JP3585274B2

JP3585274B2 - Interferon-γ production promoter

Info

Publication number: JP3585274B2
Application number: JP29073794A
Authority: JP
Inventors: 重昭石坂; 正雄小林; 良雄古沢
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-11-25
Filing date: 1994-11-25
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2019-11-04
Also published as: JPH08143592A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、配列表中の配列番号１で示されるペプチドを有効成分とするインターフェロン−γ産生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決すべき課題】
生体は細菌やウイルス等の感染に対し免疫応答反応によって対抗するが、その免疫応答反応の担い手となるマクロファージやリンパ球が産生する液性因子を、一般にサイトカインと呼ぶ。
【０００３】
サイトカインに分類される物質の中にインターロイキン（以下、「ＩＬ」という。）と呼ばれる一群の物質が存在し、それらは、現在インターロイキン１〜１５（以下、それぞれ「ＩＬ−１」〜「ＩＬ−１５」という。）に分類されている。
【０００４】
ＩＬ−１は、リンパ球活性化因子と呼ばれていた物質であり、１０^−１０モル以下という極微量で、種々の生理活性作用を示し、生体の恒常性維持機構に深く関与していることが知られている。このＩＬ−１の生理活性に着目し、ＩＬ−１を医薬品等として利用する研究が進められた。しかし、ＩＬ−１は種々の生理活性を有するため、これを生体に大量に投与すると、目的とする作用以外の作用も同時に発現し、生体の恒常性維持が図れなくなるという危険性があった。そこで、その危険性を回避するため、ＩＬ−１の持つ生理作用のうちの一部の生理活性作用のみを有する物質（一般に「ＩＬ−１様活性物質」と呼ばれている。）をＩＬ−１の代わりに利用する研究が進められた。
【０００５】
ＩＬ−１様活性物質の一つとして配列番号１で示されるポリペプチド（以下、「Ｐ−１０」という。）が見出され、その生理活性として、特異的抗体産生増強作用及びコンカナバリンＡ共存下における胸腺細胞に対する増強作用を有することが確認された（特開平３−１７０４９８号公報）。
【０００６】
さらに、最近、Ｐ−１０が肝癌細胞の増殖を抑制する一方、正常肝細胞の増殖を促進することが報告された（サイトカイン、Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．３，１９９４：ｐｐ２６５−２７１（本文献中で、Ｐ−１０．２と称しているものは本明細書でいうＰ−１０と同一物質である。））。本文献には、ＩＬ−１は肝癌細胞の増殖を抑制しなかったことも記載されていることから、Ｐ−１０のＩＬ−１様活性ではない、新たな生理活性が見出された。
【０００７】
そこで、本発明は、Ｐ−１０の未知の生理活性を探求すべく、リンパ球等のいわゆる免疫担当細胞ではない、肝細胞に対するＰ−１０の作用を明らかにし、Ｐ−１０の新たな用途を見出すことを目的とする。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため、鋭意研究を重ねた結果、Ｐ−１０がインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」という。）の産生を特異的に促進させることを見出し本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、アミノ酸配列（配列番号１）
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
からなるペプチド（すなわち「Ｐ−１０」）を有効成分とするＩＦＮ−γ産生促進剤を第一の要旨とする。
さらに、本発明は、Ｐ−１０のＩＦＮ−γ産生促進作用に基づく抗ウイルス剤を第二の要旨とする。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＩＦＮ−γ産生促進剤は、生体の細胞に働きかけ、後述の生理活性を有するＩＦＮ−γを細胞に産生させることを促すものである。
【００１１】
ここで、ＩＦＮは、ウイルスや核酸などの刺激を受けた動物細胞が産生し、細胞外に分泌される抗ウイルス蛋白質として見出された物質であり、その後の研究により、抗ウイルス作用のみでなく、抗腫瘍作用や免疫系の活性化等様々な活性を示すことが明らかにされた。ＩＦＮは、α型、β型及びγ型に大別され、ウイルス等以外のレクチンやマイトジェンなどの刺激によって、Ｔ細胞等から産生されるものをγ型（ＩＦＮ−γ）と呼ぶ。ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用は示すが、ＩＦＮ−α及びβとは構造上の類似性もなく、その作用する細胞上のレセプターも異なっており、その性質や作用もＩＦＮ−α及びβとはかなり異なっている。それ故、現在では、ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用を示すが、インターロイキン類として位置づけられている。
【００１２】
ＩＦＮ−γの生理活性としては、上述の抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞障害性Ｔリンパ球の誘導促進作用、ナチュラルキラー細胞活性の誘導作用、好中球の活性化作用、マクロファージの活性化作用、ＭＨＣクラスＩＩの発現促進作用、ＩＬ−２リセプターの発現促進作用、Ｆｃリセプターの発現促進作用等が知られている。
【００１３】
また、ＩＦＮは、元々生体の異物に対する防御機構の一端を担う生体内物質であり、極めて選択毒性が高く、生体にとって安全性の高いものである。
【００１４】
生体細胞を刺激してＩＦＮ−γの分泌を促進させる本発明のＰ−１０を有効成分とする薬剤（以下、「本発明薬剤」という。）は、ＩＦＮ−γの有する生理活性を当然に引き出しうるものである。従って、本発明薬剤は、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗細菌感染症剤として使用できるものである。
【００１５】
本発明薬剤の有効成分であるＰ−１０の正常細胞に対する安全性は、上述の文献（サイトカイン）及び後述する試験例１によって確認し、ＩＦＮ−γ産生促進作用は、試験例２及び３の実験によって確認した。
【００１６】
本発明薬剤は、ヒトその他の温血動物のＩＦＮ−γの産生促進が望ましい疾病、例えば癌、ウイルス感染症、細菌感染症（例えば、肝膿腫、肝アメーバー症）等の治療及び予防に適用できるが、特に癌の治療及び、ウイルス感染症の治療及び予防に好適に用いることができる。
【００１７】
