JP3561349B2

JP3561349B2 - Liquid chromatography columns

Info

Publication number: JP3561349B2
Application number: JP28596895A
Authority: JP
Inventors: 和之大石; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2015-11-02
Also published as: JPH09127080A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィー分析、特にＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、最も汎用されている分析手法の一つである。液体クロマトグラフィー分析において、測定対象試料のクロマトグラムを改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことではない。
【０００３】
また、液体クロマトグラフィーの分析手法を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示されている。
【０００４】
特開平６−２７３４０１号公報には、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてアルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出させて分析を行う、イオン交換クロマトグラフィーによる陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されているが、これは、カラムを交換することなく両方のイオン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。
【０００５】
また、特開平１−１５８３４９号公報には、リン酸カルシウム系化合物の粒子を充填してなる液体クロマトグラフィーカラムにおいて、溶媒流入側にカラムの残りの部分に充填された粒子よりも耐久性の高い粒子が充填されたカラムが開示されているが、これは溶媒による充填剤への溶解作用及び力学的衝撃が、溶媒の流入側に強く働くことに着目して、溶媒流入側の部分に耐久性の高い粒子を充填し、残りの部分に吸着能に優れた粒子を充填することにより、カラムの耐久性の向上と吸着能の保持を目的とするものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、測定対象試料のクロマトグラムの改良がなされ得、かつ容易に製造され得る液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラム（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、測定対象試料の分離に主に作用する充填剤（Ａ）と、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが、一本のカラムに充填されてなることを特徴とする。
【０００８】
本発明１でいうクロマトグラムの改良とは、例えば、各ピークの分離性、ピークのシャープさ、各ピークの保持時間の短縮などを言う。
【０００９】
本発明１で使用される充填剤（Ａ）は、測定対象試料の分離に主に作用する充填剤である。
【００１０】
上記充填剤（Ａ）としては、測定対象試料が主にイオン交換の分離モードで分離できる試料であれば、カチオン交換基又はアニオン交換基をもつ充填剤が選ばれ、カチオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＣＯＯＨ、−ＳＯ₃Ｈなどをもつ充填剤が挙げられ、アニオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＮＲ₂、−ＮＲ₃（Ｒは水素原子又はアルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。
【００１１】
上記充填剤（Ａ）の骨格の素材としては、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００１２】
充填剤（Ａ）は、通常、１種の充填剤が使用されるが、同じ分離モードの充填剤であれば、２種以上の充填剤を混合して用いてもよい。
【００１３】
本発明１で使用される充填剤（Ｂ）は、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤に限定される。充填剤（Ｂ）は、充填剤（Ａ）の種類により変わるが、その選択範囲は、具体的には、上記充填剤（Ａ）の選択範囲と同様のものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２種以上混合して使用してもよい。
【００１７】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１８】
本発明１で用いられるカラムは、従来から液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられているものであれば、特に制限されないが、直径１〜２０ｍｍ、長さ２０〜５００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１９】
本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序としては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層状態でカラム内に存在することになる）してもよい。また、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的には、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合った量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は定圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００２０】
本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムの測定対象試料は、本発明１で用いられる複数の充填剤のうち、主となる充填剤（Ａ）の分離モードで一般に分析される試料であり、分離モードを変えることにより従来液体クロマトグラフィーにより分析されてきた殆ど全ての試料が分析可能である。従って、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、従来から行われてきた広範囲にわたる領域の液体クロマトグラフィー分析に応用できる。
【００２１】
本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムの使用方法は、公知の液体クロマトグラフィー用カラムの使用方法と同様である。以下その使用方法を説明する。図１は、本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して分析する際の装置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー４から測定対象試料を注入する。分離された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記録計６に記録される。なお、測定対象試料に必要に応じて公知の前処理が施されてもよい。
【００２２】
上記移動相としては、各分析モードにおける公知の溶離液が用いられる。例えば、水系では、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）および／またはこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられる。また、有機溶媒系では、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが用いられる。また、水と有機溶媒の混合系も用いられる。移動相の通液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれる。
【００２３】
上記の分離については、公知の方法が採用され、適当濃度の移動相により試料が分離溶出される。また、クロマトグラムの改良ため、分析途中で溶離液濃度や流速等を変えることもできる。また、液体クロマトグラフィー用カラム等を恒温槽内に設置することもできる。
