JP3544968B2

JP3544968B2 - Human hemoglobin detector

Info

Publication number: JP3544968B2
Application number: JP2002164922A
Authority: JP
Inventors: 昌彦木下; 哲央小池; 剛史土江
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd; Tauns Laboratories Inc
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd; Tauns Laboratories Inc
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2004-07-21
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: JP2003028861A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糞便中のヒトヘモグロビン（以下、ヒトＨｂとよぶ）を検出するための装置に関する。さらに詳しくは、消化管の腫瘍性機転を引き起こす疾患などの診断および治療上重要である、便潜血検出のための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以前は、糞便中の潜血の検出の方法として、Ｈｂのペルオキシダーゼ様作用を利用した非特異的な検出法が用いられていた。しかし、この方法は食肉中のヘモグロビンやその他の物質によっても反応が陽性となるため、検査前の厳しい食事制限が必要なうえ、正確度にも問題があった。
【０００３】
近年、抗ヒトＨｂ抗体によるヒトＨｂの免疫学的測定法（バロウズ（Ｂａｒｒｏｗｓ）、アメリカンジャーナルオブクリニカルパソロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉ．Ｐａｔｈｏｌ．）６９３４２−３４６，１９７８参照）が開発されて以来、食事制限を必要としない糞便中の潜血の検出法がつぎつぎと開発されている。
【０００４】
特開昭５６−１０６１５４号公報では、サンドイッチＥＩＡまたは競合的ＥＩＡなどによりＨｂを検出する方法が述べられている。これらの方法は非常に高感度かつ特異的であるという利点を有する。しかし、その反面操作手順が多く煩雑で、測定には長時間を要するため、使用者の熟練が必要であり、使用する場面も限られたものとなるという欠点を有する。
【０００５】
特開昭５９−１２５０６４号公報では、抗Ｈｂ抗体感作ラテックスを用いた免疫学的ラテックス凝集反応によるＨｂの検出方法が記載されている。この方法は、操作が簡便であるという利点を有する。しかし、反応時間を厳守しないばあいは正確さに問題があり、判定が肉眼によるラテックスの凝集の有無の確認により行なわれるため紛らわしく、集団検診などの多検体同時処理には適さないという欠点を有する。また、便懸濁液をスライド板上で反応させなくてはならないため、使用者に臭気、不潔感などの不快感を与えるという欠点も有する。
【０００６】
これに関して、特開平１−１６１１５２号公報では、抗Ｈｂ抗体で感作したラテックスによる凝集反応を光学的に検出する自動化した機械について述べられている。この方法では、Ｈｂを定量的に測定でき判定の紛らわしさはなくなり、また自動化により操作性、作業者の不快さの点でも改善された。しかし、機械自体非常に高価なものとなり、集団検診用として多検体処理する際には適しているが、家庭および医院で少ない検体数を測定するには不向きである。
【０００７】
特開昭５９−１８２３６７号および特開昭６１−２２８３５１号公報には、便に直接スティックまたはサジを接触させてヒトＨｂを吸着させ洗浄したのち、これを特異的反応に付す方法が記載されている。また、特開昭６０−１７３４７１号公報には、抗Ｈｂ抗体を固定化した濾紙上に便を適用し、洗浄する方法が記載されている。しかし、これらの方法はいずれも洗浄および発色などの操作を必要とし、煩雑であるという欠点を有する。
【０００８】
特開平２−１４１６６５号公報には、抗Ｈｂモノクロナール抗体を感作した金コロイド粒子の凝集による色調の変化により検出する方法について記載されている。