JP3569746B2

JP3569746B2 - Low Amylose Rice Variety Milky Queen and DNA Fragments, Primers and Variety Identification Method Specific to the Varieties

Info

Publication number: JP3569746B2
Application number: JP2001154200A
Authority: JP
Inventors: 宏之佐藤; 保宏鈴木; 時雄井辺; 真坂井
Original assignee: 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2004-09-29
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: JP2002369688A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なＤＮＡ断片、プライマー及び品種識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
米は胚乳デンプンを構成するアミロースとアミロペクチンの含有割合によって「もち米」と「うるち米」に大別される。「もち米」ではデンプンがアミロペクチンのみで構成されているが、「うるち米」のデンプンは約２０％のアミロースと約８０％のアミロペクチンから構成されており、米の胚乳デンプンに占めるアミロース成分の割合、すなわちアミロース含量は、デンプン粒結合型のアミロース合成酵素をコードする構造遺伝子であるｗｘ座の対立遺伝子によって決定される。ｗｘ座は、胚乳デンプンのもち性及びうるち性を支配し、うるち性遺伝子（Ｗｘ）がもち性遺伝子（ｗｘ）遺伝子に対して優性である。この米のアミロース含量は、炊飯米の食味の良否に影響を与える重要な形質である。
【０００３】
粘りの強い良食味米は、胚乳のアミロース含量を低減させることによって得ることができるので、近年、各種研究機関において、種々の低アミロース米品種が育成され、その作付面積は現在増加傾向にある。低アミロース米品種とは、通常のうるち米品種よりもアミロース含量が低い品種のことであり、具体的には、アミロース含量が０以上〜１５％未満の品種である。低アミロース品種としては、例えば、「コシヒカリ」に受精卵メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）処理を行い、アミロース含量に着目して選抜、育成された品種「ミルキークイーン」、低アミロース系統「７４ＷＸ２Ｎ−１」に「レイメイ」を交配して育成された品種「スノーパール」、低アミロース由来系統「永系８４２７１」に「キタアケ」を交配し、葯培養によって得られた植物体から選抜して育成された品種「彩」、低アミロース系統「探系２０２１」に「ニシホマレ」を交配して育成された「柔小町」、「研系２０７８」に「北陸１２７号」を交配して育成された品種「ソフト１５８」などがある。
【０００４】
これら低アミロース米品種を通常のうるち米品種と識別する方法としては、１）低アミロース米品種の種子胚乳が白濁することに基づいた肉眼による識別法と、２）胚乳のアミロース含量を測定する方法の２つがある。しかしながら、胚乳の白濁度及びアミロース含量は、産地、生産年、栽培法及び収穫物の乾燥方法等によって変動するため、前記した２方法で低アミロース米品種と通常のうるち米品種の仕分けを確実に行うのは困難である。
【０００５】
一方、遺伝子に着目した低アミロース米品種の識別方法が開発され、特定品種奥羽３４４号（現在の品種名はスノーパール）及び同品種と系譜が同じ品種をＤＮＡ配列に基づいて識別する方法が知られている（特開平１２−２０１６７９号公報）。しかしながら、この方法は、奥羽３４４号を含む同系統における特異的な塩基配列に基づいた品種判別方法であるため、奥羽３４４号及び同系統品種と他品種とを識別することは可能であっても、奥羽３４４号以外の他系統の低アミロース米を識別することはできない。
【０００６】
現在、米の品種等の農産物検査において、各品種に対する確実な検査方法の確立が望まれているが、未だ、低アミロース米品種のうち、ミルキークイーン及び同系統品種を他の低アミロース米及び通常のうるち米品種と識別する方法は報告されていない。このため、ミルキークイーン及び同系統品種の識別方法を確立するためには、前記の遺伝子に着目した低アミロース米品種の識別方法と同様に、ミルキークイーンに特異的な遺伝子を特定し、それに基づいた識別方法を開発する必要がある。しかしながら、ミルキークイーンはコシヒカリにＭＮＵ処理して育成された品種であるため、両者が非常に類似した特性及び遺伝子を有しており、ミルキークイーンとコシヒカリとの遺伝上の差異を明確にしなければ、ミルキークイーン及び同系統品種のみを特異的かつ効率的に他品種と識別することが困難であるため、コシヒカリと同品種の差別化が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なＤＮＡ断片、プライマー及び品種識別方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、低アミロース米品種ミルキークイーンが保有するＤＮＡ塩基配列に着目し、ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なＤＮＡ配列を見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡ断片である。
【０００９】
また、本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより特異的に増幅することが可能な、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーである。
【００１０】