【００２４】
上記の検出についても公知の技術が用いられる。例えば、測定対象試料が蛋白質等の生体試料の場合には、紫外可視分光光度計が、糖類や高分子物質の場合には示差屈折計が、イオン類の場合には電気電導度検出器などが好適に使用される。
【００２５】
請求項４記載の分析方法（以下、請求項４記載の発明を本発明４という）は、前記充填剤（Ａ）がイオン性官能基を有する充填剤である請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いた分析方法である。
【００２６】
本発明４で使用される充填剤（Ａ）は、測定対象試料の分離に主に作用する充填剤であり、イオン性官能基を有する充填剤であれば、従来からイオンクロマトグラフィー用充填剤として使用されてきたいずれの充填剤も使用可能である。
【００２７】
上記充填剤（Ａ）としては、カチオン交換基又はアニオン交換基をもつ充填剤が選ばれ、カチオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＣＯＯＨ、−ＳＯ_３Ｈなどをもつ充填剤が挙げられ、アニオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＮＲ_２、−ＮＲ_３（Ｒは水素原子又はアルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。
【００２８】
上記充填剤（Ａ）の骨格の素材としては、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材のとしては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００２９】
充填剤（Ａ）は、通常、１種の充填剤が使用されるが、同一種のイオン交換系（例えば、カチオン交換同士又はアニオン交換同士）の充填剤であれば、２種以上の充填剤を混合して用いてもよい。
【００３０】
本発明４で使用される充填剤（Ｂ）は、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）に限定される。充填剤（Ｂ）は、充填剤（Ａ）の種類により変わるが、その選択範囲は、従来から液体クロマトグラフィー用充填剤として使用されてきたいずれの充填剤も使用可能であり、具体的には、上述の本発明１の充填剤（Ｂ）の選択範囲と同様のものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２種以上混合して使用してもよい。
【００３１】
本発明４の充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとしては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）が共にイオン性官能基を有する充填剤である組合せが挙げられる。具体的には、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）のイオン性官能基が異なる例として、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＳＯ₃Ｈ基をもつ充填剤の組合せ、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＮＲ₂基をもつ充填剤の組合せ、ＮＲ₂基をもつ充填剤とＮＲ₃基をもつ充填剤の組合せが挙げられる。
【００３４】
本発明４における充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率、液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法などは本発明１と同様である。
【００３５】
本発明４の分析方法の測定対象試料は、一般にイオンクロマトグラフィーで測定され得る物質を含む試料である。例えば、有機や無機の陽陰イオンなどである。
【００３６】
本発明４の分析方法は、分析装置の構成例としては、液体クロマトグラフィー用カラムとして、上記のイオン交換モードの液体クロマトグラフィー用カラムのみが使用されることの他は、本発明１の説明で述べたものと同様であり、使用される移動相、分離方法、検出方法なども本発明１の説明で述べたことと同様である。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例における分析装置は、前記図１のように構成して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。
送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。
サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０。
検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰＤ−６ＡＶ。
【００３８】
実施例において使用した充填剤は、以下の通りである。
充填剤カチオン−１
以下のように、特開平３−７３８４８号公報の方法によりカチオン交換充填剤を製造した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入し、８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、アクリル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間重合した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗浄し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−１とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯＯＨを有する。
【００３９】
充填剤カチオン−２
市販のカチオン交換充填剤（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤ、メルク社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基として−ＳＯ_３Ｈを有している。
【００４０】
充填剤アニオン−１
市販のアニオン交換系充填剤（ＥＳ−５０２Ｎ、旭化成社製）。骨格の素材として、ビニルアルコール系ポリマーが使用され、官能基として−Ｎ（Ｃ_２Ｈ_５）_２を有している。
【００４１】
充填剤アニオン−２
市販のアニオン交換系充填剤（ＩＣＰａｋＡｎｉｏｎ、Ｗａｔｅｒｓ社製）。骨格の素材として、アクリル系ポリマーが使用され、官能基として−Ｎ（ＣＨ_３）_３を有している。
【００４２】
充填剤逆相−１
市販の逆相系充填剤（ＭｉｃｒｏｎｅｘＲＰ−３０、積水化学工業社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基としてフェニル基を有している。
【００４３】
充填剤順相−１
市販の順相系充填剤（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ−ＮＨ_２、Ｗａｔｅｒｓ社製）。骨格の素材として、シリカが使用され、官能基として−ＮＨ_２を有している。
【００４４】
充填剤アパタイト−１
市販のアパタイト系充填剤（ＨＣＡ−Ａ、三井東圧社製）。
【００４５】
（実施例１〜３、比較例１）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
▲２▼蛋白質の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、蛋白質標品（ミオグロビン、キモトリプシノーゲン、チトクロムＣ及びリソゾームを含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２８０ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）に、０．５Ｍの濃度でＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を混合するリニアグラジエント法にて溶出し、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを図３に示した。なお、実施例２、３のクロマトグラムも実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図２及び３における各ピークは、１１ミオグロビン、１２キモトリプシノーゲン、１３チトクロムＣ、１４リソゾームである。