この方法は、結果の安定性、判定の容易性、操作の簡便性の点ですぐれているが、反応時間が数１０分と長くかかるという欠点がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、家庭においても糞便中の潜血を測定できるよう、操作、判定の容易性および判定結果の安定性を兼ね備え、さらに作業者の不快感を除いた、操作が容易で短時間にヒトＨｂを検出しうる安価な装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的に鑑み鋭意検討を重ねた結果、ヒトＨｂ検出において、試料中のヒトＨｂと特異的に結合する抗体をクロマトグラフ媒体に組み込んだサンドイッチイムノアッセイと、反応・未反応成分の分離のためのクロマトグラフをあわせて行なうイムノクロマトグラフ法を、ヒトＨｂと抗体との凝集反応による妨害を受けない一定条件下で行なわせる装置により目的が達成されることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、着色粒子により標識化された、試料中のヒトヘモグロビンと特異的に結合する第１の抗体が含浸された部位（１）を有する多孔性マトリックスと、試料中のヒトヘモグロビンと特異的に結合する第２の抗体が固定化された反応部位（２）を有する多孔性マトリックスとを有する試料中のヒトヘモグロビン検出装置であって、該部位（１）を有する多孔性マトリックスと該反応部位（２）を有する多孔性マトリックスとが別の多孔性マトリックスからなり、該部位（１）と該反応部位（２）との距離が０．５ｃｍ以上４ｃｍ以下である、ヒトヘモグロビン検出装置に関する。
【００１２】
つぎに本発明の装置について説明する。
【００１３】
本発明の装置は、第１の抗体が含浸された部位（１）および第２の抗体が固定化された反応部位（２）を有するクロマトグラフ媒体（３）からなる装置である。
【００１４】
本発明の第１の抗体としては、ヒトＨｂに対するモノクローナル抗体が用いられる。第２の抗体としては、ヒトＨｂと特異的に結合しうる抗体であれば、とくに限定されない。
【００１５】
第１の抗体は、着色粒子により標識化される。この標識化に用いられる着色粒子は肉眼により検出しうる粒子であればとくに限定されないが、好ましくは、たとえば金コロイドなどの金属コロイドまたは着色ラテックスが用いられる。該粒子の大きさは、通常直径約２０〜３００ｎｍの範囲であるが、それ以外の大きさの粒子も用いうる。
【００１６】
このような粒子による第１の抗体の標識化は、着色粒子表面への抗体の吸着により行なうことができる。たとえば着色粒子として金コロイドを用いるばあい、抗体と金コロイドとをすみやかに混合し、１〜２分インキュベーションしたのち、そこへ非特異的な凝集を防ぐためにポリエチレングリコールまたは牛血清アルブミンなどを加える。ついで、高速で遠心分離して上清を吸引除去する。えられた沈殿をポリエチレングリコールまたは牛血清アルブミンなどを含有する緩衝液に再懸濁して、遠心処理により残っている標識化されていない抗体を除くことにより、着色粒子により標識化された抗体がえられる（ジョージガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ）ら、ジャーナルオブイムノロジカルメソッズ（ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ）３４，１１−２１，１９８０など参照）。
【００１７】
着色粒子により標識化された第１の抗体は、クロマトグラフ媒体の一部分に含浸・乾燥されていてもよいし、またはクロマトグラフ媒体とは別の繊維の多孔性マトリックスに含浸・乾燥され、該マトリックスがクロマトグラフ媒体と接触させられていてもよい。このようなマトリックスとしては、好ましくは不織布またはフェルトなどが用いられる。
【００１８】
第２の抗体は、クロマトグラフ媒体の一定の部位に固定化される。
【００１９】
固定化の方法は、クロマトグラフ媒体の種類によって異なるが、通常の濾紙、ガラスフィルター、ナイロンメンブレンなどのばあい、抗体はまずラテックス粒子と結合される。使用するラテックス粒子はフィルターの目の大きさ（保留粒子径）よりも大きな粒子径のものを用いるか、小さな粒子径のものを凝集させて用いる。
【００２０】
第２の抗体とラテックス粒子とを結合させた固相ラテックスは通常の方法により行なわれ調製される。たとえば、抗体とラテックスエマルジョンを室温で約２時間インキュベーションし、ついで牛血清アルブミンなどを含有する緩衝液を加え、遠心分離する。えられた沈殿を同じ緩衝液により１〜３回、懸濁・遠心分離操作を行なうことにより洗浄し、ラテックス粒子と結合された抗体、すなわち固相ラテックスがえられる。
【００２１】
ラテックス粒子と結合された抗体は、前記緩衝液に懸濁された状態で、スポッティングまたは直接噴射印刷されることにより固定化される。
【００２２】
一方、ニトロセルロースメンブレンやある種の活性化されたメンブレンでは、抗体溶液をそのままスポッティングまたは直接噴射印刷されることにより固定化される。
【００２３】
第２の抗体が固定化される部位は以下に述べる理由から、クロマトグラフ媒体上に、第１の抗体が含浸された部位から下流方向に０．５ｃｍ以上４ｃｍ以下、好ましくは０．５ｃｍ以上２ｃｍ以下の距離にあることが必要である。すなわち、ヒトＨｂはαおよびβ各２つのサブユニットからなる４量体であるという特殊な構造を有するため、１つのヘモグロビンあたり同一の抗原決定基を２つずつ有することになる。このため第１の抗体としてモノクローナル抗体を用いてもクロマトグラフ媒体中で、ヒトＨｂ・標識化抗体結合物が凝集塊を形成し、展開不能となってしまう。しかし、標識化抗体と反応部位との距離が４ｃｍ以下、とくに２ｃｍ以下であるばあいは、ヒトＨｂ・標識化抗体結合物は凝集塊の成長により展開が不能となる以前にすみやかに展開されて固定化抗体に捕捉されることが見出されたのである。一方、０．５ｃｍより短い距離のばあいは、第１の抗体が、抗原（ヒトＨｂ）と接触し、第２の抗体に達するまでの時間が短く、つまりは抗原抗体反応に要する充分な時間がえられないために、充分な感度がえられない。したがって０．５ｃｍ以上の距離が必要である。