さらに、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーを用い、識別対象の米のＤＮＡに対してＰＣＲを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別する方法である。
【００１１】
【本発明の実施形態】
本発明の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種の識別方法についてさらに詳細に説明する。
本発明において識別の対象となる低アミロース米品種は、ミルキークイーン及び同系統品種である。本発明における低アミロース米品種ミルキークイーンは、１９９８年５月に第６３８５号として品種登録されている、コシヒカリに受精卵メチルニトロソウレア処理を行い、変異第２代でアミロース含量に着目した個体選抜を行って育成されたアミロース含量が通常のうるち米よりも低い品種である。具体的には、アミロース含量がコシヒカリの３／５程度の約１０％である品種である。ここで、品種とは、重要な形質に係る特性の全部又は一部によって他の植物体の集合と区別することができ、かつ、その特性の全部を保持しつつ繁殖させることができる一の植物体の集合を意味する。
【００１２】
また、同系統品種とは、ミルキークイーンを交配親に用いて育成され得る品種のことを意味する。例えば、ミルキークイーンの食味をそのままに栽培特性を改良した新系統「越南ｄ１９０号」、「上育４３６号」等がある。
一方、うるち米他品種とは、上記のミルキークイーン及び同系統品種以外の品種を意味し、通常のコシヒカリ等のうるち米、並びに、ミルキークイーン及び同系統品種以外の低アミロース米を含む。
【００１３】
品種識別対象となる米のＤＮＡの採取源としては特に限定されるものではなく、植物体のいずれの組織からも抽出できるが、例えば、穂、葉、根、種子、精米、玄米、さらに炊飯米等からも抽出することができる。遺伝子を調製する方法としては、当業者に利用可能なものであればいずれの方法（例えば、ＣＴＡＢ法）をも利用できる。
本発明の品種識別には、低アミロース米品種ミルキークイーンにおけるアミロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列と、通常のうるち米のアミロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列の相違を利用する。
【００１４】
コシヒカリ等の通常のうるち米品種は、ｗｘ座に優性のうるち遺伝子Ｗｘを保有していることが知られている（文献：奥野（１９９５）「米の科学」竹生新治郎編朝倉書店Ｐ６１−７６）。一方、ミルキークイーンの低アミロース性は、ｗｘ座の劣性遺伝子ｗｘ−１（ｔ）によって支配されていることがわかった。この低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）の全塩基配列は、配列番号５に示すとおりである。ｗｘ−１（ｔ）とＷｘのＤＮＡ配列を比較すると相違する特異的塩基はわずかに２塩基である。第１相違塩基は、Ｗｘの第４エクソン中のコドン１５８部位のＧがミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）ではＡであり、そのアミノ酸はアルギニンがヒスチジンに変化している。また、第２相違ＤＮＡは、Ｗｘの第５エクソン中のコドン１９１部位のＴがｗｘ−１（ｔ）ではＣであり、そのアミノ酸はチロシンがヒスチジンに変化している。
【００１５】
本発明では、前記の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーを用い、識別対象の米のＤＮＡに対してＰＣＲを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別することができる。
【００１６】
本発明のＰＣＲに用いるプライマーは、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、通常のうるち米品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅することが可能な、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーであれば任意に設計することができる。具体的には、前記ＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーを用いることができ、１）第１相違塩基のみを含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマー、２）第２相違塩基のみを含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマー、３）第１相違塩基及び第２相違塩基の両方を含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマー等が含まれる。これらプライマーは、通常の化学合成により得ることができ、その位置は適宜設定可能であるが、相違塩基を含むプライマーが好ましく、そのうち、変異遺伝子の検出感度を増すために、３’末端を識別目的の前記相違塩基となるように設計するのがさらに好ましい。また、そのサイズは２０〜３０ｍｅｒ程度が適当である。なお、これらのプライマーのうち、１）のプライマーは、第１相違塩基部位と第２相違塩基部位が近接しているため、後述する電気泳動を行う際に支障をきたす可能性があり、また、２）のプライマーは、第２相違塩基部位付近のＧＣ含量及びＴｍ値の関係から、３’末端を識別目的にあわせて設計するのが難しいことから、３）のプライマーを利用するのが好適である。なお、３）の第１相違塩基及び第２相違塩基の両方を含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマーとしては次のプライマーセットがある。
【００１７】

