JP3566653B2 - 微小球を利用する複合アレイ - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、１９９８年１２月２８日に出願された米国特許出願６０／１１３，９６８号および１９９９年２月２４日に出願された同０９／２５６，９４３号の継続出願である。
（発明の分野）
本発明は、多数の試料の同時プロセッシングを可能とする個々のアレイの複合アレイを含むセンサー構成物に関する。さらに、本発明は該複合アレイの作製方法および使用方法にも関する。
【０００２】
（背景技術）
流体および気体中の特異的物質の存在および／または濃度の検出のためのいくつかのアッセイおよびセンサーがある。これらの多くは、検出メカニズムとして特異的リガンド／アンチリガンド反応に依存する。すなわち、一対の物質（すなわち、結合対またはリガンド／アンチリガンド）は、互いに結合するが、他の物質に対してわずかに結合するか、または全く結合しないことが知られている。このことは、これらの結合対を複合体の検出に利用するいくつかの技術の焦点であった。これらは、一般に、例えば、放射性同位元素、蛍光および他の光学上活性な分子、酵素などを用いて検出可能な全複合体を製造するために、複合体の１の成分をある方法で標識することによって行われる。
【０００３】
これらのセンサーにおいて、ルミネセンスを利用する検出メカニズムが特に使用される。近年、化学分析測定のための光吸収色素と組み合わせた光ファイバーおよび光ファイバーストランドの使用が、特に過去１０年の間に迅速に発展した。このような目的の光ファイバーおよび技術の使用は、Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈら、”Ｎｏｖｅｌ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｂｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＰＩＥ ２８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｏｎ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ４９４， １９８０； Ｓｅｉｔｚ， Ｗ．Ｒ．， ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ” ｉｎ Ｃ．Ｒ．Ｃ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １９， １９８８， ｐｐ． １３５−１７３； Ｗｏｌｆｂｅｉｓ， Ｏ．Ｓ．， ”Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒｓ Ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ” ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｓ．Ｇ． Ｓｃｈｕｌｍａｎ編）， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）； Ａｎｇｅｌ， Ｓ．Ｍ．， Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２ （４）： ３８ （１９８７）； Ｗａｌｔら、”Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ”， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ． ４０３， １９８９， ｐ． ２５２およびＷｏｌｆｂｅｉｓ， Ｏ．Ｓ．， Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ， Ｅｄ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９９１， ２ｎｄ Ｖｏｌｕｍｅによって記載されている。
【０００４】
より最近、光ファイバー・センサーが作製され、これは単一の分離した光ファイバーの束で、複数の色素の使用を可能としている。Ｗａｌｔらの米国特許５，２４４，６３６号および第５，２５０，２６４号はファイバー束の遠位端での複数の異なる色素はり付け用のシステムを開示しており、これらの各特許の教示を出展明示で本明細書に組み入れる。開示された構成は、束の別々の光ファイバーが個々の色素と光学的にアクセスすることを可能としている。これは、各色素が異なるアナライトに対して感受性である２つ以上の色素からの信号が組み合わされ、色素の発光スペクトルに有意なオーバーラップがある場合に起こる、各色素からの反射光（ｒｅｔｕｒｎｉｎｇ ｌｉｇｈｔ）中の別々の信号のデコンボルブ（ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｉｎｇ）の問題を回避する。
米国特許出願０８／８１８，１９９号および０９／１５１，８７７号は基体の表面上、例えば、各々の個々のファイバーが光学的サインを含むビーズを含んでなる光ファイバー束の末端上の微小球またはビーズを利用するアレイ構成物を記載している。ビーズはランダムに動くので、アレイを「デコード」するために独特な光学的サインを必要とする。すなわち、アレイ作製後、アレイ上の個々の部位の位置と、特定の部位のビーズまたは生物活性剤との相関を作ることができる。これは、ビーズがアレイ上でランダムに分布してよいことを意味し、従来のｉｎ ｓｉｔｕ合成またはスポッティング技術と比較して迅速で安価な方法である。一旦、アレイにビーズを負荷すれば、以下に詳しく説明するように、テスト後に起こる完全または部分デコードに応じてアレイをデコードでき、あるいは使用できる。
また、マイクロタイター・プレート中の複数のプローブ・アレイを含むシリコン・ウエファースを含む構成物が米国特許第５，５４５，５３１号に記載されている。
【０００５】
（発明の概要）
上記目的に従って、本発明は各アッセイ場所が複数の分離した部位を含む、複数のアッセイ場所を含む表面を有する第１基体を含む複合アレイ構成物を提供する。この基体はさらに、各サブ集団が生物活性剤を含む、少なくとも第１および第２のサブ集団を含む微小球の集団とを含む。該微小球は各アッセイ場所上に分布している。
さらなる態様において、本発明は複数のアッセイ場所を含む表面を有する第１基体と、各アレイ場所が分離した部位を含む、複数のアレイ場所を含む第２基体とを含む複合アレイを提供する。この構成物はさらに、各サブ集団が生物活性剤を含む、少なくとも第１および第２のサブ集団を含む微小球の集団とを含む。該微小球が各アレイ場所上に分布している。
さらなる態様において、本発明は、上記したアレイ構成物を用意し、該アレイ構成物に複数のデコーダー結合リガンドを添加して少なくとも複数の生物活性剤の位置を同定することを特徴とするアレイ構成物のデコード方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、試料を上記した構成物と接触させ、標的アナライトの存在または不存在を決定することを特徴とする１またはそれ以上の試料中の１またはそれ以上の標的アナライトの存在決定方法を提供する。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、多数の試料の同時分析、すなわち、逐次（ｓｅｒｉａｌ）プロセッシングよりも並行プロセッシングをすることのできる非常に高密度なアレイの形成に向けられている。これは「アレイのアレイ」、すなわち、複数の試料のプロセッシングができるように配置された複数の個々のアレイを含む複合アレイを形成することにより行える。例えば、各個々のアレイがマイクロタイター・プレートの各ウェル内に存在している。かくして、マイクロタイター・プレートのサイズおよび個々のアレイのサイズによって、非常に多数のアッセイを同時に進行できる。例えば、２０００の異なるスピーシーズ（高いレベルの重複組み込みを伴う）の個々のアレイと、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いて、１９２，０００の実験を一度に行うことができ、３８４マイクロタイター・プレート中の同じアレイは７６８，０００の同時実験を提供し、１，５３６マイクロタイタープレートは３，０７２，０００の実験を与える。
【０００７】
一般に、本発明のアレイ構成物は幾つかの様式で配置できる。好ましい具体例においては、以下に詳細に説明するように、「１構成要素」系を用いる。すなわち、複数のアッセイ場所（「アッセイ・ウエル」と称する場合もある）を含む、マイクロタイター・プレートのような第１基体を、各アッセイ場所が個々のアレイを含むように配置する。すなわち、アッセイ場所はアレイ場所と同じである。例えば、マイクロタイター・プレートのプラスチック材料を、各アッセイ・ウエルの底部に複数の「ビーズ・ウエル」を含むように成型できる。ついで、生物活性剤を含むビーズを、以下にさらに詳しく説明するように、各アッセイ場所のビーズ・ウエルに負荷（ｌｏａｄ）することができる。本明細書の開示ではビーズの使用を強調しているが、本発明の全ての具体例においてビーズを使用する必要はなく、生物活性剤はアレイ場所と直接結合してもよい。例えば、他のタイプのアレイがよく知られており、このフォーマットも使用でき、また、スポット、プリントまたはフォトリトグラフィー・アレイもよく知られている。例えば、ＷＯ９５／２５１１６、ＷＯ９５／３５５０５、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０９１６３、米国特許第５，７００，６３７号、第５，８０７，５２２号、第５，４４５，９３４号、および米国特許出願０８／８５１，２０３号、０９／１８７，２８９号ならびにこれらの引用文献参照。これら全てを出展明示で本明細書の記載に組み入れる。１構成要素系において、ビーズを使用しない場合、好ましい具体例は非シリコン・ウエハー基体の利用である。
【０００８】
別法として、「２構成要素」系を使用できる。この具体例において、個々のアレイは第２基体上に形成され、ついで第１のマイクロタイター・プレート基体に嵌るか、「浸漬（ｄｉｐｐｅｄ）」する。当業者が判るごとく、種々のアレイ・フォーマットおよび配置が利用できる。好ましい具体例は、個々のアレイとして光ファイバー束を利用し、一般に、各ファイバーの１表面にエッチングされた「ビーズ・ウエル」を有し、生物活性剤を含むビーズが光ファイバー束の該端部に負荷されている。かくして、複合アレイはマイクロタイター・プレートのウエル内に嵌るように配置された多数の個々のアレイを含む。別法として、他のタイプのアレイ・フォーマットも２構成要素系に使用できる。例えば、スポッティング、プリンティングまたはフォトリトグラフィー技術で作製されたような配列したアレイを上記したような第２基体上に位置させることができる。さらに、図１Ｃ〜Ｆに示すように、アレイの「片（ｐｉｅｃｅｓ）」をランダムに、または配列させた第１基体として利用できる。
【０００９】
総じて、本発明は、異なる化学的機能を担持する微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）とも称されるビーズを、個々の微小球と結合できる分離した部位を有するパターン化した表面を有する基体上に分布させるビーズに基づく分析化学システムを含む先の研究に基づいている。一般に、ビーズは基体上にランダムに置かれ、それ故、幾つかの異なる方法がアレイの「デコード」に使用される。１つの具体例では、独特の光学的サイン、一般に、蛍光色素がビーズに組み込まれ、個々のビーズ上の化学的機能を確認するのに使用できる。これにより、候補薬剤（すなわち、核酸および抗体のような化合物）の合成を、アレイ上のそれらの配置とは分離して可能とする。すなわち、候補薬剤をビーズ上で合成でき、ついでビーズはパターン化した表面へランダムに分布される。ビーズはまず、光学的サインによりコードされるので、これはアレイが後に「デコード」できることを意味する。すなわち、アレイを作製後、アレイ上の個々の位置と、各位置におけるビーズまたは候補薬剤とを相関させることができる。これはビーズをアレイ上にランダムに分布でき、従来のｉｎ ｓｉｔｕ合成や、スポッティング技術と比べて迅速で安価な方法である。これらの方法は、全般的に、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０２５、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１１９３、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０９１４、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１４３８７および米国特許出願０８／８１８，１９９、０９／３１５，５８４、０９／１５１，８７７に説明されており、これら全てを出展明示で本明細書に組み込む。また、本明細書での考察は、一般的に、ビーズの使用に向けられているが、同じ構成はセルおよび他の粒子にも適用できる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４４７３参照。
【００１０】
これらのシステムにおいて、生物活性剤の配置は一般にランダムであり、それ故、コーディング／デコーディング・システムはアレイ中の各位置における生物活性剤を同定ないしは確認する必要がある。これは、以下に詳しく説明するように、種々の方法で行うことができ、一般に、ａ）生物活性剤またはビーズに結合した同定物（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）結合リガンド（ＩＢＬ）と結合する、一般に直接ラベルされたデコーディング（ｄｅｃｏｄｉｎｇまたはｄｅｃｏｄｅｒ）結合リガンド（ＤＢＬ）の使用、ｂ）例えば、ビーズ配置を標的とするか（例えば、ビーズの個々の位置への選択的付加を可能とする光活性化または光切断性部分の使用により）、または以下に詳しく説明するようにサブ−バンドル（ｓｕｂ−ｂｕｎｄｌｅｓ）の使用または部位の選択的負荷による位置デコーディング、ｃ）標的と結合するビーズだけがデコードされる選択的デコーディングが含まれる。場合により、以下に詳しく説明するように、このデコーディングは全てのビーズで起こってもよく、また、ある標的アナライトと結合したビーズのみで起こってもよい。同様に、これは標的アナライトの添加前でも後でも起こってよい。
一旦、アレイにおける各微小球の同一性（すなわち、実際の薬剤）および位置が固定されたら、アレイを標的アナライトを含有する試料に曝す。以下に説明するが、これは分析前でも分析の間でもできる。標的アナライトは、以下に詳しく説明するように生物活性剤と結合し、個々のビーズの光学的サインの変化をもたらす。
【００１１】
本発明においては、「デコーディング」は、光学的サイン、デコーディング工程の間に添加されるデコーディング結合リガンドまたはこれの方法の組み合わせが使用できる。デコーディング結合リガンドはビーズ上に位置する特有の同定物結合リガンド・パートナーか、例えば、ビーズが一本鎖核酸を生物活性剤として含む場合、生物活性剤自体と結合する。デコーディング結合リガンドは、直接または間接的にラベルされ、このラベルの存在を検出することによりデコーディングが起こる。デコーディング結合リガンドのプールを連続して使用することにより、デコーディング工程の数を非常に少なくすることが可能である。
【００１２】
したがって、本発明は、複数のアッセイ場所を含む表面を有する少なくとも第１の基体を含むアレイ構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供するものである。本明細書における「アレイ」は、アレイ・フォーマットの複数の候補薬剤を意味し、アレイのサイズは構成物およびアレイの最終使用目的に依存する。アレイは、約２つの異なる生物活性剤（すなわち、異なるビーズ）から数百万まで含むことができ、非常に大きなファイバーオプティック・アレイも可能である。一般に、アレイは、ビーズおよび基体のサイズ、アレイの最終使用目的に応じて、２から１０億以上を含むことができ、すなわち、非常な高密度、高密度、中密度、低密度、非常な低密度のアレイとすることができる。非常な高密度のアレイの好ましい範囲は、約１０，０００，０００〜約２，０００，０００，０００（全ての数字はｃｍ^２当り）で、好ましくは約１００，０００，０００〜約１，０００，０００，０００である。高密度アレイの範囲は、約１００，０００〜約１０，０００，０００で、特に好ましくは約１，０００，０００〜約５，０００，０００である。中密度アレイの範囲は、約１０，０００〜約１００，０００で、特に好ましくは約２０，０００〜約５０，０００である。低密度アレイは、一般に、１０，０００より少なく、約１，０００〜約５，０００が好ましい。非常な低密度アレイは約１，０００より少なく、約１０〜約１，０００が好ましく、約１００〜約５００が特に好ましい。ある具体例においては、本発明の構成物はアレイ・フォーマットでなくてもよく、すなわち、ある具体例については、単一の生物活性剤を含む構成物も同様に作製してよい。また、いくつかのアレイでは、異なるまたは同一構成物の複数の基体を使用してもよい。かくして、例えば、大きなアレイは複数のより小さい基体を含むことができる。
【００１３】
また、本発明の構成物の１つの利点は、特に、ファイバーオプティック技術を介して、極端な高密度アレイを作製できることである。例えば、２００μｍ以下のビーズ（２００ｎｍのビーズも可能である）を使用でき、非常に小さなファイバーも公知であり、０．５ｃｍ^２当り個々のビーズまたはファイバー１５，０００，０００以上の密度（場合により２５〜５０×１０^６も）で、１ｍｍ^２のファイバーオプティク・バンドル中４０，０００〜５０，０００以上（場合によっては百万）もの多数の異なるファイバーおよびビーズを得ることも可能である。
本明細書で用いる「複合アレイ」または「組み合わせアレイ」あるいは文法的均等物は、上記した複数の個々のアレイを意味する。一般に、個々のアレイの数は用いるマイクロタイター・プレートのサイズによりセットされ、９６ウエル、３８４ウエルおよび１５３６ウエルマイクロタイター・プレートは９６、３８４および１５３６個の個々のアレイを含む複合アレイに利用されるが、当業者に判るとおり、各マイクロタイター・ウエルが個々のアレイを含む必要はない。複合アレイは同一、同様または異なる個々のアレイを含むことができることに注意すべきである。すなわち、ある具体例では、９６の異なる試料について２０００の同じアッセイを行うことが要望されることがあり、一方、同じ試料について１９２０００の実験（すなわち、９６ウエルの各々に同じ試料）を行うことが要望されうる。また、複合アレイの各列（ｒｏｗ）またはカラムを重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）／品質管理用に同じにすることができる。当業者が判るように、このシステムを作るために種々の方法がある。また、アレイのランダム性はビーズの同じ集団を２つの異なる表面に付加し、実質的に同じ、ただし、多分同一ではないアレイをもたらすことを意味しうる。
