JP3574845B2 - Antimicrobial material and method for enhancing antimicrobial activity - Google Patents
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- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌性素材及びこの素材を用いて抗菌活性を増強する方法に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、身の回りのあらゆる商品に安全性や清潔性が求められるようになってきた。若者を中心とした清潔志向が高まりを見せ、抗菌性を付与した製品が注目されている。生体組織や環境の汚染につながらない毒性の低い抗菌剤並びに抗菌性製品の開発が積極的に進められている。このように、近年、清潔指向、衛生指向が高まり、医療分野、衣料分野はもとより、トイレ用品、台所用品、鮮度保持フィルム及び除菌シート等の家庭用品分野、洗濯機、冷蔵庫、フロッピーディスクケース及び文房具等の家電・事務用品分野、並びに食品分野等に抗菌性素材が用いられている。
【０００３】
抗菌性素材で最も一般的なものは、銀、銅等の抗菌性金属を含んだものである。例えば、銀イオンを担持した抗菌性素材には、銀イオンが溶出することにより抗菌性が発現する溶出型のものが多い。この溶出型素材の担体としては、ゼオライト、粘土鉱物、ガラス等が知られている。このような銀イオンをはじめとする抗菌性金属の溶出型素材は、優れた抗菌性機能を持つ反面、金属が溶出して生体系、環境系を汚染する懸念があり、安全性には特に注意を払う必要がある。
【０００４】
従来の抗菌性粉末としては、銀、銅、亜鉛、あるいはこれらの錯体を含有するものが知られている（特開平9−263715号公報）。この素材は、強い抗菌性を持つ反面、抗菌性無機粒子から銀等の金属イオンが微量づつ長年にわたり流出するので、これが生体組織、あるいは環境を汚染する原因ともなりかねない。そのため、抗菌性素材から金属イオンが流れ出ることのない、安定した抗菌性機能を維持できる抗菌性素材の開発が望まれてきた。
【０００５】
抗菌性金属を含有するゼオライトを練り込んだ抗菌性樹脂組成物も知られている（特開昭63−265958号公報）が、コスト高となり、光のエネルギーで樹脂が着色や変色をしてしまうために、実用上問題となっていた。また、抗菌性を有する粉末塗料を用いる時には、焼付け時に150〜200℃まで加熱する工程を必要とするため、通常多く用いられる一般的な有機系の抗菌剤では抗菌機能の低下が問題であった。
【０００６】
従来、抗菌性繊維の製造方法として、例えば、抗菌性を示す金属又は金属化合物の微粒子を分散液とし、これを有機高分子材料と接触させ、有機高分子材料の表面を被覆し、該表面に付着せしめる方法（特開平7−97769号公報）や、繊維表面をコロイド粒子サイズの抗菌性金属と他の金属の酸化物とで被覆する方法（特開平7−109674号公報）等が知られている。しかしながら、これらの方法により得られる抗菌性繊維は、抗菌性金属が繊維表面に単に付着しているだけなので、使用中に脱落し、抗菌効果がなくなるという耐久性上の問題がある。
【０００７】
特開平3−2106号公報には、グアニル−O−メチルイソ尿素等と第４族遷移金属の塩との錯体を有効成分とする抗カビ・抗菌剤であって、活性の持続性に優れ、合成樹脂等に優れた分散性を有するものが開示されている。
【０００８】
特開平9−124425号公報には、Pt、Pd、Ruからなる群から選ばれる1種以上の金属を、活性炭等の担体に担持してなる抗菌材及びその製造方法が記述されている。例えば、これらの金属を前駆体であるヘキサクロロ白金（+4）酸等の金属錯体とした後、含浸法等により担体上に担持させ、水素等による還元を行い金属担持物とする方法が開示されている。
【０００９】
特開平4−18177号公報には、銀置換抗菌性ゼオライト粒子を含む合成繊維を染色加工と同時に又はその前後で1価又は2価の銅イオンで処理して、染色又は仕上加工しても抗菌効果が失活せず、優れた抗菌性を発揮する合成繊維を得る方法が開示されている。
【００１０】
そのほか、抗菌性繊維の製造方法として、抗菌性金属である銀をシリカ、アルミナ等の球状セラミックス微粒子の表面に担持させたものを繊維表面に付着させる方法、多孔質の天然ゼオライト又は銀イオンをゼオライトに吸着させたものを素材表面に被覆させる方法等が知られている。
【００１１】
しかし、上記したように抗菌性金属を物理的に繊維に付着させる方法は、得られた繊維製品から、使用中に抗菌性金属担持物が脱落し易いので、初期の抗菌効果を長期間持続させ難い等の問題がある。そのため、抗菌スペクトルが広くて、広範囲の病原性細菌の増殖を阻害することができると共に、抗菌活性の持続性に優れ、様々な工業資材として利用できる抗菌性物質を開発する必要性が益々増している。
【００１２】
また、多くの抗菌性物質が知られているが、これをどのようにして合成繊維、天然繊維等に化学的に結合させて耐久性に優れた抗菌性素材を調製するかは未解決であり、その解決が待たれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題を解決することにあり、耐久性に優れた抗菌性素材であって、病原微生物の増殖抑制機能を増強することができる抗菌性素材及びこの抗菌性素材を用いて病原微生物の抗菌活性を増強する方法を提供することにある。すなわち、抗菌活性に優れた配位子を含む生体高分子抗菌性素材や、抗菌性金属イオンが該抗菌性配位子に配位結合で結合してなる錯体を含む生体高分子抗菌性素材、及びこれらの抗菌性素材を用いて病原微生物の抗菌活性を増強する方法を提供することにある。これらの生体高分子からなる抗菌性素材の場合、使用中に抗菌性成分の脱落が少ないので、抗菌効果が持続し、耐久性に優れた抗菌性素材を容易かつ経済的に提供することができる。
【００１４】
また、本発明の課題は、使用環境の明暗条件により各種の細菌（以下、病原細菌、病原微生物と呼ぶこともある）の増殖を抑制する抗菌活性が変化する抗菌性素材及びこれを用いた抗菌活性増強方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、各種の細菌に対して広い抗菌性スペクトルを持ち、耐久性に優れた抗菌性有機高分子素材を開発すべく鋭意検討した結果、コバルト(Co)イオン、ルテニウム(Ru)イオンが抗菌活性を持つことを確認し、フェナントロリン等の配位子、さらに、コバルトイオン、ルテニウムイオン等が該配位子を含めた各種配位子に配位結合で結合した（本明細書では、以下、単に「結合する」あるいは「配位する」と表現する場合もある）錯体について、抗菌活性の発現の様子を観察し、試料環境の明暗の差で抗菌活性が変化することを明らかにすると共に、さらに、配位子、又は錯体を絹蛋白質、羊毛等の天然生体高分子に結合させることにより、耐久性に富む抗菌性素材を製造することできることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の抗菌性素材は、動物蛋白質からなり、この動物蛋白質に抗菌性成分としてフェナントロリン、及び基本骨格としてフェナントロリン骨格を有する化合物から選ばれた配位子が結合されて含まれていることを特徴とする。
【００１７】
本発明の抗菌性素材において、上記動物蛋白質は、絹蛋白質又は羊毛蛋白質であることを特徴とし、また、この絹蛋白質は、絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液中に溶解して得た絹フィブロイン水溶液から蒸発固化して得た絹フィブロイン膜であってもよい。
【００１８】
上記抗菌性成分が、上記配位子にさらにコバルトイオン又はルテニウムイオンが配位結合されてなる金属錯体であることを特徴とする。
上記金属錯体が、トリス ( １ , １０−フェナントロリン ) ルテニウム (II) クロライドハイドレート、及びジクロロ ( １ , １０−フェナントロリン ) 銅 (II) から選ばれた錯体であることを特徴とする。
【００１９】
また、上記抗菌性素材は、光を照射した条件下又は光を遮断した条件下での使用で抗菌活性を示すと共に、特に光照射条件下で使用することにより病原微生物の増殖抑制機能を増強し、かつ、持続せしめることができるものであることを特徴とする。
【００２０】
本発明の抗菌活性の増強方法は、上記抗菌性素材を光照射条件下で使用して、病原微生物の増殖抑制機能を増強し、かつ、持続せしめることを特徴とする。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書中で使用する用語を簡単に解説すると共に、発明の実施の形態及びその周辺技術について詳細に説明する。
【００２２】
本明細書において、「結合」とは、金属イオンが配位結合により配位子と化学的に結合することや、絹蛋白質等に導入されたEDTAと金属イオンとが化学的に結合することのみならず、配位子又は錯体と高分子素材とを組み合わせた場合等に、両者間に働く、化学結合以外の水素結合、イオン結合、疎水結合等の物理的な結合をも意味するものとする。
【００２３】
配位子とは、金属イオンが配位結合できる化合物の総称である。本発明において用いることができる抗菌性配位子としては、上記したような、フェナントロリン、基本骨格としてフェナントロリン骨格を有する化合物がある。なお、同じような抗菌性を有する化合物 として、シアノフェナントレン、フェナントリジン、又はサリチルアルデヒドがある。これらの配位子の中で、3つのベンゼン環から成り、金属イオンが配位可能なN 配位原子を 2 個含むフェナントロリン等が好ましく利用できる。すなわち、本発明で用いる優れた抗菌活性を持つ配位子の代表としては、1,10-フェナントロリン、並びに基本骨格がこれに類似した2,7-ジメチル-1,10-フェナントロリン、及び4,7-フェナントロリンがある。なお、配位子のフェナントレン自体には抗菌活性がないが、この化合物にシアノ基が付いた9-シアノフェナントレンには抗菌活性が発現する。
【００２４】
本発明で用いることのできる抗菌性金属イオンには、コバルトイオン、ルテニウムイオン自体に加えて、これら金属イオンの由来は問わず、塩化物、硝酸塩、炭酸塩、チオシアン酸塩等も含まれ、例えば、硝酸コバルト、炭酸コバルト、塩化コバルト、チオシアン酸コバルト、硝酸ルテニウム、炭酸ルテニウム、塩化ルテニウム、又はチオシアン酸ルテニウム由来のコバルトイオン又はルテニウムイオンが含まれる。
【００２５】
上記抗菌性金属イオンが配位結合で配位した錯体は、配位子自体には抗菌活性が見られなくとも上記抗菌性金属イオンが配位結合で配位した錯体は優れた抗菌活性を示す。例えば、トリフェニルホスフィンには抗菌活性はないが、この配位子にコバルトイオン等が配位すると抗菌活性が現れる。この錯体の場合の配位子には、上記した抗菌活性を有する配位子は勿論のこと、以下述べるような、金属イオンと配位結合で結合する配位子であればいずれの配位子であっても使用することができる。配位子には金属イオンが配位するいくつかの配位基がある。ここで、配位基とは、一般に、-NH2、-NH-、-CONH2、-CONH-、-SH、-COOH、-OH基等や、窒素、硫黄、酸素原子等を含む基を持つ化合物であり、金属イオンはこのような配位子と配位結合で結合する。コバルトイオンやルテニウムイオン等の金属イオンそのものでも抗菌活性があるが、コバルトイオンやルテニウムイオンの錯体とすれば、さらに優れた抗菌活性を発現する。
【００２６】
なお、抗菌活性を発現する錯体を形成し得る配位子としては、一般に、上記配位子以外にも、例えば、2,2'-ビピリジン、EDTA、トリフェニルホスフィン、アセチルアセトン酸、トリフェニルホスフィン、エチレンジアミン、5,10,15,20-テトラフェニル-21H,23H-ポルフィン、サリチルアルデヒド、N,N'-ビス(サリチリデン)-1,2-フェニレンジアミン、ビス(サリチリデンイミニナート-3-プロピル)メチルアミン、フタロシアニン、1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25-ヘキサデカフルオロ-29H,31H-フタロシアニン、1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、テトラフェニル等が使用できる。なお、コバルトイオン又はルテニウムイオンのいずれかと配位結合した配位子化合物である本発明で用いる金属錯体の他に、一般に、シアノコバラミン ( ビタミン B 12 ) や、コバルト (III) アセチルアセトナート、クロロトリス ( トリフェニルホスフィン ) コバルト (I) 、トリス ( エチレンジアミン ) コバルト (III) クロライドジハイドレート、 5,10,15,20- テトラフェニル -21H,23H- ポルフィンコバルト (II) 、ビス ( サリチルアルデヒド ) コバルト (II) ジハイドレート、 N,N'- ビス ( サリチリデン )-1,2- フェニレンジアミノコバルト (II) モノハイドレート、ビス ( サリチリデンイミニナート -3- プロピル ) メチルアミノコバルト (II) 、コバルト (II) フタロシアニン、コバルト (II)1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25- ヘキサデカフルオロ -29H,31H- フタロシアニン、 [1,2- ビス ( ジフェニルホスフィノ ) エタン ] ジクロロコバルト (II) 、テトラフェニルホスフォニウムアセテートジクロロジオキソルテナート (VI) 、ジクロロテトラキス ( トリフェニルホスフィン ) ルテニウム (II) 、及びトリス (2,2'- ビピリジル ) ルテニウム (II) クロライドヘキサハイドレート等がある。
【００２７】
