JP3563366B2

JP3563366B2 - 蛋白質高次構造に対してアンフォールド活性を有する蛋白質多量体

Info

Publication number: JP3563366B2
Application number: JP2001136610A
Authority: JP
Inventors: 如美逆瀬川; 博之佐々木; 承一郎月田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-05-07
Filing date: 2001-05-07
Publication date: 2004-09-08
Anticipated expiration: 2021-05-07
Also published as: US7335734B2; EP1403279A4; WO2002090385A1; US20050048078A1; EP1403279A1; DE60232970D1; JP2002356497A; EP1403279B1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、細胞内で合成された蛋白質の高次構造をほぐす活性（アンフォールド活性）を有し、蛋白質高次形成不全（蛋白質の凝集等）に起因する各種疾患の治療薬開発等に有用な蛋白質多量体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内で合成されたアミノ酸は、正しい立体構造を形成することができてはじめて機能する蛋白質となる。それゆえ、アミノ酸の正確な立体構造形成は細胞内で常に速やかで効率よく行われる必要があり、細胞は分子シャペロンと呼ばれる高次構造形成促進因子を持っている。ところが、分子シャペロンが働かないことや、合成されたアミノ酸の配列が間違っていて蛋白質が変性するような、何らかの不都合が生じることがある。このような蛋白質の機能的高次構造形成システムがうまく働かないことが原因で、様々な疾患が生じていることが近年わかってきた。
【０００３】
例えば、アルツハイマー病は、細胞内でアミロイドと呼ばれる成分が凝集してしまったために起こる神経疾患である。この場合、通常ならヘリックス立体構造を形成すべきアミロイドがクロスβ構造と呼ばれる構造に変換したために、アミロイドどうしが接着しやすくなり、細胞内に蓄積して脳神経傷害を引き起こす。また神経疾患のハンチントン舞踏病は、遺伝子の変異から新規に合成された蛋白の最後にポリグルタミン酸の尾部が付いてしまい蛋白質同士が互いに接着して機能しなくなることで生じる。さらに、パーキンソン病、Ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ、一部の脊髄小脳変性症などで、その病因が分子シャペロンの一つＨＳＰ（ＨＳＣ）の機能不全にあると指摘されている。
【０００４】
これらのように一見異なる疾患群が蛋白質の高次構造形成不全という共通の分子基盤に起因していることが解明されてくる一方で、極めて有効な治療法が存在しないのも事実である。なぜなら基質特異性なしに蛋白質の高次構造をほぐす活性を持つ成分が細胞内で未だ見つけられていなかったために、直接疾患の原因となる蛋白質にターゲットを当てて解析できないからである。
【０００５】
ところで細胞は疾患状態でなくとも、運動や分裂などダイナミックな動きをするときや、間違った高次構造をとったものを一旦ほどいて分解系へ手渡すような場合、蛋白質の構造が速やかにほぐれる柔軟性が必要になってくる。これまで、そういった因子の必要性は認識されていたもののその精製は困難で同定されていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前述のとおり、蛋白質の高次構造形成不全に起因する各種疾患を根本治癒するためには、疾患蛋白質の凝集を解消することが必要であり、そのためには、「蛋白質の高次構造をほぐす因子」を特定し、単離精製することが不可欠である。またそのような因子は、細胞生物学的な研究においても極めて有用な材料として使用しうるものと期待される。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、蛋白質高次構造に対して優れたアンフォールド活性を示す新しい蛋白質多量体を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質が８〜１５個会合し、蛋白質高次構造に対するアンフォールド活性を有することを特徴とする蛋白質多量体を提供する。
【０００９】
すなわち、この第１発明の蛋白質多量体は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅ（ＯＲＦ）ＹＤＬ１７８ｗ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｚ７４２２６）から転写される蛋白質（配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質）が８〜１５個、好ましくは１０〜１２個会合している蛋白質多量体（以下、ＹＤＬ１７８Ｗ多量体と記載することがある）である。