【００４８】
（実施例４、５、比較例２）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表２に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表２に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの２０％メタノール水溶液に分散した（比較例２は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００４９】
【表２】

【００５０】
▲２▼医薬品の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、医薬品標品（アスピリン、サリチル酸、コデイン、サリチルアミド及びカフェインを含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２５４ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、２０％メタノール水溶液にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例４で得られたクロマトグラムを図４に、比較例２で得られたクロマトグラムを図５に示した。なお、実施例５のクロマトグラムも実施例４のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図４及び５における各ピークは、１５アスピリン、１６サリチル酸、１７コデイン、１８サリチルアミド、１９カフェインである。
【００５１】
（実施例６、比較例３）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表３に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表３に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの２０％アセトニトリル水溶液に分散した（比較例３は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００５２】
【表３】

【００５３】
▲２▼水溶性ビタミンの分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、水溶性ビタミン標品（リボフラビン、ピリドキシン、チアミン及びアスコルビン酸を含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２５４ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、２０％アセトニトリル水溶液にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例６で得られたクロマトグラムを図６に、比較例３で得られたクロマトグラムを図７に示した。なお、図６及び７における各ピークは、２０リボフラビン、２１ピリドキシン、２２チアミン、２３アスコルビン酸である。
【００５４】
（実施例７、比較例４）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表４に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表４に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に分散した（比較例４は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００５５】
【表４】

【００５６】
▲２▼蛋白質の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、蛋白質標品（オブアルブミン、ラクトアルブミン、ミオグロビン及びリソゾームを含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２８０ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を混合するリニアグラジエント法にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例７で得られたクロマトグラムを図８に、比較例４で得られたクロマトグラムを図９に示した。なお、図８及び９における各ピークは、２４オブアルブミン、２５ラクトアルブミン、２６ミオグロビン、２７リソゾームである。
【００５７】
（実施例８〜１０、比較例５）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表５に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表５に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの１ｍＭ過塩素酸水溶液に分散した（比較例５は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００５８】
【表５】

【００５９】
▲２▼有機酸の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、有機酸標品（クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸及び酢酸を含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２１０ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、１ｍＭ過塩素酸水溶液にて溶出し、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例８で得られたクロマトグラムを図１０に、比較例５で得られたクロマトグラムを図１１に示した。なお、実施例９、１０のクロマトグラムも実施例８のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図１０及び１１における各ピークは、２８クエン酸、２９リンゴ酸、３０コハク酸、３１乳酸、３２酢酸の各イオンである。
【００６０】
【発明の効果】
本発明１〜３の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は上記の通りであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良がなされ得、かつ容易に製造され得る液体クロマトグラフィー用カラムが得られる。従って、本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムを使用すれば、分離モードを選択することにより、従来液体クロマトグラフィーにより分析されてきた殆ど全ての試料を、簡便な方法でより正確に分析できる。
【００６１】
本発明４〜６の分析方法の構成は上記の通りであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良がなされ得、かつ容易に製造され得るイオン交換系液体クロマトグラフィー用カラムを使用しているので、イオン交換の分離モードによって測定可能な測定対象試料を、簡便な方法でより正確に分析できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して分析する際の装置の構成の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
【図４】実施例４のクロマトグラムである。
【図５】比較例２のクロマトグラムである。
【図６】実施例６のクロマトグラムである。
【図７】比較例３のクロマトグラムである。
【図８】実施例７のクロマトグラムである。
【図９】比較例４のクロマトグラムである。
【図１０】実施例８のクロマトグラムである。
【図１１】比較例５のクロマトグラムである。
【符号の説明】
１液体クロマトグラフィー用カラム
２移動相
３送液ポンプ
４サンプラー
５検出器
６記録計[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a column for liquid chromatography and an analytical method using the same.