本発明によれば、以下述べるように、上記配位子や、錯体を含んだ絹糸又は絹フィブロイン膜等の高分子素材を調製して提供できる。なお、コバルトイオン、ルテニウムイオンと結合した絹糸又は絹フィブロイン膜等の高分子素材も調製して提供できる。
【００２８】
配位子を含んだ絹フィブロイン膜は次のようにして調製できる。例えば、まず、家蚕絹糸を臭化リチウムなどの中性塩の水溶液中で完全に溶解させた後、この水溶液をセルロース製透析膜に入れて、所定の温度で蒸留水と置換することにより不純物を除去し、純粋な絹フィブロイン水溶液を調製する。一方、1,10-フェナントロリンのような配位子の所定量を、DMF等の有機溶媒と水とを当量ずつ含む混合溶液に溶かす。得られた混合水溶液を上記絹フィブロイン水溶液に加え、必要によりセルロース製透析膜で透析する。この絹フィブロイン水溶液をポリエチレン膜上に広げて蒸発乾固させると、配位子を含んだ絹フィブロイン膜が製造できる。
【００２９】
金属イオンを含んだ絹フィブロイン膜は次のようにして調製できる。例えば、上記したようにして得た純粋な絹フィブロイン水溶液を、硝酸コバルト又は硝酸ルテニウム水溶液とイオン強度調整用の中性塩水溶液（例えば、硝酸カリウム水溶液）との混合水溶液に加えて、イオン強度を所定の範囲(例えば、I=0.1〜1）にし、この溶液のpHを所定の値に調整し、一定の温度で放置後、所望により透析膜を用いて透析し、この溶液をポリエチレン膜上に広げて蒸発乾固させると、金属イオンを含んだ絹フィブロイン膜が得られる。
【００３０】
上記のようにして反応系のイオン強度を一定にして絹フィブロインに金属イオンを配位させる反応を進めるために、イオン強度調整用の中性塩を加えるが、このカチオンは、特に制限されるわけではなく、例えば、K,Na,Ca,Mg等が使用できる。通常は、配位子に強く結合してしまわないカリウム塩が特に好ましい。この中性塩の添加量は、金属イオン濃度に比べて過剰にすることが望ましく、濃度的には、50-100 mMが適当であり、特に好ましくは 70-90 mMである。銀イオンと配位子との化学反応に着目して考えると、抗菌性金属塩の使用量は、優れた抗菌性を示す銀イオンの場合では、0.1-20 mM程度の微量でよいし、この添加量は用途に合わせて自由に変えることができる。一価の正イオンを持つ銀イオンでは、イオン強度調整用の中性塩を加える必要があるが、二価の正イオンを持つ銅イオンでは、イオン強度調整用の中性塩は不要である。価数の異なる金属イオンを配位子や配位基に結合させるには、イオン強度を一定にする必要があるため、所望により中性塩を加えるとよい。Fe,Cu,Zr,Zn等の抗菌性が中程度の金属塩では、添加すべき抗菌性金属イオンの量は多い方が望ましく、通常は、1-70 mMでよい。更に、この反応系のpHを、アルカリ水溶液添加によりpH 5-12(好ましくは、7-12)に調整しておくことが望ましい。アルカリ水溶液として用いられるアルカリ剤は、従来公知のものはいずれも利用できる。たとえば、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が挙げられ、好ましくはアンモニア水溶液が挙げられる。
【００３１】
金属イオン含有絹フィブロイン膜の場合において、絹フィブロイン膜にコバルトイオンが結合しているかどうかは、次のようにして実証できる。上記したようにイオン強度調整用に硝酸カリウムを加えた絹フィブロイン水溶液のpHを所定の値に調整した水溶液試料について、電子スペクトルを測定すると、絹フィブロイン水溶液単独ではみられない大きなピークが457nmに現れる。これは、d-d遷移に基づくものであり、絹フィブロインとコバルトイオンとが化学的に結合していることを示している。コバルトイオンの代わりにルテニウムイオンを用いた場合も同様である。そのため、絹フィブロイン膜を硝酸コバルト水溶液又は硝酸ルテニウム水溶液に浸漬することによっても、コバルトイオン又はルテニウムイオンを絹フィブロイン膜に結合させ得るものと考えられる。
【００３２】
絹糸や絹フィブロイン膜のような高分子素材と抗菌性金属イオンとの間に強固な結合を形成するためには、金属イオンと結合できるEDTAを高分子素材に予め導入しておき、導入したEDTA部位に抗菌性金属イオンを結合させることにより可能となる。EDTAは金属イオン定量用に用いられるものであり、金属イオンと結合する働きを持っている。そのため、DMF等の有機溶媒に溶解したEDTA酸無水物が絹蛋白質等の高分子素材とアシル化反応を起こし、その結果、導入されたEDTAにも金属イオンを結合する働きがあるため、EDTA加工された絹糸や絹フィブロイン膜等の高分子素材にルテニウムイオン等の金属イオンが同様に結合する。
【００３３】
素材に導入したEDTAを介して金属イオンが結合している絹フィブロイン膜や絹糸の製造方法の概要は次の通りである。ルテニウムイオン又はコバルトイオンを絹糸や絹フィブロイン膜のような高分子素材に結合させるために、ルテニウムイオンやコバルトイオンを試料と結合させるに先だち、上記したように、試料にEDTA酸無水物を導入する。EDTA酸無水物としては、エチレンジアミン四酢酸２無水物[4,4'-エチレンビス(2,6-モルホリンジオン)](Aldrich社製, 33,204-6)（以下、EDTA酸無水物と略記することもある。）を用いる。
【００３４】
EDTA酸無水物を高分子素材の反応基と化学的に結合させるためには、まず、EDTA酸無水物をジメチルスルホキシド（以下、DMSOと略記する。）、又はN,N'-ジメチルホルムアミド（以下、DMFと略記する。）等の有機溶媒に溶解させ、高分子素材をこの溶液系に浸漬し、60-80℃の温度で1時間〜5時間かけてアシル化反応させればよい。EDTA酸無水物は水の存在下で反応してしまうので、DMSO又はDMFは脱水したものであることが望ましい。高分子素材に導入できるEDTA量は反応温度と反応時間により決まる。反応温度が低い場合には反応時間を長めに設定する必要があるし、反応温度が高すぎると反応が早すぎるためEDTA導入量が制御しにくい。そこで、最も好ましい反応条件は、家蚕絹糸では、75℃、2-4時間、羊毛では75℃、1-2時間である。
【００３５】
EDTA酸無水物は、絹蛋白質や羊毛蛋白質等の生体高分子の分子側鎖のリジン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)等の反応性に富む塩基性アミノ酸残基とアシル化反応を起したり、セリン、チロシン、スレオニン等のフェノール性の水酸基を持つアミノ酸残基とも反応する。羊毛には、反応性に富むこれらの塩基性アミノ酸残基やフェノール性水酸基の総量が、絹蛋白質に比べて、ほぼ一桁多く含まれるので、羊毛を加工する際のEDTA酸無水物濃度は絹蛋白質の場合に比べて、希薄でも良く、また、反応時間は短時間でもよい。
【００３６】
反応終了後は、DMF等の有機溶媒で試料の高分子素材を洗い、試料に付着した未反応物を除去し、最終的には水で洗う。このようにして高分子素材とEDTA酸無水物とをアシル化反応で結合させることで、後の反応で抗菌性金属イオンと結合するEDTAが高分子素材に容易に導入できる。
【００３７】
高分子素材に導入したEDTAに抗菌性金属イオンを結合させるには次のようにするとよい。EDTAを導入した試料を室温の抗菌性金属塩水溶液に5-40時間浸漬することで、金属イオンを高分子素材に結合させることができる。効率的に金属イオンを結合させるには金属塩水溶液のpHを5-12、好ましくは7-12に調製するとよい。通常は、金属塩水溶液に1Nのアンモニア水を加えてpH調整をすることにより金属イオンの結合能力が高まる。金属塩水溶液濃度は、0.1-30 mMでよく、好ましくは0.1-10 mMである。ここで着目しなくてはいけないことは、EDTAを結合する前後における絹蛋白質、羊毛繊維への金属イオンの結合量と金属塩水溶液のpHとの関係である。
【００３８】
加工していない絹蛋白質、羊毛ケラチンの場合、家蚕フィブロインを構成するグルタミン酸(Glu)、アスパラギン酸(Asp)等の酸性アミノ酸残基のCOOH基が強酸性のpH領域では解離しないため金属イオンが簡単には結合しないが、pH3-5.6程度の強酸性〜弱酸性のpH領域では、COOH基が解離して金属イオンと結合するCOO−となるため、次第に金属イオンが結合するようになる。また、金属イオンの結合部位となり得るアミノ基は、酸性〜弱酸性のpH領域では解離しないが、弱アルカリ性となると脱プロトン反応が起こり金属が結合し易くなる。一方、EDTA酸無水物で化学修飾した蛋白質繊維は各種のpH領域で上記の反応が起こる他、反応の結果試料に導入されたEDTAのCOOH基が環境pHの違いにより次第に解離し、完全にCOOH基が解離する時点で金属イオンの結合量が次第に増加する。
【００３９】
錯体を含んだ絹フィブロイン膜は、上記金属イオンや配位子を含んだ絹フィブロイン膜の場合と同様に製造できる。その際、例えば、金属イオンとして、コバルトイオンやルテニウムイオンを利用できるし、配位子として、例えば、2,2'-ピピリジン、1,10-フェナントロリン、EDTA、トリフェニルホスフィン等を利用できる。
【００４０】
例えば、配位子として1,10-フェナントロリンを用いて、所望の錯体含有絹フィブロイン膜を製造するための概要は次の通りである。1,10-フェナントロリンに対して等モルのコバルト又はルテニウムの硝酸塩等をDMF等の有機溶媒に溶かしたものに等量の水を加えて、混合溶液を調製し、所定の温度に放置した後、このコバルト又はルテニウムの硝酸塩水溶液を、別に調製した絹フィブロイン水溶液に加え、冷蔵庫で静置する。所定の時間経過後、得られた溶液をポリスチレン膜上に広げ乾燥固化させると、錯体含有抗菌性絹フィブロイン膜が調製できる。この絹フィブロイン膜の水不溶化は、例えば、水：メタノール等の混合溶媒に浸漬して行う。得られた試料について、以下詳細に述べるようなトマトかいよう病細菌、大腸菌に対する菌増殖阻害実験を行い、抗菌活性を検討する。一般に、抗菌性の配位子やコバルトイオン、ルテニウムイオン等の金属イオンは病原細菌に対してほぼ同一の抗菌活性を示すが、これらの金属イオンが配位結合で配位した錯体の抗菌活性は相乗的に向上する。
【００４１】
また、上記錯体に光を照射すると（本明細書中では、明条件下と略記することもある。）、光を照射しない場合（暗条件下と略記することもある。）に比べて抗菌活性は増強する場合がある。このような錯体は、明条件下で用いる抗菌性商品などの素材として有用である。
【００４２】
本発明において、試料を明条件下に置くことにより、抗菌活性を増強させるための光としては、およその波長が400-750nmの可視光であっても、1〜400nmの紫外線であっても、また、750nm〜1mmの赤外線であっても同様に利用できる。これらの光のうち、抗菌活性を増強させるための最も好ましい光は紫外線である。本明細書中で用いる暗条件下とは、病原微生物の増殖実験が光を遮った環境下で行われることを意味する。この暗条件は、黒い布を用いて光を遮断することにより簡単に設定できる。
【００４３】
本発明で利用できる高分子素材である生体高分子としては、昆虫由来、例えばカイコ由来の絹蛋白質繊維、この繊維から得られる絹蛋白質、羊毛繊維、羊毛ケラチン、動物由来コラーゲン、クモの糸、又は海性蛋白質である足糸等の蛋白質素材等がある。さらに、木綿等のセルロース繊維であってもよい。絹蛋白質繊維としては、例えば、家蚕(Bombyx mori)幼虫から得られる家蚕絹糸の他に、野蚕に属する柞蚕、天蚕、エリ蚕、ムガ蚕、シンジュ蚕の幼虫から得られる野蚕絹糸、又はこれらから得られる繊維製品の何れであっても使用できる。また、絹蛋白質としては、カイコが吐糸して作る繭繊維の外側を膠着するセリシン、又は該セリシンを除去して得られる絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液中に溶解した後、セルロース製の透析膜を用いて透析して得られる水溶性絹フィブロイン、又はカイコ体内より取り出した絹糸腺内の水溶性絹セリシンもしくは水溶性絹フィブロインであってもよい。好ましくは、家蚕絹糸、柞蚕絹糸等の野蚕絹糸、羊毛繊維等の動物蛋白質繊維が挙げられる。繊維の形態は、特に制限されず、綿、糸、織物、編物、不織布等の繊維集合体或いは繊維製品のいずれであってもよい。
【００４４】
なお、絹フィブロイン繊維を溶解するには、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、臭化リチウム等一般に知られた中性塩が利用できる。絹糸の溶解性を高め、未変性状態に近い絹フィブロインを製造するためには、溶解性の高いリチウムイオンを含む中性塩が望ましく、臭化リチウム等が特に好ましく用いられる。絹フィブロイン繊維を溶解する前に、柞蚕あるいは天蚕等から得られる野蚕繭糸を、例えば、繭糸重量に対して50倍量の0.1％過酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、98℃で1時間処理してセリシンを予め除去しておく必要がある。セリシンの除去された野蚕絹フィブロイン繊維をチオシアン酸リチウム等の溶解性の高い中性塩で溶解し、さらにセルロース製透析膜にいれて純水で透析することで野蚕絹フィブロイン水溶液が調製できる。
【００４５】
【実施例】
次に、本発明を実施例、比較例及び参考例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４６】
以下の実施例、比較例及び参考例では、植物性病原細菌として、普遍的な植物性病原細菌の代表であって、耐性菌が出現しやすく、多くの植物を犯す多犯性の腐敗病菌であり、植物性病原細菌の中でも数少ないグラム陽性菌としてのトマトかいよう病細菌菌（学術名：Corynebacterium michiganese pv. michiganese）と、動物由来の病原細菌である大腸菌を選んだ。
【００４７】
＜トマトかいよう病細菌の増殖阻害評価＞
実施例等の細菌に対する抗菌活性評価は下記の方法により行った。
【００４８】
細菌に対する抗菌活性検定法：