本発明薬剤は、各種剤型、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤等の経口剤、注射剤、貼付剤、軟膏等の経皮剤、経粘膜剤、インプラント剤、点眼剤等に調製して用いることができる。
【００１８】
本発明薬剤の製剤化に当たっては、製薬学的に許容しうる賦形剤、補助剤、他の薬効成分を添加することが可能である。添加する賦形剤等としては、例えば塩化ナトリウム、グリシン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、ショ糖、澱粉、デキストラン、ゼラチン等が挙げられる。
【００１９】
本発明薬剤のＰ−１０含有量は、剤型により異なるが、一般に固体及び半固体形態の場合には製剤重量に対し５〜１００重量％、また液体形態の場合には０．０１〜１０重量％とすることが望ましい。
【００２０】
本発明薬剤の投与量は、投与対象となるヒトを含む温血動物の種類、治療又は予防すべき疾患の種類、症状の軽重、投与部位、剤型、医師の判断等により広範に変えることができ、投与量の上限及び下限は固定されないが、本発明薬剤の有効成分であるＰ−１０の量で、一般に１日当たり５μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ〜４ｍｇ／ｋｇとすることができる。なお、本発明薬剤は、一日当たり上記投与量となるように、一日一回又は数回に分けて投与することができる。
【００２１】
本発明薬剤は、その有効成分であるＰ−１０の薬効を損なわない限り、他の薬剤、例えば制癌剤、抗ウイルス剤、抗生物質、化学療法剤等の疾病治療剤、ビタミン剤、糖液等の栄養補給剤などと併用することができる。
【００２２】
本発明の第二の要旨であるＰ−１０のＩＦＮ−γ産生促進作用に基づく抗ウイルス剤（以下、「本発明抗ウイルス剤」という。）は、治療又は予防すべき疾患がウイルス感染症である以外は、上述した本発明薬剤と同様である。すなわち、その投与剤型、Ｐ−１０含有量、投与量等は、本発明薬剤について説明したとおりである。
【００２３】
本発明抗ウイルス剤が適用されるウイルス感染症としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイスル、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスによるウイルス性肝炎等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
試験例１：正常マウス肝細胞の増殖におけるＰ−１０の影響
正常マウス肝細胞株であるＮＣＴＣＣｌｏｎｅ１４６９（以下、「Ｃｌｏｎｅ１４６９」という。）の細胞増殖がＰ−１０によってどのような影響を受けるかを試験した。細胞増殖反応は、ブロモデオキシウリジンの取り込みにより測定した。
【００２６】
細胞増殖の検出は、免疫組織化学的検出システム（細胞増殖検出キット、アマシャム社製）を用いて測定した。
Ｃｌｏｎｅ１４６９細胞（２×１０^４個／ｍｌ）にＰ−１０を添加し、２４穴平底プレート（コーニング社製）にて培養し、さらに、１μｇ／ｍｌのブロモデオキシウリジンを添加し、６時間培養した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄後、細胞を酸−エタノールで３０分間固定し、さらに、抗−ブロモデオキシウリジンモノクローナル抗体１００μｌ／ｗｅｌｌとペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、ブロモデオキシウリジンを取り込んだ細胞は０．０３％Ｈ_２Ｏ_２、０．０３％ＮｉＣｌ_２含有ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）溶液を添加して染色し、顕微鏡下で測定した。
【００２７】
本試験結果を下記表１に示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】
表１の結果から、Ｐ−１０は正常肝細胞の増殖を促進することがわかる。
【００３０】
試験例２：Ｐ−１０が肝癌細胞及び正常肝細胞のサイトカイン分泌に与える影響
肝細胞が分泌することが知られているサイトカインの分泌が、Ｐ−１０によってどのような影響を受けるかを調べるため、Ｃｌｏｎｅ１４６９及びマウス肝癌細胞株であるＭＨ１３４のサイトカイン分泌細胞数の変動をＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）法に従い測定した。
【００３１】
すなわち、サイトカインとしては、ヘルパーＴ細胞１（Ｔ_ｈ１）由来のＩＦＮ−γ及び、ヘルパーＴ細胞２（Ｔ_ｈ２）由来のＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０を検出した。
【００３２】
Ｃｌｏｎｅ１４６９細胞及びＭＨ１３４細胞にＰ−１０を添加し、４２時間培養した。培養液を遠心分離後、細胞を集め、それぞれの細胞を１％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液（日水製薬社製）に５×１０^４個／０．５ｍｌの濃度で懸濁し、ミリセル（直径１２ｍｍ）の各ｗｅｌｌ（０．５ｍｌ容）に分注し、２４穴平底プレート（コーニング社製）中、５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。６時間後に培養液を捨て、ミリセル膜表面をセル・スクラッパー（住友ベークライト社製）にて軽くこすり付着している細胞を除去し、ミリセル膜表面をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．６）にて３回洗浄した。
【００３３】
次いで、ミルセル膜に２％過酸化水素含有ＴＢＳを加え、１０分間反応させた後、ミリセル膜を１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）にて５回洗浄した。ミリセル膜に３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製）含有ＴＢＳを加え、３７℃で１時間反応させて、ミリセル膜の各ｗｅｌｌの膜をブロックした。その後、ミリセル膜をＴＢＳＴにて３回洗浄し、各ｗｅｌｌにそれぞれビオチン標識抗マウス・ＩＦＮ−γ抗体、ビオチン標識抗マウス・ＩＬ−４抗体、ビオチン標識抗マウス・ＩＬ−５抗体及びビオチン標識抗マウス・ＩＬ−１０抗体（それぞれファーミンゲン社製、５００倍希釈したもの）を０．２ｍｌを加えて一昼夜放置した後、ミリセル膜をＴＢＳＴにて４回洗浄した。
【００３４】
各ｗｅｌｌは、アビジン・ペルオキシダーゼ（ベクター・ラボラトリー社製、ＡＢＣキット）を加えて３０分間反応させ、ＴＢＳにて３回洗浄し、０．２ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び０．００３％過酸化水素含有ＴＢＳを加えて１０分間反応後、各ｗｅｌｌ中に形成されたスポットを顕微鏡下で計数した。
【００３５】
形成されたスポットの数は、それぞれのサイトカインを産生している細胞の数に相当する。
【００３６】
表２に本試験の結果を示す。
【００３７】
【表２】