[0002]
[Prior art]
Liquid chromatography analysis, especially HPLC (high performance liquid chromatography) analysis, is one of the most widely used analytical methods. In the liquid chromatography analysis, when it is desired to improve the chromatogram of the sample to be measured, there are various methods such as changing the type of eluent, the measurement temperature or the column size, and the improvement of the packing material is most effective. However, it is cumbersome and not easy to improve the chromatogram by newly producing a filler suitable for the purpose and using it.
[0003]
Further, as one method for simply improving the analysis method of liquid chromatography, a method using a column in which two types of fillers are packed in one column is disclosed.
[0004]
JP-A-6-273401 discloses that a packing having a cation exchange group and a packing having an anion exchange group are packed in one column, and an alkaline solution and an acidic solution are used as a mobile phase. A method for analyzing cations and anions by ion exchange chromatography, in which both solutions are switched and passed through a column to elute each ionic species separately for analysis, is disclosed. This method aims to simplify the method by analyzing both ion species without performing the method, and does not improve the chromatogram of the sample to be measured.
[0005]
Also, JP-A-1-158349 discloses that in a liquid chromatography column filled with particles of a calcium phosphate compound, particles having higher durability than particles charged in the remaining portion of the column on the solvent inflow side are provided. A packed column is disclosed, which focuses on the fact that the dissolving action of the solvent on the packing material and the mechanical impact strongly act on the solvent inflow side, and a highly durable portion is provided on the solvent inflow side. The purpose of this method is to improve the column durability and maintain the adsorption capacity by filling the particles and filling the remaining part with particles with excellent adsorption capacity.The chromatogram of the sample to be measured is improved. Not.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to improve the chromatogram of a sample to be measured, and to easily produce a column for liquid chromatography and an analytical method using the same. Is to provide.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The column for liquid chromatography according to claim 1 (hereinafter, the invention according to claim 1 is referred to as the present invention 1) is characterized in that a filler (A) that mainly acts on separation of a sample to be measured and the sample to be measured are separated from each other. It is characterized in that the filler (A) is different from the filler (A) in action, and the filler (B) capable of improving the chromatogram of the filler (A) with respect to the sample to be measured is packed in one column. And
[0008]
The improvement of the chromatogram in the present invention 1 means, for example, the resolution of each peak, the sharpness of the peak, and the shortening of the retention time of each peak.
[0009]
The filler (A) used in the present invention 1 is a filler mainly acting on separation of a sample to be measured .
[0010]
As the filler (A), a filler having a cation exchange group or an anion exchange group is selected as long as the sample to be measured is a sample that can be separated mainly in an ion exchange separation mode. is, for example, -COOH as a functional group, a filler having like -SO ₃ H, and examples of those having an anion-exchange group, for example, -NR _2, -NR ₃ as a functional group (R is a hydrogen atom or Filler having an alkyl group) .
[0011]
The material of the skeleton of the filler (A) is not particularly limited, and any of an organic type and an inorganic type can be used, and the organic type may be any of a synthetic type and a natural type. Examples of the synthetic material include acrylic and styrene polymers, and examples of the natural material include cellulose, chitosan, and polyamino acids, and inorganic materials. Examples thereof include silica, zirconia and the like.
[0012]
As the filler (A), one kind of filler is usually used, but two or more kinds of fillers may be mixed and used as long as they are of the same separation mode.
[0013]
The filler (B) used in the present invention 1 is different from the filler (A) in the interaction with the sample to be measured, and can improve the chromatogram of the filler (A) with respect to the sample to be measured. Limited to fillers. Filler (B) will vary depending on the type of filler (A), the selection, the concrete, the same selection of the filler (A). The filler (B) may be used as a mixture of two or more kinds.
[0017]
The ratio of the amount of the filler (A) to the amount of the filler (B) used depends on the type of the filler used, but usually the filler (B) in the total amount of the filler (A) and the filler (B) is used. Is preferably 50% by weight or less.