加熱溶解後55℃に保持した半合成脇本培地又はキングＢ培地25mLと、検定菌の胞子液（濃度10９−１０個／mL）2mLとを混合し、この混合物をシャーレに流し込んで平板状に固めた。この菌液混合平板培地上に約2cmの長さ、0.1cmの幅に切断した繊維状の検定試料を置き、ピンセットで注意深く検定試料の両端を培地に埋め込み、試料全体を培地に密着させた。この培地を20〜25℃に保ち、培養2日目における試料の外周に現れる透明な阻止円（病原細菌の増殖が阻止された領域）の直径を抗菌活性の指標としてmm単位で表示した。
【００４９】
＜大腸菌の増殖阻害評価＞
上記トマトかいよう病細菌の増殖に及ぼす阻害効果の評価方法と同様の方法で大腸菌の増殖に及ぼす阻害効果を評価した。大腸菌として、PROMEGA社製のStrain: JM109を使用し、培地として、LB培地、LB寒天培地を使用した。蒸留水100mL当たりのLB培地組成は次の通りであった。ポリペプトン1.0g、酵母エキス0.5g、塩化ナトリウム1.0gの組成から構成された培地であり（LB寒天培地の場合は、さらに、寒天1.5g）、滅菌後の培地のpHを7.0-7.4に調整した。具体的な培養手法は次の通りである。
【００５０】
(i)LB培地を用い、培養温度35℃で振盪しながら、一昼夜、大腸菌を増殖させた。
【００５１】
(ii)約60℃で溶解したLB寒天培地と、増殖した前記大腸菌の入ったLB培地を等量宛混合し、滅菌済みの容器に注入した。
【００５２】
(iii)混合培地が固化した後、被検試料を培地表面に置いた。
【００５３】
(iv)一定時間の培養後、阻止円の大きさを観察した。評価の判断基準は、トマトかいよう病細菌の場合と同様とした。
【００５４】
＜金属イオンの耐久性評価試験法＞
高分子素材とひとたび結合した金属イオンが長期間安定して結合しているかどうかを次のようにして評価した。すなわち、金属イオンの結合した被検試料をpH3.8、25℃の酢酸水溶液中に浸漬し、3日間静置した後、試料を取り出して室温で風乾させた。この風乾させた試料について、上記の方法で抗菌活性を評価した。ここで、pH3.8の酢酸水溶液中での浸漬処理前後で抗菌活性の変化が少ないもの程高い耐久性を持つ素材といえる。
【００５５】
＜光照射環境＞
トマトかいよう病細菌及び大腸菌の増殖阻害に及ぼす各種金属錯体の阻止効果を調べた。抗菌実験は、蛍光灯下（ナショナル10W）、30cmの位置に培養器を置いた明条件区と、遮光した暗条件区の2通りについて行った。これらの区を以下、明条件、暗条件と表記する。
【００５６】
＜金属イオンの定量＞
試料に含まれる金属イオンの定量は、パーキンエルマー社製の原子発光分析装置(Inductive Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer(ICP-AES))plasma 400型を用いて行った。測定に先だって、CEM社製のMicrowave Digestion System Mod. MDS-81D を用い、5〜20mgの金属イオン含有の試料を65%, 2mLの硝酸で完全に分解させた後、ICP-AES分析の直前に、これに10mL蒸留水を加えて金属イオンの定量を行った。分析結果は4回の測定の平均値で示した。
参考例1：配位子の抗菌活性
トマトかいよう病細菌の増殖に及ぼす表1記載の各種配位子の抗菌活性を暗条件下で評価した。試料の外周に現れる阻止円（病原細菌の増殖が阻止された領域）を抗菌強度の指標としてmm単位で表示した。得られた結果を表1に示す。
【００５７】
表１ 配位子の抗菌活性（トマトかいよう病細菌：暗条件下）
表1の結果から、金属イオンが配位可能な配位子のうち、フェナントロリン、あるいはフェナントロリンを基本骨格として有する配位子と共に、9-シアノフェナントレリン、フェナントリジン、サリチルアルデヒドが優れた抗菌活性を示すことが分かる。なお、フェナントレンは抗菌活性を示さないが、この配位子にシアノ基(CN)が入った9-シアノフェナントレンには抗菌活性が見られる。
【００５８】
また、表1の結果から、試料と抗菌活性について、フェナントロリン類を下記の3グループ（１、２、３）に分類して論議することにする。
【００５９】
１．ベンゼン環が3つあり、配位原子のNが2つある1,10-フェナントロリンと同じ基本構造を持つ配位子で官能基が異なる配位子化合物
２．化合物4,7-ジメチル-1,10-フェナントロリン
３．4,7-フェナントロリン
上記１、２、３はいずれも抗菌活性を示し、１＞２＞３の順序で抗菌活性が高い。
参考例2：金属錯体の抗菌活性
トマトかいよう病細菌の増殖に及ぼすコバルト錯体の抑制効果を参考例1と同様にして評価した。抗菌実験は、上記「光照射環境」に記載のように、蛍光灯下、30cmの位置に被測定試料を置いた明条件区と、遮光した暗条件区の2通りについて行った（これらの区を明条件、暗条件と表記した）。得られた結果を表２に示す。
【００６０】
表２ 金属錯体の抗菌活性(トマトかいよう病細菌：明・暗条件下)
表２から明らかなように、コバルトイオンが配位した錯体は、光を照射した明条件下で抗菌活性が増大するものがほとんどである。また、トリフェニルホスフィンには抗菌活性がみられないが(表１)、この配位子にコバルトイオンが配位したクロロトリス(トリフェニホスフィン)コバルト(I)は高い抗菌活性を示し、特に明条件下で高い抗菌活性を示すこと分かる。
【００６１】
次に、ルテニウム錯体の抗菌性を参考例2と同様にして調べた。得られた結果を表3に示す。
【００６２】
表３ ルテニウム錯体の抗菌活性（トマトかいよう病細菌：明・暗条件下）
【００６３】
表４ コバルト、ルテニウム錯体の抗菌活性（大腸菌：明・暗条件下）
【００６４】
また、ルテニウム錯体がコバルト錯体と同様に優れた抗菌活性を有すること、光の明条件下で抗菌活性が顕著に増大することが明らかであった。
【００６５】
また、コバルト錯体、ルテニウム錯体が大腸菌の増殖を阻害することも明らかであった。
【００６６】
1,10-フェナントロリン（表1）にルテニウムイオンが配位したトリス(1,10-フェナントロリン)ルテニウム(II)クロライドハイドレート（表3）はともに優れた抗菌活性を示す。
参考例3：金属硝酸塩の抗菌性評価
上記参考例で抗菌性が示唆されたコバルトやルテニウムそのものが抗菌性を示すのか、又は金属イオンとなって流出したときに抗菌性を示すのかをこれら金属の硝酸塩を用いて検討した。すなわち、コバルトやルテニウムの硝酸塩によるトマトかいよう病細菌の増殖抑制効果を明・暗条件下で調べた。得られた結果を表5に示す。
【００６７】
表５ 金属硝酸塩、硫酸塩、塩化物の抗菌活性（トマトかいよう病細菌：明・暗条件下）
*2：塩化コバルト6水和物
（ ）内の符号A及びBは、それぞれ、抗菌性評価試験の結果、阻止円の現れ方がハロー状となり不明瞭なもの(A)、及び明瞭なもの(B)を意味する。
表5から明らかなように、コバルト、銀、銅、及びルテニウムの硝酸塩や塩化物が病原微生物の増殖を抑制することが分かる。コバルト塩に着目すると、明条件下において抗菌活性が最も優れているものは硝酸塩、次いで硫酸塩、最後に塩化物の順である。また、硝酸塩に着目して抗菌活性をみると、ルテニウムイオンが最も優れた抗菌活性を示し、次いで、銀イオン、コバルトイオン、銅イオンの順になっている。
参考例4：金属イオンを結合させた高分子素材の調製と抗菌活性評価
20%EDTA酸無水物を含むDMF溶液中に絹糸又は羊毛を加え、75℃で異なる時間アシル化反応を行い、EDTAの導入量が違う試料を調製した。表6において、例えば、羊毛−EDTA(5.92%)及び絹糸−EDTA(10.31%)は、EDTAが羊毛及び絹糸に対して試料重量基準で、それぞれ5.92、10.31重量%化学的に導入されたことを意味する。
【００６８】
次に、これらの試料を、アンモニア水でpH11.4に調整した硝酸コバルト、硝酸ルテニウム、硝酸銀、又は硝酸銅等の金属塩水溶液に浸漬することにより、試料に金属イオンを結合させた。また、EDTA未加工の絹糸、羊毛についても、同様にして金属塩水溶液に浸漬することで金属イオンを結合させた。表6において、例えば、羊毛−EDTA(5.92%)−コバルト、絹糸−EDTA(10.31%)−コバルトとは、EDTAを所定量導入した上記試料を硝酸コバルト水溶液に浸漬し、コバルトイオンをEDTAに結合させた試料を意味する。
【００６９】
また、上記試料の他に、絹フィブロイン膜を用いて、上記と同様にして金属イオンを結合させた。まず、2.5gの家蚕絹糸を55℃の8.5M臭化リチウム水溶液20mL中で完全に溶解させた後、この水溶液をセルロース製透析膜に入れて、5℃で5日間蒸留水と置換することにより不純物を除去し、純粋な絹フィブロイン水溶液を調製した。かくして得られた絹フィブロイン水溶液に蒸留水を加え、絶乾濃度が0.4％となるように絹フィブロイン水溶液の原液を調製した。また、0.02mL/Lの金属塩水溶液（硝酸コバルト、硝酸ルテニウム、硝酸銀、又は硝酸銅水溶液）1mLと所定量の硝酸カリウム水溶液1mLとを混合し、混合水溶液を調製した。次いで、この混合水溶液に上記0.4％絹フィブロイン水溶液10mLを加え、蒸留水で全液量を25mLとした（イオン強度I=0.1）。この水溶液に1Nのアンモニア水を加えてpHを11.4とした後、5℃で12時間放置し、次いで、セルロース製透析膜を用いてpH11.4のアンモニア水で透析した。得られた水溶液をポリエチレン膜上に広げ、室温で水分を蒸発させ、金属イオンを含んだ、すなわち金属イオンの結合した絹フィブロイン膜を得た。
【００７０】
このようにして得た各種の試料について、トマトかいよう病細菌及び大腸菌に対する抗菌活性（明・暗条件下）の測定を行った。得られた結果をそれぞれ表６及び７に示す。
【００７１】
表６ 金属イオンが結合した高分子素材の抗菌活性（トマトかいよう病細菌：明・暗条下）
【００７２】
表７ 金属イオンが結合した高分子素材の抗菌活性（大腸菌：明・暗条件下）
表6及び7の結果から、羊毛、絹等の蛋白質繊維や、絹フィブロイン膜に直接又はEDTAを介して金属イオンを導入したものが、病原細菌の増殖を抑制する活性を持つこと、明条件下では錯体のみの場合と同様に抗菌活性が増強していることが分かる。天然蛋白質繊維にEDTAを化学結合したものにコバルトイオン、ルテニウムイオンを結合させたものは優れた抗菌活性を示す。絹フィブロイン膜にコバルトイオン、ルテニウムイオンを結合させた膜状試料も抗菌活性を示す。コバルトイオンの代わりにルテニウムイオンを結合させた方がより優れた抗菌性を示した。
【００７３】
表6の試料、羊毛−EDTA(5.92%)−コバルト、絹糸−コバルト、絹糸−EDTA(10.31%)−コバルト、絹フィブロイン−コバルト膜、絹フィブロイン−ルテニウム膜、絹糸−EDTA(17.18%)−ルテニウムについて、上記した「金属イオンの耐久性評価試験法」に基づいて試験をした。試験後の試料は、いずれも抗菌性が試験前の試料とほとんど変わらず、耐久性は良好であった。
実施例 1：金属錯体を固定化した高分子素材の調製と抗菌活性
絹フィブロイン中に各金属の錯体を含んだ試料を調製するために、まず、コバルトの錯体の溶解条件を検討した。コバルトの錯体の中から、抗菌活性に優れた、クロロトリス(トリフェニルホスフィン)コバルト(I)、コバルト(III)アセチルアセトナート、ビス(サリチルアルデヒド)コバルト(II)ジハイドレートの3種類の化合物を選び、水、DMF中での溶解度を調べた。なお、コバルトの錯体の溶解性は、5mLの水又はDMFに錯体2mgを投入し、25℃で20分静置した際の錯体の溶解状態を目視により簡易に評価したものである。その評価は次の3段階評価によって行った。
【００７４】
○：投入後速やかに溶解し、粉末状態が確認されなくなる。
【００７５】
△：粉末の一部が認められるだけで、ほとんどの試料は溶解して見えなくなる。
【００７６】
×：錯体は試験管の底に沈殿し、全く溶解する形跡が認められない。
得られた結果を表8に示す。
【００７７】
表８ コバルトの錯体の溶解性
【００７８】
次いで、上記結果に基づいて、絹フィブロイン膜中に配位子を含んだ試料を調製した。2.5gの家蚕絹糸を55℃の8.5M臭化リチウム水溶液20mL中で完全に溶解させた後、この水溶液をセルロース製透析膜に入れて、5℃で5日間蒸留水と置換することにより不純物を除去し、純粋な絹フィブロイン水溶液を調製した。この絹フィブロイン水溶液に蒸留水を加え、2%絹フィブロイン水溶液とした。一方、1,10-フェナントロリン(10mg=0.0555mmol)をDMFと水とを当量ずつ含む200μLの混合溶液に溶かした。この水溶液を5mLの上記2%絹フィブロイン水溶液に加え、セルロース製透析膜で透析した。このようにして得られた溶液をポリスチレン膜上に広げ、乾燥固化させることにより配位子結合抗菌性絹フィブロイン膜を調製した。
【００７９】
また、上記と同様にして、絹フィブロイン膜中に、銅、コバルト、ルテニウムの錯体を含んだ試料を調製した。1,10-フェナントロリン(10mg=0.0555mmol)に対して等モルの金属塩（硝酸銅、硝酸ルテニウム、又は硝酸コバルト）をDMF(100μL)に溶かし、これにDMFと等量の水(100μL)をさらに加え、室温で1日放置した。その後、得られた金属錯体水溶液を上記と同様にして調製した2%絹フィブロイン水溶液(5mL)に加え、さらに冷蔵庫内に1日静置した。このようにして得られた溶液を、セルロース製透析膜を用いて透析を行った後、又は透析を行うことなく、ポリスチレン膜上に広げ、乾燥固化させることにより金属錯体結合抗菌性絹フィブロイン膜を調製した。
【００８０】
上記の抗菌性絹フィブロイン膜はまた、市販の1,10-フェナントロリン錯体をDMFと水とからなる200μLの混合溶液(DMFと水との体積比=1:1)に溶かし、得られた混合溶液を2%絹フィブロイン水溶液(5mL)に加え、この水溶液をポリスチレン膜上に広げ、乾燥固化させることによっても得られる。
【００８１】
上記のようにして得られた膜を、水：メタノールの体積比1：1の混合溶媒に室温で5分間浸漬して、水不溶性にした。得られた不溶性試料についてトマトかいよう病細菌、大腸菌に対する菌増殖阻害実験を行った。得られた結果を表9〜11に示す。
