JP3577171B2 - Glucodextranase gene, recombinant DNA and method for producing glucodextranase - Google Patents

Description

【００１０】
本発明の第２は、 以下の（ａ） または（ｂ） のタンパク質をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子である。
（ａ） 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） アミノ酸配列（ａ） において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコデキストラナーゼ活性を有するタンパク質
本発明の第３は、上記記載の組み換え体ＤＮＡである。
【００１１】
本発明の第４は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体である。
本発明の第５は、上記形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物よりグルコデキストラナーゼを採取することを特徴とするグルコデキストラナーゼの製造法である。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、グルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有する遺伝子の調製について述べる。
本酵素をコードする遺伝子のドナー微生物としては、本酵素を生産するものであれば、如何なるものでもよく、例えば、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株〔Ｊ． ＡＰＰｌ． Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．， 第４３巻、７３ー７８頁（１９９６）〕等が挙げられる。上記菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同様であり、通常は、液体培地による振盪培養法または、通気撹拌培養法等が用いられる。
【００１３】
培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタミン、ミネラル及び本酵素の誘導基質であるデキストランを含んだものが用いられる。ｐＨは、本菌が成育するｐＨ領域であればいずれでもよく、通常は、６〜８の範囲が好ましい。
【００１４】
培養条件は、例えば、通常２０〜４０℃で、１６時間〜４日間振盪培養または通気撹拌培養を行う。この様にして得られる培養物を、例えば３０００ｒｐｍ以上、好ましくは８０００〜１００００ｒｐｍで５分以上、好ましくは１０〜２０分間遠心分離してアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４株の菌体を得る。この菌体より、例えば、斎藤、三浦の方法〔バイオケム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕の方法等により染色体ＤＮＡを得ることができる。
【００１５】
次いで、この染色体ＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、例えばＳａｕ３Ａ１（宝酒造社製）を、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度０．１〜１０ユニット／ｍｌ で２０分以上、好ましくは３０分〜２時間作用させて部分消化し、種々の鎖長の染色体ＤＮＡ断片を得る。染色体ＤＮＡ断片は、必要によりフェノール抽出処理、フェノール、クロロホルム抽出処理、エタノール沈殿処理等の既存の精製工程により精製する。
【００１６】
一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵＣ１１８ＤＮＡ（宝酒造社製）等が好ましい。
【００１７】
上記ベクターＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１０〜１０００ユニット／ｍｌで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。ベクターＤＮＡは、必要によりフェノール抽出処理、フェノール、クロロホルム抽出処理、あるいはエタノール沈殿処理等の既存の精製工程により精製する。
【００１８】
次いで、上記のようにして得たアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来で、グルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物と切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）等、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７℃、好ましくは４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。本工程は市販のライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて行なうことも可能である。
【００１９】
この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）、大腸菌ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）、大腸菌ＤＨ Ｉ （ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ−１７７６ （ＡＴＣＣ３１２４４） 、大腸菌ＸＬ１（東洋紡社製）等を形質転換あるいは形質導入して夫々の菌株を得る。この形質転換は、ディー・エム・モーリソン（Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕により行なうことができる。また形質導入は、ビー・ホーン（Ｂ．Ｈｏｈｎ）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができる。
【００２０】
そして、上記菌株よりグルコデキストラナーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、グルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グルコデキストラナーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を得ることができる。
【００２１】
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、ピー・グーリー（Ｐ．Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ．バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１１６巻、第１０６４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェイ．バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕等により得ることができる。
【００２２】
更に上記グルコデキストラナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを用いて、実施例の項目４に示すようにＴａｑポリメラーゼを用いたサンガー・ジデオキシ・ターミネーション（Ｓａｎｇｅｒ／ｄｉｄｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法によってグルコデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行ない（配列番号２参照）、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポチペプチドのアミノ酸一次配列を確定する。（配列番号１参照）。
【００２３】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、かつ、グルコデキストラナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子は、全て本発明に含まれる。
【００２４】
そして、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個の、好ましくは１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、かつ、グルコデキストラナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで選択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
【００２５】
