【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、化学発光検出法により物質を分析する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より過酸化物と反応して強い発光を与え、その発光量を測定することにより過酸化物を定量する事ができる化学発光試薬として、ルミノールが良く知られている。ルミノールの発光は、例えばハロゲン、鉄錯体、ヘミン、ヘモグロビン、酸化遷移金属など種々の化学発光触媒物質の存在下で起こるが、より優れた化学発光試薬を見いだすために、イソルミノールを始め多くの誘導体が開発されている。ルミノールによる化学発光系は、化学発光試薬であるルミノールと、酸化剤である酸化物および化学発光触媒物質であるヘモグロビンなどの物質の三者が存在して初めて発光現象を示すもので、この原理を応用して、過酸化水素及び過酸化物または化学発光触媒の分析が行われている。
過酸化水素は、生体内の種々の物質から各種オキシダーゼにより生成させることができ、固定化酵素カラムなどを用いることにより選択的に生成させ、過酸化水素を測定することで生体に関する有用な情報が得られることが期待される。またそれ自身は漂白剤、抗菌剤として用いられているため、残存濃度の把握が染色、排水処理などの工程で重要となっている。また過酸化物、例えば生体中の過酸化脂質は動脈硬化、肝疾患、糖尿病、脳血管障害など多くの疾患に関連することが報告されており、臨床や食品化学等における測定はますます重視されている。
【０００３】
従来より用いられている過酸化水素の定量法としては、ＫＭｎＯ４ による滴定や過酸化水素電極による方法とガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィーによる方法などが知られている。また過酸化物の定量法としては、チオバルビツール酸法（ＴＢＡ法）、ヨード滴定法、紫外吸収法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などが知られている。しかし、これらの方法では選択性の点でヒドロペルオキシドを限定して測定することができないという欠点を有したり、充分な感度が得られないという問題があった。
【０００４】
このような問題を解決するため化学発光検出器を用いる化学発光−高速液体クロマトグラフィー法（ＣＬ−ＨＰＬＣ法）が開発された（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０（６），９１５〜９２５ （１９８７）等）。これは液体クロマトグラフィーによる分子分別と、ヒドロペルオキシドに特異的な化学発光検出からなるものである。化学発光法の理論感度（１．７ ×１０−１８ｍｏｌ／ｌ）は極めて高く、従来の吸光法の１０９ 倍、蛍光分析法の１０４ 倍に相当し、生体成分の高感度分析への応用が大いに期待されている検出法である。このとき用いられる化学発光試薬は種々検討されており例えばルミノール誘導体、ロフィン誘導体、ルシゲニン等が知られている。またその反応の触媒として用いられているものとしては、チトクロムｃ 、ヘモグロビン等のヘム蛋白やＦｅ３＋、Ｃｏ２＋等の金属イオンなどがある。代表的な組み合わせとしては、ルミノールとチトクロムｃ のアルカリ性混液を用いたものがある。クロマトグラフィーで分離された分子種に含まれているヒドロペルオキシド基は、ポストカラムではじめにチトクロムｃ （Ｆｅ３＋）と反応してペルオキシルラジカルを生じ（反応１）、これはさらにラッセル反応で１Ｏ２ を生成する（反応２）。生じた１Ｏ２ はルミノールを酸化し、元のヒドロペルオキシド由来の強い発光（４３２ｎｍ）を呈する。（反応３）。この場合の化学発光反応はヒドロペルオキシ基に特異的であり、例えば特異性をもたせるためにラベル化などの二次的反応を要する蛍光分析より大いに有利な点と言える。
【０００５】
しかし従来のＣＬ−ＨＰＬＣ法はポストカラム法を用いるため、溶出用のポンプと反応液用のポンプを必要とし、またルミノール−チトクロムｃ のアルカリ反応液は用時調製しなければならない点、使用しているうちに活性が低下してしまう点などの問題点を有し、より簡便で、安定かつ高感度な分析法の開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようする課題】
分析対象である過酸化物の分子分別を行い、かつポストカラム法を用いることなく化学発光法により特異的な高感度分析を可能にすることが本発明の目的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は化学発光試薬とその触媒を固定化した組成物を用いることにより、上記目的が達成されることを見いだした。