【００１４】
本明細書で使用する「基体」または「固体支持体」または他の文法的均等物は、ビーズの結合または会合に適した分離した個々の部位を含むように修飾でき、、少なくとも１つの検出法に敏感に反応するいずれかの物質を意味する。当業者に明らかなごとく、可能な基体の数は非常に多い。可能な基体には、限定するものではないが、ガラス、修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を包含する）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび修飾シリコンを包含するシリカベース物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー・バンドルおよび種々の他のポリマーが包含される。一般に、基体は光学的検出を可能にし、それ自体は認められるほどに蛍光を発しない。
一般に、基体は平ら（平面）であるが、当業者に明らかなごとく、基体の他の配置も同様に使用でき、例えば、試料のビーズへの接近（アクセス）を可能とし、検出に共焦点（ｃｏｆｏｃａｌ）顕微鏡を使用できるプラスチックの多孔質ブロックにビーズを埋め込むことにより、三次元配置も使用できる。同様に、ビーズをフロー‐スルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）試料分析用のチューブの内表面に位置させて試料容量を最少にすることもできる。好ましい基体には、以下に説明する光ファイバー束や、ガラス、ポリスチレンと他のプラスチックおよびアクリルのような平面が包含される。幾つかの具体例では、シリコン・ウエファー基体は好ましくない。
【００１５】
第１基体は、標的アナライトのアッセイが行われる位置である複数のアッセイ場所を含む表面を含む。アッセイ場所は一般に、例えば、マイクロタイター・プレートのウエルのように相互に物理的に分離しており、他の構成（疎水性／親水性等）もアッセイ場所の分離に使用できる。
好ましい具体例において、第２基体は、米国特許出願０８／９４４，８５０号および０８／５１９，０６２号ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０２５およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０９１６３に一般的に記載されているような光ファイバー束またはアレイであり、これらを出展明示で本明細書に組み入れる。好ましい具体例は、予め成形された一元のファイバーオプティック・アレイを利用する。本明細書で使用する「予め成形された一元のファイバーオプティック・アレイ」は、長さ方向に沿って、共軸的に配置され、一体となった光ファイバー束を意味する。ファイバーストランドは、一般的に個々にクラッディングされている。しかし、他のファイバーオプティック・フォーマットと予め成形された一元のアレイとを区別する１つのことは、ファイバーが個々に物理的に操作できないこと、すなわち、一般に、１つのストランドが、長さ方向に沿ったいずれの点でも物理的に他のフェアバーストランドから分離できないことである。
しかし、ある「２構成要素」具体例では、第２基体はファイバーオプティック・アレイではない。
好ましい具体例において、アッセイ場所（「１構成要素システム」の）またはアレイ場所（「２構成要素システム」の）は複数の分離部位を含む。すなわち、前者において、本明細書に記載するようにアッセイ場所はアレイ場所と同じである。後者において、アレイ場所は別々にアッセイ場所に嵌る。これらの具体例において、基体の少なくとも１つの表面を修飾して、後の微小球との会合のため（または、微小球を使用しない場合、生物活性剤の結合のため）の分離した個々の部位を含ませる。これらの部位は、物理的に変化した部位、すなわち、ビーズを保持して微小球をその中で支えることができる基体におけるウエルまたは小さなくぼみのような物理的な構成、または、他の力（磁力または圧縮）の使用、または、化学的に機能化された部位のような化学的に変化したもしくは活性化された部位、静電気的に変化された部位、親水性／疎水性的に機能化された部位、接着剤のスポット等を含むことができる。
【００１６】
部位はパターン化、すなわち、一定のデザインまたは配置とすることができ、またはランダムに分布させてもよい。好ましい具体例では、Ｘ−Ｙ座標平面でアドレス指定できるように部位の一定のパターンを用いる。この意味での「パターン」には、好ましくは基体上のビーズに高密度を可能とするユニット・セルの繰返しが包含される。しかし、これらの部位は、分離した部位でなくてもよいことに注意すべきである。すなわち、例えば、いずれかの位置でビーズの会合を可能にする接着剤または化学的機能性の均一な表面を使用することも可能である。かくして、基体の表面を修飾して、個々の部位が他の部位と連続していても、不連続であっても、微小球の個々の部位への会合を可能とさせる。例えば、基体の表面を、単一の会合したビーズのみを有するように分離した部位を修飾するか、別法として、基体の表面を修飾し、ビーズがどこかに沈み、最後に分離した部分に入らせることもできる。
【００１７】
好ましい具体例において、基体の表面を修飾してウエル、すなわち、基体表面の窪みを含ませる。これは、限定するものではないが、フォトリトグラフィー、スタンプ技術、成型技術およびマイクロエッチング技術を包含する種々の技術を用いて、当業者に一般的に知られている方法で行なうことができる。当業者に明らかなごとく、用いる技術は構成物および基体の形状に依存する。第１基体がアッセイ場所と個々のアレイの両方を有する場合、好ましい方法は、マイクロタイター・プレートの底部にビーズ・ウエルを形成する成型技術を利用する。同様に、好ましい具体例は、アレイ・フォーマットに「フィンガー」または突起を含み、各フィンガーがビーズ・ウエルを含む成型第２基体を利用する。
好ましい具体例において、物理的変化を基体の表面に作製し、部位を生じさせる。好ましい具体例において、例えば、基体がファイバーオプティカル・バンドルである場合、基体の表面は、米国特許出願０８／８１８，１９９号および０９／１５１，８７７号に一般的に記載されるファイバー束一末端である。これらを出展明示で本明細書に組み入れる。この具体例において、ウエルは、個々のファイバーを含むファイバーオプティカル・バンドルの末端または遠位端中に作製される。この具体例において、個々のファイバーの芯はクラッディングに関してエッチングされ、ファイバーの一端に小さなウエルまたは窪みが形成される。ウエルの必要な深さはウエルに加えるビーズのサイズに依存する。
【００１８】
一般に、この具体例において、該ウェルは以下に概説するように化学的に機能するが、微小球はウェルに共有結合しておらず、ビーズ上に架橋剤を用いることができ、あるいは物理的バリアー、すなわち、フィルムまたは膜を用いることもできる。
好ましい具体例においては、本発明の微小球を基体上の分離した部位または位置に共有または非共有のいずれかで結合させるのに用いることのできる、修飾された部位、特に化学的に修飾された部位を含有するように基体の表面を修飾する。本明細書中の「化学的に修飾された部位」とは、対応する反応性官能基も含有するのが一般である微小球を共有結合させるのに用いることのできる、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基を含む、１つのパターンの化学的官能基の付加；微小球を結合させるのに用いることのできる１つのパターンの接着剤の付加（接着剤を付加するために先に化学的に官能化するか、または接着剤の直接的付加のいずれかによる）；微小球を静電気的結合させるための１つのパターンの荷電基の付加（化学的官能化と同様）、すなわち、微小球がその部位と反対の荷電基を含む場合；適当な実験条件下、同様に疎水性または親水性微小球の付加がヒドロアフィニティーに基づいて微小球の該部位への会合をもたらすように、該部位を特異に疎水性または親水性とする１つのパターンの化学的官能基の付加を包含するが、これらに限定されるものではない。例えば、水性系にて、疎水性部位を疎水性ビーズと使用すると、該部位上でのビーズの会合が優勢的に行われる。
また、ビーズを基体と結合させるのに生物学的修飾も使用できる。例えば、本明細書に一般的に記載するように、結合リガンド対を使用できる。１つのパートナーをビーズ上に、他のパートナーを基体上に存在させる。この態様の特に好ましいものは、相補的核酸鎖と抗原／抗体対である。
さらに、この方法における生物学的部分の使用は、複合アレイの創作も可能とする。これは、基体１０がないことを除いて図１Ｆに示すシステムと同様である。この具体例において、ビーズの集団は１つの結合パートナーを含み、この集団のサブ集団は異なる生物活性剤を有する。異なる結合パートナーを有する異なる集団と、空間的に分離した結合パートナーを有する異なるアッセイまたはアレイ場所を含む基体を使用することにより、複合アレイを生じさせることができる。この具体例も、以下に一般的に記載するように、複合アレイの各分離したアレイが同じコードを使用できるように、コードを再使用する。
上記したように、「パターン」は、この意味において、ビーズを分離した部位に結合させるためにその表面を均一に処理するのに用いること、ならびにその表面を処理して分離した部位を得ることを包含する。当業者に自明であるように、これは種々の方法で行うことができる。
【００１９】
当業者が判るように、図面に一般的に示すようにシステムの多数の可能な配置がある。本明細書に記載の標準的なフォーマットに加え、種々の他のフォーマットを使用できる。例えば、図１Ｃ〜１Ｆに示すように、相互に連結していない基体の「片」を使用できる。再び、これらは同じアレイでも、異なるアレイでもよい。これらの片を個別に作製することも、単一の基体上の大きなユニットとしても作製し、ついで基体を異なる個々の基体に切断または分離できる。すなわち、例えば、図１Ｃおよび１Ｄは第２基体のウエルに添加した複数のビーズを示し、図１Ｃは混合を最大化するための「ビーズのビーズ」である。図１Ｄは複数の平らな第１基体を利用するもので、当業者が判るように、これらは第２基体に結合しても、しなくてもよい。１つの具体例においては、何ら特別な結合手段を用いない。これとは別に種々の結合技術が使用される。例えば、ビーズと基体の結合について説明したように、接着剤、化学、疎水性／親水性相互反応等の使用を含め、共有または非共有力を使用できる。また、基体は磁性であっても、磁力的に保持されていても（所望により混合しても）よい。すなわち、例えば、図１Ｆに示すように、結合部分を使用することができ、これらは共有結合または非共有結合とすることができる。これらは単純に結合のため、または第１基体アレイを第２基体中または上の個々の位置を標的とするために使用できる。すなわち、例えば、異なるオリゴヌクレオチドを、第１基体を第２基体に向け、結合させるために使用できる。
好ましい具体例において、イメージ作製に用いる基体に光学的特性を組み込む。かくして、例えば、１構成要素または２構成要素システムのいずれでも、基体に「レンズ化（ｌｅｎｓｉｎｇ）」能を組み込むことができる。例えば、１構成要素システムにおいて、１つ以上のアッセイ場所の底部は、レンズ、フィルター等の独特な、特別の光学的要素を有していてもよい。
【００２０】
また、好ましい具体例はアッセイ反応の混合を容易にするための配置を利用する。例えば、好ましい具体例は混合を可能にする２構成要素システムを利用する。すなわち、幾つかの具体例においては、アレイはブロックから突出し、反応を撹拌して反応成分の良好な混合、反応の動力学を増加する等の「スティック」として使用できる。当業者が判るとおり、これは種々の方法で行うことができる。好ましい具体例では、第１および第２の基体を、それらが相互に関してＸ−Ｙ座標平面、Ｘ−Ｚ座標平面、Ｙ−Ｚ座標平面または三次元（Ｘ−Ｙ−Ｚ）で動くことができるように配置される。好ましい具体例は、ブロックがプレートの平面内またはプレート平面に対して直交して自由に動くことのできるブロック・ジグを利用する。標準的混合条件は反応容量が小さい時には、しばしば、十分に作用しないので、これはこのような時に特に有用である。
また、これに加えて、あるいはこの代わりに、システムの一部としてさらなる混合要素が存在してもよい。例えば、外来性混合粒子が存在してもよく、１つの具体例では、例えば、混合を強制するために動く磁石と共に磁性粒子を利用する。例えば、小さい磁性混合バーと、磁石回転板を使用できる。
別法として、１構成要素または２構成要素システムにおいて、標準的技術を用い、所望により混合粒子を用い、システムを密閉し、振盪することにより行うことができる。
【００２１】
好ましい具体例において、本発明の構成物はさらに一集団の微小球を含む。本明細書中の「集団」とは、アレイについて上記したように、複数のビーズを意味する。集団内には、単一の微小球または複数の個々の微小球とすることのできる分離したサブ集団がある。すなわち、ある具体例においては、以下にさらに詳細に記載するように、アレイは各生物活性剤用に単一のビーズを含有するだけであってもよい；好ましい具体例は各タイプの複数のビーズを利用する。
本明細書中の「微小球」または「ビーズ」または「粒子」あるいは文法的に均等な物は、小さな別個の粒子を意味する。ビーズの組成は、生物活性剤の種類および合成方法に応じて変化する。適当なビーズ組成は、ペプチド、核酸および有機物の合成に用いられる組成、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性物質、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、セファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびテフロンを含むが、これらに限定されるものではなく、このすべてを用いることができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮの「ミクロスフェア・ディテクション・ガイド（Ｍｉｃｒｏｓｐｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ）」が有用なガイドブックである。
ビーズは球状である必要はなく；不規則な粒子を用いることもできる。また、生物活性剤の結合またはＩＢＬの結合に利用できるビーズの表面積を増加させるのに、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズの大きさは、ナノメーター、すなわち１００ｎｍから、ミリメーター、すなわち１ｍｍの範囲にあり、約０．２ミクロンないし約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５ないし約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、ある場合には、さらに小さなビーズを用いることもできる。
本発明で重要な要素は、アッセイの過程でビーズが動かないように、ビーズを基体の表面にある分離した部位に結合または付着させることのできる基体／ビーズのペアリングを使用することである。
【００２２】
当業者に明らかであるように、微小球は、各々、生物活性剤を含み、その合成方法に応じて、生物活性剤を含まない微小球が存在してもよい。本明細書中の「候補生物活性剤」または「生物活性剤」または「官能基物質」または「結合リガンド」は、本明細書で用いる場合、本発明の微小球に結合することのできる、いずれもの分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小型有機分子、配位錯体、多糖類、ポリヌクレオチドなどを意味する。本発明の構成物には２通りの主たる用途があることが理解されよう。好ましい具体例において、以下にさらに詳細に記載するように、特定の標的アナライトの存在、例えば、特定のヌクレオチド配列または特定のタンパク質、例えば、酵素、抗体もしくは抗原の有無を検出するのに当該構成物が用いられる。別の好ましい具体例において、当該構成物を用い、生物活性剤、すなわち、薬物候補物質を特定の標的アナライトへの結合についてスクリーニングすることができる。
【００２３】
生物活性剤は、典型的には有機分子であり、好ましくは分子量が１００ダルトンより大きく、約２５００ダルトンよりも小さい、小型有機化合物であるが、多くの化学種を包含する。生物活性剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に不可欠な官能基を有しており、典型的には少なくとも１個のアミノ、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の官能基を含む。生物活性剤は、上記した１またはそれ以上の官能基で置換された、環状炭素構造または複素環構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む場合が多い。生物活性剤はまた、ペプチド、核酸、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログまたは組合せを含む生物分子中にも見られる。核酸およびタンパク質が特に好ましい。
生物活性剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、多種の供給源から手に入れることができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、多種の有機化合物と生物分子のランダム合成および定方向性合成に多くの手段を利用することができる。別法として、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーも利用可能であり、あるいは容易に生成される。また、天然または合成生成されたライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学、物理および生化学手段を介して容易に修飾される。既知の薬理学的物質を、アシル化、アルキル化、エステル化および／またはアミド化などの定方向性またはランダムな化学的修飾に付し、構造的アナログを生成してもよい。
【００２４】
好ましい具体例においては、生物活性剤はタンパク質である。本明細書の「タンパク質」とは、少なくとも２個のアミノ酸が共有結合したものを意味し、タンパク質類、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。タンパク質は天然に存在するアミノ酸とペプチド結合とから、あるいは合成ペプチド疑似構造からできていてもよい。このように、本明細書で用いる場合の「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸であると考えられる。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい具体例においては、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。天然に存在しない側鎖を用いるならば、例えば、インビボ分解を防止または妨げるのに非アミノ酸置換基を用いてもよい。