上記の様にして得られたグルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グルコデキストラナーゼ生産能を有する形質転換体または形質導入体、例えばエッシェリシア属に属する菌株を用いてグルコデキストラナーゼを生産するには、培養法は、原則的には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地による振盪培養法または、通気撹拌培養法等が好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、初発ｐＨは、７〜９に調製するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間実施するのが好ましい。
【００２６】
培養終了後、該培養物よりグルコデキストラナーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
例えば、常法により菌体を超音波破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いてグルコデキストラナーゼを抽出するか、または、トルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化をおこなわせグルコデキストラナーゼを菌体外に排出させる。この溶菌液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、これを水に透析した後真空乾燥して粗酵素標品を得る。
【００２７】
更に、グルコデキストラナーゼの精製標品を得るには、例えばＤＥＡＥ−セファロース〔ジエチルアミンエチルセファロース、ファルマシア社製〕、ＤＥＡＥ−セファデックス〔ファルマシア社製〕等のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、例えばセファデックスＧ−２００〔ファルマシア社製〕、バイオラッドＰ−１５０〔バイオラッド社製〕等のゲル濾過による各種クロマトグラフィーを行ない、必要により、例えばＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ〔東ソー社製〕等のイオン交換クロマトグラフィーあるいは、例えば、ＴＳＫ ｇｅｌ エーテル５ＰＷ〔東ソー社製〕、ＴＳＫ ｇｅｌ フェニル５ＰＷ〔東ソー社製〕等の疎水クロマトグラフィー、あるいは、例えばＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ〔東ソー社製〕等のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）操作を適宜組合せて実施することにより、高度に精製されたグルコデキストラナーゼ酵素標品を得ることができる。
上記手段により得られる精製グルコデキストラナーゼの理化学的性質は、親株由来のグルコデキストラナーゼの性質と全く同様である。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
（１）アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡの調製
１％デキストラン４０（名糖産業社製）、１％ペプトン（極東製薬工業社製）、０．５％ ＮａＣｌ及び０．１％イーストエキストラクト（ディフコ社製）からなる液体培地（水道水使用、ｐＨ ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、１２０℃で２０分間、滅菌処理を行なった。これに、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５８１２）保存スラントより１白金耳接種し、３０℃で１日間振盪培養した。本培養液１ｍｌを上記と同一の培地組成と滅菌条件により調製した１０ｍｌの培地を含有する大型試験管に接種し、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で２日間振盪培養を行ない、培養終了後、培養液から８０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離処理により菌体を分離し、湿潤菌体約５０ｍｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケム．バイオフィズ．アクタ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕により染色体ＤＮＡ溶液１ｍｌを得た。
【００３０】
次いで、この染色体溶液３６０μｌ（約２００μｇ染色体ＤＮＡ）及び制限酵素Ｓａｕ３Ａ１（宝酒造社製）０．２ユニットを、５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４含有）（ｐＨ７．４）に混合し、３７℃で１時間反応させて部分消化液を得た。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈殿処理した後、このＳａｕ３Ａ１で部分消化されたＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁記載の方法で子牛ホスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理により、ＤＮＡ断片の脱燐酸化反応を行ない、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して、Ｓａｕ３Ａ１で部分消化されたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡ断片１６０μｇを得た。
【００３１】
（２）プラスミドベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡを利用したアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製及びエンドデキストラナーゼ遺伝子の検索
プラスミドベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡ（宝酒造社製）２０μｇ及び制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）１０ユニットを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４含有）（ｐＨ７．４）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得た。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈殿処理して、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８を得た。
【００３２】
次いで、このＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡ断片１μｇ、上記項目（１）で得られたＳａｕ３Ａ１で部分消化されたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡ断片１μｇ及びＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を常法に従って混合後、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。
【００３３】
このようにして得た組み換え体プラスミドＤＮＡ含有液１０μｌを大腸菌コンピテントセル（ＸＬ２）（東洋紡社製）１００μｌと混合し、氷中で２０分間静置することにより形質転換を行なった。本形質転換液１１０μｌを前記と同様の滅菌条件により調製した滅菌済Ｔ−Ｙ培地〔１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（ディフコ社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）イーストエキストラクト（ディフコ社製）及び０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）〕３ｍｌに接種し、３７℃で３０分間振盪培養した後、培養液を２００μｌずつ滅菌済ブルーデキストラン含有Ｘ−Ｇａｌプレート〔０．５％（Ｗ／Ｖ）ブルーデキストラン（ファルマシア社製）、１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（ディフコ社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）イーストエキストラクト（ディフコ社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ、１．５％寒天（ｐＨ７．２）を前記と同様の滅菌条件により滅菌処理したものに、滅菌済フィルター（孔径 ０．２２μｍ）（ミリポア社製）で無菌濾過したＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ベーリンガーマンハイム社製）、Ｘ−Ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ベーリンガーマンハイム社製）及びアンピシリン（シグマ社製）を無菌的に添加して夫々、５０μｇ／ｍｌ（Ｗ／Ｖ）ＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌ（Ｗ／Ｖ）Ｘ−Ｇａｌ及び２５μｇ／ｍｌ（Ｗ／Ｖ）アンピシリンの濃度に調製した培地を直径９ｃｍのシャーレに２０ｍｌずつ分注したプレート〕に塗布し、３７℃で２４時間静地培養した。生じたコロニーのうち、白色コロニーのものを染色体ＤＮＡライブラリーとし、ライブラリーの中でコロニーのまわりにクリアーハローを生じる菌株を検索した。その結果、染色体ＤＮＡライブラリー約１００００コロニーより陽性コロニーを１０株得た。