【００２４】
本発明の装置において用いられるクロマトグラフ媒体は、便懸濁液試料を展開できるものであればとくに限定されないが、試料の吸着がなく、均一で速い展開速度がえられるため、ガラスフィルターがとくに好ましい。このクロマトグラフ媒体の多孔性マトリックスは短冊状に成型して用いる。
【００２５】
本発明の装置は、便懸濁液試料を装置に適用する際に、試料を一時的に吸収、濾過するためのサンプルパッド（４）を有していてもよい。このようなサンプルパッドとしては、繊維の多孔性マトリックス、好ましくは不織布またはフェルトなどをクロマト展開に必要なサンプル量を保持できる程度の大きさにしたものが用いられる。該サンプルパッドは、第１の抗体含浸部位と該部位の下流側で一部重復してクロマトグラフ媒体上に位置する。このサンプルパッドにより便懸濁液が濾過されるため、事前に便中に含まれる繊維などの不溶物を除く操作が不要となる。
【００２６】
本発明の装置は、展開し終えた試料を保持するための吸水パッド（６）を有していてもよい。この吸水パッドは、吸水性の高い多孔性マトリックスからなる。該吸水パッドは展開し終えた試料をすべて保持するのに充分な大きさを有し、クロマトグラフ媒体の下流末端と重複して位置する。
【００２７】
本発明の装置は、ハウジング（５）を有していてもよい。ハウジングは、非浸水性の成形可能な材質、たとえばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、カルプまたはポリプロピレンなどからなり、サンプルパッド、クロマトグラフ媒体および吸水パッドからなる装置全体を被い、かつ試料適用部位および第２抗体固定化部位に窓が設けられている形状を有する。このハウジングを設けることにより、臭気や便懸濁液が漏出するのを防ぐことができる。
【００２８】
本発明の装置を用いた便懸濁液中のヒトＨｂの検出は以下のようにして行なわれる。すなわち、第一の抗体（１）が含浸された部位の側に試験試料を接触させ、ヒトＨｂを標識化された第一の抗体と反応させ、形成されたヒトＨｂ・第一抗体・着色粒子複合体をさらに該クロマトグラフ媒体（３）上で移動させ、固定化された第二の抗体（２）と反応させ、補足させることにより、試料中のヒトＨｂの有無を着色シグナルとして表現する。反応部位に着色シグナルが現われるか否かによって、試料中のヒトＨｂの有無を判定することができる。ここで、便を懸濁するための溶媒は、とくに限定されないが、たとえば０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水などが用いられる。
【００２９】
【実施例】
つぎに実施例に基づいて本発明をさらにくわしく説明するが、本発明はもとよりこれらに限られるものではない。
【００３０】
実施例
（ヒトＨｂのイムノクロマトグラフィーによるアッセイ）
（ａ）固相ラテックスの調製
市販ラテックスエマルジョン（積水化学工業株式会社製、Ｎ−４５０）を固形分濃度が０．６重量％となるようリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）により希釈した。その１ｍｌと、ヒトＨｂに対するウサギ抗体を濃度１００ μｇ／ｍｌとしたもの１ｍｌとをエッペンドルフ遠沈管に採り、室温で２時間インキュベーションしてラテックス粒子にウサギ抗体を感作させた。ついで濃度０．１重量％のウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を含有するＰＢＳを用いて３回、８０００Ｇにて１０分間遠心沈降処理によって洗浄し、最終的に２ｍｌとなるよう再懸濁することにより、固相ラテックスを調製した。
【００３１】
（ｂ）金コロイド粒子の調製
金コロイド粒子の調製は、ジーフレンス（Ｇ．Ｆｒｅｎｓ）の方法（ネイチャーフィジカルサイエンス（ＮＡＴＵＲＥＰＨＹＳＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ）２４１Ｊａｎ．１１９７３年参照）にしたがった。すなわち、濃度０．０１重量％の塩化金水溶液２００ｍｌを沸騰させ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液２ｍｌを加えた。溶液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わるまで加熱沸騰を行なうことにより、平均粒子径が０．０４μｍの金コロイド分散液を調製した。
【００３２】
（ｃ）金コロイド粒子標識抗体の調製