【００８２】
表９ 金属錯体を含む絹フィブロイン膜の抗菌活性（トマトかいよう病細菌：明・暗条件下）
NTは抗菌性評価試験を行わなかったもの。
【００８３】
表１０ 金属錯体を含む絹フィブロイン膜の抗菌活性（トマトかいよう病細菌：明・暗条件下）
【００８４】
表１１ 金属錯体を含む絹フィブロイン膜の抗菌活性(大腸菌：明・暗条件下）
表9〜11から明らかなように、配位子や金属錯体を絹フィブロイン蛋白質に坦持させることにより抗菌機能を持った膜を製造することが可能となった。また、膜調製時に透析を行うことにより金属錯体が流失し、抗菌活性が低下する傾向がある。
【００８５】
表9〜11の試料のうち、ジクロロ（1,10-フェナントロリン）銅(II)、トリス(1,10-フェナントロリン)ルテニウム(II)クロライドハイドレート、クロロトリス(トリフェニルホスフィン)コバルト(I)を含有した絹フィブロイン膜について、上記した「金属イオンの耐久性評価試験法」に基づいて、pH3.8、25℃の酢酸水溶液に浸漬し、3日間静置した後、試料を取り出し室温で風乾させて、トマトかいよう病細菌に対する抗菌活性を評価した。得られた結果を表12に示す。
【００８６】
表１２ 金属錯体を含む絹フィブロイン膜の抗菌活性(トマトかいよう病細菌：明条件下）
参考例 5：絹フィブロインと金属イオンとの錯体形成の検証
水溶液状態のコバルト錯体化絹フィブロインのpH滴定曲線を文献（高分子論文集、51巻、167-171(1994))に示された方法で求めた。得られた結果において、消費されたOHの量を金属1イオン当たりに換算してpHに対してプロットすると、複数の階段状ステップ部位が認められたことから、絹フィブロインに金属イオンが結合していることが確かめられた。
【００８７】
次に、金属イオン含有絹フィブロイン水溶液中において絹フィブロインと金属イオンとが錯体を形成しているかどうかの検証を行った。
【００８８】
金属イオンの強度を調整するために、3.6mMの金属イオン(コバルトイオン、ルテニウムイオン)と50mM硝酸カリウムとを含む0.31重量%の絹フィブロインの水溶液のpHを、アンモニア水溶液で11.4に調整した。このようにして調整した金属イオンを含む絹フィブロイン水溶液を1mLの石英製の角形セルに入れ、電子スペクトル測定装置（日立製作所製、U-3200）で吸光度を測定した。測定の波数範囲は200〜500nmであった。コバルトイオン又はルテニウムイオンを含む絹フィブロインの水溶液の電子スペクトルに、絹フィブロインのみ、及び金属イオンのみの水溶液では全く見られない新しい吸収が出現した。すなわち、457nmに強度の大きなピークが出現した。この吸収ピークはd-d遷移に基づくものであり、絹フィブロインと金属イオンとが錯体を確かに形成していることを示すものである。従って、金属イオンを含む絹フィブロイン水溶液を乾燥固化させて得た絹フィブロイン膜の場合も金属イオンが錯体を形成している。
実施例2
ジクロロ(1,10-フェナントロリン)銅(II)水溶液に絹フィブロイン水溶液を加え、銅の金属錯体を絹フィブロインに結合させた試料において、金属錯体が絹フィブロイン膜から溶出するかどうかの安定性（耐久性ともいう）を次のようにして評価した。なお、絹フィブロインと結合しない、錯体、銅イオン、又は配位子を混合水溶液系から除去する処理の前後で、絹フィブロインに含まれる金属錯体の耐久性を評価するため、銅の金属錯体水溶液と絹フィブロイン水溶液とを混合した後、セルロース製透析膜を用いて純水で置換操作を行った。透析処理を行った混合水溶液、行わなかった混合水溶液をポリエチレン膜上に広げて蒸発乾固させ、銅の金属錯体を含んだ絹膜を調製した。これらの試料をpH3.8の酢酸水溶液中に1〜72時間浸漬後、トマトかいよう病細菌に対する抗菌活性の測定を行った。得られた結果を表13に示す。
【００８９】
表１３ ジクロロ(1,10-フェナントロリン)銅(II)-絹フィブロイン膜の抗菌耐久性（トマトかいよう病細菌：暗条件下）
参考例 6
EDTA酸無水物で加工した家蚕絹糸、柞蚕絹糸、及び羊毛へのコバルトイオンの結合量(mmol/g)と加工率(%)との関係を調べた。結合量は、上記「金属イオンの定量」に記載の方法に従って測定した。得られた結果を図1に示す。EDTA酸無水物で加工した羊毛(羊毛−EDTA)へのコバルトイオンの結合量は加工率が増えると目立って増加する。EDTA加工した羊毛では、加工率が13%以上となるとコバルトイオンの結合率は平衡状態となる。このことから、羊毛に対するEDTAの使用量は、所定の平衡状態の結合率が達成できるだけの量であれば十分である。一方、EDTA加工した家蚕絹糸、柞蚕絹糸へのコバルトイオンの結合量はほぼ0.5〜0.6mmol/gであり、加工率が変わっても結合量の増加は明瞭ではない。このことから、絹糸に対するEDTAの使用量は、EDTA酸無水物がアシル化反応の結果、試料重量の10%となるように調整するとよい。羊毛と家蚕絹糸及び柞蚕絹糸とでみられたコバルトイオンの結合量の違いは、次の理由に基づくものと考えられる。未加工の羊毛及びEDTA加工した羊毛にコバルトイオンが結合するのは、絹の分子構造とちがって羊毛の分子構造には分子間に-S=S-結合が存在し、還元反応でこの結合が決裂する結果、生じた-S-基にコバルトイオンが結合するためであろう。
参考例 7
EDTA酸無水物で加工した家蚕絹糸をpHが異なるコバルトイオン含有水溶液（硝酸コバルト水溶液）中に一定時間浸漬することにより、この加工された家蚕絹糸にコバルトイオンを結合させ(家蚕絹糸−EDTA−コバルト)、コバルトイオンの結合量(mmol/g)とコバルトイオン含有水溶液pHとの関係を調べた。結合量は、参考例 6の場合と同様に、上記「金属イオンの定量」に記載の方法に従って測定した。得られた測定結果を図2に示す。なお、EDTA酸無水物未加工の家蚕絹糸を対照区(家蚕絹糸−コバルト)として用いた。図2から明らかなように、未加工家蚕絹糸へのコバルトイオンの結合量は、該水溶液pHが7未満であると実質的にゼロであるが、pHが7以上となるとコバルトイオンの結合量は次第に増加した。これは、pHが7未満の酸性pHであると、家蚕絹フィブロインを構成する塩基性アミノ酸（例えば、Lys、Arg、Hist等）が解離し難いため、金属イオンと結合し易いNH２が形成されないからである。しかし、pHが7以上になると、NH３ ＋が解離してNH２が形成するため、コバルトイオンの結合が目立って増加したものと考えられる。一方、EDTA酸無水物加工した家蚕絹糸へのコバルトイオンの結合量は、浸漬液のpHによらず0.4〜0.6mmol/gの値となり、浸漬液のpHが大きく変動してもコバルトイオンを効率的に結合するという長所が観察できる。このことから、目的に応じて、適宜の水溶液pHを自由に選択することが可能である。
参考例 8
EDTA酸無水物で加工した柞蚕絹糸をpHが異なるコバルトイオン含有水溶液（硝酸コバルト水溶液）中に一定時間浸漬することにより、この加工された柞蚕絹糸にコバルトイオンを結合させ(柞蚕絹糸−EDTA−コバルト)、コバルトイオンの結合量(mmol/g)とコバルトイオン含有水溶液pHとの関係を調べた。結合量は、参考例 6の場合と同様に、上記「金属イオンの定量」に記載の方法に従って測定した。得られた測定結果を図3に示す。なお、EDTA酸無水物未加工の柞蚕絹糸を対照区(柞蚕絹糸−コバルト)として用いた。図3から明らかなように、得られた結果は参考例 7で述べた家蚕絹糸の場合と同様であった。
参考例 9
EDTA酸無水物で加工した羊毛をpHが異なるコバルトイオン含有水溶液（硝酸コバルト水溶液）中に一定時間浸漬することにより、この加工された羊毛にコバルトイオンを結合させ(羊毛−EDTA−コバルト)、コバルトイオンの結合量(mmol/g)とコバルトイオン含有水溶液pHとの関係を調べた。結合量は、参考例7の場合と同様に、上記「金属イオンの定量」に記載の方法に従って測定した。得られた測定結果を図4に示す。なお、EDTA酸無水物未加工の羊毛を対照区(羊毛−コバルト)として用いた。図4から明らかなように、得られた結果は参考例 7で述べた家蚕絹糸の場合と同様であった。
【００９０】
【発明の効果】
本発明で用いる抗菌性成分である抗菌性物質は、フェナントロリン等の抗菌性配位子、又は抗菌性金属イオンとしてのコバルトイオン、ルテニウムイオンと配位子とが化学的に結合した錯体からなり、いずれも優れた抗菌活性を示す。また、これらの抗菌性物質は、絹蛋白質、羊毛ケラチン等の生体高分子素材と結合し得るため、使用に適した耐久性に富む抗菌性素材が提供できる。さらに、抗菌性を示さない配位子であっても、抗菌性金属イオンと配位結合した錯体は、優れた抗菌活性を示す。本発明のこれらの抗菌性素材はいずれも使用環境の明・暗等、すなわち光を照射するか否かの光照射条件により抗菌活性が変化し、光を照射する環境下で抗菌活性が著しく増強する。
【００９１】
これら抗菌性生体高分子素材は金属イオンを溶出し易くする酸性pHの水溶液中に浸漬処理しても、抗菌性の低下が極めて少なく、抗菌効果が持続し耐久性に優れたものである。従って、本発明の抗菌性素材は、衣料分野、医療分野、家庭用品分野、家電・事務分野、食品分野等の従来抗菌性が要求される分野のみならず、植物病原細菌に対して有効な抗菌活性を示すことから、農業、園芸分野においても好適に用いられ得る。農業、園芸分野において、特に液中や土壌中の病原菌の低減、外部からの病原菌侵入の阻止に有効であるので、例えば養液（水耕）栽培における循環液の殺菌フィルター材、土壌に混入する消毒材、土壌面に敷設する病害防除用不織布シート、又は樹木の病害治療部や切除部の保護テープ若しくはシート等として用いることができる。さらに、本発明の抗菌性素材は、植物病原細菌に近い動物病原細菌や腸内細菌に対しても同様な抗菌活性を示す。
【００９２】
本発明の抗菌性素材は、含有する金属イオンが溶出し難いため、生体や環境を悪染する危険性がない。また、金属イオンを配位した金属錯体を複数用いることで、各種の金属イオンを同一素材表面に固定化して同時に担持できるので、抗菌スペクトルを一層制御、拡大することが可能である。
【００９３】
本発明で用いる抗菌性錯体の場合、抗菌性金属イオンを含み、かつ金属イオンと配位子とが錯体を形成しているので、抗菌性成分が溶出し難いという、従来の有機系抗菌剤にはない優れた特徴を有している。また、この抗菌性素材に人が接触しても、抗菌性成分が付着したりしないため安全である。
【００９４】
本発明で利用する抗菌性金属イオン、配位子、又は錯体の組成物は、スプレーとして用いることができ、木材、紙、金属、ガラス、セラミックス、プラスチック等のあらゆるものに、容易に抗菌性を付与することが可能である。
【００９５】
さらに、本発明の抗菌性素材は、細菌等の微生物に対し抗菌性を示し、かつ抗菌効果の耐久性に優れたものであるので、例えば、肌着、シャツ、ブラウス、パジャマ等の衣料品、寝装具、タオル、ハンカチ、若しくは包帯等の各種抗菌性製品として、又はマット、シート、綿体、粉砕体等の各種抗菌性製品の素材として好適なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】EDTA酸無水物で加工した家蚕絹糸、柞蚕絹糸、及び羊毛へのコバルトイオンの結合量とアシル化による加工率との関係を示すグラフ。
【図２】家蚕絹糸へのコバルトイオンの結合量とコバルトイオン含有水溶液pHとの関係を示すグラフ。
【図３】柞蚕絹糸へのコバルトイオンの結合量とコバルトイオン含有水溶液pHとの関係を示すグラフ。
【図４】羊毛へのコバルトイオンの結合量とコバルトイオン含有水溶液pHとの関係を示すグラフ。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an antibacterial material and a method for enhancing antibacterial activity using the material.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, safety and cleanliness have been required for all products around us. There is a growing interest in cleanliness, especially among young people, and products with antibacterial properties are attracting attention. The development of low-toxic antibacterial agents and antibacterial products that do not lead to pollution of living tissues and the environment is being actively promoted. Thus, in recent years, cleanliness orientation and hygiene orientation have increased, and in addition to the medical field and the clothing field, toilet articles, kitchen articles, household articles such as freshness retaining films and disinfecting sheets, washing machines, refrigerators, floppy disk cases, and the like. BACKGROUND ART Antibacterial materials are used in the field of household appliances and office supplies such as stationery, and in the field of food.