【００３４】
該陽性株を前記と同様の滅菌条件により調製した滅菌済Ｔ−Ｙ培地にアンピシリン及びＩＰＴＧを各々終濃度５０μｇ／ｍｌになるように、無菌的に添加して調製した液体培地３ｍｌに１白金耳接種後、３７℃で１６時間振盪培養を行ない培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより菌体を分離し、湿潤菌体約２ｍｇを得た。該菌体から、〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、第２５〜２８頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年〕記載のアルカリ法によりエンドデキストラナーゼ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従いエタノール沈殿処理により精製した後、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０） 緩衝液に溶解した。該組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＤＸ１〜ｐＤＸ１０と命名した。該プラスミドＤＮＡを用いて〔ジェイ． バクテリオロジー（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１９巻、第１０７２頁〜１０７４頁 （１９７４年）〕記載の形質転換法により大腸菌ＸＬ２株（東洋紡社製）を形質転換し、エンドデキストラナーゼ活性を検討し、形質転換株を得た。
【００３５】
この様にして得られたエンドデキストラナーゼ遺伝子を含む形質転換体より、再度アルカリ法によりプラスミドを抽出し、次いで、組み換え体プラスミドＤＮＡｐＤＸ７及びｐＤＸ１を用いてキロシークエンス用欠失キット（宝酒造社製）を用い、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）の方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２８巻、第３５１〜３５９頁、（１９８４年）〕に従い、エンドデキストラナーゼ遺伝子及びその近傍の遺伝子に種々の欠失が導入されたプラスミドＤＮＡを作製し、項目（２）と同様にして大腸菌ＸＬ２を形質転換した。再度アルカリ法によりプラスミドを抽出し、得られた２本鎖ＤＮＡによるシークエンシングはタックポリメラーゼシークエンシングキット（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕及びＤＮＡシークエンサー〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕を用いて、常法に従って行なった。得られたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のエンドデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列及びその近傍の塩基配列を解析したところ、ｐＤＸ１の挿入ＤＮＡ断片のエンドデキストラナーゼ遺伝子の上流に、約２．４ｋｂのオープンリーディングフレームが存在していることが確認され、その塩基配列から翻訳されるアミノ酸一次配列中に、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のグルコデキストラナーゼのリジルエンドペプチダーゼ処理により得られたペプチド断片の配列と一致する箇所が、数箇所確認された。すなわち、この約２．４ｋｂのオープンリーデイングフレームは、グルコデキストラナーゼのＣ末端側約８００アミノ酸残基をコードしていることが明かとなった。
【００３６】
（３）プローブＤＮＡの作製
そこで、本オープンリーデイングフレーム上の、中間部分約１．２ｋｂをプローブとして、プローブ法により、グルコデキストラナーゼ遺伝子の全長が挿入された組み換え体ＤＮＡを検索した。中間部分の塩基配列より、２０残基のセンスプライマー、アンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕により合成し、ｐＤＸ１を鋳型にして、ＬＡＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により中間部分約１．２ｋｂの配列を増幅させた。増幅された約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を含んだ反応溶液を１．５％アガロースゲル電気泳動操作に供し、目的のＤＮＡ断片をゲルから常法に従って抽出し、エタノール沈殿処理後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０）緩衝液に溶解した。該ＤＮＡ溶液を、ＤＮＡラベリング＆ディテクションキット〔Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、（ベーリンガー社製）〕を用いてラベリングし、非放射性プローブＤＮＡを作製した。
【００３７】
（４）グルコデキストラナーゼ遺伝子の検索及びグルコデキストラナーゼ遺伝子の塩基配列の解析
項目（３）で調製した非放射性プローブＤＮＡを用いて、項目（２）で作製した染色体ＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーション処理を〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓａｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）第９０〜９９頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年〕記載の方法により行なった。対合した非放射性プローブＤＮＡの検出は、ＤＮＡラベリング＆ディテクションキット〔Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、（ベーリンガー社製）〕を用いて行なった。その結果、染色体ＤＮＡライブラリー約５０００コロニーより陽性コロニーを４株得た。該陽性株を前記と同様の滅菌条件により調製した滅菌済Ｔ−Ｙ培地３ｍｌに１白金耳接種後、３７℃で１６時間振盪培養を行ない培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより菌体を分離し、湿潤菌体約２ｍｇを得た。
【００３８】
該菌体から、〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓａｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）第２５〜２８頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年〕記載のアルカリ法によりグルコデキストラナーゼ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従いエタノール沈殿処理により精製した後、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０）緩衝液に溶解した。得られた４株の組み換え体ＤＮＡをｐＧＤ７、ｐＧＤ８、ｐＧＤ９、ｐＧＤ１１と命名した。該プラスミド上の挿入断片の塩基配列を解析は、２本鎖ＤＮＡを調製後、ダイプライマータックポリメラーゼシークエンシングキット及びダイターミネータータックポリメラーゼシークエンシングキット（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕及びＤＮＡシークエンサー〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕を用いて、常法に従って行なった。その結果、ｐＧＤ８には、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のグルコデキストラナーゼのＮ末端側のアミノ酸一次配列と完全に一致する配列が確認され、グルコデキストラナーゼ遺伝子を全長含んでいることが明かとなった。得られたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のグルコデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列を配列番号２に、また該塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号１に夫々示した。更に、これら２種類のプラスミド１μｇを制限酵素を組み合わせて処理することにより切断した後、常法に従い、０．７％及び１．５％アガロースゲル電気泳動を行ない各ＤＮＡ断片の長さを調べることにより、制限酵素開裂地図を作成した。
【００３９】
（５）大腸菌ＸＬ２（ｐＧＤ８）の培養及び粗グルコデキストラナーゼ酵素液の調製
