リードウィンドウ：トリガー添加８秒間後、36秒
間 g.検出波長:340nm 標準曲線を作成するために検定はいくつかの標準を用
いて行われた。標準曲線の数値を表１に示す（O.D.＝光
学濃度（吸光度）;Min＝分；％B/B0は最初の反応速度に
対する指示された速度の比のパーセントである）。
上記の３−試薬検定を38名の患者の群についてTDx検
定と平行して行った。３−試薬シンクロン値とTDxフォ
ーマットを用いて得られた値との間には良好な相関性が
認められた。分析の結果、次の相関式が得られた： シンクロン＝1.00（TDx）＋0.1 ｒ＝0.9470 ｎ＝38 前述のように、前記の２−試薬方式を用いたシンクロ
ン免疫検定も行った。２−試薬検定方式は、ラテックス
−アビジン−ビオチン−フェニトイン複合体、及びラテ
ックス凝集反応をおこすための抗体からなっていた。こ
うして２試薬検定フォーマットではフェニトイン−ビオ
チン二座配位子は複合体成分として処分された。検定に
は次の試薬と緩衝液を用いた： a.ベックマンインスツルメンツによって生産されたモノ
クローナルフェニトイン抗体AS8を用いた。この抗体
は、ARRAY抗体希釈液（ベックマン P/N 668579）で1:
50に希釈し、検定に用いた。
定と平行して行った。３−試薬シンクロン値とTDxフォ
ーマットを用いて得られた値との間には良好な相関性が
認められた。分析の結果、次の相関式が得られた： シンクロン＝1.00（TDx）＋0.1 ｒ＝0.9470 ｎ＝38 前述のように、前記の２−試薬方式を用いたシンクロ
ン免疫検定も行った。２−試薬検定方式は、ラテックス
−アビジン−ビオチン−フェニトイン複合体、及びラテ
ックス凝集反応をおこすための抗体からなっていた。こ
うして２試薬検定フォーマットではフェニトイン−ビオ
チン二座配位子は複合体成分として処分された。検定に
は次の試薬と緩衝液を用いた： a.ベックマンインスツルメンツによって生産されたモノ
クローナルフェニトイン抗体AS8を用いた。この抗体
は、ARRAY抗体希釈液（ベックマン P/N 668579）で1:
50に希釈し、検定に用いた。
b.ラテックス−アビジン−ビオチン−フェニトイン複合
体（トリス緩衝液（0.02M、0.2％ツイーン−20、0.2％B
SA、pH9.0）で希釈した）。ラテックス材料（100nm）は
セラジンから購入した。0.3mgアビジン対1mgラテックス
の質量比を用いてラテックス粒子をアビジンに結合し
た。次いで、ラテックス−アビジンを前記フェニトイン
二座配位子と複合体化することによって所望の複合体を
得た。
体（トリス緩衝液（0.02M、0.2％ツイーン−20、0.2％B
SA、pH9.0）で希釈した）。ラテックス材料（100nm）は
セラジンから購入した。0.3mgアビジン対1mgラテックス
の質量比を用いてラテックス粒子をアビジンに結合し
た。次いで、ラテックス−アビジンを前記フェニトイン
二座配位子と複合体化することによって所望の複合体を
得た。
検定緩衝液は70％アポ希釈液（ベックマンインスツル
メンツ）及び30％リューマトイド緩衝液（ベックマンイ
ンスツルメンツ）の混合液であった。較正曲線は脱脂ヒ
ト血清で作成した。シンクロン分析器を２−試薬検定の
ために次のように組み立てた。
メンツ）及び30％リューマトイド緩衝液（ベックマンイ
ンスツルメンツ）の混合液であった。較正曲線は脱脂ヒ
ト血清で作成した。シンクロン分析器を２−試薬検定の
ために次のように組み立てた。
a.試薬カートリッジコンパートメントＡ中の検定緩衝
液:220μｌ b.コンパートメントＣ中のラテックス−アビジン−フェ
ニトイン−ビオチン複合体:45μｌ c.サンプル:3μｌ（希釈していない） d.コンパートメントＢ中の抗体トリガー:30μｌ e.トリガー添加時間：サンプルの添加後16秒間 f.反応リードウィンドウ：トリガーの添加８秒間後、36
秒間 g.検出波長:340nm 標準曲線を作成するためにいくつかの標準を用いて検
定を行った。標準曲線の数値を表２に示す。
液:220μｌ b.コンパートメントＣ中のラテックス−アビジン−フェ
ニトイン−ビオチン複合体:45μｌ c.サンプル:3μｌ（希釈していない） d.コンパートメントＢ中の抗体トリガー:30μｌ e.トリガー添加時間：サンプルの添加後16秒間 f.反応リードウィンドウ：トリガーの添加８秒間後、36
秒間 g.検出波長:340nm 標準曲線を作成するためにいくつかの標準を用いて検
定を行った。標準曲線の数値を表２に示す。
上記の２−試薬検定を62名の患者の群についてTDx検
定と平行して行った。２−試薬シンクロン値とTDxフォ
ーマットを用いて得られた値との間には良好な相関性が
認められた。分析の結果、次の相関式が得られた： シンクロン＝1.10（TDx）−0.1 ｒ＝0.9798 ｎ＝62 検定感度または検定の要件に与えるラテックス−アビ