【００１８】
また、プライマーは、上記の低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）に特異的なＤＮＡマーカーを増幅し得るプライマーだけでなく、うるち米他品種と低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）とに共通なＤＮＡ領域を増幅し得るプライマーとを組み合わせて用いることができる。一例として、次のプライマーセットを上記Ｗ１及びＷ２と組みあわせて用いることができる。
【００１９】

【００２０】
低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡの検出は、基本的に前述のＷ１及びＷ２のプライマーセットのみの使用でも可能であるが、ＰＣＲの機種や反応条件によっては、うるち米他品種においてもＷ１及びＷ２のプライマーセットによる薄いバンドが得られることもあるので、うるち米他品種と低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）とに共通なＤＮＡ領域を増幅し得るＷ３及びＷ４などのプライマーセットを用いて対照区を設定することによって、ＰＣＲ反応の成否を更に精度よく確認することができる。
【００２１】
ＰＣＲの反応工程は、熱変性：９３〜９５℃で３０〜６０秒、アニーリング：６０〜７０℃で３０〜６０秒、伸長反応：７２℃で６０〜３００秒で行う。好ましくは、熱変性：９４℃で６０秒、アニーリング：６９℃で６０秒、伸長反応：７２℃で１２０秒を１サイクルとし、これを２５〜３５回、好ましくは２８〜３０回行う。
【００２２】
次に、このＰＣＲによって得られた反応産物は、電気泳動及び分光光度計によって分析することができるが、このうち、電気泳動が好ましい。電気泳動分析は常法によって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したＤＮＡパターンを分析する。前記Ｗ１及びＷ２のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、電気泳動分析により、ｗｘ−１（ｔ）を保有するミルキークイーン及び同系統品種では７４１ｂｐのバンドが出現するが、同遺伝子を保有しないコシヒカリ等の通常のうるち米品種ではバンドは出現しない。また、前記Ｗ１〜Ｗ４のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ｗｘ−１（ｔ）を保有するミルキークイーン及び同系統品種では７４１ｂｐと４６９ｂｐの２本のバンドが出現するが、同遺伝子を保有しないコシヒカリ等の通常のうるち米品種では７４１ｂｐのバンドは出現せず、４６９ｂｐの１本のバンドのみが出現する。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］ｗｘ−ｌ（ｔ）遺伝子及びＷｘ遺伝子のＤＮＡ配列の決定
ミルキークイーン及び比較品種であるコシヒカリの出穂１４日後の穂からそれぞれＲＮＡを抽出した。抽出にはＱｉａｇｅｎ社のＲｎｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔを使用した。得られたＲＮＡは、タカラ（株）のＨｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＲＴ−ＰＣＲキットを用いた逆転写反応に供し、ｗｘ−１（ｔ）及びＷｘ遺伝子の全長ｃＤＮＡをそれぞれ得た。
【００２４】
逆転写反応に必要な機材には，タカラ（株）のＰＣＲＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒＭＰを用いた。次に、得られたｃＤＮＡをそれぞれＮｏｖａｇｅｎ社のプラスミドベクターｐＴ−７ｂｌｕｅ−Ｔｖｅｃｔｏｒに組み込み、シークエンスプライマーを用いた塩基配列の決定操作を行った。塩基配列の決定にはＡＢＩ社の３７７オートシークエンサーを用いて解析を行った。その結果、塩基配列ｗｘ−１（ｔ）（配列番号５）及び対応するアミノ酸配列（配列番号６）、並びに塩基配列Ｗｘ（配列番号７）及び対応するアミノ酸配列（配列番号８）が得られた。
これらのＤＮＡ配列を比較したところ、両配列の相違はわずか２塩基であることが判明した。すなわち、ｗｘ−１（ｔ）はこの相違部位にＡとＣを保有し、一方、ＷｘはＧとＴを保有することが分かった（図１）。
【００２５】
［実施例２］ｗｘ−１（ｔ）遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を利用した品種識別法
（１）プライマー
ＰＣＲを用いた品種識別を行うため、以下の４つのプライマーを設計した。
すなわち、Ｗ１及びＷ２は、ミルキークイーン及び同系統品種が保有するｗｘ−１（ｔ）遺伝子に特異的な部位を増幅可能なプライマーであり、ＰＣＲにより７４１ｂｐの増幅産物が得られる。なお、Ｗ１はＷｘ−１（ｔ）に特異的な第１相違塩基「Ａ」を末端に含んでいるプライマーである。
また、Ｗ３及びＷ４は、ミルキークイーン及び同系統品種とコシヒカリ等の通常のうるち米品種に共通の部位を増幅可能なプライマーであり、ＰＣＲにより４６９ｂｐの増幅産物が得られる。
【００２６】