すなわち、本発明は（１）化学発光試薬と化学発光触媒が同一または相異なる担体に固定化されてなりかつ溶媒に不溶性であることを特徴とする化学発光検出用組成物、（２）化学発光試薬が、ルミノール誘導体、ロフィン誘導体、ピロガロール誘導体、シロキセンおよびルシゲニン誘導体からなる群より選ばれる化合物である上記（１）に記載の化学発光検出用組成物、（３）化学発光触媒が、Ｃｏ（ＩＩ），Ｆｅ（ＩＩ），Ｆｅ（ＩＩＩ），Ｎｉ（ＩＩ），Ｃｒ（ＩＩ），Ｃｕ（ＩＩ），Ｍｎ（ＩＩ）およびそれらの塩、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６ 、鉄錯体、ヘミン、ヘモグロビン、過硫酸塩、過塩素酸塩ならびにアミン錯塩からなる群より選ばれる化合物である上記（１）または（２）に記載の化学発光検出用組成物、（４）ルミノールおよびチトクロムＣを固定化してなる上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の化学発光検出用組成物、（５）化学発光検出法を用いて過酸化水素及び過酸化物を分析するに際し、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の組成物を用いることを特徴とする分析システム、（６）化学発光検出法を用いた液体クロマトグラフィーによる過酸化水素及び過酸化物を分析するに際し、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の化学発光検出用組成物がフローセルに充填されていることを特徴とする分析システム、および（７）化学発光検出法を用いたフローインジェクションによる過酸化水素及び過酸化物を分析するに際し、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の化学発光検出用組成物がフローセルに充填されていることを特徴とする分析システムに関する。本発明で分析システムとしているが、分析方法と解されることは言うまでもない。
【０００８】
ここで本発明に関わる組成物に固定化される化学発光試薬は、過酸化物と化学発光触媒の存在下化学発光可能な化合物で、直接あるいはアルキル鎖、アラルキル鎖等を介して、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、エポキシ基、ハロゲン基のような担体と化学結合が可能な官能基を有するものであれば特に制限はなく、ルミノール誘導体、ロフィン誘導体、ピロガロール誘導体、シロキセン、ルシゲニン誘導体等がある。また化学発光触媒として用いられる物質としては、化学発光反応を著しく促進するものであれば特に制限はないが、例えばＣｏ（ＩＩ），Ｆｅ（ＩＩ），Ｆｅ（ＩＩＩ），Ｎｉ（ＩＩ），Ｃｒ（ＩＩ），Ｃｕ（ＩＩ），Ｍｎ（ＩＩ） 等の重金属類およびそれらの塩、錯体例えばＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６ 、鉄錯体、ヘミン、ヘモグロビンなど、および過硫酸塩、過塩素酸塩、アミン錯塩などが挙げられる。またその際用いられる組成物は、分析上用いられる溶媒に不溶なものであれば特に制限はなく、ナイロン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、及びこれらの共重合体あるいはこれらの架橋体等の合成高分子、セルロースやアガロースなどの天然高分子、シリカ、アルミナ、チタニアなどの無機物を例示することができる。なお、これらの溶媒に不溶の担体は、担体中に化学発光試薬及び化学発光触媒を結合させるための水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ハロゲン基のような官能基を有することが必要である。また多くの化学発光試薬の場合、発光反応がアルカリ条件下で行われるため、アルカリ溶液に不溶であることが望ましい。さらにこれらの用いる合成高分子は、フローセルの中に充填可能であればどのような形状でも良いが、高密度で充填しなおかつフローセルの耐圧性能を考えると直径数十μｍ 〜数百μｍ の球状であることが有利である。
【０００９】
化学発光試薬及び化学発光触媒を固定化するに際しては、特に制限はなくそのまま直接にあるいは例えばプロパンジアミン、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルまたは４−アミノ酪酸のような二官能性化合物をスペーサーにして用いることができる。また化学発光触媒として金属イオンなどを用いる場合は、エチレンジアミン四錯体やイミノ二酢酸などを固定化した後金属イオンを配位させることもできる。固定化反応はそれぞれの官能基に応じて適当な溶媒中で、酸塩基などのような触媒またはカルボジイミド類、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドやカルボニルジイミダゾールなどのような縮合剤の存在下、あるいは非存在下で常法に従って行うことができる。
【００１０】
このようにして得られた化学発光試薬固定化組成物は、化学発光検出器中のフローセルに充填し使用されることもあるが、このとき用いられるフローセルの形状についても特に制限はなく、キュービックなものや、平板状のものでも良いが、通常石英ガラス製またはフッ素化樹脂製のチューブを渦巻き型またはジグザグに加工した全内容積１００μｍ 〜２００μｍ 程度のものが受光効率をあげるためによく用いられる（図１）。またこのときの発光の検出方法についても、アナログモードあるいはカウンティングモードどちらでも良い。
【００１１】
化学発光試薬固定化組成物をフローセルに充填した化学発光検出器を用いた液体クロマトグラフィー及びフローインジェクションシステム（以下、本発明に関わるシステムと称する。）を用いて過酸化物を分析するに際しては、図２に示すように、溶離液にアルカリ溶液を用いることにより従来２つ以上必要であったポンプが１つで分析可能となる。ここで用いるアルカリ溶液のｐＨは７以上であれば特に制限はないが、ルミノール系の化学発光試薬が発光を生じるためにはｐＨ９〜１３が好ましい。
【００１２】