ジン粒子の影響を明らかにするために比較を行った。そ
こでフェニトインの２−試薬シンクロン検定を上記のラ
テックス−アビジン粒子の存在下及び不存在下で行っ
た。両検定は同じ抗フェニトインモノクローナル抗体
（ハイブリドーマクローンAS3によって産生された）を
用いた。検定は表３に示す最適条件下で行われた。
定と平行して行った。２−試薬シンクロン値とTDxフォ
ーマットを用いて得られた値との間には良好な相関性が
認められた。分析の結果、次の相関式が得られた： シンクロン＝1.10（TDx）−0.1 ｒ＝0.9798 ｎ＝62 検定感度または検定の要件に与えるラテックス−アビ
ジン粒子の影響を明らかにするために比較を行った。そ
こでフェニトインの２−試薬シンクロン検定を上記のラ
テックス−アビジン粒子の存在下及び不存在下で行っ
た。両検定は同じ抗フェニトインモノクローナル抗体
（ハイブリドーマクローンAS3によって産生された）を
用いた。検定は表３に示す最適条件下で行われた。
ラテックス粒子なしで検定を行う場合（すなわち“液
体処方フェニトイン二座配位子検定”）には1/3.25の抗
体希釈が必要であることがわかった。それに対して、ア
ビジンをラテックス粒子に結合させた場合には（すなわ
ち“ラテックス強化”免疫検定処方では）、1/100の抗
体希釈を用いることができた。こうして液体処方検定は
“ラテックス強化”免疫検定処方に比べて少なくとも30
倍も多い抗体を必要とした。その上、液体処方ではラテ
ックス処方に比べてはるかに感度の鈍い使用量に対する
応答を示した。
体処方フェニトイン二座配位子検定”）には1/3.25の抗
体希釈が必要であることがわかった。それに対して、ア
ビジンをラテックス粒子に結合させた場合には（すなわ
ち“ラテックス強化”免疫検定処方では）、1/100の抗
体希釈を用いることができた。こうして液体処方検定は
“ラテックス強化”免疫検定処方に比べて少なくとも30
倍も多い抗体を必要とした。その上、液体処方ではラテ
ックス処方に比べてはるかに感度の鈍い使用量に対する
応答を示した。
液体処方及びラテックス強化検定の標準曲線を決める
ために、１組のフェニトイン標準溶液を用いて検査を評
価した。標準曲線を表４に示す。
ために、１組のフェニトイン標準溶液を用いて検査を評
価した。標準曲線を表４に示す。
液体処方及びラテックス強化検定の結果は、どちらの
検定を用いてもフェニトイン濃度を正確に測定できるこ
とを示した。
検定を用いてもフェニトイン濃度を正確に測定できるこ
とを示した。
例３
100Nmラテックス粒子を用いるフェニトインのラテック
ス粒子強化均質免疫検定のための検定パラメーターの最
適化 上記のように、フェニトインの非常に好適な免疫検定
はいくつかの“所望の検定パラメーター”を示す：被検
体濃度０μg/mlで約0.2Δ（O.D.単位）／分より大きい
速度；最大較正濃度で約0.02Δ（OD単位）／分より大き
い反応速度；及びゼロではない最低較正濃度で約75〜85
％、最高較正濃度で25％未満の使用量に対する応答（％
B/B0で表される）。フェニトインでは、最低の生理学的
に関連した、非ゼロ較正濃度は約2.5μg/mlであり；最
高の生理学的に関連した、非ゼロ較正濃度は約40μg/ml
である。
ス粒子強化均質免疫検定のための検定パラメーターの最
適化 上記のように、フェニトインの非常に好適な免疫検定
はいくつかの“所望の検定パラメーター”を示す：被検
体濃度０μg/mlで約0.2Δ（O.D.単位）／分より大きい
速度；最大較正濃度で約0.02Δ（OD単位）／分より大き
い反応速度；及びゼロではない最低較正濃度で約75〜85
％、最高較正濃度で25％未満の使用量に対する応答（％
B/B0で表される）。フェニトインでは、最低の生理学的
に関連した、非ゼロ較正濃度は約2.5μg/mlであり；最
高の生理学的に関連した、非ゼロ較正濃度は約40μg/ml
である。
このような好ましい免疫検定を定義づけるために、ラ
テックス−アビジン試薬のアビジンの粒子に対する負荷
比（“A/C"比）の効果を調査した。A/C比0.25が、好ま
しいフェニトイン免疫検定のパラメーターを満足する免
疫検定を提供することが確認された。0.01Mリン酸塩緩
衝液、0.075M NaCl、3.3％ポリエチレングリコール、
0.003％エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、200単位/m
lヘパリン、及び0.97％トリトンＸ−100を含む検定緩衝
液を用いて検定を行った。その検定には緩衝液容量230
μｌ、ラテックス二座配位子容量45μｌ、抗体容量30μ
ｌ、及びサンプル容量3mlを用いた。抗体は1/50希釈で
あった。検定の結果を表５に示す。
テックス−アビジン試薬のアビジンの粒子に対する負荷
比（“A/C"比）の効果を調査した。A/C比0.25が、好ま
しいフェニトイン免疫検定のパラメーターを満足する免