金濃度が０．０１重量％である前記の金コロイド分散液を１Ｍ炭酸カリウム溶液を用いてｐＨを６．７に調製した。これにヒトＨｂに対するモノクロナール抗体を、金コロイド分散液１ｍｌあたり５μｇとなる割合で加えた。１〜２分後、その１０ｍｌに濃度１０重量％のＢＳＡを０．１ｍｌ加え、１０，２００Ｇで１時間遠心沈降処理して上清を除去し、ＢＳＡを濃度０．１重量％で含有するＰＢＳを用いて３回、１０２００Ｇにて１時間遠心沈降処理により洗浄し、金コロイド粒子標識された第１の抗体を調製した。これを前記ＰＢＳ１０ｍｌに再分散させ、０．１ｍｌを５×１０ｍｍのベンリーゼ不織布（商品名、旭化成工業株式会社製）に含浸させ凍結乾燥した。
【００３３】
（ｄ）クロマトグラフ媒体の調製
市販ガラスフィルター（アドバンテック東洋製、ＧＣ−５０）より１０×１００ｍｍの膜ストリップを裁断し、これをガラス板上に置き、取り扱いやすくするために粘着テープにより固定した。ストリップの端から０．２、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０または５．０ｃｍの位置に、アキュラジェッター液体噴射装置（商品名、ノードソン社製）およびＸＹテーブルエアロステージ（商品名、ＴＨＫ社製）を用いて、展開方向に垂直に、すなわちストリップの短辺と平行に固相ラテックス１μｌを１０ｍｍの長さに噴射印刷した。
【００３４】
（ｅ）装置の組立
１０×１２０ｍｍの粘着シート上に前記クロマトグラフストリップを、横幅１０ｍｍを揃えて、ラテックスを噴射印刷した部位より遠い方の端をそろえて置き、さらにその上に３方の端をそろえて１０×４０ｍｍの濾紙（ワットマン製、１７Ｃｈｒ）を重ね、テープでとめた。もう一方の前記のクロマトグラフストリップの端には、前記の金コロイド標識抗体含有不織布が２．５ｍｍ重なるように置いた。さらに前記の金コロイド標識抗体含有不織布に２．５ｍｍ重なるように、サンプルパッドとして１０×２０ｍｍのベンリーゼ不織布を置いた。
【００３５】
（ｆ）ヒトＨｂ含有試料の調製
ヒトＨｂ（シグマ製）を、濃度０．１重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳにより希釈して、ヒトＨｂ濃度がそれぞれ０．１、１．０、１０および１００ μｇ／ｍｌのヒトＨｂ含有試料を調製した。
【００３６】
（ｇ）アッセイ
前記のヒトＨｂ含有試料２００ μｌまたはブランクとして濃度０．１重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳ２００ μｌを前記（ｅ）においてえられた装置のサンプルパッドに滴下し、当該試料を展開させた。５分間の経過後、反応部位におけるラインの有無を観察した。
【００３７】
反応部位に何も現われなかったばあいを−、わずかにラインが認められるばあいを±、ラインが認められるばあいを＋およびはっきりとしたラインが認められるばあいを＋＋と評価した。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
表１より以下のことがわかる。すなわち、標識化抗体含浸部位と反応部位との距離が５．０ｃｍのばあい、試料中のＨｂ濃度が１０μｇ／ｍｌ以上になると反応部位におけるラインがあいまいになり、Ｈｂ濃度が１００ μｇ／ｍｌ以上では陰性の結果が出てしまう。一方、標識化抗体含浸部位と反応部位との距離が０．２ｃｍのばあい、試料中のＨｂ濃度が１μｇ／ｍｌでは反応部位におけるラインが少しあいまいになる。これに対して、標識化抗体含浸部位と反応部位との距離が０．５ｃｍ以上４．０ｃｍ以下であるときは、試料中の幅広い濃度範囲において安定な判定結果がえられる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、家庭でも短時間で容易に安定な判定結果がえられ、しかも作業者の不快感をなくした簡便なＨｂ検出装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の平面図である。
【図２】サンプルパッドと吸水パッドを備えた本発明の装置の平面図である。
【図３】図２の装置の側面図である。
【図４】ハウジングを備えた本発明の装置の平面図である。
【図５】図４の装置の側面の断面図である。
【符号の説明】
１標識化抗体含浸部位
２反応部位
３クロマトグラフ媒体
４サンプルパッド
５ハウジング
６吸水パッド
７粘着シート[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to an apparatus for detecting human hemoglobin (hereinafter referred to as human Hb) in feces. More specifically, the present invention relates to an apparatus for detecting fecal occult blood, which is important for diagnosis and treatment of diseases causing neoplastic mechanisms of the gastrointestinal tract.