本発明に関わるシステムを用いて行う分析条件については通常行われる塩類や緩衝液を含む溶離液、温度範囲、及び流速などを任意に選択することができる。
【００１３】
【実施例】
以下に、本発明に関わるシステムを用いた分析方法について代表的な例を示し、さらに具体的に説明する。但し、これらは説明のための単なる例示であって、本発明はこれらに何ら制限されないのは言うまでもない。
【００１４】
（実施例１）
グリシジルメタクリレートとグリセリンジメタクリレートから常法により得られたエポキシ含有ゲル重合体（ エポキシ含有量６００ μｍｏｌ ／ｇ ）２ｇを、ジオキサン５ｍｌ 中７０℃で５ 時間プロパンジアミン２ｇを反応させ、洗浄、乾燥した。得られたアミノ基含有ゲル（アミノ基含有量１４０ μｍｏｌ ／ｇ ）を、ジオキサン７ｍｌ 中５０℃で５ 時間無水コハク酸２ｇを反応させ、メタノ−ル、水、０．１ＮＨＣｌ で順次洗浄後氷冷下無水酢酸３ｍｌ を１時間反応させ、カルボキシル基含有ゲル重合体を得た。このゲルをジオキサン１０ｍｌ中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．５ｇで活性化後、縮合剤であるジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）０．８ｇ を加え一晩４ ℃で反応させたのち濾過し、水酸化ナトリウム水溶液５ｍｌ 中ルミノール６０ｍｇを加え常温で２時間反応させ、ルミノール固定化ゲルを得た。反応液中の未反応物をＨＰＬＣにより定量したルミノールが４５μｍｏｌ ／ｇ 固定化されていることが確かめられた。
【００１５】
同様にしてエポキシ基含有ゲル３ｇに炭酸ナトリウム水溶液中γ− アミノ− β− ヒドロキシ−ｎ− 酪酸１３０ｍｇ を６５℃１０時間反応させ、水、１ＮーＮａＣｌ 、０．０５Ｎ−ＨＣｌ 、エタノールで順次洗浄、乾燥しカルボキシル基含有ゲル重合体を得た。得られたゲルを用い、ジオキサン１０ｍｌ中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．４ｇで活性化後、縮合剤であるＤＣＣ０．６ｇ を加え炭酸水素ナトリウム水溶液５ｍｌ 中チトクロムｃ２０ｍｇを反応させ、チトクロムｃ 固定化ゲルを得た。反応後ＨＰＬＣにより定量したところ０．４ μｍｏｌ ／ｇ 固定化されていることが確かめられた。
【００１６】
このようにしてできたゲルを任意の割合で混合し、内径１０ｍｍのフッ素系樹脂チューブに充填しフォトマルの前に渦巻状に固定し化学発光検出用セルとした。
【００１７】
上記の条件でｍ−クロロ過安息香酸のフローインジェクション分析を行ったところ、ｐｍｏｌ〜ｎｍｏｌオーダー（注入量）で直線性が得られた（図３）。
【００１８】
（実施例２）
実施例１で用いた化学発光検出用セルを用いて過酸化脂質の分析を行った。過酸化脂質は、高圧水銀灯を用いて光化学反応により生成させ、日本油化学協会法（増補版 過酸化脂質実験法 金田尚志、植田伸夫 編集 医歯薬出版株式会社参照）により定量し標品とした。
【００１９】
上記の条件でフォスファチジルコリンヒドロペルオキシドの分析を行ったところ、ｐｍｏｌ〜ｎｍｏｌオーダー（注入量）で直線性が得られた（図４）。
【００２０】
（比較例）
ルミノール、チトクロムｃをゲルに固定化せずに反応液中で送液し、実施例１と同様にｍ−クロロ過安息香酸のフローインジェクション分析を行った。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の化学発光検出用組成物を用いる過酸化物測定システムは、従来常時送液していた化学発光試薬とその触媒を、固定化した充填剤を用いているため、試薬の浪費を抑えるばかりでなく、用時調製の必要もなくさらに送液用のポンプを省略できる。また生じた化学発光をセル内で全て測光するため、簡単に高感度でかつ経済的に安価なシステムとして用いることができる。
化学発光試薬とその触媒とを固定化した組成物を化学発光検出器中のフローセルに充填して用いることにより、従来ポストカラム法により送液していた化学発光試薬−触媒（例えばルミノール−チトクロムｃ）のアルカリ性反応液を用いることなく、過酸化物を分子分別後、フローセル内の充填剤上の化学発光試薬とその触媒と反応させ化学発光検出をする事で全ての発光量を測光し、安定的に高感度に定量する事が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に使用されるフローセルの形状の例を示したものである。
【図２】本発明の分析システムの例を模式的に示したものである。
【図３】本発明に関わるシステムを用いて、実施例１によりｍ−クロロ過安息香酸を分析したときの注入量と化学発光強度の関係を示したものである。
【図４】本発明に関わるシステムを用いて、実施例２によりフォスファチジルコリンヒドロペルオキシドを分析したときの注入量と化学発光強度の関係を示したものである。
【図５】比較例により、ｍ−クロロ過安息香酸を分析したときの注入量と化学発光強度の関係を示したものである。
【符号の説明】
１ 光透過性チューブ
１Ａ 光透過性チューブ
１Ｂ 光透過性チューブ
２ 反射面
３ 突起
４ 窓板
５ セル板
６ 長尺溝
６Ａ 長尺溝
６Ｂ 長尺溝
１１ 溶離液
１２ ポンプ
１３ インジェクター
１４ カラム
１５ 化学発光検出器
１６ 記録計[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a technique for analyzing a substance by a chemiluminescence detection method.