[0018]
The column used in the present invention 1 is not particularly limited as long as it has been conventionally used as a column for liquid chromatography, but a stainless steel tube having a diameter of 1 to 20 mm and a length of 20 to 500 mm is preferable.
[0019]
In order to manufacture the column for liquid chromatography of the first aspect of the present invention, one column may be filled with the filler (A) and the filler (B). As the filling order, the filler (A) and the filler (B) may be mixed and then charged, or may be charged separately (in this case, the filler is present in the column in a multilayer state). May be. As a filling method, a wet filling method is preferable. Specifically, an amount of the filler corresponding to the column size is dispersed in the eluent used for analysis and transferred to the packer.A pump is connected to the inlet of the packer, and a column is connected to the outlet, and a constant flow or constant A method of filling the solution by pressure feeding is given.
[0020]
The sample to be measured by the liquid chromatography column of the present invention 1 is a sample that is generally analyzed in the separation mode of the main filler (A) among the plurality of packings used in the present invention 1, and the separation mode By changing the above, almost all samples conventionally analyzed by liquid chromatography can be analyzed. Therefore, the column for liquid chromatography of the present invention can be applied to the conventional wide range of liquid chromatography analysis.
[0021]
The method of using the column for liquid chromatography of the present invention 1 is the same as the method of using a known column for liquid chromatography. Hereinafter, the method of using the same will be described. FIG. 1 is an example of the configuration of an apparatus used for analysis using the column for liquid chromatography of the present invention 1. A sample to be measured is injected from a sampler 4 while supplying a mobile phase 2 to a liquid chromatography column 1 by a liquid sending pump 3. The separated sample is detected by the detector 5, and the result is recorded in the recorder 6. Note that a known pretreatment may be performed on the sample to be measured as necessary.
[0022]
As the mobile phase, a known eluent in each analysis mode is used. For example, in an aqueous system, a buffer solution composed of an inorganic acid (such as phosphoric acid), an organic acid (such as citric acid) and / or a salt thereof is used. Further, in the organic solvent system, for example, methanol, ethanol, acetonitrile and the like are used. Also, a mixed system of water and an organic solvent is used. The flow rate (flow rate) of the mobile phase is generally selected to be about 0.5 to 5 ml / min.
[0023]
For the above separation, a known method is adopted, and the sample is separated and eluted with a mobile phase having an appropriate concentration. In order to improve the chromatogram, the eluent concentration and the flow rate can be changed during the analysis. Further, a column for liquid chromatography or the like can be installed in the thermostat.
[0024]
Known techniques are also used for the above detection. For example, when a sample to be measured is a biological sample such as a protein, an ultraviolet-visible spectrophotometer is used, when a saccharide or a polymer is used, a differential refractometer is used, and when an ion is used, an electric conductivity detector is used. It is preferably used.
[0025]
In the analysis method according to claim 4 (hereinafter, the invention according to claim 4 is referred to as the present invention 4), the packing material (A) is a packing material having an ionic functional group. This is an analysis method using a column.
[0026]
The filler (A) used in the present invention 4 is a filler mainly acting on the separation of a sample to be measured, and if it is a filler having an ionic functional group, it has been conventionally used as a filler for ion chromatography. Any filler that has been used can be used.
[0027]
As the filler (A), a filler having a cation exchange group or an anion exchange group is selected. As the filler having a cation exchange group, for example, a filler having a functional group such as —COOH or —SO ₃ H is used. and examples of those having an anion-exchange group, for example, -NR 2 as a functional group, _-NR 3 _(R is a hydrogen atom or an alkyl group) filler with the like.
[0028]
The material of the skeleton of the filler (A) is not particularly limited, and any of an organic type and an inorganic type can be used, and the organic type may be any of a synthetic type and a natural type. Examples of the synthetic material include, for example, acrylic and styrene-based polymers, and examples of the natural material include, for example, cellulose, chitosan, and polyamino acids. Examples thereof include silica, zirconia and the like.
[0029]
As the filler (A), one kind of filler is usually used, but two or more kinds of fillers may be used if they are of the same type of ion exchange system (for example, cation exchange or anion exchange). May be used in combination.