[0002]
[Prior art]
Previously, as a method of detecting occult blood in feces, a non-specific detection method utilizing the peroxidase-like action of Hb was used. However, this method also requires a strict dietary restriction before the test because of a positive reaction due to hemoglobin and other substances in meat, and also has a problem in accuracy.
[0003]
In recent years, an immunoassay for human Hb using an anti-human Hb antibody (see Burrows, American Journal of Clinical Pathology (Am. J. Cli. Pathol.) 69 342-346, 1978) has been developed. Methods for detecting fecal occult blood that do not require dietary restriction are being developed one after another.
[0004]
JP-A-56-106154 describes a method of detecting Hb by sandwich EIA or competitive EIA. These methods have the advantage of being very sensitive and specific. However, on the other hand, there are drawbacks in that the operation procedures are many and complicated, and the measurement requires a long time, so that the skill of the user is required and the use scene is limited.
[0005]
JP-A-59-125064 describes a method for detecting Hb by immunological latex agglutination using an anti-Hb antibody-sensitized latex. This method has an advantage that the operation is simple. However, if the reaction time is not strictly adhered to, there is a problem in accuracy, it is confusing because the judgment is made by confirming the presence or absence of latex aggregation by the naked eye, and has a drawback that it is not suitable for simultaneous processing of multiple samples such as mass screening. . In addition, since the stool suspension must be reacted on the slide plate, it has the disadvantage of giving the user discomfort such as odor and uncleanness.
[0006]
In this regard, JP-A-1-161152 describes an automated machine for optically detecting an agglutination reaction by a latex sensitized with an anti-Hb antibody. According to this method, Hb can be measured quantitatively, the confusing of the judgment has been eliminated, and the automation has improved the operability and the discomfort of the operator. However, the machine itself becomes very expensive and is suitable for processing multiple samples for mass screening, but is not suitable for measuring a small number of samples at home and in a clinic.
[0007]
JP-A-59-182667 and JP-A-61-228351 describe a method in which human Hb is adsorbed and washed by directly contacting a stick or saji with stool and then subjected to a specific reaction. I have. Further, Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-173471 describes a method of applying stool to a filter paper on which an anti-Hb antibody is immobilized and washing the filter paper. However, these methods all require operations such as washing and coloring, and have the disadvantage of being complicated.
[0008]
JP-A-2-141665 describes a method for detecting an anti-Hb monoclonal antibody by a change in color tone due to aggregation of sensitized colloidal gold particles. This method is excellent in stability of results, easiness of judgment, and simplicity of operation, but has a disadvantage that the reaction time is as long as tens of minutes.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention combines the ease of operation, determination, and stability of the determination result so that occult blood in feces can be measured even at home, and furthermore, eliminates the discomfort of an operator, is easy to operate, and reduces human Hb in a short time. It is an object of the present invention to provide an inexpensive device capable of detecting the inconvenience.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above-mentioned object, and as a result, in the detection of human Hb, a sandwich immunoassay in which an antibody that specifically binds to human Hb in a sample is incorporated into a chromatographic medium, and a reaction / unreacted component It has been found that the object can be achieved by an apparatus for performing an immunochromatography method in which chromatographs for separation of Hb are combined with each other under constant conditions not hindered by an agglutination reaction between human Hb and an antibody, thereby completing the present invention. Reached.