大腸菌ＸＬ２（ｐＧＤ８）（ＦＥＲＭ Ｐ−１５８１３）を、Ｔ−Ｙ培地３ｍｌ中で温度３７℃で１６時間振盪培養した後、培養液を氷中で２分間超音波処理して得た粗酵素液中のグルコデキストラナーゼ活性は、約４．４ｍＵ／ｍｌであった。尚、比較の為ｐＵＣ１１８ベクターＤＮＡを有する大腸菌ＸＬ２を用いて、上記と同様の処理を行なって得た細胞抽出液中のグルコデキストラナーゼ活性を測定した結果、活性は検出されなかった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、グルコデキストラナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体及びこの形質転換体または形質導入体を用いてグルコデキストラナーゼを製造する方法を提供する。又、この方法によりグルコデキストラナーゼを高価なデキストランを培地に添加することなく短時間に、かつ、効率的に生産することができる。したがって、本発明は産業上きめて有用である。
【００４１】
【配列表】

【００４２】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a glucodextranase gene, a recombinant DNA, a transformant or a transductant, and a method for producing glucodextranase.
[0002]
[Prior art]
Cyclic isomatooligosaccharides synthesized from dextran by the action of cyclic isomatooligosaccharide synthase are novel novel cyclic isomatooligosaccharides isolated for the first time by the present inventors from a culture in a dextran-containing medium of one strain isolated from soil. This is a useful cyclic oligosaccharide which is expected to be used for pharmaceuticals, foods, etc. by forming an inclusion compound with a low molecular weight compound in the same manner as cyclodextrin (Japanese Patent Application Laid-Open No. H6-197783). reference).
[0003]
Since this cyclic oligosaccharide is also a specific inhibitor of glucan synthase produced by Streptococcus genus known as a causative bacterium of dental caries, it significantly inhibits plaque formation. Therefore, application to anti-caries agents is also expected (see JP-A-8-59484).
[0004]
On the other hand, in order to efficiently produce cyclic isomaltooligosaccharides, a patent application was filed for a method for producing the cyclic isomaltooligosaccharides using a cyclic isomaltooligosaccharide synthase, which is an enzyme for synthesizing cyclic isomaltooligosaccharides from dextran (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-1995). No. 8276).
[0005]
Furthermore, when isolating and purifying the cyclic oligosaccharide, glucodextranase, which is an exo-type dextranase, is allowed to act to specifically remove linear isomaltoligosaccharides contaminating as impurities. The cyclic oligosaccharide can be purified by a simple operation.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Glucodextranase has, for example, been, for example, up to now two strains of Arthrobacter globiformis [Agric. Biol. Chem. 40, 1293-1299 (1976), J. Am. Appl. Glycosci. 43, pp. 73-78 (1996)], and as a similar enzyme, Streptococcus mitis [Carbohyrdo. Res. 29, 1-14 (1973)].
[0007]
Since glucodextranase produced by these bacteria is an inducing enzyme, there is a problem that expensive dextran must be added to the medium and the culture time is long.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Thus, the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned points, and as a result, for the first time, isolated a gene encoding glucodextranase from Arthrobacter gloviformis T-3044 strain and determined its structure. Succeeded and completed the present invention. That is, the first aspect of the present invention is a DNA fragment containing the glucodextranase gene having the following restriction enzyme cleavage map and having a base pair of 4.8 Kb.
[0009]

[0010]
A second aspect of the present invention is a glucodextranase gene encoding the following protein (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and having a glucodextranase activity
A third aspect of the present invention is the above-described recombinant DNA.
[0011]
A fourth aspect of the present invention is a transformant or a transductant containing the recombinant DNA.
A fifth aspect of the present invention is a method for producing glucodextranase, comprising culturing the above transformant or transductant in a medium and collecting glucodextranase from the culture.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
First, preparation of a gene containing a gene encoding glucodextranase will be described.
As the donor microorganism of the gene encoding the present enzyme, any microorganism can be used as long as it produces the present enzyme. For example, Arthrobacter globiformis strain T-3044 [J. APPl. Glycosci. 43, 73-78 (1996)]. The cultivation of the above strain is basically the same as the method employed in aerobic cultivation of general microorganisms, and usually, a shaking culture method using a liquid medium, an aeration stirring culture method, or the like is used.