【００２７】
（２）ＰＣＲ
パーキンエルマー社のＡｍｐｌｉｔａｑ２．５Ｕ、Ａｍｐｌｉｔａｑに付属の１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ５μｌ、５０ｎｇＤＮＡ、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３及びＷ４プライマー各２０ｐｍｏｌを含む最終容量５０μｌの反応液を調製した。ＰＣＲ反応に必要な機材には前記したタカラ（株）のＰＣＲＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒＭＰを用い、９４℃で１分間反応後、９４℃で１分間、６９℃で１分間及び７２℃で２分間の一連の反応を２８回行い、最後に７２℃で４分間反応させた。
【００２８】
（３）電気泳動分析
反応液を５μｌ採り、０．８％アガロースゲルにローディングし、１００Ｖで４０分間電気泳動を行った。ＤＮＡ分子量マーカーとしては、φｘ１７４／ＨａｅＩＩＩを用いた。得られた結果を図２に示す。
【００２９】
ミルキークイーンにおいては、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の４つのプライマーの配列が全てｗｘ−１（ｔ）遺伝子の塩基配列に含まれるため、ＰＣＲにより７４１ｂｐと４６９ｂｐの２つのバンドが増幅した。一方、コシヒカリ等の通常のうるち米品種においては、Ｗ１プライマーのみ配列がＷｘ遺伝子の塩基配列と異なり、ＰＣＲにより７４１ｂｐのバンドは増幅せず４６９ｂｐのバンドのみが増幅した。
【００３０】
【発明の効果】
以上のことから、本発明の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種と通常のうるち米品種を識別し得るプライマーを用いてＰＣＲにより増幅したバンドを確認することによって、ミルキークイーン及び同系統品種とコシヒカリ等の通常のうるち米品種とを識別することが可能である。
【００３１】
【配列表】