【００３８】
表２の結果から、Ｃｌｏｎｅ１４６９細胞及びＭＨ１３４細胞は、Ｐ−１０の刺激が無くてもサイトカインを分泌している細胞が存在することがわかる。
【００３９】
正常肝細胞株であるＣｌｏｎｅ１４６９では、Ｐ−１０の添加によってＩＦＮ−γを分泌する細胞数のみが有意に増加しているが、ＩＬ−４、５及び１０については対照群と有意差がない。また、肝癌細胞株であるＭＨ１３４では、いずれのサイトカインについても、Ｐ−１０の添加によって有意に変動していないことがわかる。
【００４０】
上記の結果から、Ｐ−１０は、正常肝細胞のＩＦＮ−γの産生を特異的に促進することがわかる。
【００４１】
試験例３：Ｐ−１０が正常肝細胞のＩＦＮ−γ分泌に与える影響
上記試験例２において、Ｐ−１０の添加により正常肝細胞Ｃｌｏｎｅ１４６９細胞のＩＦＮ−γ分泌が促進されたことが確認された。そこで、本試験においては、正常肝細胞のＩＦＮ−γ分泌におけるＰ−１０濃度の影響を調べた。
【００４２】
試験は、Ｐ−１０濃度を下記表３に示す濃度とした以外は、試験例２と同様に実施した。本試験結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】