[0003]
The most common antibacterial materials include those containing antibacterial metals such as silver and copper. For example, many antibacterial materials carrying silver ions have an elution type in which antibacterial properties are developed by elution of silver ions. Zeolites, clay minerals, glass and the like are known as carriers for this eluting type material. The elution-type material of antibacterial metal such as silver ion has excellent antibacterial function, but there is a concern that metal elutes and pollutes biological and environmental systems. Need to pay.
[0004]
As a conventional antibacterial powder, a powder containing silver, copper, zinc, or a complex thereof is known (JP-A-9-263715). Although this material has strong antibacterial properties, a small amount of metal ions such as silver flows out of antibacterial inorganic particles for a long time, which may cause contamination of living tissue or the environment. Therefore, development of an antibacterial material that does not allow metal ions to flow out of the antibacterial material and can maintain a stable antibacterial function has been desired.
[0005]
An antibacterial resin composition in which a zeolite containing an antibacterial metal is kneaded is also known (JP-A-63-265958), but the cost is high and the resin is colored or discolored by light energy. Therefore, it has been a practical problem. In addition, when using a powder coating having antibacterial properties, a step of heating to 150 to 200 ° C. is required at the time of baking. .
[0006]
Conventionally, as a method for producing an antibacterial fiber, for example, a dispersion of fine particles of a metal or a metal compound exhibiting antibacterial properties is brought into contact with an organic polymer material, and the surface of the organic polymer material is coated. Known methods include a method of attaching the particles (JP-A-7-97769) and a method of coating the fiber surface with an antibacterial metal having a colloid particle size and an oxide of another metal (JP-A-7-109674). I have. However, the antibacterial fiber obtained by these methods has a problem in durability that the antibacterial metal is simply adhered to the fiber surface and thus falls off during use and loses the antibacterial effect.
[0007]
JP-A-3-2106 discloses an antifungal / antibacterial agent containing a complex of a guanyl-O-methylisourea or the like and a salt of a transition metal of
[0008]
JP-A-9-124425 describes an antibacterial material comprising one or more metals selected from the group consisting of Pt, Pd and Ru supported on a carrier such as activated carbon, and a method for producing the same. For example, a method has been disclosed in which a metal complex such as hexachloroplatinic (+4) acid as a precursor is formed from these metals and then supported on a carrier by an impregnation method or the like, and reduced with hydrogen or the like to form a metal support. ing.
[0009]
JP-A-4-18177 discloses that a synthetic fiber containing silver-substituted antibacterial zeolite particles is treated with monovalent or divalent copper ions at the same time as or before and after the dyeing process, and the antibacterial agent is dyed or finished. A method for obtaining a synthetic fiber exhibiting excellent antibacterial properties without losing its effect is disclosed.
[0010]
In addition, as a method for producing antibacterial fibers, a method in which silver, which is an antibacterial metal, supported on the surface of spherical ceramic fine particles such as silica and alumina is adhered to the fiber surface, and porous natural zeolite or silver ion is converted into zeolite. A method of coating the surface of a material with the material adsorbed on the surface is known.
[0011]
However, as described above, the method of physically attaching the antibacterial metal to the fiber, the antibacterial metal carrier is easily dropped from the obtained fiber product during use, so that the initial antibacterial effect is maintained for a long time. There are problems such as difficulty. Therefore, the antibacterial spectrum is broad, the growth of a wide range of pathogenic bacteria can be inhibited, and the sustainability of antibacterial activity is excellent. Therefore, there is an increasing need to develop antibacterial substances that can be used as various industrial materials. I have.
[0012]
Also, many antibacterial substances are known, but how to chemically bond them to synthetic fibers, natural fibers, etc. to prepare an antibacterial material with excellent durability is unsolved. The solution is awaited.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, an antibacterial material having excellent durability, an antibacterial material capable of enhancing the function of suppressing the growth of pathogenic microorganisms, and this antibacterial material. To provide a method for enhancing the antibacterial activity of a pathogenic microorganism by using the method. SandThat is, a biopolymer antibacterial material containing a ligand having excellent antibacterial activity, and a biopolymer antibacterial material containing a complex in which an antibacterial metal ion is bonded to the antibacterial ligand by a coordination bond, And method for enhancing antibacterial activity of pathogenic microorganisms using these antibacterial materialsIs to provide. In the case of an antibacterial material composed of these biopolymers, the antibacterial component is less likely to fall off during use, so that the antibacterial effect is sustained, and an antibacterial material with excellent durability can be provided easily and economically. .
[0014]
Further, an object of the present invention is to provide an antibacterial material in which the antibacterial activity of suppressing the growth of various bacteria (hereinafter sometimes referred to as pathogenic bacteria and pathogenic microorganisms) changes depending on the light and dark conditions of the use environment, and an antibacterial material using the same. An object of the present invention is to provide a method for enhancing activity.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have a wide antibacterial spectrum against various bacteria, as a result of intensive studies to develop an antibacterial organic polymer material with excellent durability, cobalt (Co) ion, ruthenium (Ru) ion Has an antibacterial activity, and a ligand such as phenanthroline, and further, a cobalt ion, a ruthenium ion and the like are bound to various ligands including the ligand by a coordination bond (in the present specification, (Hereinafter, it may be simply referred to as "binding" or "coordinating".) Observe the appearance of the antibacterial activity of the complex, and clarify that the antibacterial activity changes depending on the difference in the brightness of the sample environment. In addition, it has been further clarified that a durable antibacterial material can be produced by binding a ligand or a complex to a natural biopolymer such as silk protein or wool, thereby completing the present invention. Was.
[0016]
The antibacterial material of the present invention,Consists of animal protein, and as an antibacterial component to this animal proteinPhenanthroline,as well asCompounds having a phenanthroline skeleton as the basic skeletonThingLigand chosen fromAre combined and included..
[0017]
Antibacterial material of the present inventionWherein the animal protein is a silk protein or a wool protein. May be silk fibroin membrane.
[0018]
The antimicrobial component is a metal complex in which a cobalt ion or a ruthenium ion is further coordinated to the ligand..
The metal complex is Tris ( 1 , 10-phenanthroline ) ruthenium (II) Chloride hydrate and dichloro ( 1 , 10-phenanthroline ) copper (II) Characterized in that it is a complex selected from.
[0019]
In addition, the antibacterial material exhibits antibacterial activity when used under light-irradiated conditions or under light-shielded conditions, and enhances the function of suppressing the growth of pathogenic microorganisms, particularly when used under light-irradiated conditions.And can be sustained.
[0020]
BookThe method for enhancing antibacterial activity of the invention uses the above antibacterial material under light irradiation conditions.do it,Enhance the function of suppressing the growth of pathogenic microorganismsAnd sustain it.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the terms used in the present specification will be briefly described, and embodiments of the present invention will be described.And related technologiesThis will be described in detail.
[0022]
In the present specification, the term "bond" means that a metal ion is chemically bonded to a ligand by a coordination bond, or that the metal ion is chemically bonded to EDTA introduced into a silk protein or the like. However, when a ligand or a complex is combined with a polymer material, it also means a physical bond such as a hydrogen bond, an ionic bond, or a hydrophobic bond other than a chemical bond that acts between the two. .
[0023]
A ligand is a general term for compounds to which a metal ion can coordinate. As the antibacterial ligand that can be used in the present invention, as described above, phenanthroline, a compound having a phenanthroline skeleton as a basic skeletonThere is. Compounds with similar antibacterial properties As, Cyanophenanthrene, phenanthridine, or salicylaldehyde. Among these ligands, it is composed of three benzene rings and can coordinate metal ionsN Coordinating atom Two PiecesPhenanthroline and the like can be preferably used. That is, as representatives of the ligand having excellent antibacterial activity used in the present invention, 1,10-phenanthroline, and 2,7-dimethyl-1,10-phenanthroline whose basic skeleton is similar thereto, and 4,7 -There's phenanthroline. The ligand phenanthrene itself has no antibacterial activity, but 9-cyanophenanthrene having a cyano group attached to this compound exhibits antibacterial activity.
[0024]
Antibacterial metal ions that can be used in the present invention include, in addition to cobalt ions and ruthenium ions themselves, these metal ions.Regardless of origin,Includes chlorides, nitrates, carbonates, thiocyanates, etc.For example, cobalt ions or ruthenium ions derived from cobalt nitrate, cobalt carbonate, cobalt chloride, cobalt thiocyanate, ruthenium nitrate, ruthenium carbonate, ruthenium chloride, or ruthenium thiocyanate are included..
[0025]
The complex in which the antibacterial metal ion is coordinated by a coordination bond, the complex in which the antibacterial metal ion is coordinated by a coordination bond exhibits excellent antibacterial activity even if the ligand itself does not show antibacterial activity. . For example, triphenylphosphine has no antibacterial activity, but when a cobalt ion or the like coordinates to this ligand, the antibacterial activity appears. The ligand in the case of this complex includes not only a ligand having the above-described antibacterial activity but also any ligand that binds to a metal ion through a coordination bond as described below. Can also be used. The ligand has several coordination groups to which the metal ion coordinates. Here, the coordinating group is generally -NHTwo, -NH-, -CONHTwo, —CONH—, —SH, —COOH, and —OH groups, and a group containing a nitrogen, sulfur, oxygen atom, or the like, and a metal ion binds to such a ligand by a coordination bond. Although metal ions such as cobalt ions and ruthenium ions themselves have antibacterial activity, a complex of cobalt ions and ruthenium ions exhibits even better antibacterial activity.
[0026]
In addition,As a ligand capable of forming a complex exhibiting antibacterial activity,In general,In addition to the above ligands, for example, 2,2'-bipyridine, EDTA, triphenylphosphine, acetylacetonic acid, triphenylphosphine, ethylenediamine, 5,10,15,20-tetraphenyl-21H, 23H-porphine, salicyl Aldehyde, N, N'-bis (salicylidene) -1,2-phenylenediamine, bis (salicylideneimininate-3-propyl) methylamine, phthalocyanine, 1,2,3,4,8,9,10, 11,15,16,17,18,22,23,24,25-hexadecafluoro-29H, 31H-phthalocyanine, 1,2-bis (diphenylphosphino) ethane, tetraphenyl and the like can be used.Note that, A ligand compound coordinated with either a cobalt ion or a ruthenium ionIn addition to the metal complex used in the present invention, generally, cyanocobalamin ( vitamin B 12 ) And cobalt (III) Acetylacetonate, chlorotris ( Triphenylphosphine ) cobalt (I) , Tris ( Ethylenediamine ) cobalt (III) Chloride dihydrate, 5,10,15,20- Tetraphenyl -21H, 23H- Porphine cobalt (II) ,Screw ( Salicylaldehyde ) cobalt (II) Dihydrate, N, N'- Screw ( Salicylidene ) -1,2- Phenylenediamino cobalt (II) Monohydrate, screw ( Salicylidene imininate -3- Propyl ) Methylaminocobalt (II) ,cobalt (II) Phthalocyanine, cobalt (II) 1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25- Hexadecafluoro -29H, 31H- Phthalocyanine, [1,2- Screw ( Diphenylphosphino ) Ethane ] Dichlorocobalt (II) , Tetraphenylphosphonium acetate dichlorodioxol tenate (VI) , Dichlorotetrakis ( Triphenylphosphine ) ruthenium (II) , And Tris (2,2'- Bipyridyl ) ruthenium (II) Chloride hexahydrate etc..
[0027]
According to the present invention, as described below, it is possible to prepare and provide a polymer material such as the above-mentioned ligand or a complex-containing silk thread or silk fibroin membrane.You. In addition,A polymer material such as a silk thread or a silk fibroin membrane combined with a cobalt ion or a ruthenium ion can also be prepared and provided.