【００３２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】ｗｘ−１（ｔ）遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を検出し得るプライマー、Ｗ１〜Ｗ４の配置図及び品種識別の原理を示す図である。
【図２】ｗｘ−ｌ（ｔ）遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を検出し得るプライマーの一例を用いたＰＣＲ反応結果を示す図である。図中、Ｋはコシヒカリ、Ｍはミルキークイーンを示す。また、マーカーはφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a low amylose rice variety Milky Queen and a DNA fragment, a primer and a variety identification method specific to the same variety.
[0002]
[Prior art]
Rice is roughly classified into "sticky rice" and "sticky rice" according to the content ratio of amylose and amylopectin which constitute the endosperm starch. In "sticky rice", the starch is composed of only amylopectin, but the starch of "Uruchi rice" is composed of about 20% amylose and about 80% amylopectin, the ratio of the amylose component in the endosperm starch of rice, That is, the amylose content is determined by an allele at the wx locus, which is a structural gene encoding a starch granule-bound amylose synthase. The wx locus governs the stickiness and stickiness of endosperm starch, where the sticky gene (Wx) is dominant over the sticky gene (wx) gene. The amylose content of the rice is an important trait that affects the quality of cooked rice.
[0003]
Good-tasting rice with strong stickiness can be obtained by reducing the amylose content of the endosperm. In recent years, various low-amylose rice varieties have been cultivated by various research institutions, and the planted area thereof is currently increasing. The low amylose rice variety is a variety having a lower amylose content than a normal glutinous rice variety, and specifically, a variety having an amylose content of 0 to less than 15%. As low amylose varieties, for example, fertilized egg methylnitrosourea (MNU) treatment is performed on “Koshihikari”, and the cultivar “Milky Queen” and the low amylose strain “74WX2N-1” are selected and cultivated by focusing on the amylose content. Cultivar "Snow Pearl" bred by breeding "Reimei", "Kitaake" is bred to low amylose-derived line "Eikei 84271", and cultivar selected and bred from plants obtained by anther culture Aya, a low-amylose strain "Shou 2021" and "Yukomachi" bred by crossing "Nishihomare", and "Kenkei 2078" a cultivar "Soft 158" bred by crossing "Hokuriku 127" and so on.
[0004]
Methods for distinguishing these low amylose rice varieties from ordinary glutinous rice varieties include 1) a visual identification method based on the opacity of seed endosperm of low amylose rice varieties, and 2) a method of measuring the amylose content of endosperm. There are two. However, since the turbidity and amylose content of the endosperm vary depending on the place of production, the year of production, the cultivation method, the method of drying the harvest, etc., the low-amylose rice varieties and the normal glutinous rice varieties are surely sorted by the above two methods. It is difficult.
[0005]
On the other hand, a method for identifying low-amylose rice varieties focusing on genes has been developed, and a method for identifying specific cultivar Ouha 344 (current cultivar name is Snow Pearl) and varieties having the same genealogy as the same cultivar based on DNA sequences has been known. (JP-A-12-201679). However, since this method is a cultivar discrimination method based on a specific base sequence in the same line including Ou 344, even if it is possible to distinguish Ou 344 and the same line varieties from other varieties. , Low amylose rice other than Ou 344 cannot be identified.
[0006]
At present, in the inspection of agricultural products such as rice varieties, it is desired to establish a reliable inspection method for each variety. However, among low amylose rice varieties, Milky Queen and the same strain varieties are still used for other low amylose rice and normal No method has been reported for discriminating it from rice varieties. For this reason, in order to establish a method for identifying milky queens and varieties of the same strain, in the same manner as the method for identifying low-amylose rice varieties focused on the aforementioned genes, a gene specific to milky queens was identified and based on it. Identification methods need to be developed. However, Milky Queen is a cultivar grown by subjecting Koshihikari to MNU treatment, and therefore both have very similar characteristics and genes. Unless the genetic difference between Milky Queen and Koshihikari is clarified, Since it is difficult to specifically and efficiently distinguish only the milky queen and the same variety from other varieties, differentiation between Koshihikari and the same variety is required.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a low amylose rice variety Milky Queen and a DNA fragment, a primer, and a variety identification method specific to the same strain variety.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, focused on the DNA base sequence possessed by the low amylose rice variety Milky Queen, and found a specific DNA sequence for the Milky Queen and the same strain variety, The present invention has been completed.
That is, the present invention is a DNA fragment containing a specific base that is present in the low amylose rice variety Milky Queen and is not present in other rice varieties.
[0009]
Further, the present invention provides a low amylose rice cultivar Milky Queen and a low amylose rice cultivar which are capable of specifically amplifying a DNA fragment containing a specific base not present in other rice varieties. It is a primer that can distinguish lineage varieties from other rice varieties.