疫検定を提供することが確認された。0.01Mリン酸塩緩
衝液、0.075M NaCl、3.3％ポリエチレングリコール、
0.003％エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、200単位/m
lヘパリン、及び0.97％トリトンＸ−100を含む検定緩衝
液を用いて検定を行った。その検定には緩衝液容量230
μｌ、ラテックス二座配位子容量45μｌ、抗体容量30μ
ｌ、及びサンプル容量3mlを用いた。抗体は1/50希釈で
あった。検定の結果を表５に示す。
例４
フェニトインのラテックス粒子強化均質免疫検定におけ
る60Nmラテックス粒子の使用：検定パラメーターの最適
化 免疫検定に用いる粒子の直径は、免疫沈殿が生成する
速度をコントロールする。粒子サイズの標準化は、複数
の被検体の免疫検定を実施するコスト及び複雑さを減ら
す。その上、粒子サイズの標準化により多重免疫検定に
同じ試薬を使用でき、そのため検定に伴うコストが低下
する。大部分の被検体は60nm粒子（パーキング面積＝10
0Å2/COOH）を用いて検定できるので、直径60nmの粒子
を用いることが望ましい。この理由から、直径60nmの粒
子を用いて、上記所望のパラメーターを満足させる能力
について免疫検定を評価した。
る60Nmラテックス粒子の使用：検定パラメーターの最適
化 免疫検定に用いる粒子の直径は、免疫沈殿が生成する
速度をコントロールする。粒子サイズの標準化は、複数
の被検体の免疫検定を実施するコスト及び複雑さを減ら
す。その上、粒子サイズの標準化により多重免疫検定に
同じ試薬を使用でき、そのため検定に伴うコストが低下
する。大部分の被検体は60nm粒子（パーキング面積＝10
0Å2/COOH）を用いて検定できるので、直径60nmの粒子
を用いることが望ましい。この理由から、直径60nmの粒
子を用いて、上記所望のパラメーターを満足させる能力
について免疫検定を評価した。
アビジンの粒子に対する負荷比（“A/C"比）0.15を有
する60nmラテックス粒子を用いて、６匹のマウスの腹水
液の抗フェニトイン抗体をスクリーニングした。検定緩
衝液は0.01Mリン酸塩緩衝液、0.075M NaCl、3.6％ポリ
エチレングリコール、0.003％エチレンジアミン四酢酸
塩（EDTA）、200単位/mlヘパリン、及び1.1％トリトン
Ｘ−100であった。検定には緩衝液容量230μｌ、ラテッ
クス二座配位子容量45μｌ、抗体容量30μｌ、及びサン
プル容量３μｌを用いた。抗体は1/50に希釈した。
する60nmラテックス粒子を用いて、６匹のマウスの腹水
液の抗フェニトイン抗体をスクリーニングした。検定緩
衝液は0.01Mリン酸塩緩衝液、0.075M NaCl、3.6％ポリ
エチレングリコール、0.003％エチレンジアミン四酢酸
塩（EDTA）、200単位/mlヘパリン、及び1.1％トリトン
Ｘ−100であった。検定には緩衝液容量230μｌ、ラテッ
クス二座配位子容量45μｌ、抗体容量30μｌ、及びサン
プル容量３μｌを用いた。抗体は1/50に希釈した。
２匹の動物の腹水液（AS3及びAS8）がその他の腹水液
に比較して良い免疫反応性及び検定特異性を示したが、
しかしながらそれらは前記パラメーターのもとで所望の
ものよりもはるかに急勾配の使用量に対する応答曲線を
示した（表６）。検定最適化のためにAS8からの抗体を
選んだが、それはその使用量に対する応答が％B/B0に関
して所望のパラメーターにより近かったからである。速
度は（Δ（O.D.）／分）として表わされる。
に比較して良い免疫反応性及び検定特異性を示したが、
しかしながらそれらは前記パラメーターのもとで所望の
ものよりもはるかに急勾配の使用量に対する応答曲線を
示した（表６）。検定最適化のためにAS8からの抗体を
選んだが、それはその使用量に対する応答が％B/B0に関
して所望のパラメーターにより近かったからである。速
度は（Δ（O.D.）／分）として表わされる。
いくつかのアプローチを用いてより適した使用量に対
する応答及び速度を得ることができる。表６に表した結
果から、検定前にサンプルを希釈すると曲線の感度は明
らかに低下し、使用量に対する応答が所望のパラメータ
ーの範囲内になるであろう。このことはサンプル希釈能
力を”装置上（on−board）に”備えたARRAYTM分析器の
ような自動装置を用いれば容易に実現できるが、このよ
うなサンプル希釈特徴がなくかつ使用サンプルサイズが
その装置に許された最小サンプル容量（３μＬニート）
であるシンクロン分析器のような分析器を用いる場合は
容易には実現できない。
する応答及び速度を得ることができる。表６に表した結
果から、検定前にサンプルを希釈すると曲線の感度は明
らかに低下し、使用量に対する応答が所望のパラメータ
ーの範囲内になるであろう。このことはサンプル希釈能
力を”装置上（on−board）に”備えたARRAYTM分析器の