[0011]
The present invention provides a porous matrix having a site (1) impregnated with a first antibody that specifically binds to human hemoglobin in a sample, which is labeled with colored particles, A device for detecting human hemoglobin in a sample, comprising: a porous matrix having a reaction site (2) to which a second antibody that binds to a substrate is immobilized, wherein the porous matrix having the site (1) and the reaction site The present invention relates to a human hemoglobin detection device, wherein the porous matrix having (2) is formed of another porous matrix, and the distance between the site (1) and the reaction site (2) is 0.5 cm or more and 4 cm or less.
[0012]
Next, the device of the present invention will be described.
[0013]
The device of the present invention is a device comprising a chromatographic medium (3) having a site (1) impregnated with a first antibody and a reaction site (2) immobilized with a second antibody.
[0014]
As the first antibody of the present invention, a monoclonal antibody against human Hb is used. The second antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to human Hb.
[0015]
The first antibody is labeled with a colored particle. The colored particles used for this labeling are not particularly limited as long as they are particles that can be detected by the naked eye, but preferably, a metal colloid such as a gold colloid or a colored latex is used. The size of the particles is usually in the range of about 20 to 300 nm in diameter, but particles of other sizes can also be used.
[0016]
Labeling of the first antibody with such particles can be performed by adsorption of the antibody on the surface of the colored particles. For example, when colloidal gold is used as the colored particles, the antibody and the colloidal gold are promptly mixed and incubated for 1 to 2 minutes, and then polyethylene glycol or bovine serum albumin is added thereto to prevent non-specific aggregation. Subsequently, centrifugation is performed at a high speed to remove the supernatant by suction. The precipitate obtained is resuspended in a buffer containing polyethylene glycol or bovine serum albumin, etc., and the remaining unlabeled antibody is removed by centrifugation to obtain the antibody labeled with the colored particles. (See Geoghegan et al., J Immunol Methods 34, 11-21, 1980).
[0017]
The first antibody labeled with the colored particles may be impregnated and dried on a portion of the chromatographic medium, or may be impregnated and dried on a porous matrix of fibers separate from the chromatographic medium. May have been contacted with the chromatographic medium. As such a matrix, a nonwoven fabric or felt is preferably used.
[0018]
The second antibody is immobilized at a fixed site on the chromatographic medium.
[0019]
The method of immobilization varies depending on the type of chromatographic medium, but in the case of ordinary filter paper, glass filter, nylon membrane, etc., the antibody is first bound to latex particles. As the latex particles to be used, particles having a particle size larger than the size of the filter (retained particle size) or particles having a smaller particle size are aggregated and used.
[0020]
The solid phase latex in which the second antibody and latex particles are bound is prepared and prepared by a usual method. For example, the antibody and the latex emulsion are incubated at room temperature for about 2 hours, and then a buffer containing bovine serum albumin and the like is added, followed by centrifugation. The obtained precipitate is washed by carrying out suspension and centrifugation operations 1 to 3 times with the same buffer to obtain an antibody bound to latex particles, that is, a solid phase latex.
[0021]
The antibody bound to the latex particles is immobilized by spotting or direct jet printing while suspended in the buffer.
[0022]
On the other hand, with nitrocellulose membranes or certain activated membranes, the antibody solution is immobilized by spotting or directly jet printing the antibody solution.
[0023]
The site where the second antibody is immobilized is 0.5 cm 2 or more and 4 cm or less, preferably 0.5 cm 2 or more and 2 cm or less in the downstream direction from the site where the first antibody is impregnated on the chromatographic medium for the reason described below. It is necessary to be at the following distance. That is, human Hb has a special structure such as a tetramer composed of two subunits, α and β, and therefore has two identical antigenic determinants per hemoglobin. For this reason, even when a monoclonal antibody is used as the first antibody, the conjugate of human Hb / labeled antibody forms an aggregate in the chromatographic medium and cannot be developed. However, when the distance between the labeled antibody and the reaction site is 4 cm or less, particularly 2 cm or less, the conjugate of human Hb / labeled antibody is rapidly developed before the development becomes impossible due to the growth of aggregates. It was found to be captured by the immobilized antibody. On the other hand, when the distance is shorter than 0.5 cm 2, the time required for the first antibody to contact the antigen (human Hb) and reach the second antibody is short, that is, a sufficient time required for the antigen-antibody reaction. As a result, sufficient sensitivity cannot be obtained. Therefore, a distance of 0.5 cm or more is required.