[0010]
Furthermore, by using low amylose rice varieties Milky Queen and primers capable of distinguishing the same lineage varieties from other rice varieties, PCR is performed on the DNA of the rice to be identified, and the resulting reaction products are analyzed to obtain low amylose rice. This is a method for identifying whether or not the varieties are milky queens and the same type varieties.
[0011]
[Embodiment of the present invention]
The low amylose rice cultivar Milky Queen and the method of identifying the same varieties of the present invention will be described in more detail.
Low amylose rice varieties to be identified in the present invention are milky queens and the same varieties. The low amylose rice cultivar Milky Queen of the present invention is a cultivar registered as No. 6385 in May 1998, which is obtained by subjecting Koshihikari to fertilized egg methylnitrosourea treatment and performing individual selection focusing on the amylose content in the second generation of mutation. This is a variety that has a lower amylose content than normal glutinous rice grown. Specifically, it is a variety having an amylose content of about 10% which is about 3/5 of Koshihikari. Here, a variety is a plant that can be distinguished from a set of other plants by all or a part of characteristics relating to important traits and that can be propagated while retaining all the characteristics. Means a set of bodies.
[0012]
In addition, the same lineage variety means a variety that can be bred using a milky queen as a crossing parent. For example, there are new strains “Etsunan d190” and “Kyoiku 436” which have improved cultivation characteristics while retaining the taste of milky queens.
On the other hand, the other varieties of glutinous rice refer to varieties other than the above-mentioned milky queen and the same varieties, and include normal glutinous rice such as Koshihikari, and low amylose rice other than the milky queens and the same varieties.
[0013]
The source of the DNA of the rice to be identified is not particularly limited, and can be extracted from any tissue of the plant. For example, ears, leaves, roots, seeds, polished rice, brown rice, and cooked rice Etc. can also be extracted. As a method for preparing a gene, any method (for example, CTAB method) can be used as long as it can be used by those skilled in the art.
The cultivar identification of the present invention utilizes the difference between the nucleotide sequence of the gene encoding the amylose synthase in the low amylose rice variety Milky Queen and the nucleotide sequence of the gene encoding the amylose synthase of the ordinary glutinous rice.
[0014]
It is known that ordinary rice varieties such as Koshihikari have a dominant rice gene Wx at the wx locus (Literature: Okuno (1995) "Rice Science", Shinjiro Takeo, Asakura Shoten P61-76) . On the other hand, it was found that the low amylose property of Milky Queen was controlled by the recessive gene wx-1 (t) at the wx locus. The entire nucleotide sequence of wx-1 (t) of this low amylose rice variety Milky Queen is as shown in SEQ ID NO: 5. When the DNA sequences of wx-1 (t) and Wx are compared, only two specific bases are different. In the first difference base, G at codon 158 in the fourth exon of Wx is A in milky queen wx-1 (t), and its amino acid is changed from arginine to histidine. In the second difference DNA, T at codon 191 in the fifth exon of Wx is C when wx-1 (t), and the amino acid is changed from tyrosine to histidine.
[0015]
In the present invention, by using the low amylose rice varieties Milky Queen and primers capable of distinguishing the same varieties from other rice varieties, PCR is performed on the DNA of the rice to be identified, and the resulting reaction product is analyzed. And low amylose rice varieties Milky Queen and the same line varieties.
[0016]
Primers used in the PCR of the present invention are present in low amylose rice varieties Milky Queen, and are capable of amplifying, by PCR, DNA fragments containing specific bases not present in ordinary glutinous rice cultivars, Any primer can be designed as long as it can discriminate the same lineage varieties from other rice varieties. Specifically, a primer capable of amplifying the DNA fragment can be used, and 1) a primer capable of amplifying a DNA sequence containing only the first different base, 2) amplifying a DNA sequence containing only the second different base. Primers to be obtained, and 3) primers capable of amplifying a DNA sequence containing both the first different base and the second different base. These primers can be obtained by ordinary chemical synthesis, and their positions can be appropriately set. However, primers containing different bases are preferable. Among them, in order to increase the sensitivity of detecting a mutated gene, the 3 ′ end is identified. It is more preferable to design so as to be the above-mentioned different base. The size is suitably about 20 to 30 mer. In addition, among these primers, the primer 1) may hinder electrophoresis to be described later because the first different base site and the second different base site are close to each other. For the primer of 2), it is difficult to design the 3 ′ end according to the purpose of discrimination from the relationship between the GC content and the Tm value near the second different base site, and thus it is preferable to use the primer of 3). is there. The following primer sets are available as primers capable of amplifying a DNA sequence containing both the first and second different bases in 3).
[0017]