【００２５】
１つの好ましい具体例においては、生物活性剤は天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。このように、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物またはタンパク質性細胞抽出物のランダムまたは定方向性消化を用いることができる。この点では、原核生物および真核生物のタンパク質のライブラリーを本明細書に記載のシステムにてスクリーニングするために調製することができる。この具体例においては、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳動物のタンパク質が特に好ましく、とりわけ後者が好ましく、ヒトタンパク質が最も好ましい。
好ましい具体例において、生物活性剤は、約５ないし約３０個のアミノ酸のペプチドであり、約５ないし約２０個のアミノ酸が好ましく、約７ないし約１５個のアミノ酸が特に好ましい。ペプチドは上記した天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチドまたは「偏向した」ランダムペプチドであってもよい。本明細書の「ランダム化」または文法的に均等な物は、核酸およびペプチドが、各々、本質的にランダムヌクレオチドおよびアミノ酸からなっていることを意味する。一般に、これらのランダムペプチド（または以下に記載の核酸）は化学的に合成されるため、それらはどのヌクレオチドまたはアミノ酸のどの位置に入ることもできる。合成方法は、ランダム化タンパク質または核酸を生成し、配列の長さのすべてまたは大部分で可能な組合わせを形成するように設計し、そうしてランダム化生物活性タンパク質性物質のライブラリーを形成することができる。
【００２６】
好ましい具体例においては、生物活性剤のライブラリーを用いる。そのライブラリーは生物活性剤の構造上十分に多様な集団を提供するものであり、標的アナライトに対して蓋然的に十分な範囲にて結合する。したがって、反応体ライブラリーはそのメンバーの少なくとも１つが標的アナライトに対してアフィニティーを付与する構造を有するように十分に大きくなければならない。反応体ライブラリーの必要とする絶対的な大きさを測ることは困難であるが、免疫応答特性で１の手掛かりが得られる：１０^７〜１０^８の異なる抗体の多様性は、生物が直面する可能性のある大部分の抗原と相互作用するのに十分にアフィニティーのある少なくとも１つの組合わせを提供する。発表されたインビトロの選択技術も１０^７〜１０^８のライブラリーの大きさが標的に対するアフィニティーを有する構造を見出すのに十分であることを示している。このように、好ましい具体例においては、少なくとも１０^６、好ましくは少なくとも１０^７、より好ましくは少なくとも１０^８、最も好ましくは少なくとも１０^９の異なる生物活性剤を本発明の方法にて同時に分析する。好ましい方法はライブラリーの大きさおよび多様性を最大限に活用する。
好ましい態様においては、ライブラリーは十分にランダム化されており、どの位置においても配列の優先性および定常性はない。もう１つの好ましい具体例においては、ライブラリーを偏向させる。すなわち、配列内のある位置は、定常性を保持するか、または可能性のある限定された数の中から選択される。例えば、好ましい具体例において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、所定の種類、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、架橋してシステインを創製することに、ＳＨ−３ドメインについてのプロリンに、リン酸化部位についてセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン等に、またはプリンに立体的に偏向した（小型または大型）残基内でランダム化する。
【００２７】
好ましい具体例において、生物活性剤は核酸（一般に、本明細書中、「プローブ核酸」または「候補プローブ」と称される）である。本明細書中の「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に均等な物は、少なくとも２つのヌクレオチドが一緒に共有結合したものを意味する。本発明の核酸はリン酸ジエステル結合を含有するのが一般的であるが、場合によっては、以下に示すように、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の引用文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８０５（１９８４）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｒａ、２６：１４１（１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５６４４０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホルアミド連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、オリゴヌクレオチドおよびアナログ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）およびペプチド核酸骨格および連結（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｉｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：２０７（１９９６）、そのすべてを出典明示により本明細書の一部とする）を含む、別の骨格を有していもよい核酸類似体が含まれる。他の類似する核酸は正の骨格（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：６０９７（１９９５））；非イオン性骨格（米国特許第５３８６０２３号；第５６３７６８４号；第５６０２２４０号；第５２１６１４１号；および第４４６９８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉら、Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ、３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１３：１５９７（１９９４）；第２章および第３章、ＡＳＣシンポジウム・シリーズ５８０、「アンチセンスリサーチにおける炭水化物修飾」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ．Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ、３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３７：７４３（１９９６））および米国特許第５２３５０３３号および第５０３４５０６号ならびに第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウム・シリーズ５８０、「アンチセンスリサーチにおける炭水化物修飾」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ．Ｃｏｏｋ編に記載の非リボース骨格を有する核酸を包含する。１またはそれ以上の炭素環状糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、（１９９５）１６９−１７６頁を参照）。数種の核酸類似体が、Ｒａｗｌｓ，Ｃ．＆Ｅ Ｎｅｗｓ、６月２日、１９９７年、３５頁に記載されている。これらの刊行物はすべて出典を明示することにより本明細書の一部とする。リボース−リン酸骨格においてこれらの修飾を行い、標識などのさらなる部分の付加を促進し、あるいは生理学的環境中のかかる分子の安定性および半減期を増加させることもできる；例えば、ＰＮＡが特に好ましい。加えて、天然に存在する核酸および類似体の混合物を調製することもできる。また、種々の核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸および類似体の混合物を調製することもできる。核酸は特記されていれば一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、あるいは二本鎖または一本鎖の両方の配列の部分を含有していてもよい。核酸はＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく；ここで、核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組合わせ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニンおよび塩基類似体、例えば、ニトロピロールおよびニトロインドール等を含む、塩基のいずれの組合わせを含有していてもよい。
【００２８】
好ましい具体例において、生物活性剤はクローン核酸のライブラリーであり、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。この具体例において、一般的には、慣用的方法（プラスミドまたはファージベクター中での増殖、ＰＣＲを包含する増幅方法等を包含するが、これらに限らない）を用いて個々の核酸が調製される。好ましくは、核酸は、マイクロタイター・プレート・フォーマット、およびライブラリーを付着させるために添加されるビーズのごとき特定のフォーマットにおいて並べられる。
化学的またはアフィニティー捕捉（例えば、後でそれらを用いて核酸を表面に付着させることができるＡｍｉｎｏＬｉｎｋまたはビオチン化ヌクレオチドのごとき誘導体化ヌクレオチドを含ませること、ならびにハイブリダイゼーションによるアフィニティー捕捉を包含）、架橋、および静電気的付着等を包含する当該分野で理解されている種々の方法（これらの方法に限らない）において、クローンライブラリー（または本明細書で説明するいずれかの核酸）の付着を行うことができる。
好ましい具体例において、アフィニティー捕捉を用いてクローン核酸をビーズに付着させる。例えば、結合ペアーの一方のメンバーでクローン化核酸を誘導体化し、結合ペアーの他方のメンバーでビーズを誘導体化することができる。適当な結合ペアーはＩＢＬ／ＤＢＬペアーに関して本明細書で説明されているものである。例えば、クローン化核酸ををビオチン化してもよい（例えば、ビオチン化ヌクレオチドの酵素による取り込みを用いて、あるいはビオチンの光活性化架橋により）。次いで、当該分野において知られているように、ビオチン化核酸をストレプトアビジン被覆ビーズ上に捕捉することができる。同様に、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体のごとき他のハプテン−受容体の組み合わせを使用することができる。別法として、核酸を表面に付加するために使用する化学基を誘導体化ヌクレオチドの形態に付加することもできる。
好ましい付着は共有結合であるが、核酸分子１個につき複数の付着部位が存在する場合には、比較的弱い相互作用（すなわち、非共有結合）であっても核酸を表面に付着させるに十分でありうる。かくして、例えば、生物活性剤とは逆の電荷を有するビーズを用いることにより、静電気的相互作用を付着に使用することができる。
同様に、ハイブリダイゼーションを用いるアフィニティー捕捉を用いて、クローン化核酸をビーズに付着させることもできる。例えば、当該分野において知られているように、オリゴ−ｄＴビーズへのハイブリダイゼーションによりポリＡ付加ＲＮＡをルーチンに捕捉する。これには、オリゴ−ｄＴ捕捉およびその後の架橋工程（例えば、プソラレン架橋）を用いてもよい。目的の核酸がポリＡ部分を含まない場合には、当該分野で知られているように、ターミナルトランスフェラーゼを用いるポリマー化、あるいはオリゴＡリンカーの連結により付着させることができる。
別法として、例えば、当該分野で知られているように、チミジンを反応性基に対して光活性化架橋することによって化学的架橋を行ってもよい。
【００２９】
一般的には、以下にさらに詳細に説明するように、クローンのアレイを解読するには特別な方法が必要である。
タンパク質に関して上で一般的に説明したように、核酸生物活性剤は天然に存在する核酸、ランダム核酸または「偏向した」ランダム核酸であってもよい。例えば、タンパク質に関して上で説明したように、原核および真核ゲノムの消化物を使用してもよい。
一般的には、標的配列（試料の標的アナライト配列または本明細書に記載の他のプローブ配列のいずれか）に対して相補的なものなるように本発明のプローブを設計して、標的と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが起こるようにする。この相補性は完全である必要はない。標的配列と本発明の１本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害するいくつかの数の塩基対ミスマッチが存在するかもしれない。しかしながら、最小のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下においてさえも変異の数が多すぎてハイブリダイゼーションが起こり得ない場合、その配列は相補的でない標的配列である。かくして、本明細書において「実質的に相補的」とは、プローブが標的配列に対して十分に相補的であり、選択された反応条件下においてハイブリダイゼーションすることを意味する。高いストリンジェンシー条件は当該分野において知られており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９およびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．参照（いずれも出展明示により本明細書に一体化させる）。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況において異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなるガイドはＴｉｊｓｓｅｎ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｓ ａｓｓａｙｓ” （１９９３）に見出される。一般的には、一定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるようにストリンジェントな条件を選択する。Ｔｍは、平衡状態において標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイゼーションする温度（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度において）である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡状態ではプローブの５０％が占領されている）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオンよりも低いものであり、典型的には、ｐＨ７．０ないし８．３において約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）の場合には温度は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）の場合には少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのごとき脱安定化剤の添加によっても達成されうる。もう１つの具体例において、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が使用される。例えば、当該分野で知られているような中程度ないし低いストリンジェンシーの条件を用いてもよい。ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｕｓｂｅｌの上記文献およびＴｉｊｓｓｅｎの上記文献参照。
本明細書の用語「標的配列」または文法的均等語は、核酸の１本の鎖上にある核酸配列を意味する。標的配列は遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを包含するＲＮＡ等の一部であってもよい。それはいずれの長さであってもよく、より長い配列がより特異的であることが理解されている。当業者により理解されるように、相補的標的配列は多くの形態を取り得る。例えば、より大きな核酸配列、すなわち、遺伝子またはｍＲＮＡの全体または部分、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメント等の中にそれが含まれていてもよい。以下に詳しく説明するように、標的配列にハイブリダイゼーションして試料中の標的配列の存在または不存在を決定するようにプローブが作製される。一般的に言って、この用語は当業者によって理解されるであろう。
【００３０】
好ましい具体例において、生物活性剤は有機化学的部分であり、種々の有機化学的部分が文献において利用可能である。
好ましい具体例において、各ビーズは単一タイプの生物活性剤を含むが、好ましくは、複数の個々の生物活性剤を各ビーズに付着させる。同様に、好ましい具体例は、１つの特有の生物活性剤を含む１種よりも多い微小球を用いるものである。すなわち、微小球の下位集団の使用によって系中に構築された縮重が存在し、下位集団中の各微小球が同じ生物活性剤を含んでいるものである。
当業者によって理解されるように、ビーズ上で生物活性剤を直接合成してもよく、あるいは合成後にビーズに付着させてもよい。好ましい具体例において、リンカーを用いて生物活性剤をビーズに付着させて、良好な付着を可能にし、標的分子との良好な相互作用を可能にする十分な柔軟性を持たせ、望ましくない結合反応を回避するようにする。
好ましい具体例において、ビーズ上で生物活性剤を直接合成する。当該分野で知られているように、ペプチド、有機部分および核酸のごとき多くのクラスの化合物が、ビーズを包含する支持体上で合成されている。
好ましい具体例において、生物活性剤を最初に合成し、次いで、ビーズに共有結合させる。当業者に理解されるように、生物活性剤およびビーズの組成に応じてこれを行う。チオール、アミン、カルボキシル等のごとき化学的反応性の基を用いる、ある種のポリマーのごとき固体支持体表面の官能化は当該分野において広く知られている。したがって、使用者による所望の官能基の付着を容易ならしめる表面化学基を有する「ブランク」微小球を用いてもよい。ブランク微小球に関するこれらの表面化学基のいくつかの例は、限定されるものではないが、脂肪族および芳香族アミンを包含するアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびサルフェートを包含する。