[0030]
The filler (B) used in the present invention 4 is different from the filler (A) in the interaction with the sample to be measured, and can improve the chromatogram of the filler (A) with respect to the sample to be measured. It is limited to the filler (B). The filler (B) varies depending on the type of the filler (A), and the selection range thereof can be any of the fillers conventionally used as a filler for liquid chromatography. And the same range as the selection range of the filler (B) of the present invention 1 described above. The filler (B) may be used as a mixture of two or more kinds.
[0031]
Examples of the combination of the filler (A) and the filler (B) of the present invention 4 include a combination in which both the filler (A) and the filler (B) are a filler having an ionic functional group. Specifically, examples of the filler (A) and the filler (B) having different ionic functional groups include a combination of a filler having a COOH group and a filler having an SO ₃ H group, and a filler having a COOH group. and the combination of filler with the NR ₂ groups include unions of filler with the filler and NR ₃ group with NR ₂ group Sega.
[0034]
The ratio of the amounts of the filler (A) and the filler (B) used in the present invention 4 and the method for producing a column for liquid chromatography are the same as those of the present invention 1.
[0035]
The sample to be measured in the analysis method of the present invention 4 is generally a sample containing a substance that can be measured by ion chromatography. For example, organic and inorganic cations and the like.
[0036]
The analysis method according to the fourth aspect of the present invention is described in the description of the first aspect of the present invention, except that, as a configuration example of the analyzer, only the column for liquid chromatography in the ion exchange mode is used as the column for liquid chromatography. This is the same as that described above, and the mobile phase used, the separation method, the detection method, and the like are the same as those described in the description of the first embodiment.
[0037]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, examples of the present invention will be described.
The analyzer in the embodiment was configured as shown in FIG. In addition, each apparatus used the following.
Liquid sending pump 3: LC-9A, manufactured by Shimadzu Corporation.
Sampler 4: Auto sampler. ASU-420 manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.
Detector 5: UV-visible spectrophotometer. SPD-6AV manufactured by Shimadzu Corporation.
[0038]
The fillers used in the examples are as follows.
Filler Cation-1
A cation exchange filler was produced by the method described in JP-A-3-73848 as follows.
1 g of benzoyl peroxide (polymerization initiator, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 200 g of diethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and added to a 3% by weight aqueous solution of polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Gosei Co., Ltd.). Nitrogen was introduced with stirring, and polymerization was performed at 80 ° C. for 2 hours. After cooling to room temperature, 40 g of acrylic acid was added, and the mixture was heated again to 80 ° C. and polymerized for 2 hours. The obtained particles were sequentially washed with water and acetone, dried, and then classified with an air classifier (manufactured by Nippon Steel Mining Co., Ltd.) to collect particles of 6 to 8 μm, which were designated as filler cation-1. Filler cation-1 has -COOH as a functional group.
[0039]
Filler Cation-2
Commercially available cation exchange filler (Fractogel EMD, manufactured by Merck). As a scaffold material, styrenic polymers are used, it has a -SO 3 _H as a functional group.
[0040]
Filler Anion-1
Commercially available anion exchange filler (ES-502N, manufactured by Asahi Kasei Corporation). A vinyl alcohol-based polymer is used as a material of the skeleton, and has —N (C ₂ H ₅ ) ₂ as a functional group.
[0041]
Filler Anion-2
Commercially available anion exchange filler (ICPak Anion, Waters). An acrylic polymer is used as a material of the skeleton, and has —N (CH ₃ ) ₃ as a functional group.
[0042]
Filler reverse phase-1
Commercially available reversed-phase filler (Micronex RP-30, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.). A styrene-based polymer is used as a skeleton material, and has a phenyl group as a functional group.
[0043]
Filler Normal phase-1
Commercially available normal phase filler (μ Bondasphere-NH ₂ , manufactured by Waters). As a scaffold material, silica is used, and a -NH ₂ as a functional group.
[0044]
Filler Apatite-1
Commercially available apatite-based filler (HCA-A, manufactured by Mitsui Toatsu).
[0045]
(Examples 1 to 3, Comparative Example 1)
{Circle around (1)} Preparation of Liquid Chromatography Column Filler (A) and filler (B) shown in Table 1 were added to 30 ml of 25 mM phosphate buffer (pH 6) at the used amount (g) shown in Table 1. It was dispersed (Comparative Example 1 used only the filler (A)). The above dispersion was added to a packer (capacity: 30 ml, manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 50 mm, and a liquid feed pump (manufactured by Shimadzu Corporation, LC-6AD) was connected to the packer. The column was manufactured by constant pressure packing.