[0013]
As the medium, a medium containing an appropriate nitrogen source, carbon source, vitamins, minerals, and dextran which is an inducing substrate of the present enzyme is used. The pH may be any range as long as the present bacterium can grow, and is usually preferably in the range of 6 to 8.
[0014]
As for the culture conditions, for example, shaking culture or aeration and stirring culture is usually performed at 20 to 40 ° C. for 16 hours to 4 days. The culture thus obtained is centrifuged at, for example, 3000 rpm or more, preferably 8000 to 10000 rpm for 5 minutes or more, preferably 10 to 20 minutes to obtain the cells of Arthrobacter globiformis T-3044. From the cells, chromosomal DNA can be obtained, for example, by the method of Saito and Miura [Biochem. Biophys. Acta, Vol. 72, p. 619 (1963)]. .
[0015]
Then, a restriction enzyme that generates a protruding end in the chromosomal DNA, for example, Sau3A1 (Takara Shuzo) is used at a temperature of 30 ° C. or more, preferably 37 ° C., and an enzyme concentration of 0.1 to 10 units / ml for 20 minutes or more, preferably A partial digestion is performed for 30 minutes to 2 hours to obtain chromosomal DNA fragments of various chain lengths. The chromosomal DNA fragment is purified by an existing purification step, such as phenol extraction, phenol / chloroform extraction, or ethanol precipitation, as necessary.
[0016]
On the other hand, the vector DNA that can be used in the present invention may be any vector DNA, for example, a plasmid vector DNA, a bacteriophage vector DNA, etc., and specifically, for example, a plasmid pUC118 DNA (manufactured by Takara Shuzo) is preferred.
[0017]
A restriction enzyme that produces a protruding end in the vector DNA, for example, BamHI is digested by acting at a temperature of 30 ° C. or higher, preferably 37 ° C., and an enzyme concentration of 10 to 1000 units / ml for 1 hour or longer, preferably 1 to 3 hours. To obtain a cleaved vector DNA. The vector DNA is purified by an existing purification step such as a phenol extraction treatment, a phenol / chloroform extraction treatment, or an ethanol precipitation treatment, if necessary.
[0018]
Next, a mixture of a DNA fragment mixture containing the gene encoding glucodextranase derived from the strain of Arthrobacter globiformis T-3044 obtained as described above and the cut vector DNA were mixed. Ligase (manufactured by New England Biolabs) T4 DNA ligase (manufactured by Boehringer Mannheim) or the like, preferably T4 DNA ligase, at a temperature of 4 to 37 ° C, preferably 4 to 16 ° C, and an enzyme concentration of 1 to 100 units for 1 hour or more, preferably Is allowed to act for 6 to 24 hours to obtain a recombinant DNA. This step can also be performed using a commercially available ligation kit (Takara Shuzo).
[0019]
Using this recombinant DNA, for example, Escherichia coli K-12, preferably Escherichia coli JM101 (ATCC33876), Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo), Escherichia coli HB101 (ATCC33694), Escherichia coli DH I (ATCC33849), Escherichia coli χ-1776 (ATCC31244) , Escherichia coli XL1 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) or the like, to obtain each strain. This transformation is performed by the method of DM Morrison (Methods in Enzymology, Vol. 68, pp. 326-331 (1979)). Can be. Transduction can be carried out by the method of B. Hohn (Methods in Enzymology, Vol. 68, pp. 299-309 (1979)).
[0020]
Then, by screening a strain having glucodextranase-producing ability from the above-mentioned strains, a recombinant DNA obtained by inserting a DNA containing a gene encoding glucodextranase into a vector DNA is obtained. A strain belonging to the genus Escherichia can be obtained.
[0021]
To obtain a novel recombinant DNA purified from the thus obtained strain, for example, a method such as P. Guerry [J. Bacteriology (J. Bacteriology), Vol. 116, pp. 1064-1066 (1973)], the method of DB Clewell [J. Bacteriology (J. Bacteriology), Vol. 110, pp. 667-676 (1972)] and the like.
[0022]
Further, using the DNA containing the glucodextranase gene, all bases of the glucodextranase gene were obtained by the Sanger / dideoxy termination method using Taq polymerase as shown in item 4 of the Examples. The sequence is analyzed (see SEQ ID NO: 2), and then the primary amino acid sequence of the potipeptide translated by the gene having the nucleotide sequence is determined. (See SEQ ID NO: 1).
[0023]
In addition, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or more amino acids are added, deleted or substituted, and the glucodextranase gene encoding the amino acid sequence that brings about glucodextranase activity is all Included in the present invention.
[0024]
In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or more, preferably one or several amino acids are added, deleted or substituted, and the amino acid sequence which brings about glucodextranase activity is encoded. Any method can be used to obtain a glucodextranase gene, for example, a site-directed mutagenesis method, which is a well-known technique for generating a point mutation or a deletion mutation in a gene; selectively cleaving the gene; A method of removing or adding a selected nucleotide and linking genes; an oligonucleotide mutagenesis method and the like.