ような自動装置を用いれば容易に実現できるが、このよ
うなサンプル希釈特徴がなくかつ使用サンプルサイズが
その装置に許された最小サンプル容量（３μＬニート）
であるシンクロン分析器のような分析器を用いる場合は
容易には実現できない。
免疫検定の使用量に対する応答曲線を改善する第２の
アプローチはアビジンの粒子に対する負荷比を最適化す
ることを含む。このアプローチを説明するために、４種
類の異なるA/C比（0.25;0.35;0.45;0.5）を用いてラテ
ックス−アビジン二座配位子試薬を調製した。粒子を評
価して、A/C比の変化が所望のパラメーターを有する検
定をもたらすかどうか確かめた。こうしてアビジン−ラ
テックス粒子のA/C比のみを変化させて同一の免疫検定
を行った。これらの実験に用いた検定緩衝液は0.01Mリ
ン酸塩緩衝液、0.75M NaCl、3.6％ポリエチレングリコ
ール、0.003％エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、200
単位/mlヘパリン、及び1.1％トリトンＸ−100であっ
た。検定の構成成分及び速度の計算値を表７に示す。
アプローチはアビジンの粒子に対する負荷比を最適化す
ることを含む。このアプローチを説明するために、４種
類の異なるA/C比（0.25;0.35;0.45;0.5）を用いてラテ
ックス−アビジン二座配位子試薬を調製した。粒子を評
価して、A/C比の変化が所望のパラメーターを有する検
定をもたらすかどうか確かめた。こうしてアビジン−ラ
テックス粒子のA/C比のみを変化させて同一の免疫検定
を行った。これらの実験に用いた検定緩衝液は0.01Mリ
ン酸塩緩衝液、0.75M NaCl、3.6％ポリエチレングリコ
ール、0.003％エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、200
単位/mlヘパリン、及び1.1％トリトンＸ−100であっ
た。検定の構成成分及び速度の計算値を表７に示す。
表７から分かるように、高いA/C比（0.45〜0.50）で
は％B/B0は増加した。しかしながら、試験したA/C比の
なかで、反応速度と使用量に対する応答の両方を同時に
所望の検定パラメーターの範囲内とするものはなかった
≧0.45のA/C比では、ラテックス材料に起因する反応バ
ックグラウンドが高く、ラテックス試薬と緩衝液との間
に幾分顕著な非特異的反応が認められた。
は％B/B0は増加した。しかしながら、試験したA/C比の
なかで、反応速度と使用量に対する応答の両方を同時に
所望の検定パラメーターの範囲内とするものはなかった
≧0.45のA/C比では、ラテックス材料に起因する反応バ
ックグラウンドが高く、ラテックス試薬と緩衝液との間
に幾分顕著な非特異的反応が認められた。
例５
デタージェントで簡易化され、ラテックス粒子で強化さ
れたフェニトイン均質免疫検定における60Nmラテックス
粒子の使用 上記所望の検定パラメーターを満足する免疫検定に60
nm粒子を使用できる検定条件を同定するために、ポリエ
チレングリコール及びデタージェントの検定感度及び速
度に及ぼす影響を調べた。
れたフェニトイン均質免疫検定における60Nmラテックス
粒子の使用 上記所望の検定パラメーターを満足する免疫検定に60
nm粒子を使用できる検定条件を同定するために、ポリエ
チレングリコール及びデタージェントの検定感度及び速
度に及ぼす影響を調べた。
そこで、0.01Mリン酸塩緩衝液、0.075M NaCl、3.6％
または4.4％のどちらかの濃度のポリエチレングリコー
ル（“PEG"）、200単位/mlヘパリン、及び０％または1.
1％のどちらかの濃度のトリトンＸ−100を含む検定緩衝
液を用いて免疫検定を行った。トリトンＸ−100を含む
反応は0.003％EDTAも含んだ。それらの検定は緩衝液容
量230μｌ、ラテックス二座配位子（1:1.5）容量32μ
ｌ、抗体容量40μｌ、及びサンプル容量３μｌを用い
た。抗体は1/50に希釈した。この分析結果（表８に示さ
れる）は、PEGが検定速度に顕著な効果を有すること、
及びトリトンＸ−100を含有することにより検定の使用
量に対する応答曲線が最適感度にまで実質的に改善され
ることを示している。トリトンＸ−100がない場合、０
から５μg/mlまで反応速度は急激に減少し、薬剤濃度が
より高くなると徐々に水平になった。この結果、有効な
薬剤濃度範囲（10〜20μg/ml）と毒性レベル（＞20μg/
ml）との間にほとんど区別を示さない、望ましくない使
用量に対する応答を生じた。しかし、トリトンＸ−100
を含有することにより、曲線はより“直線状”になり、
全検定領域にわたって良い使用量に対する応答が得られ
た。
または4.4％のどちらかの濃度のポリエチレングリコー
ル（“PEG"）、200単位/mlヘパリン、及び０％または1.