[0028]
A silk fibroin membrane containing a ligand can be prepared as follows. For example, first, after completely dissolving silkworm silk in an aqueous solution of a neutral salt such as lithium bromide, the aqueous solution is put into a dialysis membrane made of cellulose, and replaced with distilled water at a predetermined temperature to remove impurities. Remove and prepare pure silk fibroin aqueous solution. On the other hand, a predetermined amount of a ligand such as 1,10-phenanthroline is dissolved in a mixed solution containing an organic solvent such as DMF and water in equivalent amounts. The resulting mixed aqueous solution is added to the silk fibroin aqueous solution, and dialyzed with a cellulose dialysis membrane if necessary. When this silk fibroin aqueous solution is spread on a polyethylene membrane and evaporated to dryness, a silk fibroin membrane containing a ligand can be produced.
[0029]
A silk fibroin membrane containing metal ions can be prepared as follows. For example, the pure silk fibroin aqueous solution obtained as described above is added to a mixed aqueous solution of a cobalt nitrate or ruthenium nitrate aqueous solution and a neutral salt aqueous solution (for example, potassium nitrate aqueous solution) for adjusting ionic strength, and the ionic strength is adjusted to a predetermined value. (E.g., I = 0.1-1), adjust the pH of this solution to a predetermined value, leave it at a constant temperature, dialyze using a dialysis membrane if desired, and spread this solution on a polyethylene membrane. When evaporated to dryness, a silk fibroin membrane containing metal ions is obtained.
[0030]
As described above, a neutral salt for adjusting the ionic strength is added in order to promote the reaction of coordinating the metal ion to silk fibroin while keeping the ionic strength of the reaction system constant, but this cation is not particularly limited. Instead, for example, K, Na, Ca, Mg and the like can be used. Usually, potassium salts which do not bind strongly to the ligand are particularly preferred. The amount of the neutral salt to be added is desirably in excess of the metal ion concentration, and the concentration is suitably 50-100 mM, and particularly preferably 70-90 mM. Considering the chemical reaction between silver ions and ligands, the amount of antibacterial metal salt used may be as small as about 0.1-20 mM for silver ions showing excellent antibacterial properties. The amount added can be freely changed according to the application.You. oneFor silver ions having a valent cation, a neutral salt for adjusting ionic strength needs to be added, but for copper ions having a divalent cation, a neutral salt for adjusting ionic strength is not required. In order to bond metal ions having different valences to a ligand or a coordinating group, it is necessary to keep the ionic strength constant. Therefore, a neutral salt may be added as required. In the case of a metal salt having a moderate antibacterial property such as Fe, Cu, Zr, Zn, etc., it is desirable that the amount of the antibacterial metal ion to be added is large. Further, it is desirable that the pH of the reaction system is adjusted to pH 5-12 (preferably 7-12) by adding an aqueous alkali solution. Any conventionally known alkaline agent can be used as the alkaline aqueous solution. For example, aqueous ammonia, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide and the like can be mentioned, and preferably, an aqueous ammonia solution is used.
[0031]
In the case of a metal ion-containing silk fibroin membrane, whether or not cobalt ions are bound to the silk fibroin membrane can be verified as follows. As described above, when an electronic sample is measured for an aqueous sample in which the pH of the aqueous solution of silk fibroin to which potassium nitrate is added for adjusting the ionic strength is adjusted to a predetermined value, a large peak not seen in the aqueous solution of silk fibroin alone appears at 457 nm. This is based on the d-d transition and indicates that silk fibroin and cobalt ions are chemically bonded. The same applies when ruthenium ions are used instead of cobalt ions. Therefore, it is considered that cobalt ions or ruthenium ions can be bound to the silk fibroin film by immersing the silk fibroin film in the aqueous cobalt nitrate solution or the ruthenium nitrate aqueous solution.
[0032]
silkIn order to form a strong bond between a polymer material such as thread or silk fibroin membrane and antibacterial metal ions, EDTA that can bind to metal ions is introduced into the polymer material in advance, and the introduced EDTA This is made possible by binding an antibacterial metal ion to the site. EDTA is used for metal ion quantification and has a function of binding to metal ions. Therefore, EDTA anhydride dissolved in an organic solvent such as DMF causes an acylation reaction with a polymer material such as silk protein, and as a result, the introduced EDTA also has a function of binding metal ions. Metal ions such as ruthenium ions similarly bind to the resulting polymer material such as silk thread or silk fibroin membrane.
[0033]
An outline of a method for producing a silk fibroin membrane or a silk thread in which metal ions are bound via EDTA introduced into a material is as follows. In order to bind ruthenium ions or cobalt ions to a polymer material such as a silk thread or a silk fibroin film, EDTA anhydride is introduced into the sample as described above before the ruthenium ion or the cobalt ion is bound to the sample. . EDTA acid anhydride includes ethylenediaminetetraacetic acid dianhydride [4,4'-ethylenebis (2,6-morpholinedion)] (manufactured by Aldrich, 33,204-6) (hereinafter abbreviated as EDTA acid anhydride). Is also used.)
[0034]
In order to chemically bond EDTA anhydride with a reactive group of a polymer material, first, EDTA anhydride is converted to dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSO) or N, N'-dimethylformamide (hereinafter abbreviated as NSO). , DMF), and a polymer material is immersed in this solution system, and the acylation reaction may be performed at a temperature of 60 to 80 ° C for 1 to 5 hours. Since EDTA anhydride reacts in the presence of water, DMSO or DMF is preferably dehydrated. The amount of EDTA that can be introduced into the polymer material is determined by the reaction temperature and reaction time. When the reaction temperature is low, the reaction time needs to be set longer, and when the reaction temperature is too high, the reaction is too fast, and it is difficult to control the amount of EDTA introduced. Therefore, the most preferable reaction conditions are 75 ° C, 2-4 hours for silkworm silk, and 75 ° C, 1-2 hours for wool.
[0035]
EDTA acid anhydride undergoes an acylation reaction with highly reactive basic amino acid residues such as lysine (Lys), arginine (Arg), and histidine (His) on the molecular side chains of biological macromolecules such as silk proteins and wool proteins. And reacts with amino acid residues having a phenolic hydroxyl group such as serine, tyrosine, and threonine. The total amount of these highly reactive basic amino acid residues and phenolic hydroxyl groups in wool is almost an order of magnitude greater than that of silk proteins, so the concentration of EDTA anhydride when processing wool is Compared to the case of protein, it may be diluted and the reaction time may be short.
[0036]
After the reaction, the polymer material of the sample is washed with an organic solvent such as DMF to remove unreacted substances attached to the sample, and finally washed with water. By bonding the polymer material and the EDTA anhydride by the acylation reaction in this manner, EDTA that binds to an antibacterial metal ion in a subsequent reaction can be easily introduced into the polymer material.
[0037]
In order to bind an antibacterial metal ion to EDTA introduced into a polymer material, the following may be performed. By immersing the sample into which EDTA is introduced in an antibacterial metal salt aqueous solution at room temperature for 5 to 40 hours, metal ions can be bound to the polymer material. For efficient binding of metal ions, the pH of the aqueous metal salt solution is adjusted to 5-12, preferably 7-12. Normally, the pH of the aqueous metal salt solution is adjusted by adding 1N aqueous ammonia to increase the binding ability of metal ions. The concentration of the aqueous metal salt solution may be 0.1-30 mM, and preferably 0.1-10 mM. What should be noted here is the relationship between the amount of metal ion binding to silk proteins and wool fibers before and after binding EDTA and the pH of the metal salt aqueous solution.
[0038]
In the case of unprocessed silk protein and wool keratin, metal ions are simple because the COOH group of acidic amino acid residues such as glutamic acid (Glu) and aspartic acid (Asp) constituting silkworm fibroin does not dissociate in the strongly acidic pH region. Does not bind to COO, but in the strongly acidic to weakly acidic pH range of about pH 3-5.6, COO groups dissociate and bind to metal ions.−Therefore, the metal ions gradually bond. In addition, amino groups that can serve as binding sites for metal ions do not dissociate in the acidic to weakly acidic pH range, but when they become weakly alkaline, a deprotonation reaction occurs and metals are easily bound. On the other hand, protein fibers chemically modified with EDTA acid anhydride undergo the above reactions in various pH ranges, and as a result of the reaction, the COOH group of EDTA introduced into the sample gradually dissociates due to differences in environmental pH, and complete COOH At the time when the group is dissociated, the amount of metal ion binding gradually increases.
[0039]
The silk fibroin membrane containing the complex can be produced in the same manner as the silk fibroin membrane containing the metal ion and the ligand. At that time, for example, a cobalt ion or ruthenium ion can be used as a metal ion, and, for example, 2,2′-pipyridine, 1,10-phenanthroline, EDTA, triphenylphosphine, or the like can be used as a ligand.
[0040]
For example, an outline for producing a desired complex-containing silk fibroin membrane using 1,10-phenanthroline as a ligand is as follows. After adding an equal amount of water to a solution in which an equimolar cobalt or ruthenium nitrate or the like is dissolved in an organic solvent such as DMF with respect to 1,10-phenanthroline, a mixed solution is prepared, and the mixture is left at a predetermined temperature. This cobalt or ruthenium nitrate aqueous solution is added to a separately prepared silk fibroin aqueous solution, and the mixture is allowed to stand in a refrigerator. After elapse of a predetermined time, the obtained solution is spread on a polystyrene membrane and dried and solidified, whereby a complex-containing antibacterial silk fibroin membrane can be prepared. The water insolubilization of the silk fibroin membrane is performed, for example, by immersion in a mixed solvent such as water: methanol. The obtained sample is subjected to an experiment for inhibiting bacterial growth against tomato canker bacteria and Escherichia coli as described in detail below, and the antibacterial activity is examined. In general, antibacterial ligands and metal ions such as cobalt ion and ruthenium ion show almost the same antibacterial activity against pathogenic bacteria, but the antibacterial activity of a complex in which these metal ions are coordinated by coordination bonds is low. Improve synergistically.
[0041]
Further, when the complex is irradiated with light (in this specification, it may be abbreviated as a bright condition), when the complex is not irradiated with light (in some cases, abbreviated as a dark condition), it has an antibacterial activity. May increase. Such a complex is useful as a material for antibacterial products used under bright conditions.
[0042]
In the present invention, by placing the sample under bright conditions, the light for enhancing the antibacterial activity, even if the approximate wavelength is visible light of 400 to 750 nm, even ultraviolet light of 1 to 400 nm, In addition, infrared rays having a wavelength of 750 nm to 1 mm can be similarly used. Among these lights, the most preferred light for enhancing the antibacterial activity is ultraviolet light. As used herein, the term “dark conditions” means that a growth experiment of a pathogenic microorganism is performed in a light-shielded environment. This dark condition can be easily set by blocking the light with a black cloth.
[0043]
Examples of the biopolymer that is a polymer material that can be used in the present invention include insect-derived, for example, silk protein fibers derived from silkworms, silk proteins obtained from these fibers, wool fibers, wool keratin, animal-derived collagen, spider silk, or There is a protein material such as a marine protein, such as a thread. Further, cellulose fibers such as cotton may be used. As the silk protein fiber, for example, in addition to the silkworm silk obtained from the silkworm (Bombyx mori) larva, wild silkworm silk obtained from the larvae of tussah silkworm, natural silkworm, Eri silkworm, magnum silkworm, Shinju silkworm belonging to the wild silkworm, or obtained therefrom Any of the textile products used can be used. Further, as the silk protein, sericin that adheres to the outside of the cocoon fiber formed by silkworm spinning, or silk fibroin fiber obtained by removing the sericin is dissolved in a neutral salt aqueous solution, and then the cellulose is dialyzed. It may be water-soluble silk fibroin obtained by dialysis using a membrane, or water-soluble silk sericin or water-soluble silk fibroin in a silk gland taken out from a silkworm body. Preferable examples include wild silkworm silk such as silkworm silk and tussah silk, and animal protein fibers such as wool fiber. The form of the fiber is not particularly limited, and may be any of a fiber aggregate or a fiber product such as cotton, yarn, woven fabric, knitted fabric, and nonwoven fabric.
[0044]
For dissolving the silk fibroin fiber, generally known neutral salts such as calcium chloride, calcium nitrate, and lithium bromide can be used. In order to increase the solubility of the silk thread and to produce a silk fibroin close to the undenatured state, a neutral salt containing a highly soluble lithium ion is desirable, and lithium bromide or the like is particularly preferably used. Before dissolving the silk fibroin fiber, wild silkworm cocoons obtained from tussah or natural silkworms, for example, are immersed in a 0.1% aqueous solution of sodium peroxide 50 times the weight of the cocoons and treated at 98 ° C. for 1 hour to obtain sericin. Must be removed in advance. A wild silk silk fibroin aqueous solution can be prepared by dissolving wild silk silk fibroin fibers from which sericin has been removed with a highly soluble neutral salt such as lithium thiocyanate, and then putting the resulting solution into a cellulose dialysis membrane and dialyzing with pure water.
[0045]
【Example】
Next, an example of the present invention, Comparative Examples and Reference ExamplesWill be described more specifically, but the present invention is not limited to these examples.
[0046]
Examples below, Comparative Examples and Reference ExamplesIs a representative of universal phytopathogenic bacteria as a phytopathogenic bacterium, resistant bacteria are likely to appear, it is a multi-rot rot fungus that commits many plants, and gram is one of the few phytopathogenic bacteria Bacterial fungus of tomato canker as a positive bacterium (scientific name:Corynebacterium michiganese pv.michiganese) And E. coli, a pathogenic bacterium derived from animals.