[0025]
A transformant or a transductant having a glucodextranase-producing ability, including a recombinant DNA obtained by inserting a DNA containing the gene encoding glucodextranase obtained as described above into vector DNA, such as Escherichia In order to produce glucodextranase using a strain belonging to the genus, the culture method is basically the same as that employed in aerobic culture of general microorganisms, but usually, shaking with a liquid medium A culturing method or an aerated stirring culturing method is preferred. As the medium, for example, yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor or one or more nitrogen sources such as leachate of soybean or wheat bran, potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, One or more inorganic salts such as magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate are added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins and the like are appropriately added. The initial pH is suitably adjusted to 7 to 9. The cultivation is preferably carried out at 30 to 42 ° C, preferably around 37 ° C, for 4 to 24 hours, preferably 6 to 24 hours.
[0026]
After completion of the culture, glucodextranase can be collected from the culture using a conventional enzyme collecting means.
For example, the cells are disrupted by ultrasonic crushing, trituration, or the like by a conventional method, or glucodextranase is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken in the presence of toluene or the like. Alternatively, the glucodextranase is left to undergo autolysis and the glucodextranase is excreted out of the cells. The lysate is filtered, centrifuged, etc. to remove the solid portion, and if necessary, nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate or manganese sulfate.Then, ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added thereto and fractionated. The precipitate is collected, dialyzed against water, and dried under vacuum to obtain a crude enzyme preparation.
[0027]
Further, in order to obtain a purified sample of glucodextranase, for example, ion exchange chromatography such as DEAE-Sepharose (diethylamine ethyl sepharose, manufactured by Pharmacia), DEAE-Sephadex (manufactured by Pharmacia), or, for example, Sephadex Various chromatography by gel filtration such as G-200 (manufactured by Pharmacia) and Bio-Rad P-150 (manufactured by Bio-Rad) is performed, and if necessary, ion-exchange chromatography such as TSK gel DEAE-5PW (manufactured by Tosoh) is performed. Or hydrophobic chromatography such as TSK gel ether 5PW (manufactured by Tosoh Corporation) and TSK gel phenyl 5PW (manufactured by Tosoh Corporation), or HPLC (for example, TSK gel G3000SW (manufactured by Tosoh Corporation)) By implementing body chromatography) in combination operate properly, it is possible to obtain a highly purified glucosyltransferase dextranase enzyme preparation.
The physicochemical properties of the purified glucodextranase obtained by the above means are exactly the same as those of the glucodextranase derived from the parent strain.
[0028]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[0029]
【Example】
(1) Preparation of chromosomal DNA of Arthrobacter globiformis T-3044 strain
Liquid medium (using tap water, 1% dextran 40 (manufactured by Meito Sangyo), 1% peptone (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical), 0.5% NaCl, and 0.1% yeast extract (manufactured by Difco) (pH 7.0) 100 ml was placed in a 500 ml Sakaguchi flask and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. One platinum loop was inoculated from the stock slant of Arthrobacter globiformis strain T-3044 (FERM P-15812) and cultured with shaking at 30 ° C for 1 day. 1 ml of the main culture solution was inoculated into a large test tube containing 10 ml of the medium prepared under the same medium composition and sterilization conditions as described above, and subjected to shaking culture at 30 ° C. and 120 rpm for 2 days. From the cells by centrifugation at 8000 rpm for 20 minutes to obtain about 50 mg of wet cells, and from the cells, the method of Saito and Miura [Biochem. Bio Fizz. Actor. (Biochim. Biophys. Acta), Vol. 72, p. 619 (1963)] to obtain 1 ml of a chromosomal DNA solution.
[0030]
Next, 360 μl (about 200 μg chromosomal DNA) of this chromosome solution and 0.2 units of Sau3A1 (Takara Shuzo) were added to 50 mM Tris-HCl buffer (100 mM NaCl and 10 mM MgSO 4). ₄ (PH 7.4) and reacted at 37 ° C. for 1 hour to obtain a partially digested solution. The reaction-finished solution is subjected to phenol extraction and ethanol precipitation in a conventional manner, and then, in order to prevent the DNA fragment partially digested with Sau3A1 from recombining, molecular cloning (Molecular Cloning), 133- The DNA fragment was dephosphorylated by calf phosphatase (Calf Intestine Alkaline Phosphatase) treatment according to the method described on page 134, and subjected to phenol extraction by a conventional method, followed by ethanol precipitation and partial digestion with Sau3A1. 160 μg of a chromosomal DNA fragment of Lactobacillus globiformis T-3044 strain was obtained.
[0031]
(2) Construction of a chromosomal DNA library of Arthrobacter globiformis T-3044 strain using plasmid vector pUC118 DNA and search for endodextranase gene
20 μg of plasmid vector pUC118 DNA (Takara Shuzo) and 10 units of BamHI (Takara Shuzo) were added to a 50 mM Tris-HCl buffer (100 mM NaCl and 10 mM MgSO 4). ₄ (PH 7.4) and reacted at 37 ° C. for 2 hours to obtain a digestive juice. The reaction-terminated liquid was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation according to a conventional method to obtain a plasmid vector pUC118 digested with BamHI.