[0002]
[Prior art]
Luminol has been well known as a chemiluminescent reagent capable of reacting with peroxide to give strong luminescence and measuring the amount of luminescence to quantify the peroxide. Luminol luminescence occurs in the presence of various chemiluminescent catalysts, such as halogens, iron complexes, hemin, hemoglobin, and transition metal oxides.To find better chemiluminescent reagents, many derivatives, including isoluminol, are used. Is being developed. Luminol-based chemiluminescence systems exhibit a luminescence phenomenon only when there are three substances, such as luminol, which is a chemiluminescent reagent, and oxide, which is an oxidizing agent, and hemoglobin, which is a chemiluminescent catalyst substance. As an application, the analysis of hydrogen peroxide and peroxide or chemiluminescent catalysts has been performed.
Hydrogen peroxide can be generated from various substances in the living body by various oxidases, and is selectively generated by using an immobilized enzyme column and the like, and useful information on the living body can be obtained by measuring the hydrogen peroxide. It is expected to be obtained. Further, since it is itself used as a bleaching agent and an antibacterial agent, it is important to grasp the residual concentration in processes such as dyeing and wastewater treatment. It has also been reported that peroxides, for example, lipid peroxides in the living body, are associated with many diseases such as arteriosclerosis, liver disease, diabetes, and cerebrovascular disease, and measurement in clinical and food chemistry is becoming increasingly important. ing.
[0003]
The determination of hydrogen peroxide has been used conventionally, there is known a method in accordance with the method and gas chromatography and liquid chromatography by titration or hydrogen peroxide electrode by KMnO 4. Further, as a method for quantitatively determining peroxide, a thiobarbituric acid method (TBA method), an iodometric method, an ultraviolet absorption method, a method using high performance liquid chromatography, and the like are known. However, these methods have a drawback in that it is not possible to limit the measurement of hydroperoxide in terms of selectivity, and there is a problem that sufficient sensitivity cannot be obtained.