[0018]
The primers are not only primers capable of amplifying a DNA marker specific to wx-1 (t) of the low amylose rice variety Milky Queen, but also wx-1 ( The primer can be used in combination with a primer capable of amplifying a common DNA region in the step (t). As an example, the following primer set can be used in combination with W1 and W2 described above.
[0019]

[0020]
Detection of DNA containing specific bases present in the low amylose rice variety Milky Queen and not present in other rice varieties can basically be performed using only the aforementioned primer sets of W1 and W2. Depending on the reaction conditions, a thin band due to the W1 and W2 primer sets may be obtained in other rice varieties such as glutinous rice. Therefore, a DNA region common to the rice varieties other than rice varieties and wx-1 (t) of the low amylose rice variety Milky Queen. By setting a control group using a primer set such as W3 and W4 that can amplify the PCR, the success or failure of the PCR reaction can be more accurately confirmed.
[0021]
The reaction step of PCR is performed by heat denaturation at 93 to 95 ° C. for 30 to 60 seconds, annealing at 60 to 70 ° C. for 30 to 60 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 60 to 300 seconds. Preferably, one cycle of heat denaturation: 94 ° C. for 60 seconds, annealing: 69 ° C. for 60 seconds, and extension reaction: 72 ° C. for 120 seconds is performed 25 to 35 times, preferably 28 to 30 times.
[0022]
Next, the reaction product obtained by this PCR can be analyzed by electrophoresis and spectrophotometry, of which electrophoresis is preferred. Electrophoretic analysis may be performed by a conventional method. For example, electrophoresis is performed under voltage in an agarose or polyacrylamide gel, and the separated DNA pattern is analyzed. When PCR was performed using the W1 and W2 primers, a 741 bp band appeared in the milky queen having wx-1 (t) and the same strain cultivar by electrophoresis analysis, but Koshihikari not having the same gene. No band appears in normal glutinous rice varieties such as. When PCR was performed using the primers W1 to W4, two bands of 741 bp and 469 bp appeared in the milky queen having wx-1 (t) and the same strain varieties, but the same gene was retained. In a normal glutinous rice variety such as Koshihikari which does not exist, a band of 741 bp does not appear, and only one band of 469 bp appears.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Determination of DNA Sequences of wx-1 (t) Gene and Wx Gene RNA was extracted from the ears of the milky queen and the comparative variety Koshihikari 14 days after heading. Riasy plant mini kit from Qiagen was used for extraction. The obtained RNA was subjected to a reverse transcription reaction using a High fidelity RT-PCR kit of Takara Co., Ltd., to obtain full-length cDNAs of the wx-1 (t) and Wx genes, respectively.
[0024]
As a device required for the reverse transcription reaction, PCR Thermal cycler MP of Takara Co., Ltd. was used. Next, each of the obtained cDNAs was incorporated into a plasmid vector pT-7 blue-T vector of Novagen, and the base sequence was determined using sequence primers. The nucleotide sequence was analyzed using an ABI 377 autosequencer. As a result, the nucleotide sequence wx-1 (t) (SEQ ID NO: 5) and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 6), and the nucleotide sequence Wx (SEQ ID NO: 7) and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) were obtained. .
Comparison of these DNA sequences revealed that the difference between the two sequences was only 2 bases. That is, it was found that wx-1 (t) possesses A and C at this different site, while Wx possesses G and T (FIG. 1).
[0025]
[Example 2] Variant identification method using DNA sequence specific to wx-1 (t) gene (1) The following four primers were designed to identify varieties using primer PCR.
That is, W1 and W2 are primers capable of amplifying a site specific to the wx-1 (t) gene possessed by the milky queen and the same strain, and a 741 bp amplification product is obtained by PCR. In addition, W1 is a primer containing a first different base "A" specific to Wx-1 (t) at the end.
W3 and W4 are primers capable of amplifying a site common to milky queens and common rice varieties such as Koshihikari and the same varieties, and a 469 bp amplification product is obtained by PCR.
[0026]