[0032]
Then, 1 μg of the plasmid vector pUC118 DNA fragment digested with BamHI, 1 μg of the chromosomal DNA fragment of the Arthrobacter globiformis T-3044 strain partially digested with Sau3A1 obtained in the above item (1), and a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) Was mixed at a temperature of 16 ° C. for 16 hours to link DNA.
[0033]
Transformation was performed by mixing 10 μl of the thus obtained recombinant plasmid DNA-containing solution with 100 μl of E. coli competent cells (XL2) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and allowing to stand on ice for 20 minutes. Sterile TY medium [1% (W / V) Bacto-tripton (manufactured by Difco), 0.5% (W / V) yeast extract prepared from 110 μl of the transformant under the same sterilization conditions as above (Manufactured by Difco) and 0.5% (W / V) NaCl (pH 7.2)], and cultured with shaking at 37 ° C. for 30 minutes. Then, 200 μl of the culture solution was sterilized with X-Gal containing blue dextran. Plate [0.5% (W / V) Blue Dextran (Pharmacia), 1% (W / V) Bacto Trypton (Difco), 0.5% (W / V) Yeast Extract (Difco) ), 0.5% (W / V) NaCl, 1.5% agar (pH 7.2) sterilized under the same sterilization conditions as described above, and a sterilized filter (pore size 0.22 μm) (Millipore) Made) Aseptically filtered IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) (Boehringer Mannheim), X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactopyranoside) (Boehringer Mannheim) and Ampicillin (Bolinger Mannheim) ) Was aseptically added to the culture medium to a concentration of 50 μg / ml (W / V) IPTG, 40 μg / ml (W / V) X-Gal and 25 μg / ml (W / V) ampicillin, respectively, with a diameter of 9 cm. And a plate dispensed 20 ml at a time in a Petri dish), and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Among the resulting colonies, those of white colonies were used as a chromosomal DNA library, and strains that produced a clear halo around the colonies in the library were searched. As a result, 10 positive colonies were obtained from about 10,000 colonies of the chromosomal DNA library.
[0034]
One platinum loop was added to 3 ml of a liquid medium prepared by aseptically adding ampicillin and IPTG to a sterilized TY medium prepared under the same sterilization conditions as described above to a final concentration of 50 μg / ml. After the inoculation, the cells were shake-cultured at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes to separate the cells, thereby obtaining about 2 mg of wet cells. From the microbial cells, [Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edition, pages 25-28, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press), [Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edition], pages 25-28, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edition). 1989)], a plasmid DNA containing the endodextranase gene was extracted by the alkaline method described above, purified by ethanol precipitation according to a conventional method, and then 200 µl of TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0). Dissolved in buffer. The recombinant plasmid DNA was designated as pDX1 to pDX10. Using the plasmid DNA [J. Escherichia coli XL2 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed by the transformation method described in Bacteriology (J. Bacteriology), Vol. 119, pp. 1072 to 1074 (1974), and the endodextranase activity was examined. A transformant was obtained.
[0035]
A plasmid was again extracted from the thus obtained transformant containing the endodextranase gene by the alkaline method, and then a deletion kit for kilosequencing (manufactured by Takara Shuzo) using the recombinant plasmid DNAs pDX7 and pDX1. According to the method of Henikoff (Gene, Vol. 28, pp. 351-359, (1984)), various deletions were introduced into the endodextranase gene and genes in the vicinity thereof. The resulting plasmid DNA was prepared and Escherichia coli XL2 was transformed in the same manner as in item (2). The plasmid was extracted again by the alkali method, and sequencing with the obtained double-stranded DNA was performed using a tack polymerase sequencing kit (Taq Polymerase sequencing kit) [Applied Biosystem Instruments (ABI)] and a DNA sequencer [ Applied Biosystem Instruments (ABI)] according to a conventional method. When the entire base sequence of the obtained endodextranase gene derived from the strain of Arthrobacter gloviformis T-3044 and the base sequence in the vicinity thereof were analyzed, it was found that the upstream DNA of the endodextranase gene of the inserted DNA fragment of pDX1 was The presence of a 2.4 kb open reading frame was confirmed, and the primary amino acid sequence translated from the nucleotide sequence was treated with lysyl endopeptidase of glucodextranase derived from Arthrobacter globiformis T-3044 strain. Several places that corresponded to the sequence of the peptide fragment obtained by were confirmed. That is, it was revealed that the open reading frame of about 2.4 kb encodes about 800 amino acid residues on the C-terminal side of glucodextranase.