[0004]
In order to solve such a problem, a chemiluminescence-high-performance liquid chromatography method (CL-HPLC method) using a chemiluminescence detector was developed (Analytical Letters, 20 (6), 915-925 (1987), etc.). This consists of molecular fractionation by liquid chromatography and chemiluminescence detection specific to hydroperoxide. Theoretical sensitivity of chemiluminescence (1.7 × 10 -18 mol / l ) is very high, 10 9 times the conventional absorption spectrometry, corresponds to 10 4 times the fluorescence analysis, biological components to a high-sensitivity analysis It is a detection method that is expected to have great applications. Various chemiluminescent reagents used at this time have been studied, and for example, luminol derivatives, lophine derivatives, lucigenin and the like are known. Examples of catalysts used for the reaction include heme proteins such as cytochrome c and hemoglobin, and metal ions such as Fe 3+ and Co 2+ . As a typical combination, there is a combination using an alkaline mixed solution of luminol and cytochrome c. The hydroperoxide group contained in the molecular species separated by chromatography first reacts with cytochrome c (Fe 3+ ) in a post column to generate a peroxyl radical (reaction 1), which is further reacted by Russell reaction with 1 O 2 is produced (reaction 2). The resulting 1 O 2 oxidizes the luminol and exhibits strong emission (432 nm) from the original hydroperoxide. (Reaction 3). In this case, the chemiluminescence reaction is specific to the hydroperoxy group, which is a great advantage over a fluorescence analysis which requires a secondary reaction such as labeling to give specificity.
[0005]
However, since the conventional CL-HPLC method uses a post-column method, a pump for elution and a pump for the reaction solution are required, and the alkali reaction solution of luminol-cytochrome c must be prepared at the time of use. Therefore, there has been a problem that the activity is reduced during the process, and the development of a simpler, more stable and more sensitive analytical method has been desired.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to perform molecular fractionation of a peroxide to be analyzed and to enable specific and highly sensitive analysis by a chemiluminescence method without using a post-column method.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has found that the above object can be achieved by using a composition in which a chemiluminescent reagent and its catalyst are immobilized.
That is, the present invention provides (1) a composition for detecting chemiluminescence, wherein the chemiluminescent reagent and the chemiluminescent catalyst are immobilized on the same or different carriers and are insoluble in a solvent; Wherein the reagent is a compound selected from the group consisting of a luminol derivative, a lophine derivative, a pyrogallol derivative, a siloxene, and a lucigenin derivative; the composition for detecting chemiluminescence according to (1) above; ), Fe (II), Fe (III), Ni (II), Cr (II), Cu (II), Mn (II) and their salts, K3Fe (CN) 6, iron complex, hemin, hemoglobin, The chemiluminescent detection composition according to the above (1) or (2), which is a compound selected from the group consisting of sulfate, perchlorate and amine complex, (4) luminol and (1) The composition for detecting chemiluminescence according to any one of (1) to (3), wherein cytochrome C is immobilized, and (5) when analyzing hydrogen peroxide and peroxide using the chemiluminescent detection method. An analysis system characterized by using the composition according to any one of the above (1) to (4), and (6) analyzing hydrogen peroxide and peroxide by liquid chromatography using a chemiluminescence detection method. In doing so, an analysis system characterized in that the composition for chemiluminescence detection according to any of the above (1) to (4) is filled in a flow cell, and (7) a flow using the chemiluminescence detection method. When analyzing hydrogen peroxide and peroxide by injection, the composition for chemiluminescence detection according to any of the above (1) to (4) is filled in a flow cell. About the system. Although the analysis system is used in the present invention, it is needless to say that the analysis system is interpreted as an analysis method.