一般的には既知の化学的方法を用い、これらの官能基を用いていずれの数の異なった候補作用剤をもビーズに付加することができる。例えば、炭水化物を含有する候補作用剤をアミノ−官能化支持体に付着させることができる。標準的方法を用いて炭水化物のアルデヒドを作製し、次いで、アルデヒドを表面上のアミノ基と反応させる。別の具体例において、スルフヒドリル・リンカーを用いてもよい。ＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドのごとき当該分野で知られた多くのスルフヒドリル反応性リンカーがあり（例えば、ｔｈｅ １９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ， ｐａｇｅｓ １５５−２００参照（出展明示により本明細書に一体化させる））、それらを用いてシステイン含有タンパク質性作用剤を支持体に付着させることができる。別法として、候補作用剤上のアミノ基を表面上のアミノ基への付着に使用してもよい。例えば、多くの安定な二官能基リンカーが当該分野においてよく知られており、同種二官能基および異種二官能基リンカーが包含される（Ｐｉｅｒｃｅのカタログおよびハンドブック１５５〜２００ページ参照）。さらなる具体例において、よく知られたリンカー（Ｐｉｅｒｃｅのカタログ参照）を用いてカルボキシル基（表面のもの、または候補作用剤のもののいずれか）を誘導体化してもよい。例えば、カルボジイミドはカルボキシル基を活性化して、アミンのごとき良好な求核剤による攻撃を受けるようにする（Ｔｏｒｃｈｉｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ７（４）：２７５−３０８ （１９９１）参照（出展明示で本明細書に一体化させる））。当該分野で知られた他の方法、例えば、抗体をポリマーに付着させるための方法を用いてタンパク質性候補作用剤を付着させてもよい。例えば、Ｓｌｉｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ２：３４２−３４８ （１９９１）； Ｔｏｒｃｈｉｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， 上記文献； Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．， ３：３２３−３２７ （１９９２）； Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４： ６１７６−６１８５ （１９９４）；およびＷｉｌｂｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：２２０−２３５ （１９９４）参照（出展明示により本明細書に一体化させる）。上記方法を包含する種々の方法で候補作用剤を付着させてもよいことが理解されるはずである。好ましくは、付着様式は候補作用剤の機能性を有意に変化させないものである。すなわち、その標的との相互作用を可能にするような柔軟性のある様式で候補作用剤を付着させるべきである。また、これらのタイプの化学的または生物学的官能性を、図１Ｆに示すように、アレイをアッセイ場所、また、ビーズの個々のセットに付着させるために使用してもよい。
【００３１】
酵素を微小球上に固定化する具体的な方法が当該分野において知られている。１の場合において、ＮＨ_２表面化学基微小球を用いる。ｐＨを６．９にするリン酸塩緩衝化食塩水（１０ｍＭ）（１３８ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ）中２．５％グルタルアルデヒドを用いて表面の活性化を行う。室温で約２時間、これを撹拌ベッド上で撹拌する。次いで０．０１％ツイーン２０（界面活性剤）を添加した超純水で、微小球をすすぎ、次いで、０．０１％ツイーン２０を添加したｐＨ７．７のＰＢＳで再度すすぐ。最後に、好ましくは０．４５μｍのａｍｉｃｏｎ ｍｉｃｒｏｐｕｒｅフィルターを用いて前濾過した後、酵素を溶液に添加する。
【００３２】
いくつかの具体例において、微小球は、さらに、ある種のデコーディング系において用いる同定物結合リガンドを含む。本明細書において、「同定物結合リガンド」または「ＩＢＬ」とは、対応するデコーダー結合リガンド（ＤＢＬ）と特異的に結合してビーズに付着した生物活性剤の同一性の解明を容易にする化合物を意味する。すなわち、ＩＢＬおよび対応するＤＢＬは、結合ペアをなす。本明細書において、「特異的に結合する」とは、ＩＢＬが、対応するＤＢＬと他のＤＢＬ（すなわち、他のＩＢＬに対するＤＢＬ）または該系の他の成分もしくは汚染成分との間で区別するのに十分な特異性をもって、そのＤＢＬと結合することを意味する。該結合は、非特異的結合を除去するための洗浄工程を含むデコーディング工程の条件下で結合し続けるのに十分であるべきである。いくつかの具体例において、例えば、ＩＢＬおよび対応するＤＢＬがタンパク質または核酸である場合、ＩＢＬのそのＤＢＬに対する解離定数は、約１０^−４〜１０^−６Ｍ^−１未満であり、約１０^−５〜１０^−９Ｍ^−１未満が好ましく、約１０^−７〜１０^−９Ｍ^−１が特に好ましい。
【００３３】
ＩＢＬ−ＤＢＬ結合ペアは、既知であるか、または、既知の記述を用いて容易に見出すことができる。例えば、ＩＢＬがタンパク質である場合、ＤＢＬは、タンパク質（詳しくは、抗体またはそのフラグメント（ＦＡｂなど）を包含する）または小分子を包含するか、またはその反対の場合である（ＩＢＬが抗体であり、ＤＢＬがタンパク質である）。金属イオン−金属イオンリガンドまたはキレート化剤ペアもまた有用である。抗原−抗体ペア、酵素および基体または阻害剤、他のタンパク質−タンパク質相互作用ペア、受容体−リガンド、相補的核酸（三重螺旋を形成する核酸分子を包含する）、および炭水化物およびそれらの結合相手もまた適当な結合ペアである。一本鎖もしくは二本鎖核酸結合タンパク質および小分子核酸結合剤を包含する、核酸−核酸結合タンパク質ペアもまた有用である。同様に、米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，５６７，５８８号、第５，５９５，８７７号、第５，６３７，４５９号、第５，６８３，８６７号、第５，７０５，３３７号、および関連特許に概略記載されているように（出典明示により本明細書の一部とする）、核酸「アプタマーズ（ａｐｔａｍｅｒｓ）」は、実際にいずれもの標的に結合するために開発することができる；かかるアプタマー−標的ペアは、ＩＢＬ−ＤＢＬペアとして用いることができる。同様に、コンビナトリアル化学的方法をベースとした結合ペアの開発に関連する広範囲にわたる一群の文献がある。
【００３４】
好ましい具体例において、ＩＢＬは、色または発光特性が選択的結合ＤＢＬの存在下で変化する分子である。
一の具体例において、ＤＢＬは、蛍光体のようなラベルを担持していてもよい、ビーズ、すなわち、「デコーダー・ビーズ」に付着していてもよい。
【００３５】
好ましい具体例において、ＩＢＬ−ＤＢＬ対は、実質的に相補的な一本鎖核酸を含む。この具体例において、結合リガンドは、「同定物プローブ」および「デコーダー・プローブ」と称することができる。一般に、該同定物およびデコーダー・プローブは、約４〜約１０００個の範囲の塩基対長であり、約６〜約１００個が好ましく、約８〜約４０個が特に好ましい。重要なことは、該プローブが、特異的であるのに十分に長く、すなわち、異なるＩＢＬ−ＤＢＬペア間で区別するのに充分に長く、しかも、ａ）必要に応じて、適当に実験条件下での、解離、およびｂ）効果的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に短いことである。
【００３６】
好ましい具体例において、以下により詳しく概略記載するように、ＩＢＬは、ＤＢＬと結合しない。むしろ、ＩＢＬは、例えば、質量分光分析法の使用を介して、直接同定される同定物部分（「ＩＭ」）として用いられる。
別法として、好ましい具体例において、ＩＢＬおよび生物活性剤は、同じ部分であり；かくして、例えば、本明細書に概略記載するように、特に、光学的サインを用いない場合、生物活性剤は、同定物および該生物活性剤の両方として供することができる。例えば、核酸の場合、ビーズ結合プローブ（生物活性剤として供する）もまた、デコーダー・プローブを結合して、ビーズ上のプローブの配列を同定することができる。かくして、この具体例において、ＤＢＬは、生物活性剤と結合する。このことは、この具体例がデコーディングに加えてアレイまたはアッセイについての情報を提供することができるので、特に有用である。例えば、以下により詳しく記載するように、ＤＢＬの使用は、アレイ検量線作製およびアッセイ開発を可能にする。このことは、ＤＢＬをそのままで用いない場合でも行われる；例えば、非ランダム・アレイにおいては、これらのプローブセットの使用は、デコーディングが必要とされない場合でもアレイ検量線作製およびアッセイ開発を可能にすることができる。
【００３７】
好ましい実施態様において、微小球は、光学的サインを含まない。すなわち、米国特許出願第０８／８１８，１９９号および第０９／１５１，８７７号に概略記載されているように、従来の処理は、微小球の部分母集団の固有の生物活性剤を同定するのに用いられる固有の光学的サインまたは光学的タグを含む微小球の各部分母集団を有していた。すなわち、デコーディングは、ビーズの光学的特性を利用しており、これにより、固有の光学的サインを含むビーズが異なる光学的サインを有する他の位置のビーズと区別される。かくして、従来の処理は、各生物活性剤に固有の光学的サインを付与し、これにより、この生物活性剤を含む微小球がこのサインに基づいて同定される。これらの光学的サインは、色素、通常、発色基または蛍光体を含み、これらは、ビーズ自体に取込まれているかまたは付着している。光学的サインの多様性は、種々の蛍光色素、種々の比率の蛍光色素混合物、および蛍光色素の種々の濃度（強度）を利用した。
【００３８】
かくして、本発明は、アレイをデコードするのに光学的特性の使用だけに頼るものではない。しかしながら、当業者に理解されるように、いくつかの実施態様において、本発明の系と共に、付加的コーディング法として光学的サインを利用することが可能である。かくして、例えば、以下により詳しく概略記載するように、アレイの大きさは、有効に増大させることができるが、いくつかの方法において一組のデコーディング部分を用いた場合、そのうちの１つの方法は、光学的サインと組み合わせてビーズを用いることである。かくして、例えば、一「セット（組）」のデコーディング分子を用いた場合、光学的サインを有するものと有しないものの２つのビーズ群の使用により、アレイの大きさを有効に２倍にできる。同様に、複数の光学的サインの使用は、アレイの可能な大きさを増大させる。
【００３９】
好ましい具体例において、ビーズの各サブ集団は、複数の異なるＩＢＬを含む。各核生物活性剤をエンコードするのに複数の異なるＩＢＬを用いることにより、起こりうる固有のコードの数が実質的に増加する。すなわち、一の生物活性剤につき１個の固有のＩＢＬを用いることにより、アレイの大きさは、固有のＩＢＬの数となる（以下に概略記載するように、「再使用」は生じなかったと仮定する）。しかしながら、インジケーターとして各ＩＢＬの存在または不在を用いた場合、ビーズ１個につき複数の異なるＩＢＬを用いることにより、アレイの大きさを２^ｎに増大させることができる。例えば、ビーズ１個につき１０個のＩＢＬの付与は、１０ビット二進符号を生じ、ここで、各ビットは、「１」（ＩＢＬが存在する）または「０」（ＩＢＬが不在である）で示すことができる。１０ビット二進符号は、２^１０個の起こりうる変種を有する。しかしながら、以下により詳しく検討するように、濃度または強度などのもう１つのパラメーターが含まれる場合には、アレイの大きさは、さらに、増大できる；かくして、例えば、２種類の濃度のＩＢＬを用いた場合、アレイの大きさは、３^ｎ増大する。かくして、この実施態様において、アレイにおける各個々の生物活性剤は、生物活性剤の添加前、生物活性剤の合成後、またはその間にビーズに添加することができるＩＢＬの組合せを付与される（すなわち、ＩＢＬおよび生物活性剤成分の同時添加）。
【００４０】
別法では、生物活性剤が異なる残基のポリマーである場合、すなわち、生物活性剤がタンパク質または核酸である場合、異なるＩＢＬの組み合わせを用いてタンパク質または核酸の配列を解明することができる。
【００４１】
したがって、例えば、２つの異なるＩＢＬ（ＩＢＬ１およびＩＢＬ２）を用いて、核酸の第１の位置を解明することができる。例えば、アデノシンはＩＢＬ１およびＩＢＬ２の両方の存在によって示すことができ；チミジンはＩＢＬ１の存在およびＩＢＬ２の不在によって示すことができ、シトシンはＩＢＬ２の存在およびＩＢＬ１の不在によって示すことができ、グアノシンは両方の不在によって示すことができる。核酸の第２の位置は、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４を用いて同様に解明できる。したがって、ＩＢＬ１、ＩＢＬ２、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４の存在はＡＡの配列を与え；ＩＢＬ１、ＩＢＬ２およびＩＢＬ３は配列ＡＴを示し；ＩＢＬ１、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４は配列ＴＡを与える。第３の位置は、ＩＢＬ５およびＩＢＬ６などを利用する。このように、２０種の異なる同定物の使用が全ての起こりうる１０−ｍｅｒに対する固有のコードを生じることができる。
【００４２】
該系は、タンパク質について同様であるが、各位置において許容される多様性に依存して、各位置を同定するために多数の異なるＩＢＬを必要とする。したがって、例えば、あらゆるアミノ酸があらゆる位置で許容される場合、各位置について５つの異なるＩＢＬが必要とされる。しかしながら、上記のように、例えば、ランダムペプチドを生物活性剤として使用する場合、系中に組み込まれた偏りがあってもよく；全てのアミノ酸が全ての位置に存在できるとはかぎらず、いくつかの位置を予めセットすることができ；したがって、各アミノ酸について４つの異なるＩＢＬを用いることが可能である。
【００４３】
このように、各配列について一種の「バーコード」のようなものを構築でき；各々別個のＩＢＬの存在または不在が各生物活性剤の同定を可能にする。
【００４４】
さらに、ＩＢＬの種々の濃度または密度の使用は、ある程度の「再使用」を可能にする。例えば、第１の薬剤を含むビーズが１ｘ濃度のＩＢＬを有し、第２の薬剤を含む第２のビーズが１０ｘ濃度のＩＢＬを有する場合、対応するラベルされたＤＢＬの飽和濃度を使用することにより、使用者に２つのビーズを区別させる。
【００４５】
いったん、候補薬剤および固有のＩＢＬを含む微小球を作製したならば、それらを基体に添加してアレイを形成させる。本明細書に記載される方法の大部分は、アッセイの前にビーズを基体に添加するが、アレイの作製、使用およびデコーディングの順序は変更できる。例えば、アレイを作製し、デコードし、次いでアッセイを行うことができる。別法では、アレイを作製し、アッセイに使用し、次いでデコードすることができる。これは、たった２、３個のビーズをデコードする必要がある場合に特別に有用でありうる。別法では、ビーズを基体に添加する前に、ビーズをアッセイ混合物、すなわち、標的アナライトを含有する試料に添加し；添加およびアッセイ後、アレイをデコードすることができる。これは、特に、ビーズを含む試料を攪拌または混合する場合に好ましく；これは、単位時間あたりにビーズに結合した標的アナライトの量を増加させることができ、かくして（核酸アッセイの場合）、ハイブリダイゼーション速度が速くなる。これは、試料中の標的アナライトの濃度が低い場合に特に有用であり；一般に、低濃度の場合、長い結合時間を用いなければならない。
【００４６】
さらに、ビーズをアッセイ混合物に添加することは、選別または選択を可能にすることができる。例えば、ビーズの巨大なライブラリーを試料に添加してもよく、試料に結合するビーズだけを基体に添加してもよい。例えば、標的アナライトが蛍光ラベルされる場合（直接的（例えば、核酸増幅反応物中へのラベルの取り込みによって）または間接的（例えば、サンドウィッチアッセイの使用による）のいずれか）、標的アナライト結合の結果として蛍光を示すビーズを蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって選別することができ、これらのビーズだけをアレイに添加し、次いでデコードすることができる。同様に、選別はアフィニティー技術によって行ってもよく；標的アナライトを含むアフィニティーカラムを作製でき、結合するビーズだけをアレイにて使用する。同様に、２つのビーズ系を使用でき；例えば、標的アナライトを含む磁性ビーズを使用して標的に結合するビーズを取り出すことができ、次いで、磁性ビーズをその後に解離させ（例えば、温度上昇による）、アレイへ添加することができる。
【００４７】
一般に、固有にエンコードされることのできる異なる候補薬剤の数を最大にするために、アレイの作製方法およびアレイのデコーディング方法を実施する。本発明の構成物は、種々の方法において作製してもよい。一般に、アレイは、ビーズを含む溶液またはスラリーをビーズが結合するための部位を含有する表面に添加することによって作製される。これは、水性および有機溶媒ならびに混合液を包含する種々のバッファー中で行ってもよい。溶媒は蒸発させることができ、過剰のビーズは除去される。
【００４８】
好ましい具体例において、非共有結合法を用いてビーズをアレイに結合させる場合、アレイ上にビーズを負荷させる新規な方法が用いられる。該方法は、アレイを粒子（微小球および細胞を包含する）の溶液に曝露し、次いでエネルギーを利用すること、例えば、混合物を攪拌または振動させることを含む。これは、弱く結合したビーズを落とす（またはウエルの場合、外に落とす）ために十分なエネルギーを用いて攪拌するので、より緊密に結合した粒子を含むアレイが得られる。次いで、これらの部位は、異なるビーズを結合するために利用できる。このように、部位に対して高アフィニティーを示すビーズが選択される。このように作製されたアレイは、より静的な負荷に比べて、２つの主要な利点を有する。まず、より高い割合の部位を容易に満たすことができ、第２に、このように負荷されたアレイは、アッセイ中のビーズの損失を実質的に減少することを示す。したがって、好ましい具体例において、これらの方法を用いて、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは少なくとも約９０％の部位を満たすアレイが得られる。同様に、この方法で得られたアレイは、好ましくは、アッセイ中、約２０％未満、好ましくは約１０％未満、特に好ましくは約５％未満のビーズが損失する。
【００４９】