[0036]
(3) Preparation of probe DNA
Therefore, a recombinant DNA having the full-length glucodextranase gene inserted therein was searched by a probe method using about 1.2 kb of an intermediate portion on the open reading frame as a probe. Based on the nucleotide sequence of the intermediate portion, a sense primer and an antisense primer each having 20 residues were synthesized by a DNA synthesizer (Applied Biosystem Instruments (ABI)), and a LAPCR kit (Takara Shuzo) using pDX1 as a template. The sequence of about 1.2 kb in the middle part was amplified by a PCR method using the following method. The reaction solution containing the amplified DNA fragment of about 1.2 kb was subjected to a 1.5% agarose gel electrophoresis operation, the target DNA fragment was extracted from the gel according to a conventional method, and after ethanol precipitation, TE (10 mM Tris) was added. , 1 mM EDTA, pH 8.0) buffer. The DNA solution was labeled using a DNA labeling & detection kit [Nonradioactive DNA labeling and detection kit, (Boehringer)] to prepare a non-radioactive probe DNA.
[0037]
(4) Search for glucodextranase gene and analysis of nucleotide sequence of glucodextranase gene
Using the non-radioactive probe DNA prepared in item (3), colony hybridization treatment was performed on the chromosomal DNA library prepared in item (2) [Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edition (Molecular) Cloning a Laboratory Manual Sonic Edition, pp. 90-99, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. Detection of the paired non-radioactive probe DNA was performed using a DNA labeling and detection kit [Nonradioactive DNA labeling and detection kit, (Boehringer)]. As a result, four positive colonies were obtained from about 5000 colonies of the chromosomal DNA library. After inoculating one loopful of the positive strain into 3 ml of sterilized TY medium prepared under the same sterilization conditions as described above, shake culture is performed at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the culture, the culture is centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes. As a result, the cells were separated to obtain about 2 mg of wet cells.
[0038]
From the cells, [Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edition, pages 25-28, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press)] The plasmid DNA containing the glucodextranase gene was extracted by the alkali method described in [1989], purified by ethanol precipitation according to a conventional method, and then buffered with 200 µl of TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0). Dissolved in the liquid. The obtained recombinant DNAs of the four strains were named pGD7, pGD8, pGD9, and pGD11. The nucleotide sequence of the inserted fragment on the plasmid was analyzed by preparing a double-stranded DNA, and then using a dye primer tack polymerase sequencing kit and a dye terminator tack polymerase sequencing kit (Taq Polymerase sequencing kit) [Applied Biosystems Instruments, Inc. (Manufactured by ABI)] and a DNA sequencer [Applied Biosystem Instrument (manufactured by ABI)] according to a conventional method. As a result, pGD8 was confirmed to have a sequence completely matching the primary amino acid sequence at the N-terminal side of glucodextranase derived from Arthrobacter globiformis T-3044 strain, and contains the entire glucodextranase gene. It became clear. SEQ ID NO: 2 shows the entire nucleotide sequence of the glucodextranase gene derived from the obtained Arthrobacter globiformis T-3044 strain, and SEQ ID NO: 1 shows the amino acid primary sequence of the polypeptide translated from the nucleotide sequence. Was. Furthermore, 1 μg of these two types of plasmids are digested by treating with a combination of restriction enzymes, and then subjected to 0.7% and 1.5% agarose gel electrophoresis according to a conventional method to examine the length of each DNA fragment. Generated a restriction enzyme cleavage map.
[0039]
(5) Culture of Escherichia coli XL2 (pGD8) and preparation of a crude glucodextranase enzyme solution
Escherichia coli XL2 (pGD8) (FERM P-15813) was shake-cultured in 3 ml of TY medium at a temperature of 37 ° C. for 16 hours, and then the culture was sonicated on ice for 2 minutes to obtain a crude enzyme solution. Had a glucodextranase activity of about 4.4 mU / ml. For comparison, glucodextranase activity in a cell extract obtained by performing the same treatment as described above using Escherichia coli XL2 having pUC118 vector DNA was not detected.
[0040]
【The invention's effect】
According to the present invention, a glucodextranase gene, a recombinant DNA containing the gene, a transformant or a transductant containing the recombinant DNA, and glucodextranase produced using the transformant or the transductant Provide a method. In addition, glucodextranase can be efficiently produced in a short time without adding expensive dextran to the medium by this method. Therefore, the present invention is industrially useful.
[0041]
[Sequence list]

[0042]

Claims (5)

It is derived from Arthrobacter globiformis,
It has the following restriction enzyme cleavage map, and
Containing a glucodextranase gene encoding an amino acid sequence that provides glucodextranase activity ,
A DNA fragment having a base pair of 4.8 Kb .

A glucodextranase gene encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and which has glucodextranase activity A recombinant DNA obtained by incorporating the glucodextranase gene according to claim 1 or 2 or a DNA fragment containing the gene into a vector DNA. A transformant or a transductant containing the recombinant DNA according to claim 3. A method for producing glucodextranase, comprising culturing the transformant or the transductant according to claim 4 in a medium, and collecting glucodextranase from the culture.