[0008]
Here, the chemiluminescent reagent immobilized on the composition according to the present invention is a compound capable of chemiluminescence in the presence of a peroxide and a chemiluminescent catalyst, directly or via an alkyl chain, an aralkyl chain, etc., an amino group, There is no particular limitation as long as it has a functional group capable of chemically bonding to a carrier such as a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an aldehyde group, an epoxy group, and a halogen group, and a luminol derivative, a lophine derivative, a pyrogallol derivative, a siloxene, Lucigenin derivatives and the like. The substance used as the chemiluminescent catalyst is not particularly limited as long as it greatly promotes the chemiluminescent reaction. For example, Co (II), Fe (II), Fe (III), Ni (II), Cr Heavy metals such as (II), Cu (II), Mn (II) and salts thereof, complexes such as K 3 Fe (CN) 6 , iron complexes, hemin, hemoglobin and the like, and persulfates, perchlorates, Amine complex salts and the like can be mentioned. The composition used at this time is not particularly limited as long as it is insoluble in the solvent used for analysis, and nylon, polystyrene, polyacrylamide, polyacrylate, polycarbonate, polyester, polyurethane, and a copolymer or a copolymer thereof are used. And synthetic polymers such as crosslinked products of the above, natural polymers such as cellulose and agarose, and inorganic substances such as silica, alumina and titania. The carrier insoluble in these solvents needs to have a functional group such as a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, or a halogen group for binding the chemiluminescent reagent and the chemiluminescent catalyst in the carrier. is there. In addition, many chemiluminescent reagents are desirably insoluble in an alkaline solution because the luminescent reaction is performed under alkaline conditions. Further, the synthetic polymer used may have any shape as long as it can be filled in the flow cell, but in consideration of the pressure resistance performance of the flow cell, it is a spherical shape having a diameter of several tens μm to several hundred μm. Advantageously there is.
[0009]
When immobilizing the chemiluminescent reagent and the chemiluminescent catalyst, there is no particular limitation, and directly or directly, or a bifunctional compound such as propanediamine, glutaraldehyde, 1,4-butanediol diglycidyl ether or 4-aminobutyric acid Can be used as a spacer. When a metal ion or the like is used as a chemiluminescent catalyst, the metal ion can be coordinated after immobilizing an ethylenediamine tetracomplex or iminodiacetic acid. The immobilization reaction is carried out in a suitable solvent according to each functional group, in the presence or absence of a catalyst such as an acid base or a condensing agent such as carbodiimides, N-hydroxysuccinimide or carbonyldiimidazole. Can be performed according to a conventional method.
[0010]
The chemiluminescent reagent-immobilized composition thus obtained may be used by filling it into a flow cell in a chemiluminescence detector, but the shape of the flow cell used at this time is not particularly limited, and it may be cubic. Although a tube or a plate may be used, a tube having a total internal volume of about 100 μm to 200 μm obtained by processing a tube made of quartz glass or a fluorinated resin into a spiral or zigzag shape is often used to improve the light receiving efficiency ( (Fig. 1). At this time, the method of detecting light emission may be either the analog mode or the counting mode.
[0011]
When analyzing peroxides using liquid chromatography and a flow injection system (hereinafter, referred to as a system according to the present invention) using a chemiluminescence detector in which a chemiluminescent reagent-immobilized composition is filled in a flow cell, As shown in FIG. 2, by using an alkaline solution as the eluent, analysis can be performed with one pump, which conventionally required two or more pumps. The pH of the alkaline solution used here is not particularly limited as long as it is 7 or more, but a pH of 9 to 13 is preferable for the luminol-based chemiluminescent reagent to emit light.
[0012]
As for the analysis conditions performed by using the system according to the present invention, the eluent containing salts and buffers, the temperature range, the flow rate, and the like which are usually performed can be arbitrarily selected.
[0013]
【Example】
Hereinafter, a typical example of an analysis method using the system according to the present invention will be described, and the analysis method will be described more specifically. However, these are merely examples for explanation, and it goes without saying that the present invention is not limited to these.
[0014]
(Example 1)
2 g of an epoxy-containing gel polymer (epoxy content: 600 μmol / g) obtained from glycidyl methacrylate and glycerin dimethacrylate by a conventional method was reacted with 2 g of propanediamine in 5 ml of dioxane at 70 ° C. for 5 hours, washed and dried. The resulting amino group-containing gel (amino group content 140 μmol / g) was reacted with 2 g of succinic anhydride in 7 ml of dioxane at 50 ° C. for 5 hours, washed successively with methanol, water and 0.1N HCl, and then ice-cooled. 3 ml of acetic anhydride was reacted for 1 hour to obtain a carboxyl group-containing gel polymer. After activating this gel with 0.5 g of N-hydroxysuccinimide in 10 ml of dioxane, 0.8 g of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) as a condensing agent was added and reacted overnight at 4 ° C., followed by filtration and aqueous sodium hydroxide solution. 60 mg of luminol in 5 ml was added and reacted at room temperature for 2 hours to obtain a luminol-immobilized gel. Unreacted substances in the reaction solution were quantified by HPLC, and it was confirmed that luminol was immobilized at 45 μmol / g.