【００４４】
表３の結果から、Ｐ−１０を１０、５０及び１００μｇ／ｍｌ添加した場合、それぞれ対照群の約２．１倍、３．２倍及び３．０倍多くの細胞がＩＦＮ−γを分泌していることがわかる。
【００４５】
以上の試験例から、Ｐ−１０は、正常肝細胞を刺激してＩＦＮ−γの産生を特異的に促進させることが明らかになった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明薬剤は、正常な生体細胞にとって安全性が高く、正常な生体細胞、特に肝細胞にＩＦＮ−γの産生を促進させることができ、ＩＦＮ−γの生理活性に基づく有用な薬効を期待できる。
【００４７】
すなわち、本発明によって、ＩＦＮ−γの産生促進が望ましい疾病の治療又は予防に有用な新規な薬剤が提供された。
【００４８】
【表４】

[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to an interferon-γ production promoter comprising, as an active ingredient, the peptide represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0002]
[Prior Art and Problems to be Solved by the Invention]
Living organisms counteract infections such as bacteria and viruses by an immune response reaction, and humoral factors produced by macrophages and lymphocytes, which are responsible for the immune response reaction, are generally called cytokines.
[0003]
Among substances classified as cytokines, there is a group of substances called interleukins (hereinafter, referred to as “IL”), which are currently known as interleukins 1 to 15 (hereinafter, “IL-1” to “IL”, respectively). -15 ").
[0004]
IL-1 is a substance known as lymphocyte activating factor, 10 in trace amounts as ^-10 mol or less, show various physiological activities, that are deeply involved in the biological homeostatic mechanisms It has been known. Focusing on the physiological activity of IL-1, research on using IL-1 as a drug or the like has been advanced. However, since IL-1 has various physiological activities, if it is administered to a living body in a large amount, there is a risk that an effect other than a desired effect is simultaneously expressed, and homeostasis of the living body cannot be maintained. Therefore, in order to avoid the danger, a substance having only a part of the physiological activities of IL-1 (generally referred to as "IL-1-like active substance") is used as IL-. Research to use instead of 1 was advanced.
[0005]
A polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “P-10”) was found as one of the IL-1-like active substances, and its physiological activity was in the presence of a specific antibody production-enhancing effect and concanavalin A coexistence. Has an enhancing effect on thymocytes in E. coli (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-170498).
[0006]
Furthermore, it has recently been reported that P-10 suppresses the growth of hepatoma cells while promoting the growth of normal hepatocytes (cytokine, Vol. 6, No. 3, 1994: pp265-271 (in this document) And what is referred to as P-10.2 is the same substance as P-10 in this specification.)). This document also describes that IL-1 did not inhibit the growth of hepatoma cells, and thus a new physiological activity, not the IL-1-like activity of P-10, was found.
[0007]
Therefore, the present invention clarifies the action of P-10 on hepatocytes, which are not so-called immunocompetent cells such as lymphocytes, in order to explore the unknown physiological activity of P-10, and proposes a new use of P-10. The purpose is to find out.
[0008]
[Means to solve the problem]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, found that P-10 specifically promotes the production of interferon-γ (hereinafter, referred to as “IFN-γ”). Completed the invention.
[0009]
That is, the present invention provides an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1)
Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-Ile-Val-Leu-Leu-Lys
A first gist is an IFN-γ production promoter containing a peptide consisting of (P-10) as an active ingredient.
Furthermore, the second aspect of the present invention provides an antiviral agent based on the IFN-γ production promoting action of P-10.
[0010]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The IFN-γ production promoter of the present invention acts on cells in a living body to promote the production of IFN-γ having the below-mentioned physiological activity.
[0011]
Here, IFN is a substance found as an antiviral protein secreted and produced extracellularly by animal cells stimulated with viruses and nucleic acids. It has been shown to exhibit various activities such as antitumor activity and activation of the immune system. IFNs are roughly classified into α-type, β-type and γ-type, and those produced from T cells or the like by stimulation with lectins or mitogens other than viruses are called γ-type (IFN-γ). IFN-γ exhibits an antiviral effect, but has no structural similarity to IFN-α and β, has a different receptor on the cell on which it acts, and its properties and effects are different from those of IFN-α and β. Are quite different. Therefore, IFN-γ has an antiviral effect at present and is positioned as an interleukin.
[0012]
The physiological activities of IFN-γ include the above-described antiviral action, antitumor action, cytotoxic T lymphocyte induction promotion action, natural killer cell activity induction action, neutrophil activation action, macrophage activation The action, the action of promoting the expression of MHC class II, the action of promoting the expression of IL-2 receptor, the action of promoting the expression of Fc receptor and the like are known.
[0013]