[0024]
The chromatographic medium used in the apparatus of the present invention is not particularly limited as long as it can develop a stool suspension sample, but a glass filter is particularly preferred because there is no adsorption of the sample and a uniform and fast developing speed can be obtained. . The porous matrix of the chromatographic medium is used after being shaped into a strip.
[0025]
The device of the present invention may have a sample pad (4) for temporarily absorbing and filtering the stool suspension sample when applying the sample to the device. As such a sample pad, a porous matrix of fibers, preferably a nonwoven fabric or a felt, having a size sufficient to hold a sample amount necessary for chromatographic development is used. The sample pad partially overlaps the first antibody-impregnated site on the downstream side of the site and is located on the chromatographic medium. Since the stool suspension is filtered by the sample pad, it is not necessary to perform an operation for removing insoluble matters such as fibers contained in the stool in advance.
[0026]
The device of the present invention may have a water absorbing pad (6) for holding the developed sample. This water-absorbing pad is made of a highly water-absorbing porous matrix. The water-absorbing pad is large enough to hold all of the developed sample and overlaps the downstream end of the chromatographic medium.
[0027]
The device of the invention may have a housing (5). The housing is made of a non-water immersible moldable material, such as polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, carp or polypropylene, covers the entire device consisting of the sample pad, the chromatographic medium and the water absorbing pad, and has a sample application site and It has a shape in which a window is provided in the second antibody immobilization site. By providing this housing, it is possible to prevent the odor and the stool suspension from leaking.
[0028]
Detection of human Hb in a stool suspension using the device of the present invention is performed as follows. That is, the test sample is brought into contact with the side where the first antibody (1) is impregnated, and human Hb is reacted with the labeled first antibody to form human Hb, first antibody, and colored particles. The complex is further moved on the chromatographic medium (3), reacted with the immobilized second antibody (2), and supplemented, thereby expressing the presence or absence of human Hb in the sample as a colored signal. The presence or absence of human Hb in the sample can be determined by whether or not a colored signal appears at the reaction site. Here, the solvent for suspending the stool is not particularly limited, and for example, phosphate buffered saline containing 0.1% by weight of bovine serum albumin is used.
[0029]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0030]
Examples (Assay of human Hb by immunochromatography)
(A) Preparation of solid phase latex A commercially available latex emulsion (N-450, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) was treated with phosphate buffered saline (hereinafter, referred to as “PBS”) so that the solid content concentration was 0.6% by weight. Diluted. 1 ml of the mixture and 1 ml of a rabbit antibody against human Hb at a concentration of 100 μg / ml were placed in an Eppendorf centrifuge tube, and incubated at room temperature for 2 hours to sensitize the latex particles with the rabbit antibody. Then, the cells were washed three times with PBS containing bovine serum albumin (hereinafter referred to as "BSA") at a concentration of 0.1% by weight at 8000 G for 10 minutes, and resuspended to a final volume of 2 ml. Thus, a solid phase latex was prepared.
[0031]
(B) Preparation of colloidal gold particles The preparation of colloidal gold particles was carried out according to the method of G. Frens (see NATURE PHYSICAL SCIENCE 241 Jan. 1, 1973). That is, 200 ml of an aqueous solution of gold chloride having a concentration of 0.01% by weight was boiled, and 2 ml of an aqueous solution of sodium citrate having a concentration of 1% by weight was added thereto. By heating and boiling until the color of the solution changed from pale yellow to purple or red, a colloidal gold dispersion having an average particle size of 0.04 μm was prepared.
[0032]
(C) Preparation of Colloidal Gold Particle-Labeled Antibody The above colloidal gold dispersion having a gold concentration of 0.01% by weight was adjusted to pH 6.7 using a 1M potassium carbonate solution. To this was added a monoclonal antibody against human Hb at a rate of 5 μg per ml of colloidal gold dispersion. After 1-2 minutes, 0.1 ml of BSA having a concentration of 10% by weight was added to the 10 ml, and the supernatant was removed by centrifugation at 10,200 G for 1 hour to remove the supernatant, and PBS containing 0.1% by weight of BSA was removed. Was washed three times by centrifugation at 1,200 G for 1 hour to prepare a first antibody labeled with colloidal gold particles. This was redispersed in 10 ml of the PBS, and 0.1 ml was impregnated in a 5 × 10 mm Bemliese nonwoven fabric (trade name, manufactured by Asahi Kasei Corporation) and freeze-dried.