[0047]
<Evaluation of growth inhibition of tomato canker bacterial>
Examples such asEvaluation of antibacterial activity against bacteria was performed by the following method.
[0048]
Antibacterial activity assay for bacteria:
After heating and dissolving, 25 mL of semi-synthetic Wakimoto's medium or King B's medium maintained at 55 ° C. and a spore solution of the test bacteria (
[0049]
<Evaluation of E. coli growth inhibition>
The inhibitory effect on the growth of Escherichia coli was evaluated in the same manner as the method for evaluating the inhibitory effect on the growth of the tomato canker bacterium. Strain: JM109 manufactured by PROMEGA was used as Escherichia coli, and LB medium and LB agar medium were used as culture media. The composition of the LB medium per 100 mL of distilled water was as follows. It is a medium composed of 1.0 g of polypeptone, 0.5 g of yeast extract, and 1.0 g of sodium chloride (in the case of LB agar medium, 1.5 g of agar, and the pH of the medium after sterilization was adjusted to 7.0-7.4) . The specific culture technique is as follows.
[0050]
(i) Using an LB medium, Escherichia coli was grown overnight with shaking at a culture temperature of 35 ° C.
[0051]
(ii) Equal amounts of the LB agar medium dissolved at about 60 ° C. and the LB medium containing the grown E. coli were mixed and injected into a sterilized container.
[0052]
(iii) After the mixed medium was solidified, the test sample was placed on the surface of the medium.
[0053]
(iv) After incubation for a certain period of time, the size of the inhibition circle was observed. The evaluation criteria were the same as for the tomato canker disease bacteria.
[0054]
<Test method for durability evaluation of metal ions>
Whether or not the metal ions once bonded to the polymer material were stably bonded for a long time was evaluated as follows. That is, the test sample to which the metal ions were bound was immersed in an aqueous acetic acid solution at pH 3.8 and 25 ° C., and allowed to stand for 3 days. The antibacterial activity of the air-dried sample was evaluated by the method described above. Here, it can be said that a material having a smaller change in the antibacterial activity before and after the immersion treatment in an aqueous acetic acid solution of pH 3.8 has higher durability.
[0055]
<Light irradiation environment>
The inhibitory effect of various metal complexes on the growth inhibition of tomato canker bacteria and Escherichia coli was investigated. Antibacterial experiments were performed in two conditions: a bright condition section in which an incubator was placed at a position of 30 cm under a fluorescent light (National 10W) and a dark condition section which was shielded from light. These sections are hereinafter referred to as light conditions and dark conditions.
[0056]
<Quantification of metal ions>
The quantification of metal ions contained in the sample was performed using a plasma type 400 atomic emission spectrometer (ICP-AES) manufactured by PerkinElmer. Prior to the measurement, a sample containing 5 to 20 mg of metal ions was completely decomposed with 65%, 2 mL of nitric acid using Microwave Digestion System Mod. MDS-81D manufactured by CEM, and immediately before ICP-AES analysis. Then, 10 mL of distilled water was added thereto to quantify metal ions. The analysis results were shown as the average of four measurements.
Reference example1: Antibacterial activity of ligand
The antibacterial activities of the various ligands listed in Table 1 on the growth of tomato canker bacteria were evaluated under dark conditions. The inhibition circle (the area where the growth of pathogenic bacteria was inhibited) appearing on the outer periphery of the sample was indicated in mm as an indicator of the antibacterial strength. Table 1 shows the obtained results.
[0057]
Table 1 Antibacterial activity of ligands (bacterial tomato canker: dark conditions)
From the results in Table 1, among the ligands capable of coordinating metal ions, phenanthroline, or a ligand having phenanthroline as a basic skeleton, 9-cyanophenanthrerin, phenanthridine, salicylaldehyde is an excellent antibacterial It turns out that it shows activity. Note that phenanthrene does not show antibacterial activity, but 9-cyanophenanthrene, in which a cyano group (CN) is contained in this ligand, has antibacterial activity.
[0058]
From the results in Table 1, phenanthrolines were analyzed for the following three groups (1, 2, 3) Will be discussed.
[0059]
1.Ligand compound having three benzene rings and two coordinating atoms N and having the same basic structure as 1,10-phenanthroline with different functional groups
2.
3.4,7-phenanthroline
the above1, 2, 3Show antibacterial activity,1>2> 3Antibacterial activity is high in order.
Reference example2: Antibacterial activity of metal complex
Inhibitory effect of cobalt complex on the growth of tomato cankerReference exampleEvaluation was performed in the same manner as in 1. Antibacterial experiments were performed in two conditions: a light condition section in which the sample to be measured was placed at a position of 30 cm under a fluorescent lamp and a light-shielded dark condition section as described in the above “light irradiation environment” (these sections). Are described as light conditions and dark conditions). Table 2 shows the obtained results.
[0060]
Table 2 Antibacterial activity of metal complexes (bacteria of tomato canker: light and dark)
As is evident from Table 2, most of the complexes coordinated with cobalt ions have an increased antibacterial activity under light conditions of light irradiation. Although triphenylphosphine has no antibacterial activity (Table 1), chlorotris (triphenylphosphine) cobalt (I), in which a cobalt ion is coordinated with this ligand, shows high antibacterial activity, and particularly under bright conditions. It can be seen that it shows high antibacterial activity below.
[0061]
Next, the antibacterial properties of ruthenium complexesReference exampleInvestigated in the same way as 2. Table 3 shows the obtained results.
[0062]
Table 3 Antibacterial activity of ruthenium complexes (bacteria of tomato canker: light and dark)
[0063]
Table 4 Antibacterial activity of cobalt and ruthenium complexes (Escherichia coli: under light and dark conditions)
[0064]
In addition, it was clear that the ruthenium complex had excellent antibacterial activity similarly to the cobalt complex, and that the antibacterial activity was significantly increased under bright light conditions.
[0065]
It was also clear that the cobalt complex and the ruthenium complex inhibited the growth of Escherichia coli.
[0066]
Tris (1,10-phenanthroline) ruthenium (II) chloride hydrate (Table 3) in which ruthenium ions are coordinated to 1,10-phenanthroline (Table 1) both exhibit excellent antibacterial activity.
Reference example3: Antibacterial evaluation of metal nitrate
the aboveReference exampleUsing cobalt nitrate of these metals, it was examined whether cobalt or ruthenium itself, which was suggested to have antibacterial properties, exhibited antibacterial properties, or whether it would exhibit antibacterial properties when discharged as metal ions. That is, the effect of nitrates of cobalt and ruthenium on the growth of tomato canker bacterial growth was examined under light and dark conditions. Table 5 shows the obtained results.
[0067]
Table 5 Antibacterial activity of metal nitrates, sulfates and chlorides (bacteria of tomato canker: light and dark conditions)
* 2: Cobalt chloride hexahydrate
The symbols A and B in parentheses mean that the result of the antibacterial evaluation test is such that the appearance of the inhibition circle becomes halo-shaped and is unclear (A) and clear (B).
As is clear from Table 5, it can be seen that nitrates and chlorides of cobalt, silver, copper, and ruthenium suppress the growth of pathogenic microorganisms. Focusing on the cobalt salt, the one having the best antibacterial activity under bright conditions is nitrate, then sulfate, and finally chloride. Looking at the antibacterial activity by focusing on nitrate, ruthenium ion shows the highest antibacterial activity, followed by silver ion, cobalt ion, and copper ion.
Reference example4: Preparation of polymer material bonded with metal ion and evaluation of antibacterial activity
Silk or wool was added to a DMF solution containing 20% EDTA anhydride, and acylation reaction was performed at 75 ° C. for different times to prepare samples having different amounts of EDTA introduced. In Table 6, for example, wool-EDTA (5.92%) and silk-EDTA (10.31%) indicate that EDTA was chemically introduced into wool and silk, based on the sample weight, 5.92 and 10.31% by weight, respectively. means.
[0068]
Next, these samples were immersed in an aqueous solution of a metal salt such as cobalt nitrate, ruthenium nitrate, silver nitrate, or copper nitrate adjusted to pH 11.4 with aqueous ammonia to bind metal ions to the samples. Also, untreated EDTA silk thread and wool were similarly immersed in an aqueous metal salt solution to bind metal ions. In Table 6, for example, wool-EDTA (5.92%)-cobalt, silk-EDTA (10.31%)-cobalt, the above-mentioned sample into which a predetermined amount of EDTA was introduced was immersed in an aqueous solution of cobalt nitrate, and cobalt ions were bound to EDTA. Means the sample that was run.
[0069]
Further, in addition to the above sample, metal ions were bound in the same manner as above using a silk fibroin membrane. First, 2.5 g of silkworm silk was completely dissolved in 20 mL of an 8.5 M lithium bromide aqueous solution at 55 ° C., and this aqueous solution was placed in a cellulose dialysis membrane and replaced with distilled water at 5 ° C. for 5 days. The impurities were removed to prepare a pure silk fibroin aqueous solution. Distilled water was added to the silk fibroin aqueous solution thus obtained to prepare a stock solution of the silk fibroin aqueous solution such that the absolute dry concentration was 0.4%. Further, 1 mL of a 0.02 mL / L aqueous solution of a metal salt (aqueous cobalt nitrate, ruthenium nitrate, silver nitrate, or copper nitrate aqueous solution) was mixed with 1 mL of a predetermined amount of an aqueous potassium nitrate solution to prepare a mixed aqueous solution. Next, 10 mL of the above 0.4% silk fibroin aqueous solution was added to the mixed aqueous solution, and the total volume was adjusted to 25 mL with distilled water (ionic strength I = 0.1). The pH of the aqueous solution was adjusted to 11.4 by adding 1N aqueous ammonia, the mixture was allowed to stand at 5 ° C. for 12 hours, and then dialyzed with a 11.4 aqueous ammonia using a cellulose dialysis membrane. The obtained aqueous solution was spread on a polyethylene membrane, and water was evaporated at room temperature to obtain a silk fibroin membrane containing metal ions, that is, bonded to metal ions.
[0070]
The antibacterial activity (bright and dark conditions) against the tomato canker bacteria and Escherichia coli was measured for the various samples thus obtained. The results obtained are shown in Tables 6 and 7, respectively.
[0071]
Table 6 Antibacterial activity of polymer materials to which metal ions are bound (bacteria of tomato canker: light and dark strips)
[0072]
Table 7 Antibacterial activity of polymer materials to which metal ions are bound (Escherichia coli: under light and dark conditions)
From the results of Tables 6 and 7, protein fibers such as wool and silk, and those obtained by introducing metal ions directly or through EDTA into silk fibroin membrane have the activity of suppressing the growth of pathogenic bacteria, under light conditions It can be seen that the antibacterial activity is enhanced as in the case of the complex alone. Natural protein fibers obtained by chemically binding EDTA to cobalt ions and ruthenium ions exhibit excellent antibacterial activity. A membrane sample obtained by binding a cobalt ion and a ruthenium ion to a silk fibroin membrane also shows antibacterial activity. The binding of ruthenium ions instead of cobalt ions showed better antibacterial properties.
[0073]
Samples in Table 6, wool-EDTA (5.92%)-cobalt, silk-cobalt, silk-EDTA (10.31%)-cobalt, silk fibroin-cobalt membrane, silk fibroin-ruthenium membrane, silk-EDTA (17.18%)-ruthenium Were tested based on the above-mentioned "Test Method for Evaluating Durability of Metal Ions". All the samples after the test had almost the same antibacterial properties as the samples before the test, and had good durability.
Example 1: Preparation of polymer material with immobilized metal complex and antibacterial activity
In order to prepare a sample containing a complex of each metal in silk fibroin, first, conditions for dissolving the cobalt complex were examined. From the complexes of cobalt, three compounds of excellent antibacterial activity, chlorotris (triphenylphosphine) cobalt (I), cobalt (III) acetylacetonate, bis (salicylaldehyde) cobalt (II) dihydrate, The solubility in water and DMF was examined. The solubility of the cobalt complex is a simple evaluation by visual observation of the dissolution state of the complex when 2 mg of the complex is put into 5 mL of water or DMF and allowed to stand at 25 ° C. for 20 minutes. The evaluation was performed by the following three-step evaluation.
[0074]
：: Dissolves immediately after charging, and the powder state is not confirmed.
[0075]
Δ: Most of the sample was dissolved and became invisible because only a part of the powder was recognized.
[0076]
×: The complex precipitated at the bottom of the test tube and no trace of dissolution was observed.
Table 8 shows the obtained results.
[0077]
Table 8 Solubility of cobalt complex
[0078]
Next, a sample containing a ligand in a silk fibroin film was prepared based on the above results. After completely dissolving 2.5 g of silkworm silk in 20 mL of an 8.5 M lithium bromide aqueous solution at 55 ° C, the aqueous solution was put into a dialysis membrane made of cellulose and replaced with distilled water at 5 ° C for 5 days to remove impurities. It was removed and a pure silk fibroin aqueous solution was prepared. Distilled water was added to the silk fibroin aqueous solution to obtain a 2% silk fibroin aqueous solution. On the other hand, 1,10-phenanthroline (10 mg = 0.0555 mmol) was dissolved in a 200 μL mixed solution containing equivalent amounts of DMF and water. This aqueous solution was added to 5 mL of the above 2% silk fibroin aqueous solution, and dialyzed with a cellulose dialysis membrane. The solution thus obtained was spread on a polystyrene membrane and dried and solidified to prepare a ligand-bound antibacterial silk fibroin membrane.