Further, IFN is an in vivo substance originally serving as one part of a defense mechanism against foreign substances in a living body, and has extremely high selective toxicity and is highly safe for a living body.
[0014]
A drug containing P-10 of the present invention as an active ingredient that stimulates living cells to promote secretion of IFN-γ (hereinafter referred to as “the drug of the present invention”) naturally elicits the physiological activity of IFN-γ. It is a good thing. Therefore, the agent of the present invention can be used as an antiviral agent, an antitumor agent, and an antibacterial infectious agent.
[0015]
The safety of P-10, which is an active ingredient of the drug of the present invention, against normal cells was confirmed by the above-mentioned literature (cytokine) and Test Example 1 described later. The IFN-γ production promoting effect was confirmed by the experiments of Test Examples 2 and 3. Confirmed by
[0016]
The agent of the present invention can be applied to the treatment and prevention of diseases in which the production of IFN-γ in humans and other warm-blooded animals is desirable, for example, cancer, viral infections, bacterial infections (eg, liver abscess, hepatic amoebiasis) and the like. However, it can be suitably used particularly for the treatment of cancer and the treatment and prevention of viral infections.
[0017]
The drug of the present invention is prepared into various dosage forms, for example, oral preparations such as tablets, granules, capsules and powders, transdermal preparations such as injections, patches and ointments, transmucosal preparations, implant preparations, eye drops and the like. Can be used.
[0018]
In formulating the medicament of the present invention, pharmaceutically acceptable excipients, adjuvants, and other pharmaceutically active ingredients can be added. Examples of the excipients to be added include sodium chloride, glycine, lactose, mannitol, sorbitol, sucrose, starch, dextran, gelatin and the like.
[0019]
The P-10 content of the drug of the present invention varies depending on the dosage form, but is generally 5 to 100% by weight based on the weight of the preparation in the case of solid or semi-solid form, and 0.01 to 10% by weight in the case of liquid form % Is desirable.
[0020]
The dose of the drug of the present invention can be varied widely depending on the type of warm-blooded animal including human being to be administered, the type of disease to be treated or prevented, the severity of the symptoms, the administration site, the dosage form, the judgment of the doctor, etc. Although the upper and lower limits of the dose are not fixed, the amount can be generally 5 μg to 10 mg / kg, preferably 10 μg to 4 mg / kg per day, based on the amount of the active ingredient P-10 of the drug of the present invention. The drug of the present invention can be administered once or several times a day so that the above-mentioned dosage is obtained per day.
[0021]
The drug of the present invention is not limited to other drugs, such as anticancer drugs, antiviral drugs, antibiotics, chemotherapeutic agents, and the like, as long as the active ingredient P-10 is not impaired. It can be used in combination with nutritional supplements and the like.
[0022]
An antiviral agent based on the promotion of IFN-γ production of P-10, which is the second gist of the present invention (hereinafter referred to as “the antiviral agent of the present invention”), is a disease to be treated or prevented, which is a viral infection. Except for this, it is the same as the drug of the present invention described above. That is, the dosage form, P-10 content, dosage, etc. are as described for the drug of the present invention.
[0023]
Examples of the virus infection to which the antiviral agent of the present invention is applied include, but are not limited to, hepatitis B virus, hepatitis C virus, viral hepatitis caused by hepatitis D virus, and the like.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0025]
Test Example 1: Effect of P-10 on proliferation of normal mouse hepatocytes How cell proliferation of NCTC Clone 1469 (hereinafter referred to as “Clone 1469”), which is a normal mouse hepatocyte cell line, is affected by P-10. Tested. Cell proliferation response was measured by bromodeoxyuridine incorporation.
[0026]
Cell proliferation was measured using an immunohistochemical detection system (cell proliferation detection kit, manufactured by Amersham).
P-10 was added to Clone 1469 cells (2 × 10 ⁴ cells / ml), cultured in a 24-well flat bottom plate (manufactured by Corning), and further added with 1 μg / ml bromodeoxyuridine, and cultured for 6 hours. . After washing three times with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2), the cells were fixed with acid-ethanol for 30 minutes, and further, anti-bromodeoxyuridine monoclonal antibody 100 μl / well and peroxidase-labeled anti-mouse IgG 100 μl / well Was added, and cells that had taken up bromodeoxyuridine were stained with a DAB (diaminobenzidine) solution containing 0.03% H ₂ O ₂ and 0.03% NiCl ₂ , and the cells were measured under a microscope.
[0027]
The test results are shown in Table 1 below.
[0028]
[Table 1]