1％のどちらかの濃度のトリトンＸ−100を含む検定緩衝
液を用いて免疫検定を行った。トリトンＸ−100を含む
反応は0.003％EDTAも含んだ。それらの検定は緩衝液容
量230μｌ、ラテックス二座配位子（1:1.5）容量32μ
ｌ、抗体容量40μｌ、及びサンプル容量３μｌを用い
た。抗体は1/50に希釈した。この分析結果（表８に示さ
れる）は、PEGが検定速度に顕著な効果を有すること、
及びトリトンＸ−100を含有することにより検定の使用
量に対する応答曲線が最適感度にまで実質的に改善され
ることを示している。トリトンＸ−100がない場合、０
から５μg/mlまで反応速度は急激に減少し、薬剤濃度が
より高くなると徐々に水平になった。この結果、有効な
薬剤濃度範囲（10〜20μg/ml）と毒性レベル（＞20μg/
ml）との間にほとんど区別を示さない、望ましくない使
用量に対する応答を生じた。しかし、トリトンＸ−100
を含有することにより、曲線はより“直線状”になり、
全検定領域にわたって良い使用量に対する応答が得られ
た。
60nmラテックス粒子（パーキング面積110Å2/COOH）
及びA/Cアビジン負荷比0.45を用いて、トリトンＸ−100
濃度の反応速度及び使用量に対する応答に与える効果を
評価した。この評価の結果を表９に示す。
及びA/Cアビジン負荷比0.45を用いて、トリトンＸ−100
濃度の反応速度及び使用量に対する応答に与える効果を
評価した。この評価の結果を表９に示す。
表９は、デタージェントの濃度の増加につれて、反応
速度も増加し、同時に使用量に対する応答（％B/B0によ
って示される）は減少することを示す。検定緩衝液中で
2.1％トリトンＸ−100では、反応速度は、０μg/mlでは
0.21Δ（O.D.）／分、40μg/mlでは0.0327Δ（O.D.）／
分であり、％B/B0は、2.5及び40μg/mlでそれぞれ82.3
％〜15.3％であった。こうして2.1％トリトンＸ−100を
組み合わせると、フェニトイン検定感度を所望の検定パ
ラメーター内にうまく調節した。
速度も増加し、同時に使用量に対する応答（％B/B0によ
って示される）は減少することを示す。検定緩衝液中で
2.1％トリトンＸ−100では、反応速度は、０μg/mlでは
0.21Δ（O.D.）／分、40μg/mlでは0.0327Δ（O.D.）／
分であり、％B/B0は、2.5及び40μg/mlでそれぞれ82.3
％〜15.3％であった。こうして2.1％トリトンＸ−100を
組み合わせると、フェニトイン検定感度を所望の検定パ
ラメーター内にうまく調節した。
例６
デタージェントで簡易化され、ラテックス粒子で強化さ
れたフェニトイン均質免疫検定におけるデタージェント
タイプの変化 例５で達成された所望の検定パラメーターがトリトン
Ｘ−100デタージェントの使用に依存したのかどうか、
またその他のデタージェントも等価的に使用できるかど
うかを測定するために、トリトンＸ−100の代わりにツ
イーン−20を用いて上記の免疫検定を行った。
れたフェニトイン均質免疫検定におけるデタージェント
タイプの変化 例５で達成された所望の検定パラメーターがトリトン
Ｘ−100デタージェントの使用に依存したのかどうか、
またその他のデタージェントも等価的に使用できるかど
うかを測定するために、トリトンＸ−100の代わりにツ
イーン−20を用いて上記の免疫検定を行った。
そこで、0.01Mリン酸塩緩衝液、0.75M NaCl、3.3％
ポリエチレングリコール（“PEG"）、0.003％EDTA、200
単位/mlヘパリン、及びツイーン−20（1.1％、2.1％、
2.6％または3.1％濃度のいづれか）を含む検定緩衝液を
用いて免疫検定を行った。検定には、緩衝液容量230μ
ｌ、ラテックス二座配位子（1:1.5）容量32μｌ、抗体
容量40μｌ、及びサンプル容量３μｌを用いた。抗体は
1/50に希釈した。A/C比は0.35であった。この分析の結
果を表10に示す。
ポリエチレングリコール（“PEG"）、0.003％EDTA、200
単位/mlヘパリン、及びツイーン−20（1.1％、2.1％、
2.6％または3.1％濃度のいづれか）を含む検定緩衝液を
用いて免疫検定を行った。検定には、緩衝液容量230μ
ｌ、ラテックス二座配位子（1:1.5）容量32μｌ、抗体
容量40μｌ、及びサンプル容量３μｌを用いた。抗体は
1/50に希釈した。A/C比は0.35であった。この分析の結
果を表10に示す。
表10に示したように、ツイーン−20を用いると、免疫
検定の使用量に対する応答に、トリトンＸ−100で認め
られるのと同様の改善が得られた。トリトンＸ−100を
使用した場合には、ツイーン−20を用いて得られるより
も実質的により高い反応速度が得られるから、トリトン
Ｘ−100の方が好ましいデタージェントである。その
上、所望の使用量に対する応答及び反応速度検定パラメ
ーターに達するために必要な濃度はトリトンＸ−100の
方が低かった。これらの結果は、免疫検定の使用量に対
する応答の改善は特定の種類のデタージェントに限定さ
れないことを示す。
検定の使用量に対する応答に、トリトンＸ−100で認め
られるのと同様の改善が得られた。トリトンＸ−100を
使用した場合には、ツイーン−20を用いて得られるより
も実質的により高い反応速度が得られるから、トリトン
Ｘ−100の方が好ましいデタージェントである。その
上、所望の使用量に対する応答及び反応速度検定パラメ
ーターに達するために必要な濃度はトリトンＸ−100の
方が低かった。これらの結果は、免疫検定の使用量に対
する応答の改善は特定の種類のデタージェントに限定さ
れないことを示す。
例７
デタージェントで簡易化され、ラテックス粒子で強化さ
れたフェノバルビタールの均質免疫検定 上記のデタージェントで簡易化され、ラテックス粒子
で強化された均質免疫検定フォーマットを用いると、い
かなる被検体の濃度または存在を検定することができ
る。本発明の一般的な性質を示すために、本発明の方法
を用いてフェノバルビタールの検定を行った。フェノバ
ルビタール（５−エチル−５−フェニル−2,4,6（1H,3
H,−ピリミジントリオン））は抗けいれん剤である。そ
れは鎮静剤として及び催眠薬としても用いられ；フェノ
バルビタールはまた濫用物質でもある（チャオ（Chao,
M.K.C.）ら、：薬物の分析的プロフィール（Analytical
Profiles of Drug Substances）、５巻、Florey,K.