該具体例において、分離した部位を有する表面を含む基体を粒子（ビーズ、細胞など）を含む溶液に浸漬する。表面は、本明細書に記載するように、ウエルを含んでいてもよく、または部位に対して差別的なアフィニティーが存在するようなパターン化された表面上に他のタイプの部位を含んでいてもよい。差別的なアフィニティーは拮抗的過程をもたらし、その結果、より緊密に結合する粒子が選択される。好ましくは、ビーズが「負荷」されるべき全表面は、溶液と流動的に接触している。該溶液は、一般に、約１０，０００：１〜１：１のビーズ：溶液（容量：容量）の範囲内にあるスラリーである。一般に、溶液は、水性バッファー、有機溶媒、塩、他の試薬成分などを包含するかなり多数の試薬を含むことができる。さらに、溶液は、好ましくは、過剰のビーズを含み；すなわち、アレイ上の部位よりも多くのビーズが存在する。好ましい具体例は、２倍〜１０億倍過剰のビーズを使用する。
【００５０】
浸漬は、アッセイ条件と同様とすることができ；例えば、アレイを上方から試料を含むミクロタイタープレート中に「くぐらせる（ｄｉｐｐｅｄ）」場合、該配置を負荷の間に繰り返すことができ、かくして、重力のためにおそらく外に落ちるビーズを最小限にする。
【００５１】
いったん表面を浸漬したならば、基体、溶液またはその両方を拮抗的過程に付し、それにより、より低いアフィニティーを有する粒子を基体から解離させ、部位に対してより高いアフィニティーを示す粒子に置き換えることができる。該拮抗的過程は、熱、超音波処理、溶液または基体またはその両方をかきまぜるかまたは混合し、振動または攪拌するという形態でエネルギーを導入することによって行われる。
【００５２】
好ましい具体例は、攪拌または振動を用いる。一般に、アレイに対する損傷を防ぐために、基体の操作量を最少にする。かくして、好ましい具体例は、どちらでもよいが、アレイよりもむしろ溶液の攪拌を用いる。当業者に明らかなように、この攪拌は多数の形態で行うことができ、好ましい具体例では、ビーズを含むミクロタイタープレートをミクロタイタープレートシェイカーを用いて攪拌することを利用する。
【００５３】
攪拌は、アレイに所望の量まで負荷するのに十分な時間行う。ビーズの大きさおよび濃度ならびにアレイの大きさに依存して、該時間は約１秒〜数日の範囲であってもよく、約１分〜約２４時間が好ましい。
【００５４】
アレイの全ての部位がビーズを含むとは限らないことに注目すべきである。すなわち、基体表面上のいくつかの部位は空であってもよい。さらに、好ましくないが、１個より多くのビーズを含有するいくつかの部位が存在しうる。
【００５５】
いくつかの具体例において、例えば、化学的結合を行う場合、無作為でないかまたは規則正しい方法でビーズを結合することが可能である。例えば、光活性化可能な結合リンカーまたは光活性化可能な接着剤またはマスキング剤を用いて、ビーズの所定の集団が配置されるように、アレイ上の選択された部位を順次、結合に適するようにしてもよい。
【００５６】
本発明のアレイは、候補薬剤の同一性についての情報がアレイ中に組み込まれるように、ファイバーウエル中におけるビーズのランダムな沈着を「デコード」して、候補薬剤の同定が全ての位置で可能になるように構築される。これは、標的分子を検出するために、アレイの使用の前、間または後のいずれかにおいて、種々の方法で行ってもよい。
【００５７】
したがって、アレイを作製後、それは、基体表面上の１以上の生物活性剤、すなわち、ビーズの各サブ集団の場所を同定するために「デコード」される。
【００５８】
好ましい具体例において、選択的デコーディングシステムが使用される。この場合、標的アナライトの結合の結果として光学的シグナルの変化を示す微小球だけがデコードされる。これは、通常、「ヒット」の数、すなわち、デコードすべき部位の数が一般的に低い場合に行われる。すなわち、まずアレイを標的アナライトの不在下での実験条件下で走査する。標的アナライトを含有する試料を添加し、光学的シグナルの変化を示す場所だけをデコードする。例えば、陽性または陰性シグナル場所のいずれかのビーズを選択的にラベルするか、または（例えば、光開裂可能なリンカーによって）アレイから解離させてもよく、次いで、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）中で選別または濃縮してもよい。すなわち、全ての陰性ビーズを解離させた後、陽性ビーズを解離させるか、またはその場で分析する。または別法では、全ての陽性物を解離させ、分析する。別法では、ラベルは、ハロゲン化芳香族化合物を含んでもよく、ラベルの検出は、例えば、ガスクロマトグラフィー、化学的タグ、同位元素タグまたはマススペクトルタグを用いて行う。
【００５９】
当業者に明らかなように、これは、また、アレイがデコードされない系、すなわち、ビーズ構成物と場所との相互関係は決して必要ではない系において行ってもよい。該具体例において、ビーズをアレイ上に負荷し、アッセイを行う。次いで、「陽性」、すなわち、下記に十分に概説するように光学的シグナルの変化を示すビーズを「マーク」して、「陰性」ビーズからそれらを区別または分離する。これは、いくつかの方法、好ましくはファイバーオプティックアレイを用いて行うことができる。好ましい具体例において、各ビーズは蛍光色素を含有する。アッセイおよび「陽性」または「活性ビーズ」の同定の後、一般に光活性化試薬（典型的には溶存酸素）の存在下で、陽性ファイバーまたは陰性ファイバーだけに光を当てる。前者の場合、全ての活性ビーズは光退色する。したがって、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）機械を用いるその後の選別を伴うビーズの非選択的放出において、非蛍光活性ビーズを蛍光陰性ビーズから選別できる。別法では、光を陰性ファイバーに当てる場合、全ての陰性物が非蛍光性であり、陽性物が蛍光性であり、選別を続行することができる。結合した生物活性剤の特徴付けは、例えば、質量分析器を用いて直接行ってもよい。
【００６０】
別法では、同定は、ＩＢＬに類似するが、必ずしもＤＢＬに結合する必要のない同定物部分（「ＩＭ」）の使用によって行ってもよい。すなわち、生物活性剤の構造を直接解明するよりもむしろ、ＩＭの構成物を同定物として利用してもよい。したがって、例えば、ＩＭの特定の組み合わせをビーズをコードするために利用することができ、これを用いてビーズから解離させた後、例えば、ガスクロマトグラフィーまたは質量分光器を用いて分析することによって、ビーズ上の物質を同定することができる。
【００６１】
別法では、各ビーズに蛍光色素を含有させるよりもむしろ、各ビーズは蛍光色素の非蛍光前駆体を含む。例えば、蛍光分子上のある種のオルト−ニトロベンジル基などの光開裂可能な保護基を用いて、蛍光色素の光活性化を行うことができる。アッセイ後、光を再び「陽性」または「陰性」ファイバーに当てて、これらの集団を区別する。次いで、照明された前駆体は化学的に蛍光色素に変換される。次いで、選別を用いて全てのビーズをアレイから解離させて、蛍光および非蛍光ビーズ（陽性および陰性のどちらか、またはその逆）の集団を形成させる。
【００６２】
別の好ましい具体例において、ビーズの結合部位（例えば、ウエル）は、光重合可能な試薬を含み、または光重合可能な薬剤が構築されたアレイに加えられる。試験アッセイを実施後、光を再び「陽性」または「陰性」ファイバーのいずれかに当て、これらの集団を区別する。照射の結果として、全ての陽性物または全ての陰性物のいずれかが重合し、該部位に捕捉または結合されるが、ビーズの他の集団はアレイから解離させることができる。
【００６３】
好ましい具体例において、デコーダー結合リガンド（ＤＢＬ）を用いてあらゆる生物活性剤の場所が決定される。上記のように、ＤＢＬは、もし存在するならば同定物結合リガンドに結合するか、または好ましくは、生物活性剤が核酸またはタンパク質である場合、生物活性剤自体に結合する結合リガンドである。
【００６４】
好ましい具体例において、上記のように、ＤＢＬはＩＢＬに結合する。
好ましい具体例において、生物活性剤は１本鎖核酸であり、ＤＢＬは実質的に、生物活性剤に結合（ハイブリダイズ）する相補的な１本鎖核酸（本明細書においてデコーダープローブと称される）である。各候補プローブに実質的に相補的なデコーダープローブを作製し、アレイのデコードに使用する。該具体例において、候補プローブおよびデコーダープローブは特異性を与えるのに十分な長さ（および適当な条件下で実施されるデコーディング工程）であるべきであり；すなわち、各候補プローブは、各候補プローブの区別を可能にするのに十分な特異性を有するその対応するデコーダープローブに結合する。
【００６５】
好ましい具体例において、ＤＢＬは直接的または間接的にラベルされる。本明細書中における「ラベルされる」なる語によって、化合物が、化合物の検出を可能にするために、結合した少なくとも１個のエレメント、同位元素または化学的化合物を有することを意味する。一般に、ラベルは３つのクラス：ａ）放射性同位元素または重同位元素であってもよい同位元素ラベル；ｂ）磁性、電気的、熱；およびｃ）着色または発光性色素に分類されるが、ラベルは磁性粒子などの粒子と同様に酵素を包含する。好ましいラベルは、発光性ラベルを包含する。好ましい具体例において、ＤＢＬは直接的にラベルされる。すなわち、ＤＢＬはラベルを含む。別の具体例において、ＤＢＬは間接的にラベルされる。すなわち、ＤＢＬに結合するであろうラベル結合リガンド（ＬＢＬ）を使用する。該具体例において、ラベル結合リガンド−ＤＢＬ対はＩＢＬ−ＤＢＬ対に関する上記と同様であることができる。適当なラベルは、限定するものではないが、ユーロピウムおよびテルビウムの錯体を包含する蛍光性ランタニド錯体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ^ＴＭ）、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ｃｙ３、ｃｙ５およびＲｉｃｈａｒｄ Ｐ． ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋの第６版（出典明示により明白に本明細書の一部とされる）に記載される他のラベルを包含する。
【００６６】
１の具体例において、ラベルは、局所的環境の変化のためにその色または発光の性質がＩＢＬの存在下で変化する分子である。例えば、ラベルは、（１）その発光強度がｐＨにより変化する蛍光性ｐＨ指示薬；（２）その発光性がイオン濃度により変化する蛍光性イオン指示薬；または（３）その蛍光強度が疎水性環境下で増加するエチジウム塩のような蛍光分子であってもよい。
【００６７】
したがって、個々のビーズ（またはビーズのサブ集団）の場所の同定は、ラベルされたＤＢＬとＩＢＬまたは生物活性剤との間の結合（すなわち、生物活性剤が核酸である場合、候補プローブとデコーダープローブの間のハイブリアイゼーション）を含む１以上のデコーディング工程を用いて行われる。デコーディング後、ＤＢＬを除去でき、アレイを使用することができるが、いくつかの状況において、例えば、ＤＢＬがＩＢＬに結合し、生物活性剤に結合しない場合、ＤＢＬの除去は必要とされない（いくつかの状況においてそれは望ましい）。さらに、本明細書に概説されるように、デコーディングは、アレイをアッセイに使用する前、アッセイ中、またはアッセイ後のいずれで行ってもよい。
【００６８】
１の具体例において、単一のデコーディング工程を行う。該具体例において、固有のラベルの数が生物活性剤の数に等しいか、またはそれよりも多くなるように、各ＤＢＬを固有のラベルでラベルする（いくつかの場合、本明細書に記載のように、固有のラベルの「再使用」ができ；同様に、変種が別の次元において、すなわち、ビーズの大きさまたはラベルにおいてエンコードされる場合、候補プローブの少数の変種が同じデコーダーを共有できる）。各生物活性剤またはＩＢＬの場合、特異的にそれに結合し、固有のラベル、例えば、１以上の蛍光色素を含有するＤＢＬが作製される。したがって、各ＤＢＬの同一性、その組成（すなわち、それが核酸である場合、その配列）およびそのラベルの両方が知られている。次いで、ＤＢＬと生物活性剤またはＩＢＬのいずれかとの複合体（成分が核酸である場合、ハイブリダイゼーション複合体と称される）の形成を可能にする条件下で、生物活性剤を含有するアレイにＤＢＬを加えることによって、各ＤＢＬの場所を解明することができる。このことは、各生物活性剤の場所の同定を可能にし；ランダムなアレイがデコードされる。次いで、必要ならばＤＢＬを除去でき、標的試料を接触させる。
【００６９】
好ましい具体例において、固有のラベルの数は固有の生物活性剤の数より少なく、したがって、一連のデコーディング工程が用いられる。議論を容易にするために、他のタイプの生物活性剤およびＤＢＬも同様に有用であるが、該具体例は核酸について例示する。該具体例において、デコーダープローブはデコーディングのためにｎ個のセットに分割される。セットの数は固有のタグの数に対応する。各デコーダープローブは、ｎ個の別個のタグを用いるｎ個の別々の反応においてラベルされる。全てのデコーダープローブは同じｎ個のタグを共有する。デコーダーの各プールは、各デコーダーのｎ個のタグバージョンのうち１個だけを含有し、全プールにわたって同じ配列のタグを有する２個のデコーダープローブは存在しない。このことを実現するために必要なプールの数は、デコーダープローブの数およびｎによって決定される。各プールのアレイに対するハイブリダイゼーションは、ＩＢＬを含むあらゆるアドレスでシグナルを生じる。各プールの連続したハイブリダイゼーションは順に、各候補プローブに対して固有の配列特異的コードを生じるであろう。このことは、アレイ中における各アドレスで候補プローブを同定する。例えば、４個のタグを用いる場合、４ｘｎ個の連続したハイブリダイゼーションによって理想的に言えば、いくつかの場合、より多くの工程が必要とされうるが、４^ｎ個の配列を識別することができる。各プールのハイブリダイゼーション後、ハイブリッドは変性し、デコーダープローブが除去され、その結果、プローブは次のハイブリダイゼーションのために１本鎖にされる（しかし、利用可能なプローブが飽和しないように、制限量の標的をハイブリダイズすることも可能である。連続したハイブリダイゼーションを行うことができ、先のハイブリダイゼーションから予め存在するシグナルを引き算することによって分析することができる）。
【００７０】
一例を示す。１６個のプローブ核酸（番号１〜１６）のアレイおよび４個の固有のタグ（４個の異なる蛍光（ｆｌｕｏｒ）、例えば、ラベルＡ−Ｄ）を仮定する。ビーズ上のプローブに対応するデコーダープローブ１−１６を作製する。第１工程は、タグＡでデコーダープローブ１−４、タグＢでデコーダープローブ５−８、タグＣでデコーダープローブ９−１２およびタグＤでデコーダープローブ１３−１６をラベルすることである。プローブを混合し、プールを候補プローブが結合したビーズを含有するアレイと接触させる。次いで、各タグの場所（およびしたがって、各デコーダーおよび候補プローブ対）を決定する。次いで、デコーダープローブの最初のセットを除去する。今回はデコーダープローブ１、５、９および１３がタグＡでラベルされ、デコーダープローブ２、６、１０および１４がタグＢでラベルされ、デコーダープローブ３、７、１１および１５がタグＣでラベルされ、デコーダープローブ４、８、１２および１６がタグＤでラベルされている第２のセットを加える。したがって、両方のデコーディング工程においてタグＡを含有したビーズは、候補プローブ１；最初のデコーディング工程におけるタグＡおよび第２のデコーディング工程におけるタグＢを含有し、候補プローブ２；最初のデコーディング工程におけるタグＡおよび第２の工程におけるタグＣを含有し、候補プローブ３を含有するなど。当業者に明らかなように、デコーダープローブはいずれかの順番で作製でき、いずれの順番で加えることもできる。
【００７１】
１の具体例において、デコーダープローブをその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）でラベルする。すなわち、それらはデコーディング反応前にラベルする必要がない。該具体例において、入れるデコーダープローブは候補プローブより短く、デコーディングプローブ上に５’「突出部」を作製する。ラベルされたｄｄＮＴＰ（各々、固有のタグでラベルされた）およびポリメラーゼの付加は、配列特異的な方法でタグの付加を可能にし、したがって、シグナルの配列特異的パターンを作製する。同様に、ライゲーションなどを包含する他の修飾を行うことができる。
【００７２】
さらに、アレイの大きさは、固有のデコーディング結合リガンドの数によって設定されるので、より多くの数の試験部位を考慮に入れるために、固有のＤＢＬのセットを「再使用」することが可能である。これは、いくつかの方法、例えば、光学的サインを含むいくつかのサブ集団を使用することによって行ってもよい。同様に、アレイ内の位置的コーディングスキームの使用；異なるサブバンドルはＤＢＬのセットを再使用しうる。同様に、１の具体例はコーディング様式としてビーズの大きさを利用し、かくして、各ビーズの大きさについて固有のＤＢＬのセットの再使用を可能にする。別法では、ビーズを用いるアレイの連続した部分的負荷もまた、ＤＢＬの再使用を可能にする。さらに、「コード共有」も同様に生じることができる。
【００７３】
好ましい具体例において、ＤＢＬは、ビーズのいくつかのサブ集団に光学的サインを含ませることによって再使用されうる。好ましい具体例において、光学的サインは、一般に、レポーター色素（好ましくは蛍光性）の混合物である。混合物の組成（すなわち、１の色素の別の色素に対する比率）および色素の濃度（シグナル強度の差を導く）の両方を変化させることによって、固有の光学的サインのマトリックスを生じさせることができる。これは、色素をビーズの表面に共有結合させることによって、あるいは、ビーズ内に色素を取り込ませることによって行ってもよい。色素は発色団または蛍燐光体であってもよいが、好ましくは蛍光色素であり、それは、その強いシグナルのために、良好なシグナル対ノイズ比をデコーディングに提供する。本発明の使用に適当な色素は、上記のラベルＤＢＬについて列挙したものを包含する。
【００７４】
好ましい具体例において、エンコーディングは、例えば、ビーズの大きさにおいてより多くのエンコーディングディメンションを加えてもよいが、少なくとも２色素の比率で達成できる。さらに、ラベルは互いに識別可能であり；したがって、２つの異なるラベルは異なる分子（すなわち、２つの異なる蛍光）を含みうるか、または別法では、２つの異なる濃度または強度で１つのラベルであってもよい。
【００７５】
好ましい具体例において、色素はビーズの表面に共有結合する。ビーズの表面上の官能基を用いて、一般に生物活性剤の結合について概説されたように、これを行ってもよい。当業者に明らかなように、これらの結合は、色素に対する影響を最少にするために行われる。
【００７６】
好ましい具体例において、一般に、ビーズの孔中に色素を捕捉することによって、色素はビーズと非共有結合する。
さらに、レポーター色素のサインおよび検出感度を調べるために使用される光の強度に無反応であるので、単一の色素濃度よりもむしろ２以上の色素の比率におけるエンコーディングが好ましい。
【００７７】