【００１０】
またこの出願は、第２の発明として、配列番号１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基の欠失または他のアミノ酸残基による置換、若しくは１以上の他のアミノ酸残基の付加を有するアミノ酸配列からなる蛋白質が会合している蛋白質多量体を提供する。この第２発明の蛋白質多量体は、前記出芽酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗから転写される蛋白質の変異体、あるいは他の酵母種や生物種のＹＤＬ１７８ｗ相同遺伝子領域から転写される蛋白質が会合し、細胞内の蛋白質高次構造に対するアンフォールド活性を有する蛋白質多量体である。
【００１１】
以下、この出願の発明について実施形態を詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
第１発明の蛋白質多量体（ＹＤＬ１７８Ｗ多量体）は、出芽酵母の産生する蛋白質を対象として、その蛋白質アンフォールド活性を指標とする生化学的アッセイによっても得ることができるが、遺伝子工学的方法による大量製造が好ましい。
【００１３】
すなわち、出芽酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗをコードするＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｚ７４２２６）を用いて酵母発現ベクターを組換え、この組換えベクターを酵母に形質導入し、この形質転換酵母の培養物から目的とするＹＤＬ１７８Ｗ多量体を単離、精製することによって、例えば医薬品の開発等に利用可能な量を取得することができる。
【００１４】
組換えベクターの酵母への導入は、リチウムアセテート法など公知の方法によって行うことができる。また、形質転換酵母から目的の蛋白質多量体を得るためには、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて行うことができる。さらに、精製を簡便かつ高精度で行うためには、後記実施例に示したように、アンフォールド活性に影響しないようなオリゴペプチドタグを付した蛋白質を発現させるようにしてもよい。
【００１５】
第２発明の蛋白質多量体もまた、前記と同様の遺伝子工学的手法によって得ることができる。すなわち、出芽酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗをコードするポリヌクレオチドまたはその一部配列をプローブとして、他の酵母種や生物種由来のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、出芽酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗの相同遺伝子を特定し、この遺伝子（ポリヌクレオチド）を組み換えた発現ベクターを宿主細胞に形質導入し、この形質転換宿主の培養物から公知の方法で単離、精製することによって目的の蛋白質多量体を得ることができる。宿主細胞は、導入するポリヌクレオチドの起源等に応じて、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞および植物細胞等を適宜に用いることができる。
【００１６】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
実施例１
出願酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗをコードするＤＮＡ断片の末端にヒスチジン６個からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をタグとして付加した。このＤＮＡ断片を酵母発現ベクターｐＡＵＲ１２３（宝酒造）に挿入して組換えベクターを構築し、この組換えベクターを酵母に導入した。薬剤（オーレオバシジン、宝酒造）に対する耐性を指標として、形質転換酵母株を選択し、さらに、０．５μｇ／ｍｌ濃度のオーレオバシジンを添加した酵母培養液（ＹＰＤ）で培養した。次いで、培養した酵母を回収し、ガラスビーズで破砕し、未破砕断片を含む画分を遠心除去した後、１０万×ｇで超遠心分離し、その沈殿を、ヒスチジンタグを特異的に認識するカラム樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ、キアゲン社、またはＴＡＬＯＮ、クローンテック社等）によって精製し、酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗから産生される蛋白質分子を得た。
実施例２
実施例１で得た酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗ由来の蛋白質分子を低角度回転蒸着法で処理し、電子顕微鏡で観察した。その結果、図１に示したように、この蛋白質分子は中央にホールを持つドーナツ形またはレンチ形をしており、蛋白質単量体が集合した多量体であることが確認された。