[0027]
(2) PCR
A reaction solution was prepared in a final volume of 50 μl containing 2.5 U of Amplitaq from PerkinElmer, 5 μl of 10 × Buffer attached to Amplitaq, 5 μl of 2 mM dNTP, 50 ng DNA, 20 pmol of each of W1, W2, W3 and W4 primers. As the equipment required for the PCR reaction, the PCR Thermal cycler MP of Takara Co., Ltd. described above was used. After reacting at 94 ° C. for 1 minute, a series of 1 minute at 94 ° C., 1 minute at 69 ° C., and 2 minutes at 72 ° C. The reaction was performed 28 times, and finally, the reaction was performed at 72 ° C. for 4 minutes.
[0028]
(3) Electrophoresis analysis 5 μl of the reaction solution was taken, loaded on a 0.8% agarose gel, and subjected to electrophoresis at 100 V for 40 minutes. Φx174 / HaeIII was used as a DNA molecular weight marker. FIG. 2 shows the obtained results.
[0029]
In the milky queen, the sequences of the four primers W1, W2, W3 and W4 were all contained in the base sequence of the wx-1 (t) gene, and thus two bands of 741 bp and 469 bp were amplified by PCR. On the other hand, in a normal glutinous rice variety such as Koshihikari, the sequence of only the W1 primer was different from the base sequence of the Wx gene, and the 741 bp band was not amplified by PCR but only the 469 bp band.
[0030]
【The invention's effect】
From the above, it was confirmed that the low amylose rice varieties of the present invention, Milky Queen, and a band amplified by PCR using primers capable of discriminating between the same varieties and the normal rice varieties were used. Etc. can be distinguished from ordinary glutinous rice varieties.
[0031]
[Sequence list]

[0032]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 1: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 2: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 3: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 4: Synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the arrangement of primers W1 to W4 capable of detecting a DNA sequence specific to the wx-1 (t) gene and the principle of cultivar identification.
FIG. 2 is a diagram showing the results of a PCR reaction using an example of a primer capable of detecting a DNA sequence specific to the wxl-1 (t) gene. In the figure, K indicates Koshihikari and M indicates Milky Queen. The marker is φx174 / HaeIII.

Claims

A DNA fragment comprising at least the 27th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a base sequence consisting of at least 20 consecutive bases.

A primer comprising the DNA fragment according to claim 1.

PCR is performed on the DNA of the rice to be identified using the primer containing the DNA fragment according to claim 1, and the resulting reaction product is analyzed to determine whether it is a low-amylose rice variety Milky Queen and the same strain variety. How to identify.

The method according to claim 3, further comprising using a primer containing a DNA fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.

A primer comprising a DNA fragment having a nucleotide sequence consisting of at least 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a DNA fragment having a nucleotide sequence consisting of at least 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 The method according to claim 3, further comprising using a primer containing the primer.