好ましい具体例において、空間的または位置的コーディングシステムを行う。該具体例において、利用されるサブバンドルまたはサブアレイ（すなわち、全アレイの一部）がある。電話システムから類推すると、各サブアレイは「地域番号」であり、サブアレイの場所によって分けられている他のサブアレイの同じラベル（すなわち、電話番号）を有することができる。したがって、例えば、同じ固有のラベルをバンドル毎に再使用することができる。したがって、１００個の異なるサブアレイと組み合わせた５０個の固有のラベルの使用は、５０００個の異なる生物活性剤のアレイを形成することができる。該具体例において、１のバンドルを他のバンドルから同定できることが重要になり；一般に、これは手動で、またはマーカービーズの使用（これらは各サブアレイについて固有のタグを含有するビーズであることができる）、または異なる量における同じマーカービーズの使用、または異なる比率における２個以上のマーカービーズの使用によって行われる。
【００７８】
別の具体例において、微小球の大きさなどの付加的なエンコーディングパラメーターを加えることができる。例えば、異なる大きさのビーズの使用はＤＢＬのセットの再使用も可能にしうる。すなわち、微小球のエンコーディングディメンションを広げるために、異なる大きさの微小球を使用することが可能である。異なるファイバー直径または断面を有するピクセルを含有する光ファイバーアレイを作製することができ；別法では、より大きなバンドルを形成するために、２以上のファイバーオプティックバンドル（各々が個々のファイバーの異なる断面を有する）を一緒に加えることができ；または、同じ大きさの断面のファイバーを有するが、異なる大きさのビーズを有するファイバーオプティックバンドルを用いることができる。異なる直径を用いると、最大のウエルを最大の微小球で満たすことができ、次いで、全ての大きさのウエルが満たされるまで、次第により小さなウエル中により小さな微小球を移動させる。この方法で、同じ色素比を用いて異なる大きさの微小球をエンコードすることができ、それにより、アレイ中における異なるオリゴヌクレオチド配列または化学的官能性の数を拡大することができる。ファイバーオプティック基体について概説されるが、この方法ならびに本明細書に概説される他の方法は、他の基体および他の結合様式を用いて同様に行うことができる。
【００７９】
好ましい具体例において、コーディングおよびデコーディングは、微小球のアレイ中への連続した負荷によって達成される。該具体例において、空間的コーディングに関して上記されたように、光学的サインを「再使用」することができる。該具体例において、各々、異なる生物活性剤を含む微小球のライブラリー（または各々、異なる生物活性剤を含むサブ集団）を複数のサブライブラリーに分割し；例えば、所望のアレイの大きさおよび固有のタグの数に依存して、各々、全ライブラリーの約１０％を含む１０個のサブライブラリーを作製してもよく、各サブライブラリーはおおよそ同じ固有のタグを含む。次いで、第１のサブライブラリーをウエルを含むファイバーオプティックバンドルに加え、一般にＤＢＬの使用によって、各生物活性剤の場所を決定する。次いで、第２のサブライブラリーを加え、各生物活性剤の場所を再び決定する。この場合、シグナルは、「第１の」ＤＢＬおよび「第２の」ＤＢＬ由来のシグナルを含むであろう。２つのマトリックスを比較することによって、各サブライブラリー中における各ビーズの場所を決定することができる。同様に、第３、第４などのサブライブラリーを連続して加えることにより、アレイを満たすことができるであろう。
【００８０】
好ましい具体例において、いくつかの方法でコードを「共有」することができる。第１の具体例において、結合力が十分に異なる標的アナライトの場合、単一のコード（すなわち、ＩＢＬ／ＤＢＬ対）を２以上の薬剤に与えることができる。例えば、ｍＲＮＡ定量アッセイに用いた２個の核酸プローブは、それらのハイブリダイゼーションシグナル強度の範囲が重複しない場合、同じコードを共有することができる。これは、例えば、標的配列の１つが常に、他よりも非常に高い濃度で存在する場合に起こることができる。別法では、２つの標的配列は常に、同様な濃度で存在しうるが、ハイブリダイゼーション効率において異なる。
【００８１】
別法では、薬剤が機能的に等価である場合、単一のコードを複数の薬剤に与えることができる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブのセットが特定の遺伝子の存在を検出するという共通の目的で設計される場合、たとえプローブの配列が異なっていても、プローブは機能的に等価である。同様に、アナライトのクラスまたは「ファミリー」が所望の場合、キナーゼまたはＧ−タンパク質結合受容体のようなクラスの個々のメンバーに対する全プローブは、コードを共有することができた。同様に、該タイプのアレイを用いて既知遺伝子の相同物を検出することができた。該具体例において、各遺伝子は、異なる遺伝子領域にハイブリダイズする（したがって、配列の異なる）プローブの異種セットによって示される。プローブのセットは共通コードを共有する。相同物が存在する場合、プローブの全てではないがいくつかにハイブリダイズしうる。相同性のレベルは、ハイブリダイズするプローブのフラクションならびに平均ハイブリダイゼーション強度によって示される。同様に、同じタンパク質に対する複数の抗体は全て、同じコードを共有することができた。
【００８２】
好ましい具体例において、自己構築されたランダムアレイ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｒａｎｄｏｍ ａｒｒａｙ）のデコーディングをｐＨ滴定に基づいて行う。該具体例において、生物活性剤に加えて、ビーズは光学的サインを含み、ここに、光学的サインは発光団のようなｐＨ応答色素（ときどき、本明細書において「ｐＨ色素」と称される）の使用によって生じる。該具体例は、溶液ｐＨがｐＫａより下からｐＫａより上に（またはその逆）調整される場合、本発明で使用される色素が蛍光強度の変化を示す（または他の特性）ことを除き、ＰＣＴ ＵＳ９８／０５０２５および米国特許第０９／１５１，８７７号（どちらも、出典明示により明らかに本明細書の一部とされる）に概説されるもの類似する。好ましい具体例において、各々が異なるｐＫａを有し、好ましくは、少なくとも０．５ｐＨ単位によって区別されるｐＨ色素のセットを使用する。好ましい具体例は、ｐＫａ２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１および１１．５のｐＨ色素を使用する。各ビーズは、ｐＨ色素のいずれかのサブセットを含有することができ、このように、生物活性剤に対して固有のコードが得られる。したがって、アレイのデコーディングは、ｐＨ１からｐＨ１３でアレイを滴定し、溶液ｐＨの相関として各ビーズ由来の蛍光を測定することによって達成される。
【００８３】
好ましい具体例において、固有または別個のタグの数を増やすための付加的な方法がある。すなわち、各ビーズ上の別個の属性を用いてコード数を増やすことができる。さらに、連続したデコーディングにより、新規な方法でコードの再使用を可能にする。これらの属性は互いに独立し、したがって、コードの数をデコーディング工程の数と属性の数（例えば、別個のコード）の関数として指数関数的に増大させることができる。しかしながら、単一のデコーディング工程において得られるデコーディング情報の量を増やすことによって、デコーディング工程の数が著しく減少する。あるいは、別個のコードの数が著しく増える。デコーディング工程あたりの属性の数を増やすことによって、より少ないデコーディング工程が所定数のコードについて必要とされる。したがって、好ましい具体例において、種々の方法を用いて、アレイをデコーディングする過程において有用な多数のコードを生じ、同時に、必要なデコーディング工程を最小限にする。例えば、種々の異なるコーディング策法を組み合わせることができる。したがって、異なる「色」、色の組み合わせ（「色相」）、色または色相またはその両方の異なる強度などを全て組み合わせることができる。
【００８４】
好ましい具体例において、ＤＢＬは、物理的属性の定量的または別個のセットをビーズに接着または埋め込むこと、すなわちビーズのラベル化に依存する。ビーズの好ましい物理的属性は、限定するものではないが、表面の「平滑さ」または「ざらざらな状態」、色（蛍光およびその他）、色の強度、大きさ、検出可能な化学的部分、化学的反応性、磁性、ｐＨ感度、存在する色素間のエネルギー移動効率、疎水性、親水性、吸収性、電荷、ｐＨ感度などを包含する。
【００８５】
ビーズデコーディングスキームは、単一の定量可能な属性を各ビーズタイプに与える／しみ込ませることを包含し、ここに、各ビーズタイプは該属性の定量可能な値において異なる。例えば、所定数の蛍光体をビーズに接着させることができ、デコーディング過程において接着した蛍光体の数を定量することができるが、実際、「所定数」の属性をビーズに接着させ、属性を正確に測定することは問題があるかもしれない。一般に、目的は変動係数（ＣＶ）を減らすことである。変動係数によって、連続的なラベル化においてビーズをラベルすることにおける変化性を意味する。該ＣＶは、複数の試験において所定数のラベル（例えば、蛍光体）でビーズをラベルし、ビーズによって発せられる得られるシグナルを測定することによって決定できる。大きなＣＶは、いずれか所定の属性について、使用可能な解明可能な「レベル」の数を限定する。
【００８６】
よりしっかりとしたデコーディングスキームは、定量的属性をコードに分けるために、絶対測定よりもむしろ比率測定を用いる。比率計デコーディングにより、ある比率のラベル（すなわち、１：１０、１：１および１０：１）でビーズをラベルすることを意味する。理論上は、比率間のシグナルの差異が検出可能であるかぎり、いずれの比率も用いることができる。該過程は、より小さいＣＶを生じ、所定の動的範囲内でより多くの属性分割を可能にする。したがって、好ましい具体例において、比率計デコーディングの使用は変動係数を減少させる。
【００８７】
さらに、当業者に明らかなように、比率計デコーディングは異なる方法において達成できる。該具体例において、第１のデコーディング反応において第１の色素（または色素の組み合わせ）強度を有する所定数のＤＢＬおよび連続した第２のデコーディング反応において第２の色素強度を有する第２の数を加えるよりもむしろ、該比率計分析は、ある比率のラベル：非ラベルＤＢＬを用いて行ってもよい。すなわち、飽和濃度のデコーディングビーズのセット、例えば、１００，０００ＤＢＬ／反応を与える場合、第１の強度のデコーディング工程は、１００，０００個のラベルしたＤＢＬを加えることによって行ってもよく、第２工程は１０，０００個のラベルしたＤＢＬおよび９０，０００個のラベルしていないＤＢＬを加えることによって行うことができる。平衡は、第２工程が１０分の１のシグナル強度を与えることを示す。
【００８８】
定量的に測定した属性値の拡散のため、別個のコードの数は実際に１２個未満ほどのコードに限定される。しかしながら、異なる属性値を有するビーズを連続的に「ペイント」（すなわち、一時的に属性レベルをビーズに接着する）し、「剥がす」（属性レベルを除去する）ことによって、可能性のあるコードの数がデコーディング過程における一連の段階の数と共に指数関数的に増加する。
【００８９】
一例を示す。例えば、９個の異なるビーズタイプおよび３つの区別可能な属性分布（表１）。ビーズを２つの異なる段階において、組み合わせ上別個のパターンにおける異なる属性値で「ペイント」（ラベル）することは、各ビーズタイプにつき固有のコードを生じる。すなわち、９個の別個のコードが生じる。したがって、好ましい具体例において、ビーズは、複数の段階において、組み合わせ上別個のパターンにおける異なる属性でラベルされる。これは、各ビーズタイプにつき固有のコードを生じる。異なる属性の例は上記される。異なる属性でのビーズのラベル化は、当該分野で既知の方法によって行われる。
【００９０】
【表１】

表１．連続的デコードは、少数の属性レベルを用いて固有のコードを生じる。
【００９１】
蛍光色は、デコーディングスキームにおいて使用するために特に都合のよい属性である。蛍光色は、ＩＢＬを認識するいずれの薬剤にも接着できて、ラベルされたＤＢＬを形成する。議論は、ＤＢＬとしてのオリゴヌクレオチド（核酸類似物を包含する）に向けられる。蛍光ラベルしたオリゴヌクレオチドは、特異的、かつ、可逆的にビーズのいずれか所望のサブセットを特定の色で、ハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーション（すなわち、相補的配列を有するＤＢＬに対して）の過程によって単純に「ペイント」（ラベル）することができるので、特に有用なＤＢＬである。さらに、蛍光は容易に画像化され、標準的な光学的ハードウェアおよびソフトウェアを用いて定量される。所定のビーズタイプを特定の色で「ペイント」するために、ビーズタイプは固有のハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列（ＩＢＬ）でラベルされなければならず、デコーディング溶液は該配列の色でラベルされた補体を含有しなければならない。
【００９２】
デコーディングスキームの実施において１の考慮すべき事柄は、集められる画像の数を最小限にすることである。色に基づくスキームにおいて、集められる画像の数は色の数および段階の数の産物である。画像の数は、各所定の段階につき複数の色でビーズを「ペイント」することによって減らすことができる。複数の色をビーズに与えることにより、効果的なコードの数が増加する。例えば、コンピューターによって使用される２４ビットの３色のスキーム（例えば、赤、緑、青）カラーリングプロセスにおいて、全部で２５６^＊２５６^＊２５６＝１６．７百万個の異なる「色相」がたった３色（赤、緑、青）から生じることができる。
【００９３】
したがって、好ましい具体例において、ＤＢＬは、有色の蛍光体の組み合わせを用いてラベルされる。該方法はそれ自体、ほんの少数の異なる色素（色）を用いてＤＢＬをラベルするために利用可能なコードの数を増やすことにおいて有用である。各デコーディング工程で利用可能なコードの数を増やすことは、所定のデコーディング過程において必要とされるデコーディング工程の数を大幅に減らすであろう。
【００９４】
１の具体例において、単一のＤＢＬをエンコードするオリゴヌクレオチドの集団は、ＤＢＬが結合する各ビーズが有色の蛍光体の組み合わせから公式化される特徴的な「色相」に基づいて同定されるように、所定の比率の色でラベルされる。好ましい具体例において、２つの別個の色を用いる。好ましい具体例において、３またはそれ以上の別個の色素（色）が利用可能である。該例において、単一のＤＢＬをエンコードしているオリゴヌクレオチドの集団をいずれかの所定の色でラベルすることによって生じた区別可能なコードの数は３である。しかしながら、ラベル化における色および色のレベルの組み合わせを考慮することによって、より多くのコードが生じる。
【００９５】
ハイブリダイゼーションによってデコーディングする場合、識別可能な色調の好ましい数は２〜２０００であり、識別可能な色調のより好ましい数は２〜２００であり、識別可能な色調の最も好ましい数は２〜２０である。３つの異なる色調（強度）および３色を用いると、異なる色相の数が３^４＝８１になる。色相と連続的デコーディングの組み合わせにより、事実上無限数のコードを生じさせることができる。
【００９６】
以前の記載のように、ＤＢＬは、ＩＢＬに結合するいずれかの薬剤であることができる。好ましい具体例において、単一のＤＢＬは予め決定された比率の色でラベルされる。該比率は、各ＤＢＬについて変化され、したがって、ラベルされる各ＤＢＬ自体につき固有の「色相」が可能である。ビーズのＤＢＬでの処理後、ビーズを分析して、各ビーズと結合した「色相」を決定し、それにより、その結合した生物活性剤を有するビーズを同定する。
【００９７】
例えば、４つの主要な色および２つの強度レベル（色の存在または不在）を用いて、１５の異なる色相／段階が可能である。４つの色素および３つの異なる強度レベルを用いる場合（不在、半分存在、完全に存在）、７３の異なる色相／段階が可能である。この場合、たった４色の画像の獲得が、７３の異なるコーディングの色相についての情報を得るのに十分である。
【００９８】
好ましい具体例において、本発明は、分離した部位を含む表面を有する第１の基体を含むアレイ構成物を提供する。好ましい具体例は、該部位に分布した微小球の集団を利用し、該集団は少なくとも第１および第２のサブ集団を含む。各サブ集団は、生物活性剤およびさらに、所定のｐＫａを有する少なくとも１個の光学的色素を含む。異なる光学的色素のｐＫａは異なる。
【００９９】
好ましい具体例において、例えば、アレイがクローン化した核酸を含む場合、アレイをデコードするために用いることのできるいくつかの方法がある。好ましい具体例において、クローン化核酸についてのいくつかの配列情報が知られている場合、本明細書に広く概説するように、特定のデコーディングプローブを作製することができる。
【０１００】
好ましい態様において、「ランダム」なデコーディングプローブを作製することができる。前に概説したように、一連のハイブリダイゼーションまたは複数のラベルの使用により、固有のハイブリダイゼーションパターンが各センサーエレメントに関して生じ得る。これにより、所定のクローンを示すビーズの全ては同じグループに属するとみなすことができる。一般に、これは、配列依存的であるが高程度に配列特異的ではない様式で結合するランダムまたは部分変性デコーディングプローブを用いて行う。該プロセスは各回、異なるラベル物質を用いて何回も繰り返すことができ、ある意味特異的な相互作用に基づく異なるシグナルパターンを生じることができる。この方法において、各センサーエレメントに関して固有の光学的サインがついに確立される。パターン認識またはクラスター形成アルゴリズムを光学的サインに適用することにより、ビーズを同じサインを共有する（すなわち、同じプローブを有する）セットにグループ分けすることができる。
クローンそのものの実際の配列を同定するためには、追加的方法が必要とされ、例えば、直接配列決定を行うことができる。斑点ｃＤＮＡアレイ（ａ ｓｐｏｔｔｅｄ ｃＤＮＡ）のような、クローンを含むオーダーアレイ（ｏｒｄｅｒｅｄ ａｒｒａｙ）を用いることにより、該セット内でのその位置が分かっている特定クローンにハイブリダイゼーションパターンを関係付ける「鍵」を生じることができる。この方法で、クローンを回収し、さらに特徴づけることができる。
【０１０１】
別法では、クローンアレイは、ベクタータグを有する二元デコーディングを用いてデコードすることができる。例えば、部分的にランダム化したオリゴを核酸ベクター（例えばプラスミド、ファージなど）中にクローン化する。各オリゴヌクレオチド配列は限られたセットの配列のサブセットから成る。例えば、限られたセットが１０配列を含む場合、各オリゴヌクレオチドは幾つかのサブセット（または１０の全て）配列を有してもよい。つまり、１０配列のそれぞれがオリゴヌクレオチド中に存在することもできるし、あるいは存在しないことも可能である。それゆえ、２^１０または１，０２４の可能な組み合わせが存在する。配列は重複してもよく、可能な組み合わせの数を増すために、副次的な変種を示すこともできる（例えばＡ、Ｃ、ＴおよびＧ置換）。核酸ライブラリーをランダムなコード配列を含むベクター中にクローン化する。別法では、ＰＣＲのような他の方法を用いてタグを付加することができる。この方法において、クローンのアレイをデコードするために、少数のオリゴデコーディングプローブを用いることができる。