【００１８】
また、サイズ排除クロマトグラフィーによって確認した結果、図２に示したように、この蛋白質分子の分子量は約６７０キロダルトンであることが判明した。酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗから転写される蛋白質単量体の分子量が約６０キロダルトンであることから、実施例１で得られた蛋白質分子は、蛋白質ＹＤＬ１７８Ｗの単量体が１０〜１２会合した多量体であることが確認された。
実施例３
実施例１で得たＹＤＬ１７８Ｗ多量体の、ウサギ骨格筋由来ミオシンに対するアンフォールド活性を試験した。
【００１９】
ウサギ骨格筋由来ミオシンの一分子を電子顕微鏡で観察するため、低角度回転蒸着法によりサンプルを処理した。図３に示したように、ミオシンは頭部と尾部からなる特徴的な高次構造を有している。
【００２０】
実施例１で得たＹＤＬ１７８Ｗ多量体とミオシンとを３０℃１５分間、ＡＴＰ存在下でインキュベートし、同様に低角度回転蒸着法で処理した後、電子顕微鏡で観察した。その結果、図４に示したように、ＹＤＬ１７８Ｗ多量体によってミオシン分子は頭部が原型をとどめないほど構造が解体され、尾部のヘリックス構造もほどけている状態が観察された。
実施例４
酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗにコードされている蛋白質単量体のアミノ酸配列（配列番号１）の解析から、この蛋白質はその末端にコイル形成のための配列を含んでいることが確認された（配列番号１の位置１２９３〜１５９３）。そして、このようなコイル構造部分は通常、蛋白質の自己集合のための手段として用いられているため、ＹＤＬ１７８Ｗ多量体もこのコイル構造部分で多量体を形成していることが予想される。
【００２１】
そこで、酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗのＤＮＡ配列からこのコイル形成配列を除去し、この欠失ＤＮＡ断片を実施例１と同様にして酵母で発現させ、得られた蛋白質ＹＤＬ１８９Ｗ−ｄｅｌの分子量をサイズ排除クロマトグラフィーによって定量した。その結果、図５に示したように得られた蛋白質ＹＤＬ１８９Ｗ−ｄｅｌの分子量は、単量体蛋白質の予想される分子量とほぼ同等の約６０キロダルトンであり、コイル形成部分を欠く蛋白質は多量体を形成できないことが確認された。
【００２２】
次いで、この蛋白質ＹＤＬ１７８Ｗ−ｄｅｌの蛋白質高次構造に対するアンフォールド活性を検討した。基質として、ホタル発光酵素ルシフェラーゼを用い、ＹＤＬ１７８Ｗ−ｄｅｌまたはＹＤＬ１７８Ｗ多量体とＡＴＰ存在下でインキュベーションした。ルシフェラーゼは、高次構造が保たれていればその酵素活性によってルシフェリンを発光させることができ、ルミノメータにて検出される。図６に示したように、ＹＤＬ１７８Ｗ多量体と共にインキュベートしたルシフェラーゼはルシフェリンを発光させることができないことから、その高次構造がＹＤＬ１７８Ｗ多量体によってアンフォールドされていることが確認されたが、単量体蛋白質であるＹＤＬ１７８Ｗ−ｄｅｌと共にインキュベートしたルシフェラーゼは、高次構造がアンフォールドされず、コントロールと同程度のルシフェリン発光が検出された。
【００２３】
以上の結果から、酵母ＯＲＦＹＤＬ１７８ｗから発現される蛋白質が蛋白質高次構造アンフォールド活性を示すためには、多量体形成が必須であることが確認された。
【００２４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、蛋白質高次構造をアンフォールドする活性を有する蛋白質多量体が提供される。この蛋白質多量体は、蛋白質高次構造形成不全に起因する各種疾患の治療薬の開発等に有用である。
【００２５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のＹＤＬ１７８Ｗ多量体の構造を示す電子顕微鏡写真である。
【図２】この発明のＹＤＬ１７８Ｗ多量体の分子量を測定したサイズ排除クロマトグラフィーの結果である。
【図３】ウサギ骨格筋由来ミオシンの構造を示す電子顕微鏡写真である。
【図４】この発明のＹＤＬ１７８Ｗ多量体と共にインキュベーションしたミオシンの構造変化を示す電子顕微鏡写真である。
【図５】コイル形成部分を欠失した蛋白質ＹＤＬ１７８−ｄｅｌの分子量を測定したサイズ排除クロマトグラフィーの結果である。
【図６】この発明のＹＤＬ１７８Ｗ多量体または蛋白質単量体ＹＤＬ１７８Ｗ−ｄｅｌと共にインキュベートしたルシフェラーゼ酵素活性の測定結果である。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質が８〜１５個会合し、蛋白質高次構造に対してアンフォールド活性を有することを特徴とする蛋白質多量体。
配列番号１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基の欠失または他のアミノ酸残基による置換、若しくは１以上の他のアミノ酸残基の付加を有するアミノ酸配列からなる蛋白質が会合している請求項１の蛋白質多量体。