[0046]
[Table 1]

[0047]
{Circle around (2)} Separation of protein A protein sample (containing myoglobin, chymotrypsinogen, cytochrome C and lysosome) dissolved in water was analyzed using the above-mentioned apparatus equipped with the above-mentioned liquid chromatography column. Detection was performed by measuring absorbance at 280 nm. Elution was performed by a linear gradient method in which 25 mM phosphate buffer (pH 6) containing NaCl at a concentration of 0.5 M was mixed with 25 mM phosphate buffer (pH 6), and the flow rate was 1.5 ml / min. did. FIG. 2 shows the chromatogram obtained in Example 1, and FIG. 3 shows the chromatogram obtained in Comparative Example 1. The chromatograms of Examples 2 and 3 were almost the same as the chromatogram of Example 1. In addition, each peak in FIGS. 2 and 3 is 11 myoglobin, 12 chymotrypsinogen, 13 cytochrome C, and 14 lysosome.
[0048]
(Examples 4 and 5, Comparative Example 2)
(1) Preparation of a column for liquid chromatography The filler (A) and the filler (B) shown in Table 2 were dispersed in 30 ml of a 20% aqueous methanol solution in an amount (g) shown in Table 2 (comparative). Example 2 uses only filler (A)). The above dispersion was added to a packer (capacity: 30 ml, manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 50 mm, and a liquid feed pump (manufactured by Shimadzu Corporation, LC-6AD) was connected to the packer. The column was manufactured by constant pressure packing.
[0049]
[Table 2]

[0050]
{Circle over (2)} Separation of Drugs A device prepared by dissolving a drug sample (containing aspirin, salicylic acid, codeine, salicylamide, and caffeine) in water was analyzed using the above-mentioned device equipped with the above-mentioned liquid chromatography column. Detection was performed by measuring absorbance at 254 nm. The elution was carried out with a 20% aqueous methanol solution, and the flow rate was 1.0 ml / min. FIG. 4 shows the chromatogram obtained in Example 4, and FIG. 5 shows the chromatogram obtained in Comparative Example 2. The chromatogram of Example 5 was almost the same as the chromatogram of Example 4. The peaks in FIGS. 4 and 5 are 15 aspirin, 16 salicylic acid, 17 codeine, 18 salicylamide, and 19 caffeine.
[0051]
(Example 6, Comparative Example 3)
{Circle around (1)} Preparation of Liquid Chromatography Column The filler (A) and the filler (B) shown in Table 3 were dispersed in 30 ml of a 20% aqueous acetonitrile solution in the used amount (g) shown in Table 3 (Comparison) Example 3 uses only filler (A)). The above dispersion was added to a packer (capacity: 30 ml, manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 50 mm, and a liquid feed pump (manufactured by Shimadzu Corporation, LC-6AD) was connected to the packer. The column was manufactured by constant pressure packing.
[0052]
[Table 3]

[0053]
{Circle around (2)} Separation of water-soluble vitamin An apparatus obtained by dissolving a water-soluble vitamin preparation (containing riboflavin, pyridoxine, thiamine and ascorbic acid) in water was analyzed using the above-mentioned apparatus equipped with the above-mentioned liquid chromatography column. Detection was performed by measuring absorbance at 254 nm. The elution was performed with a 20% aqueous acetonitrile solution, and the flow rate was 1.0 ml / min. FIG. 6 shows the chromatogram obtained in Example 6, and FIG. 7 shows the chromatogram obtained in Comparative Example 3. The peaks in FIGS. 6 and 7 are 20 riboflavin, 21 pyridoxine, 22 thiamine, and 23 ascorbic acid.
[0054]
(Example 7, Comparative example 4)
(1) Preparation of column for liquid chromatography Filler (A) and filler (B) shown in Table 4 were mixed with 30 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 6.7) in the used amount (g) shown in Table 4. (Comparative Example 4 used only the filler (A)). The above dispersion was added to a packer (capacity: 30 ml, manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 50 mm, and a liquid feed pump (manufactured by Shimadzu Corporation, LC-6AD) was connected to the packer. The column was manufactured by constant pressure packing.