[0033]
(D) Preparation of Chromatographic Medium A 10 × 100 mm membrane strip was cut from a commercially available glass filter (manufactured by Advantech Toyo, GC-50), placed on a glass plate, and fixed with an adhesive tape for easy handling. At 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, or 5.0 cm from the end of the strip, an Acura Jetter liquid ejector (trade name, manufactured by Nordson) and XY Using a table aero stage (trade name, manufactured by THK), 1 μl of solid latex was jet-printed to a length of 10 mm perpendicular to the developing direction, that is, parallel to the short side of the strip.
[0034]
(E) Assembling of the device The chromatographic strip was placed on a 10 × 120 mm pressure-sensitive adhesive sheet with the same width of 10 mm, the edges farthest from the portion where the latex was jet-printed were aligned, and the three edges were further placed thereon. And a 10 × 40 mm filter paper (manufactured by Whatman, 17 Chr) was overlaid and taped. On the other end of the chromatographic strip, the gold-colloid-labeled antibody-containing nonwoven fabric was placed so as to overlap by 2.5 mm. Further, a 10 × 20 mm Bemliese nonwoven fabric was placed as a sample pad so as to overlap the above nonwoven fabric containing the colloidal gold-labeled antibody by 2.5 mm.
[0035]
(F) Preparation of human Hb-containing sample Human Hb (manufactured by Sigma) was diluted with PBS containing BSA at a concentration of 0.1% by weight so that human Hb concentrations were 0.1, 1.0, 10 and 100, respectively. A sample containing human Hb at μg / ml was prepared.
[0036]
(G) Assay 200 μl of the human Hb-containing sample or 200 μl of PBS containing BSA at a concentration of 0.1% by weight as a blank was dropped on the sample pad of the device obtained in (e) above, and the sample was developed. Was. After a lapse of 5 minutes, the presence or absence of a line at the reaction site was observed.
[0037]
When nothing appeared at the reaction site, it was evaluated as-, when a slight line was observed ±, when a line was observed +, and when a clear line was observed ++. Table 1 shows the results.
[0038]
[Table 1]

[0039]
Table 1 shows the following. That is, when the distance between the labeled antibody-impregnated site and the reaction site is 5.0 cm 2, when the Hb concentration in the sample becomes 10 μg / ml or more, the line at the reaction site becomes ambiguous, and the Hb concentration becomes 100 μg / ml or more. Would give a negative result. On the other hand, when the distance between the labeled antibody-impregnated site and the reaction site is 0.2 cm 2, when the Hb concentration in the sample is 1 μg / ml, the line at the reaction site becomes slightly ambiguous. On the other hand, when the distance between the labeled antibody-impregnated site and the reaction site is 0.5 cm or more and 4.0 cm or less, a stable determination result can be obtained in a wide concentration range in the sample.
[0040]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a simple Hb detection device which can easily obtain a stable determination result in a short time even at home and eliminates discomfort of an operator.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view of the device of the present invention.
FIG. 2 is a plan view of the device of the present invention provided with a sample pad and a water absorbing pad.
FIG. 3 is a side view of the device of FIG. 2;
FIG. 4 is a plan view of the device of the present invention with a housing.
FIG. 5 is a side sectional view of the apparatus of FIG. 4;
[Explanation of symbols]
1 Labeled antibody impregnated site 2 Reaction site 3 Chromatographic medium 4 Sample pad 5 Housing 6 Water absorption pad 7 Adhesive sheet

Claims

A porous matrix labeled with colored particles and having a site (1) impregnated with a first antibody that specifically binds to human hemoglobin in the sample; An apparatus for detecting human hemoglobin in a sample having a porous matrix having a reaction site (2) to which two antibodies are immobilized, wherein the porous matrix having the site (1) and the reaction site (2) are A human hemoglobin detection device, wherein the porous matrix comprises another porous matrix, and the distance between the site (1) and the reaction site (2) is 0.5 cm or more and 4 cm or less.