[0079]
In the same manner as above, a sample containing a complex of copper, cobalt, and ruthenium in a silk fibroin film was prepared. Dissolve an equimolar metal salt (copper nitrate, ruthenium nitrate, or cobalt nitrate) in DMF (100 μL) with respect to 1,10-phenanthroline (10 mg = 0.0555 mmol), and add water (100 μL) equivalent to DMF to this. Further, the mixture was left at room temperature for 1 day. Thereafter, the obtained aqueous solution of the metal complex was added to a 2% aqueous solution of silk fibroin (5 mL) prepared in the same manner as described above, and further left still in a refrigerator for 1 day. After dialysis using the cellulose dialysis membrane, or without dialysis, the solution thus obtained is spread on a polystyrene membrane, and dried and solidified to form a metal complex-bound antibacterial silk fibroin membrane. Prepared.
[0080]
The above antibacterial silk fibroin membrane is also obtained by dissolving a commercially available 1,10-phenanthroline complex in a mixed solution of 200 μL of DMF and water (volume ratio of DMF and water = 1: 1), and the obtained mixed solution Is added to a 2% silk fibroin aqueous solution (5 mL), and the aqueous solution is spread on a polystyrene membrane and dried and solidified.
[0081]
The membrane obtained as described above was immersed in a mixed solvent of water: methanol at a volume ratio of 1: 1 at room temperature for 5 minutes to make it water-insoluble. The obtained insoluble sample was subjected to an experiment for inhibiting bacterial growth against tomato canker bacterial and Escherichia coli. Tables 9 to 11 show the obtained results.
[0082]
Table 9 Antibacterial activity of silk fibroin membrane containing metal complex (tomato canker bacterial: light and dark conditions)
NT was not tested for antibacterial activity.
[0083]
Table 10 Antibacterial activity of silk fibroin membrane containing metal complex (tomato canker bacterial: light and dark conditions)
[0084]
Table 11 Antibacterial activity of silk fibroin membrane containing metal complex (Escherichia coli: under light and dark conditions)
As is clear from Tables 9 to 11, it became possible to produce a membrane having an antibacterial function by carrying a ligand or a metal complex on a silk fibroin protein. In addition, when dialysis is performed during membrane preparation, the metal complex tends to be washed away and the antibacterial activity tends to decrease.
[0085]
Of the samples in Tables 9-11, containing dichloro (1,10-phenanthroline) copper (II), tris (1,10-phenanthroline) ruthenium (II) chloride hydrate, chlorotris (triphenylphosphine) cobalt (I) The silk fibroin membrane obtained was immersed in an aqueous acetic acid solution at pH 3.8 and 25 ° C based on the above “Test Method for Durability of Metal Ions”, allowed to stand for 3 days, and then the sample was taken out and air-dried at room temperature. And antibacterial activity against tomato canker bacteria were evaluated. Table 12 shows the obtained results.
[0086]
Table 12 Antibacterial activity of silk fibroin membrane containing metal complex (tomato canker disease bacteria: under light conditions)
Reference example Five: Verification of complex formation between silk fibroin and metal ions
The pH titration curve of cobalt complexed silk fibroin in an aqueous solution state was determined by the method shown in the literature (Polymer Transactions, Vol. 51, 167-171 (1994)). In the obtained results, when the amount of consumed OH was converted into per metal ion and plotted against pH, multiple step-like step sites were observed, and the metal ion bound to silk fibroin. It was confirmed that there was.
[0087]
Next, it was verified whether or not silk fibroin and a metal ion form a complex in a metal ion-containing aqueous solution of silk fibroin.
[0088]
To adjust the strength of the metal ions, the pH of a 0.31 wt% aqueous solution of silk fibroin containing 3.6 mM metal ions (cobalt ions, ruthenium ions) and 50 mM potassium nitrate was adjusted to 11.4 with an aqueous ammonia solution. The silk fibroin aqueous solution containing metal ions thus prepared was put into a 1 mL quartz square cell, and the absorbance was measured with an electronic spectrum measuring device (U-3200, manufactured by Hitachi, Ltd.). The wave number range of the measurement was 200-500 nm. In the electronic spectrum of an aqueous solution of silk fibroin containing cobalt ions or ruthenium ions, a new absorption appeared which was not seen at all in an aqueous solution containing only silk fibroin and only metal ions. That is, a strong peak appeared at 457 nm. This absorption peak is based on the dd transition and indicates that the silk fibroin and the metal ion are indeed forming a complex. Therefore, in the case of a silk fibroin film obtained by drying and solidifying an aqueous solution of silk fibroin containing a metal ion, the metal ion forms a complex.
ExampleTwo
In a sample in which an aqueous solution of silk fibroin was added to an aqueous solution of dichloro (1,10-phenanthroline) copper (II) and the metal complex of copper was bound to silk fibroin, the stability of the metal complex to be eluted from the silk fibroin membrane (durability) Was also evaluated as follows. In addition, before and after the treatment of removing the complex, copper ion, or ligand from the mixed aqueous solution that does not bind to the silk fibroin, to evaluate the durability of the metal complex contained in the silk fibroin, an aqueous solution of the copper metal complex was used. After mixing with an aqueous solution of silk fibroin, a replacement operation was performed with pure water using a dialysis membrane made of cellulose. The mixed aqueous solution subjected to the dialysis treatment and the mixed aqueous solution not subjected to the dialysis treatment were spread on a polyethylene membrane and evaporated to dryness to prepare a silk membrane containing a copper metal complex. These samples were immersed in an aqueous acetic acid solution of pH 3.8 for 1 to 72 hours, and then the antibacterial activity against tomato canker bacteria was measured. Table 13 shows the obtained results.
[0089]
Table 13 Antibacterial durability of dichloro (1,10-phenanthroline) copper (II) -silk fibroin membrane (bacterial tomato canker: dark conditions)
Reference example 6
The relationship between the binding amount (mmol / g) of cobalt ions to silkworm silk, tussah silk, and wool processed with EDTA anhydride and the processing rate (%) was examined. The binding amount was measured according to the method described in the above “Quantification of metal ions”. FIG. 1 shows the obtained results. The amount of cobalt ion bound to wool (wool-EDTA) processed with EDTA acid anhydride increases markedly as the processing rate increases. In the wool subjected to EDTA processing, when the processing rate is 13% or more, the binding rate of cobalt ions becomes equilibrium. From this, it is sufficient that the amount of EDTA used for wool is such that the binding ratio in a predetermined equilibrium state can be achieved. On the other hand, the binding amount of cobalt ions to the EDTA-processed silkworm silk and tussah silkworm is about 0.5 to 0.6 mmol / g, and the increase in the binding amount is not clear even if the processing rate changes. For this reason, the amount of EDTA used for the silk thread is preferably adjusted so that the EDTA anhydride becomes 10% of the sample weight as a result of the acylation reaction. The difference in the amount of cobalt ion binding between wool and silkworm silk and tussah silk is considered to be based on the following reasons. Cobalt ions bind to raw wool and EDTA-treated wool, unlike the molecular structure of silk, where the molecular structure of wool contains -S = S- bonds between molecules, and this bond is formed in the reduction reaction. This may be because the cobalt ion binds to the resulting -S- group as a result of the cleavage.
Reference example 7
The silkworm silk processed with EDTA acid anhydride is immersed in a cobalt ion-containing aqueous solution (cobalt nitrate aqueous solution) having a different pH for a certain period of time to bind cobalt ions to the processed silkworm silk (silkworm silk-EDTA-cobalt). ), The relationship between the binding amount (mmol / g) of cobalt ions and the pH of the aqueous solution containing cobalt ions was examined. The amount of binding isReference example 6As in the case of the above, the measurement was performed according to the method described in the above “Quantification of metal ions”. FIG. 2 shows the obtained measurement results. In addition, the unprocessed silkworm silk of EDTA acid anhydride was used as a control group (silkworm silk-cobalt). As is clear from FIG. 2, the binding amount of cobalt ions to the raw silkworm silk is substantially zero when the pH of the aqueous solution is less than 7, but when the pH is 7 or more, the binding amount of cobalt ions is reduced. Gradually increased. This is because, when the pH is an acidic pH of less than 7, basic amino acids (for example, Lys, Arg, Hist, etc.) constituting the silkworm silk fibroin are difficult to dissociate, and NH is easily bonded to metal ions.2Is not formed. However, when the pH is 7 or higher, NH3 +Is dissociated by NH2Is formed, it is considered that the binding of cobalt ions is significantly increased. On the other hand, the binding amount of cobalt ions to the silkworm silk thread processed with EDTA acid anhydride is a value of 0.4 to 0.6 mmol / g regardless of the pH of the immersion liquid. The merit of binding can be observed. From this, it is possible to freely select an appropriate aqueous solution pH according to the purpose.
Reference example 8
By immersing the tussah silk processed with EDTA anhydride in a cobalt ion-containing aqueous solution (cobalt nitrate aqueous solution) having a different pH for a certain period of time, cobalt ions are bound to the processed tussah silk (tussah silk-EDTA-cobalt). ), The relationship between the binding amount (mmol / g) of cobalt ions and the pH of the aqueous solution containing cobalt ions was examined. The amount of binding isReference example 6As in the case of the above, the measurement was performed according to the method described in the above “Quantification of metal ions”. FIG. 3 shows the obtained measurement results. In addition, a tussah silk thread unprocessed with EDTA acid anhydride was used as a control group (tussah silk thread-cobalt). As is clear from FIG. 3, the obtained result isReference example 7This was the same as the case of the silkworm silk described above.
Reference example 9
By immersing wool processed with EDTA acid anhydride in a cobalt ion-containing aqueous solution (cobalt nitrate aqueous solution) having a different pH for a certain period of time, cobalt ions are bound to the processed wool (wool-EDTA-cobalt), The relationship between the amount of bound ions (mmol / g) and the pH of the aqueous solution containing cobalt ions was examined. The binding amount was measured in the same manner as in Reference Example 7, according to the method described in the above “Quantification of Metal Ions”. FIG. 4 shows the obtained measurement results. Unprocessed wool of EDTA acid anhydride was used as a control (wool-cobalt). As is clear from FIG.Reference example 7This was the same as the case of the silkworm silk described above.
[0090]
【The invention's effect】
The present inventionThe antibacterial substance which is an antibacterial component used in the antibacterial substance is an antibacterial ligand such as phenanthroline, or a cobalt ion as an antibacterial metal ion, a ruthenium ion and a ligand.Consisting of chemically bonded complexes, all exhibit excellent antibacterial activity. Further, since these antibacterial substances can be combined with biopolymer materials such as silk protein and wool keratin, a durable antibacterial material suitable for use can be provided. Furthermore, even with a ligand that does not exhibit antibacterial activity, a complex coordinated with an antibacterial metal ion exhibits excellent antibacterial activity. The antibacterial activity of each of these antibacterial materials of the present invention changes depending on the light / darkness of the use environment, that is, the light irradiation condition of light irradiation or not, and the antibacterial activity is significantly enhanced under the light irradiation environment. I do.
[0091]
Even if these antimicrobial biopolymer materials are immersed in an aqueous solution having an acidic pH that facilitates elution of metal ions, the antimicrobial properties are extremely low, the antimicrobial effect is sustained, and the durability is excellent. Therefore, the antibacterial material of the present invention can be used not only in the fields requiring conventional antibacterial properties such as the clothing field, medical field, household products field, home appliances / office field, and food field, but also effective against plant pathogenic bacteria. Since it shows activity, it can be suitably used in the fields of agriculture and horticulture. In the field of agriculture and horticulture, it is particularly effective in reducing pathogens in liquids and soil and preventing invasion of pathogens from the outside. It can be used as a disinfectant, a nonwoven fabric sheet for disease control laid on a soil surface, or a protective tape or sheet for a disease treatment part or a resection part of a tree. Furthermore, the antibacterial material of the present invention exhibits similar antibacterial activity against animal pathogenic bacteria and intestinal bacteria close to plant pathogenic bacteria.
[0092]
The antibacterial material of the present invention does not elute the metal ions contained therein, so there is no danger of injuring the living body and the environment. In addition, by using a plurality of metal complexes coordinated with metal ions, various metal ions can be immobilized on the same material surface and simultaneously supported, so that the antibacterial spectrum can be further controlled and expanded.
[0093]
The present inventionUsed inIn the case of an antibacterial complex, it contains an antibacterial metal ion, and since the metal ion and the ligand form a complex, it is difficult for the antibacterial component to be eluted. Has features. Further, even if a person comes into contact with the antibacterial material, the antibacterial component does not adhere to the material, which is safe.
[0094]
The composition of the antibacterial metal ion, ligand, or complex used in the present invention can be used as a spray, and easily imparts antibacterial properties to wood, paper, metal, glass, ceramics, plastics, and any other objects. It is possible to give.
[0095]
Further, since the antibacterial material of the present invention exhibits antibacterial properties against microorganisms such as bacteria and has excellent antibacterial effect durability, for example, clothing such as underwear, shirts, blouses and pajamas, sleeping clothes, etc. It is suitable as various antibacterial products such as appliances, towels, handkerchiefs or bandages, or as a material for various antibacterial products such as mats, sheets, cotton bodies, and crushed bodies.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of cobalt ion bound to silkworm silk, tussah silk, and wool processed with EDTA anhydride and the processing rate by acylation.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the amount of cobalt ions bound to silkworm silk and the pH of an aqueous solution containing cobalt ions.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of cobalt ions bound to tussah silk and the pH of the aqueous solution containing cobalt ions.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the amount of cobalt ions bound to wool and the pH of a cobalt ion-containing aqueous solution.
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