[0029]
The results in Table 1 show that P-10 promotes the growth of normal hepatocytes.
[0030]
Test Example 2: Effect of P-10 on cytokine secretion of hepatoma cells and normal hepatocytes To investigate how P-10 affects the secretion of cytokines known to be secreted by hepatocytes , Clone 1469, and the number of cytokine secreting cells of the mouse liver cancer cell line MH134 were measured according to the ELISPOT (Enzyme-linked immunospot) method.
[0031]
That is, the cytokines, helper T cells 1 _(T h 1) from IFN-gamma and T-helper cell 2 _(T h 2) was detected IL-4, IL-5 and IL-10 derived.
[0032]
P-10 was added to Clone 1469 cells and MH134 cells and cultured for 42 hours. After the culture was centrifuged, the cells were collected, and each cell was suspended in a 1% fetal bovine serum-containing RPMI 1640 culture solution (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at a concentration of 5 × 10 ⁴ cells / 0.5 ml. Each well (diameter: 12 mm) was dispensed into each well (0.5 ml volume) and cultured in a 24-well flat bottom plate (manufactured by Corning) at 37 ° C. for 6 hours in the presence of 5% carbon dioxide gas. After 6 hours, the culture solution is discarded, and the cells adhering lightly to the surface of the millicell membrane with a cell scraper (manufactured by Sumitomo Bakelite) are removed, and the surface of the millicell membrane is washed with Tris-buffered saline (TBS, pH 7.6). ) Three times.
[0033]
Next, 2% hydrogen peroxide-containing TBS was added to the mill cell membrane and reacted for 10 minutes, and then the millicell membrane was washed five times with 1% Tween 20 (Sigma) -containing TBS (TBST). TBS containing 3% bovine serum albumin (BSA) (manufactured by Sigma) was added to the millicell membrane and reacted at 37 ° C. for 1 hour to block each well of the millicell membrane. Thereafter, the millicell membrane was washed three times with TBST, and each well was separately labeled with a biotin-labeled anti-mouse / IFN-γ antibody, a biotin-labeled anti-mouse / IL-4 antibody, a biotin-labeled anti-mouse / IL-5 antibody, and a biotin-labeled anti-mouse. After adding 0.2 ml of mouse / IL-10 antibody (each manufactured by Pharmingen, diluted 500 times) and allowing it to stand overnight, the millicell membrane was washed four times with TBST.
[0034]
Each well was added with avidin peroxidase (ABC kit, manufactured by Vector Laboratories), reacted for 30 minutes, washed three times with TBS, 0.2 mg / ml diaminobenzidine (DAB) and 0.003% peroxide. After adding hydrogen-containing TBS and reacting for 10 minutes, the spot formed in each well was counted under a microscope.
[0035]
The number of spots formed corresponds to the number of cells producing each cytokine.
[0036]
Table 2 shows the results of this test.
[0037]
[Table 2]