[0055]
[Table 4]

[0056]
{Circle around (2)} Separation of protein An apparatus obtained by dissolving a protein sample (containing ovalbumin, lactalbumin, myoglobin and lysosome) in water was analyzed using the above apparatus equipped with the above-mentioned liquid chromatography column. Detection was performed by measuring absorbance at 280 nm. Elution was performed by a linear gradient method in which a 500 mM phosphate buffer (pH 6.7) was mixed with a 10 mM phosphate buffer (pH 6.7), and the flow rate was 1.0 ml / min. FIG. 8 shows the chromatogram obtained in Example 7, and FIG. 9 shows the chromatogram obtained in Comparative Example 4. The peaks in FIGS. 8 and 9 are 24 ovalbumin, 25 lactalbumin, 26 myoglobin, and 27 lysosome.
[0057]
(Examples 8 to 10, Comparative Example 5)
{Circle around (1)} Preparation of Liquid Chromatography Column The filler (A) and the filler (B) shown in Table 5 were dispersed in 30 ml of a 1 mM aqueous solution of perchloric acid in an amount (g) shown in Table 5 ( Comparative Example 5 uses only the filler (A)). The above dispersion was added to a packer (capacity: 30 ml, manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 50 mm, and a liquid feed pump (manufactured by Shimadzu Corporation, LC-6AD) was connected to the packer. The column was manufactured by constant pressure packing.
[0058]
[Table 5]

[0059]
(2) Separation of organic acid This is a device in which the above-mentioned liquid chromatography column is attached to the above device, and an organic acid sample (containing citric acid, malic acid, succinic acid, lactic acid and acetic acid) dissolved in water is analyzed. did. Detection was performed by measuring absorbance at 210 nm. Elution was performed with a 1 mM aqueous solution of perchloric acid, and the flow rate was 1.5 ml / min. FIG. 10 shows the chromatogram obtained in Example 8, and FIG. 11 shows the chromatogram obtained in Comparative Example 5. The chromatograms of Examples 9 and 10 were almost the same as the chromatogram of Example 8. The peaks in FIGS. 10 and 11 are the ions of 28 citric acid, 29 malic acid, 30 succinic acid, 31 lactic acid, and 32 acetic acid.
[0060]
【The invention's effect】
The configuration of the liquid chromatography column of the present inventions 1 to 3 is as described above, and a chromatogram of the sample to be measured can be improved and a liquid chromatography column that can be easily produced is obtained. Therefore, by using the column for liquid chromatography of the present invention 1, by selecting a separation mode, almost all samples conventionally analyzed by liquid chromatography can be more accurately analyzed by a simple method.
[0061]
Since the configurations of the analysis methods of the present inventions 4 to 6 are as described above, the chromatogram of the sample to be measured can be improved, and the column for ion exchange liquid chromatography that can be easily produced is used. A sample to be measured, which can be measured by the ion exchange separation mode, can be more accurately analyzed by a simple method.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an example of the configuration of an apparatus used for analysis using a column for liquid chromatography of the present invention.
FIG. 2 is a chromatogram of Example 1.
FIG. 3 is a chromatogram of Comparative Example 1.
FIG. 4 is a chromatogram of Example 4.
FIG. 5 is a chromatogram of Comparative Example 2.
FIG. 6 is a chromatogram of Example 6.
FIG. 7 is a chromatogram of Comparative Example 3.
FIG. 8 is a chromatogram of Example 7.
FIG. 9 is a chromatogram of Comparative Example 4.
FIG. 10 is a chromatogram of Example 8.
FIG. 11 is a chromatogram of Comparative Example 5.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Column for liquid chromatography 2 Mobile phase 3 Liquid sending pump 4 Sampler 5 Detector 6 Recorder

Claims

The interaction between the filler (A) having an ionic functional group that mainly acts on the separation of the sample to be measured and the filler (A) is different from that of the filler (A), and the measurement of the filler (A) is performed. The filler (B) having an ionic functional group capable of improving the chromatogram for the target sample is packed in one column, and the combination of the filler (A) and the filler (B) is A column for liquid chromatography, comprising a combination of a packing material having a COOH group and a packing material having an SO ₃ H group .