【０１０２】
好ましい具体例において、判別分析およびクラスターアルゴリズムおよびコンピューター装置を用いて、本発明のアレイ由来のデコーディングデータを分析する。多段デコーディングプロセスにおいて異なる強度および「色相」の蛍光体の使用と組み合わせた本発明に用いられる潜在的に多数のコードは、データの良好な分類を必要とする。データ、特に強度データは、各段階にてビーズが異なる色または色の混合（「色相」）で可逆的にラベルされる（例えば、色素ラベルされた相補的なデコーディングオリゴヌクレオチドをビーズ上のＩＢＬプローブにハイブリダイズすることによるか、または非核酸ＩＢＬ−ＤＢＬ対のための結合リガンド対の形成による）多段プロセスにおいてもたらされる。難題は、各工程でどの色がペイントされたかにしたがってビーズを正確に分類することである。ラベルが互いにより密接に関係すればするほど（光学的画像システムによって決定されるように）、分類が困難になる。
【０１０３】
画像システムによって示されるような色素の接近は、デコーディング色素のスペクトル特性および画像システムのスペクトルチャンネル分離によって決定される。より良好な色の分離は、狭い発光スペクトルを有する蛍光色素を用いることによって、および色素を「ピークで」励起し、「ピークで」その発光を測定するために設計された狭い帯域通過励起および発光フィルターを有する光学系を用いることによって達成される。ビーズ上の色素を光学的に画像化する過程は、目の中の３つの異なる円錐タイプにおける励起の比率を測定することによって脳が色を見るヒトの視覚過程に類似する。しかしながら、光学的画像システムを用いると、実際の色のチャンネルの数は、ヒトの目に存在する３つよりも非常に多い。ＣＣＤに基づく画像システムは、３５０ｎｍから８５０ｎｍまでの色を「見る」ことができるが、目の円錐体は５００−６００ｎｍの可視スペクトルに調律されている。
【０１０４】
ビーズアレイをデコーディングする問題は、本質的に、判別分析分類の問題である。したがって、好ましい具体例において、ハイパースペクトルαスペースにおける変動の分析は、ビーズの色または色相の既知のセットにおいて行われる。αスペースにおけるビーズクラスターの中心は、クラスターの重心と呼ばれ、クラスター内の点の散乱がクラスターの拡散を決定する。しっかりとした分類スキームは、異なるビーズクラス（色相）の重心間の距離がいずれかのクラスタークラスの拡散より非常に大きいことを必要とする。さらに、重心の場所は、ファイバー毎におよび実験毎に変化しないままであるべきである。
【０１０５】
したがって、好ましい具体例において、色相「ゾーン」は、色相の重心の周囲であって、クラスターの拡散半径の外まで広がっているαスペース中の領域として定義される。色相の重心および拡散半径の対照セットを用いると、経験的に決定されるように、データの新規なセットの分類は、所定のビーズ点が色相クラスターの「ゾーン」の近くまたは中に落ちるかどうかを求めることによって達成できる。これは、異なる色相クラスの重心からビーズ点のマハラノビス距離（この場合、それは単純にユークリッド距離計量である）を計算することによって達成される。図３に示されるデータについて、重心の場所およびそれらの互いからの距離を表２に示す。
【０１０６】
【表２】

【０１０７】
特定の色相クラスに異なるビーズを分類するために、０．３のユークリッド距離カットオフを選択した。最も近い２つの重心、Ｂｏｄ−Ｒ６ＧおよびＢｏｄ−５６４（距離＝０．５５）は、０．３のユークリッドまたはマハラノビス距離を用いる場合、デコーディングゾーンにおいてわずかに重複する。分類における改善は、この距離を減らし、異なる座標軸に適当に重みを与えることによって達成される。
【０１０８】
したがって、本発明は、ビーズの色を分析および分類するコンピューター法を提供する。ビーズの色の分類は、ハイパースペクトル「α」スペース中においてビーズを調べることによって行われ（ａ_１＝Ｉ_１／ＳＩ_ｉ，ａ_２＝Ｉ_２／ＳＩ_ｉ，ａ_３＝Ｉ_３／ＳＩ_ｉ，など）、ここに、各座標軸は、所定の画像チャンネル内のビーズ強度のフラクションを示す。例えば、４つの画像チャンネルを用いてビーズを画像化する場合、ビーズの色または色相は、３−Ｄαスペース中の点によって示すことができる（Ｓａ_ｉ＝１なので、第４の次元は必要ない）。ビーズをラベルする異なる主要な色素のセットを用いる場合、色素は比率の変化および組み合わせパターンの変化において組み合わせることができるので、これらの色素から生じることのできる色相の数は際限がない。実際の色相の数は、ハイパースペクトルαスペース中における異なる色相クラスターの分離によって、実験的に決定される。
【０１０９】
図３は、４つの分離した画像チャンネルにおいて画像化される４つの異なる色相でラベルされたビーズのハイパースペクトルαプロットを示す。ビーズが４つの別個のクラスターを形成することに注目すること。これらの４つのクラスターがよく分離しているという事実は、しっかりとしたデコード分類スキームの実行を可能にする。
【０１１０】
好ましい具体例において、デコーディング過程の品質管理分析を行う。これは、各デコーディング段階につきαスペースのクラスター分析を行うことによって達成される。決定されるクラスターの数は、色相の予想数によって固定されるであろう。クラスター重心の位置はモニターされ、予想される位置からのいずれかの偏りが注目されるであろう。
【０１１１】
したがって、本発明は、本発明のアレイをデコーディングするための装置を提供する。本明細書に概説される構成物に加えて、装置は、メモリーおよび入力／出力装置のセット（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）とバスを介して通信する中央処理装置を包含する。中央処理装置、メモリー、入力／出力装置およびバスの間の一般的な相互作用は当該分野で既知である。本発明の１の態様は、メモリー中に貯蓄されたハイパースペクトル「α」スペース分類システムに向けられている。
【０１１２】
分類システムプログラムは、光学的リーダーまたは共焦顕微鏡（または他の画像システム）からデータを受けるデータ獲得モジュールを包含する。一般に、分類プログラムはまた、ハイパースペクトルαスペース中の変化を分析でき、クラスターの重心を計算でき、クラスターの散乱（拡散）を計算でき、色相ゾーンおよび距離カットオフを明らかにすることのできる分析モジュールを包含する。一般に、分析モジュールはさらに、マハラノビス距離を計算することによって、データ点が色相ゾーン内に落ちるかどうかを決定するであろう。
【０１１３】
最終的に、分析モジュールは、最終的に生物活性剤をビーズ場所に与えるために、異なる一連のデコーディング情報を分析するであろう。
【０１１４】
このように、各工程が判別分析計算を用いる一連のデコーディング工程を行って、各工程にて、アレイ中の各ビーズを色相クラスターに与える。一連のデコーディング情報の蓄積は、ビーズの場所とそこに含まれる化学的性質の相互関係を与える。
【０１１５】
一度作成されると、本発明の構成物は、多くの応用において使用できる。好ましい態様において、存在する標的アナライトの量の定量化を含め、標的アナライトの存在または不在に関して試料溶液をプローブするために該構成物を用いる。本明細書中の「標的アナライト」または「アナライト」または文法的に等しいものにより、結合パートナーについて検出あるいは評価されるいずれかの原子、分子、イオン、分子イオン、化合物または粒子を意味する。当業者には明らかであるように、多くのアナライトを本発明に用いることができ、基本的には、生物活性剤を結合するいずれのアナライトも、または、結合パートナー（すなわち薬物候補物質）が求められているいずれのアナライトも用いることができる。
【０１１６】
適当なアナライトには、生物分子を含む有機および無機分子が含まれる。標的アナライトの検出を行う場合、適当な標的アナライトには、制限されるものではないが、環境汚染物質（農薬、殺虫剤、毒素などを含む）、化学物質（溶媒、ポリマー、有機物質などを含む）、治療分子（治療薬および濫用薬物、抗生物質などを含む）、生物分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜抗原およびレセプター（神経、ホルモン、栄養素および細胞表面レセプター）またはそれらのリガンドなどを含む）、全細胞（原核細胞（病原性細菌など）および真核細胞、哺乳動物の腫瘍細胞を含む）、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）および胞子などが含まれる。特に好ましいアナライトは、核酸およびタンパク質である。
【０１１７】
好ましい具体例において、標的アナライトはタンパク質である。当業者には明らかであるように、本発明を用いて結合パートナーについて検出または評価することができる、多数の可能性のあるタンパク質性標的アナライトがある。適当なタンパク質標的アナライトには、制限されるものではないが、（１）免疫グロブリン；（２）酵素（および他のタンパク質）；（３）ホルモンおよびサイトカイン（その多くは細胞レセプターのリガンドとして役立つ）および（４）他のタンパク質が含まれる。
【０１１８】
好ましい具体例において、標的アナライトは核酸である。米国特許第６０／１６０，０２７号；第６０／１６１，１４８号；第０９／４２５，６３３号および第６０／１６０，９１７号（全て、出典明示により明らかに本明細書の一部とされる）に広く概説されるように、これらのアッセイは、幅広い範囲の適用に用いられる。
【０１１９】
好ましい具体例において、プローブは遺伝子診断に用いられる。例えば、プローブを本明細書中に開示する方法を用いて作成し、非ポリープ性の結腸癌、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、様々な癌に関連する遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー病のより大きな危険性を示すＡｐｏＥ４遺伝子のような標的配列を検出することができ、患者、嚢胞性繊維症遺伝子、シトクロムｐ４５０ｓまたは当業者によく知られる他のいずれかの変異を容易に前駆症状スクリーニング（ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）することが可能となる。
【０１２０】
さらなる具体例において、ウイルスおよび細菌の検出を、本発明の複合体を用いて行う。この態様において、様々な細菌およびウイルス由来の標的配列を検出するためにプローブを設計する。例えば、最新の血液スクリーニング技術は抗ＨＩＶ抗体の検出による。本明細書中に開示する方法により、ＨＩＶ核酸配列、特に高度に保存されたＨＩＶ配列を検出するための臨床試料の直接スクリーニングが可能となる。加えて、抗ウイルス治療の効能を評価する改良法のように、これにより患者の体内に循環しているウイルスを直接測定することが可能となる。同様に、白血病、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩと関連するウイルスをこの方法で検出することができる。結核、クラミジアおよび他の性的伝染病のような細菌感染を検出することもできる。
【０１２１】
好ましい具体例において、本発明の核酸は、水および食物試料のスクリーニングにおいて毒性細菌のためのプローブとして用いる。例えば、試料を処理して細菌を溶解し、その核酸を放出させ、次いで、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、イー．コリのエンテロトキシン菌株および在郷軍人病細菌のような病原性菌株を含むがこれらには制限されない細菌株を認識するプローブを設計することができる。同様に、バイオレメディエーション法を本発明の構成物を用いて評価することができる。
さらなる具体例において、犠牲者および容疑者から採取した試料に対して犯罪事件のＤＮＡ（ｃｒｉｍｅ−ｓｃｅｎｅ ＤＮＡ）を対応させるための法医学「ＤＮＡフィンガープリント法」のために該プローブを用いる。
さらなる具体例において、アレイ中のプローブをハイブリダイゼーションによる配列決定のために用いる。
【０１２２】
本発明はまた、標的核酸配列における変異またはミスマッチの検出のための方法として用いる。例えば、多形ＤＮＡマーカーを使用することにより遺伝子変異と表現型の間の関係を分析することが近年注目されている。これまでの研究は、多形位置マーカーとして短いタンデムリピート（ＳＴＲ）を利用したが、近年は、単一ヌクレオチド多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）（ＳＮＰ）の使用が注目されている。共通のＳＮＰｓは、ヒトのゲノムＤＮＡ１キロベースあたり１以上の平均頻度で生じる。いくらかのＳＮＰ、特にコーディング配列内およびその付近のものは、治療的適切な表現型変種の直接原因であるようである。臨床的に重要な表現型を引き起こす多くの周知の多形があり、例えば、ａｐｏＥ２／３／４変種はアルツハイマー病および他の疾患の異なる相対リスクと関連する（Ｃｏｒｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１（１９９３）を参照されたい）。オリゴヌクレオチドアレイに対するその後のハイブリダイゼーションを用いたＳＮＰ位の多重ＰＣＲ増幅は、少なくとも何百ものＳＮＰを同時にゲノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）する迅速かつ信頼できる方法であることが示されている：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０：１０７７（１９９８）を参照されたい；さらに、Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：３３−３９（１９９８）も参照されたい。本発明の構成物は従来技術のアレイに容易に取って代わることができる。特に、単一塩基伸長（ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＢＥ））およびパイロシークエンシング技術が特に本発明の構成物に有用である。
【０１２３】
好ましい態様において、本発明の構成物を用いて生物活性剤をスクリーニングし、標的分子に結合して好ましくはその機能を修飾する薬剤を見出す。前記のように、当業者には明らかなように、幅広い種類の異なるアッセイフォーマットを作動させてもよい。一般に結合パートナーが所望される標的アナライトをラベルし、標的アナライトを生物活性剤に結合させてラベルをビーズに補充し、続いて検出する。
好ましい態様において、生物活性剤と標的アナライトの結合は特異的である；つまり、生物活性剤は標的アナライトに特異的に結合する。本明細書中、「特異的結合」は、アナライトと、試験試料の他の成分または汚染物質を区別するのに十分特異的に物質がアナライトに結合することを意味する。しかし、当業者には明らかなように、それほど特異的でない結合を用いてアナライトを検出することができるであろう。例えば、該システムは異なる結合リガンド、例えば異なるリガンドのアレイを用いてもよく、特定アナライトのいずれの検出も結合リガンドのパネルに結合するその「サイン」によるものであり、「電子ノーズ（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｎｏｓｅ）」が働く様式と類似している。これは化学アナライトの検出において特に利用できる。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄工程を含む（いくらかの態様においては、洗浄工程は必要とされないが）アッセイの条件下で結合を維持するのに、すなわち低いアフィニティーの結合パートナーを検出するのに十分であるべきである。いくらかの態様、例えばある種の生物分子の検出においては、アナライトの結合リガンドへの分離定数は約１０^−４−１０^{− ６}Ｍ^−１より小さく、約１０^{‐ ５}−１０^−９Ｍ^{‐ １}より小さいことが好ましく、１０^−７−１０^−９Ｍ^−１より小さいことが特により好ましい。
【０１２４】
一般に、（標的アナライトの検出のための、または、標的アナライトの結合パートナーをスクリーニングするための）標的アナライトを含む試料を、少なくとも一つの生物活性剤に対する標的アナライトの結合に適した条件下、すなわち、一般に生理的条件下でアレイに添加する。標的アナライトの存在または不在を次いで検出する。当業者には明らかなように、これは様々な方法で、一般に光学シグナルの変化を用いて行うことが出来る。この変化は、多くの異なるメカニズムを介して起こることができる。少数の例としては、ビーズへの色素タグを付加したアナライトの結合、ビーズ上または付近での色素種の産生、存在する色素種の破壊、ビーズ上の色素とのアナライト相互作用における光学的サインの変化、またはその他の光学的に応答指令信号を送信可能な事象が含まれる。
【０１２５】
好適な一具体例においては、光学的シグナルの変化は、直接的または間接的に検出可能なラベル（好適には蛍光色素のような光学的ラベル）でラベルされた標的アナライトの結合の結果として生じる。したがって、例えば、タンパク質性標的アナライトを用いる場合、例えばラベルした抗体の使用によって蛍光（ｆｌｕｏｒ）で直接ラベルするか、または非直接的にラベルできる。同様に、核酸は、当該分野で既知のように例えばＰＣＲ増幅を通じて、蛍光色素で容易にラベルされる。別法として、標的配列の結合に基づき、ハイブリダイゼーション指示薬をラベルとして用いることができる。ハイブリダイゼーション指示薬は通常可逆的に二本鎖核酸と優先的に結合する。ハイブリダイゼーション指示薬は、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）ならびに副溝および／または主溝結合部を包含する。好適な一具体例においては、インターカレーターを用いることができる；インターカレーションは通常二本鎖核酸の存在下においてのみ起こるので、標的ハイブリダイゼーションの存在下でのみラベルが明るくなる。したがって、標的アナライトの生物活性剤への結合に基づいてこの部位に新たな光学的シグナルが発生し、検出できる。
【０１２６】
別法として、いくつかの場合において、上記のように、酵素のような標的アナライトは直接的または間接的に光学的に検出できる種を生じる。
【０１２７】
さらに、いくつかの具体例では、光学的サインの変化は光学的シグナルに基づきうる。例えば、ある化学的標的アナライトとビーズ上のある蛍光色素との相互作用は光学的サインを変化させることができ、したがって異なる光学的シグナルを生じる。
【０１２８】
当業者に理解されるように、いくつかの具体例では、標的アナライトの存在または不在は、他の光学的または非光学的シグナル（表面増強ラマン分光法、表面プラズモン共鳴、放射活性等を含むが、これに限定されるものではない）における変化を用いてなされうる。
【０１２９】