（編）、Academic Press,NY、359〜399ページ（197
8））。
れたフェノバルビタールの均質免疫検定 上記のデタージェントで簡易化され、ラテックス粒子
で強化された均質免疫検定フォーマットを用いると、い
かなる被検体の濃度または存在を検定することができ
る。本発明の一般的な性質を示すために、本発明の方法
を用いてフェノバルビタールの検定を行った。フェノバ
ルビタール（５−エチル−５−フェニル−2,4,6（1H,3
H,−ピリミジントリオン））は抗けいれん剤である。そ
れは鎮静剤として及び催眠薬としても用いられ；フェノ
バルビタールはまた濫用物質でもある（チャオ（Chao,
M.K.C.）ら、：薬物の分析的プロフィール（Analytical
Profiles of Drug Substances）、５巻、Florey,K.
（編）、Academic Press,NY、359〜399ページ（197
8））。
0.01Mリン酸塩緩衝液、0.75M NaCl、3.6％ポリエチ
レングリコール（“PEG"）、0.003％EDTA、200単位/ml
ヘパリン、及びトリトンＸ−100（濃度1.1％、1.6％ま
たは2.1％のいづれか）を含む検定緩衝液を用いて免疫
検定を行った。検定には、緩衝液容量230μｌ、直径60n
mのラテックス粒子−アビジン−ビオチン−フェノバル
ビタール二座配位子（1:1.16）32μｌ、抗体容量45μ
ｌ、及びサンプル容量３μｌを用いた。ラテックス粒子
のA/C比は0.45であった。リードウィンドウは、抗体ト
リガーが導入された後16〜48秒間であった。この分析結
果を表11に示す。
レングリコール（“PEG"）、0.003％EDTA、200単位/ml
ヘパリン、及びトリトンＸ−100（濃度1.1％、1.6％ま
たは2.1％のいづれか）を含む検定緩衝液を用いて免疫
検定を行った。検定には、緩衝液容量230μｌ、直径60n
mのラテックス粒子−アビジン−ビオチン−フェノバル
ビタール二座配位子（1:1.16）32μｌ、抗体容量45μ
ｌ、及びサンプル容量３μｌを用いた。ラテックス粒子
のA/C比は0.45であった。リードウィンドウは、抗体ト
リガーが導入された後16〜48秒間であった。この分析結
果を表11に示す。
表11に示したように、免疫検定にトリトンＸ−100を
使用すると、上記の所望のパラメーターに合う免疫検定
において60nm粒子を使用することができた。これによっ
て本発明の一般的な有用性が証明された。
使用すると、上記の所望のパラメーターに合う免疫検定
において60nm粒子を使用することができた。これによっ
て本発明の一般的な有用性が証明された。
本発明の特異な実施態様に関連づけて本発明を説明し
てきたが、これはさらに変更可能であることが理解され
るであろうし、この出願は、本発明が関係する技術分野
における公知または慣用的実施の範囲内の、そしてこれ
までに述べた本質的特徴に適合する、そして添付の請求
の範囲の範囲内に入るような本開示からの逸脱を含む、
本発明の原理に一般的にしたがういかなる変更、用途ま
たは応用をも包含するように意図されたものである。
てきたが、これはさらに変更可能であることが理解され
るであろうし、この出願は、本発明が関係する技術分野
における公知または慣用的実施の範囲内の、そしてこれ
までに述べた本質的特徴に適合する、そして添付の請求
の範囲の範囲内に入るような本開示からの逸脱を含む、
本発明の原理に一般的にしたがういかなる変更、用途ま
たは応用をも包含するように意図されたものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/543 ５８３ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５８３
(72)発明者 キム、 ジュリー エス
アメリカ合衆国 92670 カリフォルニ
ア州 プラセンティア サン ジュアン
レイン 736
(72)発明者 オー、 チャン エス
アメリカ合衆国 91709 カリフォルニ
ア州 チノ ヒルズ エクィライム ド
ライブ 15962
(56)参考文献 特開 昭60−53846（ＪＰ，Ａ)
特表 平３−501653（ＪＰ，Ａ)
特表 平２−503029（ＪＰ，Ａ)
特表 平２−501410（ＪＰ，Ａ)
国際公開92／012429（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53 - 33/577
Claims (27)
- 【請求項１】試験サンプル中の標的被験体の存在を測定
する免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、可
溶性の二座配位子試薬と、アビジン及びストレプトアビ
ジンからなるグループから選択されるビオチン結合剤
と、デタージェントとに試験サンプルを接触させること
により反応混合物を形成するステップであって、前記デ
タージェントは前記反応混合物中に約１％より高い選択
された濃度で存在し、前記可溶性の二座配位子試薬は、
ビオチンメンバーと、被検体メンバーと、スペーサーメ