[0015]
Similarly, 3 mg of the epoxy group-containing gel was reacted with 130 mg of γ-amino-β-hydroxy-n-butyric acid in an aqueous solution of sodium carbonate at 65 ° C. for 10 hours, washed sequentially with water, 1 N NaCl, 0.05 N HCl, and ethanol. After drying, a carboxyl group-containing gel polymer was obtained. The obtained gel was activated with 0.4 g of N-hydroxysuccinimide in 10 ml of dioxane, 0.6 g of DCC as a condensing agent was added, and 20 mg of cytochrome c was reacted in 5 ml of an aqueous sodium hydrogen carbonate solution to obtain a fixed gel of cytochrome c. Was. After the reaction, quantification by HPLC confirmed that 0.4 μmol / g was immobilized.
[0016]
The gel thus formed was mixed at an arbitrary ratio, filled in a fluorine-based resin tube having an inner diameter of 10 mm, and fixed in a spiral shape before the photomal to obtain a cell for chemiluminescence detection.
[0017]
When m-chloroperbenzoic acid was subjected to flow injection analysis under the above conditions, linearity was obtained on the order of pmol to nmol (injection amount) (FIG. 3).
[0018]
(Example 2)
Using the cell for chemiluminescence detection used in Example 1, lipid peroxide was analyzed. Lipid peroxide was produced by photochemical reaction using a high-pressure mercury lamp, and quantified by the Japan Oil Chemistry Association method (enlarged edition of lipid peroxide experiment method, Naoshi Kaneda, Nobuo Ueda, edited by Itoyaku Shuppan Co., Ltd.) and used as a sample. .
[0019]
When phosphatidylcholine hydroperoxide was analyzed under the above conditions, linearity was obtained in the order of pmol to nmol (injection amount) (FIG. 4).
[0020]
(Comparative example)
Luminol and cytochrome c were fed into the reaction solution without being immobilized on the gel, and m-chloroperbenzoic acid was subjected to flow injection analysis in the same manner as in Example 1.
[0021]
【The invention's effect】
As described above, the peroxide measurement system using the composition for chemiluminescence detection of the present invention uses a chemiluminescent reagent and its catalyst, which have conventionally been constantly sent, using a filler that is immobilized. In addition to suppressing waste, there is no need for preparation before use, and a pump for feeding liquid can be omitted. Further, since all the generated chemiluminescence is measured in the cell, it can be easily used as a highly sensitive and economically inexpensive system.
By filling and using a composition in which a chemiluminescent reagent and its catalyst are immobilized in a flow cell in a chemiluminescent detector, a chemiluminescent reagent-catalyst (for example, luminol-cytochrome c) conventionally sent by a post-column method is used. Without using the alkaline reaction solution of (2), after peroxide is molecularly separated, it reacts with the chemiluminescent reagent on the filler in the flow cell and its catalyst to detect the chemiluminescence to measure the total amount of luminescence and stabilize. Quantitatively with high sensitivity.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an example of the shape of a flow cell used in the present invention.
FIG. 2 schematically shows an example of the analysis system of the present invention.
FIG. 3 shows the relationship between the injection amount and the chemiluminescence intensity when m-chloroperbenzoic acid was analyzed according to Example 1 using the system according to the present invention.
FIG. 4 shows the relationship between the injection amount and the chemiluminescence intensity when phosphatidylcholine hydroperoxide was analyzed in Example 2 using the system according to the present invention.
FIG. 5 shows the relationship between the injection amount and the chemiluminescence intensity when analyzing m-chloroperbenzoic acid according to a comparative example.
[Explanation of symbols]
REFERENCE SIGNS LIST 1 light transmitting tube 1A light transmitting tube 1B light transmitting tube 2 reflecting surface 3 protrusion 4 window plate 5 cell plate 6 long groove 6A long groove 6B long groove 11 eluent 12 pump 13 injector 14 column 15 chemiluminescence Detector 16 Recorder