当業者に理解されるように、アッセイは様々な実験条件下で実施できる。スクリーニングアッセイにおいて、種々の他の試薬が含まれうる。これらは最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、および／または非特異的もしくはバックグラウンドの相互作用を減少させるために用いることができる塩、中性タンパク質（例、アルブミン、界面活性剤等）のような試薬を包含する。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のような、別の方法でアッセイの効率を改良する試薬も用いることができる。成分の混合物は、必要な結合を与える任意の順番で添加できる。当業者に知られているように、種々のブロッキング工程および洗浄工程を用いることができる。
【０１３０】
好適な一具体例では、２色拮抗ハイブリダイゼーションアッセイを実行する。これらのアッセイは慣用のサンドイッチアッセイに基づくことができる。ビーズはＳＮＰの片側（上流または下流）に位置する捕獲配列を含み、標的配列を捕獲できる。各々異なる蛍光体でラベルした２つのＳＮＰ対立遺伝子特異的プローブを標的配列にハイブリダイズさせる。通常、より良い結合を示す較正配列を用いて、２つのシグナルの比率から遺伝子型を得ることができる。これは、ラベルされる必要のない標的配列自体において有利である。さらに、プローブは拮抗するので、これは結合条件を最適化する必要がないことを意味する。ミスマッチのプローブが安定して結合する条件下で、マッチしたプローブをさらに置き換えることができる。したがって、拮抗アッセイはそれらの条件下でより良い識別を与えることができる。多くのアッセイを平行して実施するので、全てのプローブについて条件を同時に最適化することはできない。したがって、拮抗アッセイシステムを用いて、ミスマッチ識別についての非最適条件を補うことを補助するために用いることができる。
【０１３１】
好適な一具体例においては、本発明の構成物を用いてジデオキシヌクレオチド チェーン ターミネーション配列決定を行う。この具体例においては、ＤＮＡポリメラーゼにより蛍光的にラベルしたｄｄＮＴＰを用いてプライマーを伸長する。該プライマーの３’末端はＳＮＰ部位に隣接する。この方法において、単一塩基伸長は該ＳＮＰ部位の配列に相補的である。各塩基について１つの、４つの異なる蛍光体を用い、４つの塩基特異的シグナルを比較することによりＳＮＰの配列を導き出すことができる。これはいくつかの方法で行うことができる。第１の具体例では、捕捉プローブを伸長できる；このアプローチでは、プローブはビーズ上で５’−３’合成されるか、または５’末端に結合されて、ポリメラーゼ伸長のための遊離３’末端を与えなければならない。別法として、サンドイッチ型アッセイを用いることができる；この具体例では、プローブによって標的をビーズ上に捕捉し、ついでプライマーをアニーリングし、伸長する。また、後者の場合、標的配列はラベルされていなくてもよい。さらに、サンドイッチアッセイは２つの特異的相互作用を必要とするので、これは複合試料の分析に特に有益なストリンジェンシーを増加させる。
【０１３２】
さらに、標的アナライトおよびＤＢＬの双方が薬剤に結合する場合、デコーディングの拮抗を介して非ラベル化標的アナライトの検出を行うことも可能である。
【０１３３】
好適な一具体例においては、本発明の方法はアレイ品質管理において有益である。本発明以前には、あらゆるアレイ上のあらゆるプローブの性能のポジティブ試験を提供する方法は開示されていない。アレイのデコーディングがこの試験を提供するだけではなく、そのデコーディング過程自体の間に生じたデータを利用することによってもそのようにする。したがって、さらなる実験作業は要求されない。本発明はソフトウエアにコードできる１組のデータ分析アルゴリズムのみを必要とする。
【０１３４】
品質管理処置はアレイ中の広範な体系的およびランダムな問題を同定できる。例えば、塵または他の汚染物質のランダムな斑点はいくつかのセンサーに正しくないシグナルを与えさせうる−これはデコーディングの間に検出できる。複数のアレイに由来する１以上の薬剤の遺漏もまた検出できる。この品質管理処置の利点は、アッセイ自体の直前に実行でき、個々のセンサーの真の機能試験であることである。したがって、アレイアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）と実際の使用との間で生じうるあらゆる問題を検出できる。非常に高レベルの信頼性が必要で、および／または実験手順の間にセンサーの故障の重大な可能性がある場合の応用において、デコーディングと品質管理は実際の試料分析の前後両方で実施できる。
【０１３５】
好適な一具体例においては、アレイを用いて試薬品質管理を行うことができる。多くの例では、生物学的な巨大分子が試薬として用いられ、品質管理されなければならない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブの大きなセットが試薬として提供されうる。多数の異なる生物学的な巨大分子において品質管理を実行することは通常困難である。本明細書に記載したアプローチを用いて、アレイの代わりに変化可能である試薬（ＤＢＬとして定式化した）を処理することによってこれをなすことができる。
【０１３６】
好適な実施例においては、本明細書に記載した方法をアレイ較正に用いる。ｍＲＮＡ定量のような多くの応用の場合、標的アナライトの濃度に対して線形応答であるシグナルを有するか、または別法として、非線形の場合、濃度とシグナルとの間の関係を決定し標的アナライトの濃度を評価できることが望ましい。したがって、本発明は、アレイにおける複数のビーズについて平行して較正曲線を作成する方法を提供する。分析する試料の複雑さをシミュレートする条件下で較正曲線を作成できる。各曲線は他の曲線（例えば、異なる濃度範囲について）と独立して、アレイについての他の全曲線と同時に構築できる。したがって、該具体例において、一連のデコーディングスキームは、異なる蛍光体よりもむしろ、異なる濃度をコード「ラベル」として用いて実行される。この方法において、濃度に対する応答としてのシグナルは各ビーズについて測定できる。該較正は、アレイの使用の直前に実施でき、その結果、あらゆるアレイ上のあらゆるプローブが個々に、必要に応じて較正される。
【０１３７】
好適な一具体例においては、本発明の方法を同様にアッセイ開発に用いることができる。したがって、例えば、該方法は良いプローブおよび悪いプローブの同定を可能にする；当業者に理解されるように、いくつかのプローブはうまくハイブリダイズしないかまたは１以上の配列とクロスハイブリダイズするので、うまく機能しない。これらの問題はデコーディングの間に容易に検出される。プローブの性能を迅速に評価する能力はアッセイ開発の時間と費用を大きく減少させる可能性を有する。
【０１３８】
同様に、好適な一具体例において、本発明の方法はアッセイ開発での定量において有益である。多くのアッセイの主要なチャレンジは試料間のアナライト濃度における相違を検出する能力、これらの相違を定量する能力、およびアナライト、関係するアナライトの複合混合物の存在下での全て、の絶対濃度の測定である。この課題の例は全細胞性ｍＲＮＡの存在下における特異的ｍＲＮＡの定量である。ｍＲＮＡ定量の基礎として開発された１つのアプローチは、複数のマッチしたプローブ対とミスマッチのプローブ対を利用する（Ｌｏｃｋｈａｒｔら、１９９６）（出典明示によって本明細書中にその内容を完全に取り込む）。このアプローチは単純であるが、比較的多数のプローブを必要とする。このアプローチにおいて、濃度に対する定量的応答は、目的の遺伝子または配列に対する１組の異なるプローブ由来のシグナルを平均することによって得られる。いくつかのプローブのみが定量的に応答し、これらのプローブを確実に予測することはできないので、このことは必須である。事前の知識がない場合、適切に選択されたプローブのコレクションの平均応答のみが定量的である。しかしながら、本発明においては、他のアッセイと同様に核酸に基づくアレイへの一般的な適用が可能である。要するに、そのアプローチは特定のアッセイにおいて定量的に応答するプローブを同定することであり、他のプローブとの平均ではない。これは、濃度に基づいたコードを用いる上記のアレイ較正スキームによって行われる。各および全配列を有効な方法で試験できるので、このアプローチの利点には；より少いプローブしか必要でないこと；測定の正確さが用いられるプローブの数にあまり依存しないこと；およびセンサーの応答が高度な確実性で知られることがある。特に複雑な配列混合物中において、プローブ性能の予測の困難性と不確実性を避ける、うまく機能するプローブが経験的に選択されることに注目することは重要である。対照的に、オーダーアレイを用いる、これまでに記載された実験においては、混合物へ既知のｍＲＮＡを添加する定量的なスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）実験の実施によって比較的少数の配列がチェックされる。
【０１３９】
好適な具体例においては、ＲＮＡ発現プロファイリングのためにｃＤＮＡアレイを作成する。この具体例においては、宿主ベクター系において増殖させたｃＤＮＡライブラリーから個々のｃＤＮＡクローンを増幅する（例えば、ＰＣＲを用いて）。各増幅ＤＮＡをビーズの集団に結合させる。異なる集団を一緒に混合し、ｃＤＮＡライブラリーを示すビーズのコレクションを作成する。該ビーズをアレイにし、上記のようにデコードし、アッセイに用いる（本明細書中に記載したが、同様にデコーディングがアッセイ後に起きてもよい）。抽出され、必要に応じてラベルされ、アレイにハイブリダイズしたＲＮＡ試料（全細胞またはｍＲＮＡ）を用いてアッセイを行う。拮抗分析は、個々のＲＮＡの発現レベルにおける相違の検出を可能にする。較正標準の適当なセットとの比較は、ＲＮＡの絶対量の定量を可能にする。
【０１４０】
また、ｃＤＮＡアレイをマッピングに用いて、例えば欠失／挿入をマッピングし、または例えば、腫瘍や他の組織試料由来のゲノム中のコピー数の変化をマッピングできる。これは、ゲノムＤＮＡのハイブリダイズによって行うことができる。ｃＤＮＡ（またはＥＳＴ等）の代わりに、ランダムゲノム断片を含むその他のＳＴＳ（配列タグ部位）をこの目的でアレイにすることもできる。
【０１４１】
下記の実施例は、上記の発明の使用法をより詳しく記載するために、ならびに本発明の種々の態様を実施することが意図される最良の様式を示すために役に立つ。これらの実施例は、いかなる方法においても本発明の真の範囲を制限しようとするものではなく、むしろ例示目的で提供されることが理解される。本明細書に引例した全ての参考文献は、出典明示によりその全てにおいて本明細書の一部とされる。
【０１４２】
実施例
実施例１
２つの異なる蛍光体（ＦＡＭおよびＣｙ３）を組み合わせて１６個の微小球（ビーズ）をラベルした。ラベル化の第１ラウンドにおいて、微小球上のオリゴヌクレオチド（ＩＢＬ）に相補的なＦＡＭまたはＣｙ３のいずれかでラベルしたオリゴヌクレオチドを微小球とハイブリダイズした。オリゴヌクレオチドのラベル化は、当該分野で周知のように行った。ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で既知である。
【０１４３】
ハイブリダイゼーションの第１ラウンド後、ビーズの２つのプールを各々、２つのプールに分け、各々、ＦＡＭまたはＣｙ３でラベルしたオリゴヌクレオチドのいずれかでラベルした。該過程をさらに２回繰り返した。かくして、ラベル化の４つの連続するラウンドの後、各微小球は固有のコードでラベルされた（図４参照）。各微小球の同一性は、連続して各蛍光体の同一性を決定することによって解明され；末端の蛍光体を決定し、次いで、次の蛍光体を同定できるように除去した。該様式において、４つほどの少ないデコーディング工程を用いて、１６個の微小球の同一性を決定する。
【０１４４】
実施例２
実施例１の記載と類似のデコーディングスキームを４色のデコーディングについて実行した。該実施例において、４つのラベルを各段階で用いた以外は実施例１に記載のようにビーズをラベルした。Ｂｏｄ４９３、ＢｏｄＲ６Ｇ、Ｂｏｄ５６４およびＢｏｄＴＸＲでラベルしたオリゴヌクレオチドを用いて４０１３個のビーズをラベルした。４色の連続するデコーディングに基づいて、１２８個の異なるビーズタイプを同定した。
【０１４５】
実施例３
複数の色を用いることに対する別法は、コーディングスキームとして比率計強度を用いることである。あらゆるビーズがその「最大限の」強度を示す画像の標準化がもたらされる。続くデコード段階は、「ラベル」：「非ラベル」相補的オリゴヌクレオチドの混合物をハイブリダイズすることによって強度コードを生じる。例えば、図１は、「高い」色調値で存在する全補体を有する段階に供給されることのできる３つの異なる強度の色調（低、中および高）を示す。１６個の異なるビーズタイプ上のグレースケールデコーディングを用いる実験を図６に示す。
【０１４６】
図６Ａは、ビーズを異なる比率のラベルしたオリゴヌクレオチドでラベルするためのコンビナトリアルプーリングスキームを示す。特定のオリゴが１００％Ｃｙ３ラベル、４０％Ｃｙ３ラベル（６０％非ラベル）または１０％Ｃｙ３ラベル（９０％非ラベル）フラクションで存在する。デコードオリゴを２分間、５０ｎＭ濃度でアレイに対してハイブリダイズした。次いで、２つの独立した標準化画像（全オリゴ補体は１００％Ｃｙ３ラベル種として存在する）を獲得し、得られたビーズ強度を比較した。これは、標準化した値が互いに対してプロットされる場合、図６Ｂにおいて示される。最終的に、ビーズを同定またはデコードするために、α値（指示されるデコード段階におけるビーズ強度の標準化画像における強度に対する比率）を（Ａ）に記載された３つのデコード段階についてプロットする。段階１において、たった１６個のビーズタイプがアレイ上に存在するので、たった２つのピークがα値ヒストグラムにおいて観察される。３つの区別可能なピークが第２および第３デコード段階において観察され、グレイスケールデコーディングの可能性を示す。
【０１４７】
物理的属性および属性の異なる「レベル」を、ビーズタイプを他から区別するコードとして使用できる。したがって、属性がしっかりとしたコードとして作用するために、ビーズを特定の属性の異なる「レベル」で染めることが可能であるべきである。属性の各「レベル」は、他の「レベル」から定量的によく分離されるべきである。重要な点は、属性測定値の動的範囲を最大化し、測定値の拡散を最少にすることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅは本発明の幾つかの異なる「２構成要素」系具体例を示す。図１Ａはビーズアレイを示す。第１の基体１０はウェル２５およびビーズ３０を保持するアレイ場所を有する。第２の基体４０はアッセイ場所４５を有する。光学レンズまたはフィルター６０も示してあり、当業者が判るように、これは基体の内部にあってもよい。図１Ｂも同様であるが、ビーズを使用せず、アレイ場所２０は分離した部位２１、２２、２３等を有し、これはスポッティング、プリンティング、フォトリトグラフィー技術等で形成できる。図１Ｃ〜Ｆは複数の第１基体の使用を示す。図１Ｃは「ビーズのビーズ」を示し、これは機能を混合するためのさらなる用途を有する。図１Ｄは複数のビーズアレイを示し、図１Ｅは複数の非ビーズアレイを示す。図１Ｆは「標的」第１基体１０の第２基体４０上の位置に対する結合機能の使用を示し、当業者が判るように、これは平面の第２基体上でもコンパートメント化された基体上でも行うことができる。図１Ｆは、結合リガンド対７０／７０’、７１／７１’、７２／７２’等を利用する。これらは化学的機能でも、オリゴヌクレオチドのようなＩＢＬ／ＤＢＬ対について記載されているような生物学的機能等でもよい。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは２つの異なる「１構成要素」系を示す。図２Ａはビーズ３０を含むウエル２５を保持するアッセイ場所４５を有する基体５０を有するビーズアレイを示す。図２Ｂは各アッセイ場所４５が分離した部位２１、２２、２３等を有する非ビーズアレイを示す。
【図３】図３はハイパースペクトルαスペース（α_１＝Ｉ_１／ΣＩ_ｉ、α_２＝Ｉ_２／ΣＩ_ｉ、α_３＝Ｉ_３／ΣＩ_ｉ等）におけるクラスターを示す。ファイバー束上に存在する１２８の異なるビーズタイプの１組を４つの色素、Ｂｏｄｉｐｙ−４９３、Ｂｏｄｉｐｙ−Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＸＲおよびＢｏｄ−５６４でラベルした相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイズセットでデコードした（オリゴヌクレオチド当たり１つの色素のみ）。図示したものは４段階デコードの第２段階で、４０１３個のビーズがデコードされた。色相クラスターの領域の周囲に長円を描いてある。
【図４】図４は２色デコーディングプロセスを示し、ＦＡＭラベルまたはＣｙ３ラベルオリゴ補体を、アレイ上の異なるビーズタイプの「ペイント（ラベル）」に使用している。
【図５】図５は４色および４つのデコード段階で１２８の異なるビーズタイプのデコーディングを示す（挿入図は４つの異なる色素を用いて１６のビーズタイプをデコードする単一のデコード段階を示す）。
【図６】図６は１６の異なるビーズタイプをデコードするグレースケールを示す。（Ａ）相補的デコーディングオリゴ用のコンビナトリアルプール図表。Ａ（Ｂ）２つの独立した正規化した像が得られ、得られたビーズ強度を比較した。（Ｃ）α値（示したデコード段階におけるビーズ強度の正規化した像における強度の比率）を（Ａ）に記載した３つのデコード段階についてプロットしている。

Claims (6)

1. ａ）複数のアッセイ場所を含む表面を有する第１基体と、ｂ）各アレイ場所が分離した部位を含む、複数のアレイ場所を含む第２基体と、ｃ）各サブ集団が生物活性剤を含む、少なくとも第１および第２のサブ集団を含む微小球の集団とを含み、該微小球が各アレイ場所上に分布していることを特徴とする複合アレイ構成物。
2. 該第１基体がマイクロタイター・プレートである請求項１記載の構成物。
3. 該第２基体が、複数の個々のファイバーを含む複数の光ファイバー束を含み、各束が１つのアレイ場所を含み、個々のファイバーの各々が１つのビーズ・ウエルを含む請求項１または２記載の構成物。
4. 該サブ集団の各々がさらに該生物活性剤を同定できる光学的サインを含む請求項１記載の構成物。
5. 該サブ集団の各々が、さらに、デコーダー結合リガンドと結合して生物活性剤の同定を解明できるようにする同定物結合リガンドを含む請求項１記載の構成物。
6. ａ）複数のアッセイ場所を有する第１基体に試料を添加し、試料を該複数のアッセイ場所に含有させ、ｂ）ｉ）各アレイ場所が分離した部位を含む、複数のアレイ場所を含む表面と、ｉｉ）各サブ集団が生物活性剤を含む、少なくとも第１および第２のサブ集団を含む微小球の集団とを含み、該微小球が該部位上に、該分離部位が微小球を含むように分布している第２基体と試料とを接触させ、ｂ）標的アナライトの存在または不存在を決定することを特徴とする１またはそれ以上の試料中の１またはそれ以上の標的アナライトの存在決定方法。

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