ンバーとを含み、（ｉ）前記試薬のビオチンメンバー
は、固体支持体に固定された前記ビオチン結合剤と結合
可能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検体メンバ
ーは前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能であり、
（iii）前記中間スペーサーメンバーは、前記被検体メ
ンバーが前記抗標的被検体抗体と結合し、同時に、前記
ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤と結合すること
を可能にするのに十分な長さがある、反応混合物形成す
るステップと、 （２）前記二座配位子試薬と、前記ビオチン結合剤と、
前記抗標的被検体抗体との間で複合体を形成することが
できるのに十分な条件下で前記反応混合物をインキュベ
ーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記試験サンプル中の前記標的被検体の存在を測定するス
テップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを異なる試験デタージェン
ト濃度で実施することにより決定される、試験サンプル
中の標的被検体の存在を測定する免疫検定方法。 - 【請求項２】前記デタージェントは、アルキルポリオキ
シエチレンエーテルと、アルキルフェニルポリオキシエ
チレンエーテルと、アシルポリオキシエチレンソルビタ
ンエステルとからなるグループから選択される、請求項
１に記載の免疫検定方法。 - 【請求項３】前記デタージェントはアルキルフェニルポ
リオキシエチレンエーテルである、請求項２に記載の免
疫検定方法。 - 【請求項４】前記標的被検体はフェニトイン及びフェノ
バルビタールからなるグループから選択される、請求項
１に記載の免疫検定方法。 - 【請求項５】ｉ）前記標的被検体はフェニトインで、i
i）前記第１の較正濃度は約2.5μg/mlで、iii）前記第
２の較正濃度は約40μg/mlである、請求項１に記載の免
疫検定方法。 - 【請求項６】ｉ）前記標的被検体はフェノバルビタール
で、ii）前記第１の較正濃度は約５μg/mlで、iii）前
記第２の較正濃度は約80μg/mlである、請求項１に記載
の免疫検定方法。 - 【請求項７】前記固体支持体は、約38nmから約100nmま
での直径を有する粒子である、請求項１に記載の免疫検
定方法。 - 【請求項８】前記粒子は約60nmの直径を有する、請求項
７に記載の免疫検定方法。 - 【請求項９】前記固体支持体はラテックスである、請求
項１に記載の免疫検定方法。 - 【請求項１０】試験サンプル中の標的被検体の存在を測
定する免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、二
座配位子試薬と、デタージェントとに試験サンプルを接
触させることにより反応混合液を形成するステップであ
って、前記デタージェントは約１％より高い選択された
濃度で反応混合液中に存在し、前記可溶性の二座配位子
試薬は、ビオチンメンバーと、被検体メンバーと、該ビ
オチンメンバー及び被検体メンバーとの間のスペーサメ
ンバーとを含み、（ｉ）前記試薬のビオチンメンバー
は、アビジン及びストレプトアビジンからなるグループ
から選択され、固体支持体に固定された、ビオチン結合
剤と結合可能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検
体メンバーは前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能
であり、（iii）中間にある前記スペーサメンバーは、
前記被検体メンバーが前記抗標的被検体抗体と結合し、
同時に、前記ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤に
結合するのに十分な長さであり、（iv）前記二座配位子
試薬は前記ビオチン結合剤に結合している、反応混合液
を形成するステップと、 （２）前記二座配位子試薬と前記抗標的被検体抗体との
間で複合体を形成可能となるのに十分な条件下で、前記
反応混合物をインキュベーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記標的被検体の存在を測定するステップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを異なる試験デタージェン
ト濃度で実施することにより決定される、試験サンプル
中の標的被検体の存在を測定する免疫検定方法。 - 【請求項１１】前記デタージェントは、アルキルポリオ
キシエチレンエーテルと、アルキルフェニルポリオキシ
エチレンエーテルと、アシルポリオキシエチレンソルビ
タンエステルからなるグループから選択される、請求項
10に記載の免疫検定方法。 - 【請求項１２】前記デタージェントはアルキルポリオキ
シエチレンエーテルえある、請求項11に記載の免疫検定
方法。 - 【請求項１３】前記固体支持体は、約38nmから約100nm