[0038]
From the results in Table 2, it can be seen that Clone 1469 cells and MH134 cells include cells secreting cytokines even without stimulation of P-10.
[0039]
In Clone 1469, which is a normal liver cell line, only the number of cells secreting IFN-γ is significantly increased by the addition of P-10, but IL-4, 5, and 10 are not significantly different from the control group. In addition, in MH134, which is a liver cancer cell line, none of the cytokines was significantly changed by the addition of P-10.
[0040]
The above results indicate that P-10 specifically promotes the production of IFN-γ in normal hepatocytes.
[0041]
Test Example 3: Effect of P-10 on IFN-γ secretion of normal hepatocytes In Test Example 2, it was confirmed that the addition of P-10 promoted IFN-γ secretion of normal hepatocyte Clone 1469 cells. . Thus, in this test, the effect of P-10 concentration on IFN-γ secretion of normal hepatocytes was examined.
[0042]
The test was performed in the same manner as in Test Example 2 except that the P-10 concentration was changed to the concentration shown in Table 3 below. Table 3 shows the test results.
[0043]
[Table 3]

[0044]
From the results in Table 3, when P-10 was added at 10, 50 and 100 μg / ml, about 2.1, 3.2 and 3.0 times more cells secreted IFN-γ than the control group, respectively. You can see that it is.
[0045]
From the above test examples, it was revealed that P-10 stimulates normal hepatocytes to specifically promote the production of IFN-γ.
[0046]
【The invention's effect】
The agent of the present invention is highly safe for normal living cells, can promote the production of IFN-γ in normal living cells, particularly hepatocytes, and can be expected to have useful drug effects based on the physiological activity of IFN-γ. .
[0047]
That is, the present invention provides a novel drug useful for treating or preventing a disease in which promotion of IFN-γ production is desired.
[0048]
[Table 4]

Claims

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 1)
Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-Ile-Val-Leu-Leu-Lys
An interferon-γ production promoter comprising a peptide consisting of:

The interferon-γ production promoter according to claim 1, which promotes the production of interferon-γ in normal hepatocytes.

An antiviral agent based on the interferon-γ production promoting effect of the peptide having the amino acid sequence according to claim 1 (SEQ ID NO: 1) .