までの直径を有する粒子である、請求項10に記載の免疫
検定方法。 - 【請求項１４】前記粒子は約60nmの直径を有する、請求
項13に記載の免疫検定方法。 - 【請求項１５】前記固体支持体はラテックスである、請
求項10に記載の免疫検定方法。 - 【請求項１６】ｉ）前記標的被検体はフェニトインで、
ii）前記第１の較正濃度は約2.5μg/mlで、iii）前記第
２の較正濃度は約40μg/mlである、請求項10に記載の免
疫検定方法。 - 【請求項１７】前記デタージェントは、アルキルポリオ
キシエチレンエーテルと、アルキルフェニルポリオキシ
エチレンエーテルと、アシルポリオキシエチレンソルビ
タンエステルとからなるグループから選択される、請求
項16に記載の免疫検定方法。 - 【請求項１８】前記標的被検体はフェニトイン及びフェ
ノバルビタールからなるグループから選択される、請求
項10に記載の免疫検定方法。 - 【請求項１９】ｉ）前記標的被検体はフェノバルビター
ルで、ii）前記第１の較正濃度は約５μg/mlで、iii）
前記第２の較正濃度は約80μg/mlである、請求項10に記
載の免疫検定方法。 - 【請求項２０】試験サンプル中の標的被検体の存在を測
定する均質免疫検定方法であって、 （１）標的被検体に結合可能な抗標的被検体抗体と、二
座配位子試薬と、該二座配位子試薬に結合可能でラテッ
クス粒子上に固定された二座配位子結合剤と、デタージ
ェントとに試験サンプルを接触させることにより反応混
合液を形成するステップであって、前記デタージェント
は約１％より高い選択された濃度で反応混合液中に存在
し、前記二座配位子試薬は、ビオチンメンバーと、被検
体メンバーと、スペーサメンバーとを含み、（ｉ）前記
試薬のビオチンメンバーは前記ビオチン結合剤に結合可
能であり、（ii）前記二座配位子試薬の被検体メンバー
は前記抗標的被検体抗体に特異的に結合可能であり、
（iii）中間にある前記スペーサメンバーは、前記被検
体メンバーが前記抗標的被検体抗体に結合し、同時に、
前記ビオチンメンバーが前記ビオチン結合剤に結合する
のに十分な長さである、反応混合液を形成するステップ
と、 （２）前記二座配位子試薬と、ラテックス粒子上に固定
された前記二座配位子結合剤と、前記抗標的被検体抗体
との複合体が形成可能となるのに十分な条件下で、前記
反応混合液をインキュベーションするステップと、 （３）前記サンプル中の前記標的被検体の濃度に反比例
する前記複合体の形成の程度を計測することにより、前
記標的被検体の存在を測定するステップとを含み、 前記選択されたデタージェントの濃度は、 （ａ）ゼロでない生理学的に有意義な前記標的被検体の
第１の較正濃度を同定すること、 （ｂ）前記第１の較正濃度より高い、生理学的に有意義
な前記標的被検体の第２の較正濃度を同定すること、 （ｃ）ｉ）前記標的被検体濃度０μg/mlで、約0.2O.D.
単位／分より高い複合体形成速度を有し、ii）第２の較
正濃度で、約0.02O.D.単位／分より高い複合体形成速度
を有し、iii）前記標的被検体濃度０μg/mlでの反応速
度の少なくとも約75％に等しい第１の較正濃度での複合
体形成速度を有し、iv）前記標的被検体濃度０μg/mlで
の反応速度の25％未満の第２の較正濃度での複合体形成
速度を有する免疫検定が達成されるまで、前記（１）、
（２）及び（３）のステップを少なくとも２つの異なる
試験デタージェント濃度で実施することにより決定さ
れ、 前記デタージェントは、アルキルポリオキシエチレンエ
ーテルと、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテ
ルと、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルと
からなるグループから選択される、試験サンプル中の標
的被検体の存在を測定する均質免疫検定方法。 - 【請求項２１】前記ラテックス粒子は熱応力が加えられ
ている、請求項20に記載の免疫検定方法。 - 【請求項２２】前記二座配位子結合剤は、アビジン及び
ストレプトアビジンからなるグループから選択される、
請求項20に記載の免疫検定方法。 - 【請求項２３】前記ラテックス粒子は約60nmの直径を有
する、請求項20に記載の免疫検定方法。 - 【請求項２４】前記標的被検体は、フェニトイン及びフ
ェノバルビタールからなるグループから選択される、請
求項20に記載の免疫検定方法。 - 【請求項２５】ｉ）前記標的被検体はフェニトインで、
ii）前記第１の較正濃度は約2.5μg/mlで、iii）前記第
２の較正濃度は約40μg/mlである、請求項20に記載の免
疫検定方法。 - 【請求項２６】ｉ）前記標的被検体はフェノバルビター
ルで、ii）前記第１の較正濃度は約５μg/mlで、iii）
前記第２の較正濃度は約80μg/mlである、請求項20に記
載の免疫検定方法。 - 【請求項２７】前記デタージェントはアルキルフェニル
ポリオキシエチレンエーテルである、請求項20に記載の
免疫検定方法。
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