JP3588451B2

JP3588451B2 - Decomposition treatment method of aromatic chlorine compounds by microorganisms

Info

Publication number: JP3588451B2
Application number: JP2001282280A
Authority: JP
Inventors: 伸幸江藤
Original assignee: Espec Corp
Current assignee: Espec Corp
Priority date: 2001-09-17
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2004-11-10
Anticipated expiration: 2021-09-17
Also published as: JP2003088359A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物を用いた芳香族塩素化合物の分解処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）等に代表される芳香族塩素化合物は、人間や動物に毒性を示すものが多い。皮膚や消化器等から体内に取り込まれると、皮膚傷害や肝臓傷害を引き起こす。さらに、生体中や環境中では分解され難いため、蓄積し、食物連鎖を通して濃縮されていく性質がある。これまでにＰＣＢｓ分解処理技術として、熱処理技術、化学的処理技術、微生物処理技術等が開発されてきた。熱処理技術は、ＰＣＢｓを完全に無機化するための温度管理が難しい。炉の運転温度が低くなると、有害な物質であるダイオキシンの発生が指摘されている。化学的処理技術は、処理条件が高温、高圧の場合が多く、時には金属ナトリウム等の激しい反応性を示す試薬を使用している。従って、装置が大掛かりになり、条件によっては安全上問題がある。微生物を用いた処理方法は、特開平４−３７００９７号公報、特開２０００−２７９５５１号公報等の微生物を用いた例が報告されているが、これらの微生物ではＰＣＢｓの置換塩素数が増えると微生物の分解能が低下するために何らかの脱塩素処理が必要となる等の問題を有するものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ溶液中で、芳香族塩素化合物の脱塩素反応を促進するとともに、至適生育域がアルカリ域にあり、しかも芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物を用いた芳香族塩素化合物の分解処理方法を提供することを目的とする。本発明の他の目的はかかる微生物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、
（１）バチルスｓｐ．Ｍ−７株（ＦＥＲＭＰ−１８４８２）をポリ塩化ビフェニルとともに培養する工程を含む、ポリ塩化ビフェニルの分解処理方法、並びに
（２）芳香族塩素化合物を分解する能力を有するバチルスｓｐ．Ｍ−７株（ＦＥＲＭＰ−１８４８２）、
に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の分解処理方法に用いる芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物について説明する。
【０００６】
本発明において「芳香族塩素化合物」とは、その分子中に１以上の塩素を有する芳香族化合物またはその混合物をいう。
【０００７】
本発明において「芳香族塩素化合物を分解する能力を有する」とは、芳香族塩素化合物が培地成分の炭素源として与えられたとき、資化、分解することをいう。芳香族塩素化合物を分解する能力は、下記の実施例２に記載されるようにガスクロマトグラフィー（以下、ＧＣと呼ぶ）、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと呼ぶ）、質量分析器（以下、ＭＳと呼ぶ）等を用いて測定することができ、分解菌を入れていないものに比して分解対象の芳香族塩素化合物の減少が認められるものを「芳香族塩素化合物を分解する能力を有する」ものと判定する。
【０００８】
本発明において「好塩基性微生物」とは、塩基性環境下、好ましくはｐＨ８〜１１．５で生育可能な微生物である。
【０００９】
芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物としては、バチルス属に属する微生物等が挙げられ、特に限定されない。一例として、バチルスｓｐ．Ｍ−７株が挙げられる。該株は、ＦＥＲＭＰ−１８４８２として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年８月２４日に寄託されている。
【００１０】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株の至適生育ｐＨは、１０．４であり、生育可能なｐＨ範囲は９〜１１．３である。至適生育温度は３０℃であり、生育可能な温度範囲は２０〜４０℃である。
【００１１】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株の菌学的性質を表１〜３に示す。
【００１２】
【表１】

【００１３】
【表２】

【００１４】
【表３】

【００１５】
該微生物は、好気的生育を示す有芽胞桿菌であることからバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）であると考えられる。生理性状試験からは、ブドウ糖、マンノース、メリビオースから酸を産生し、ゼラチン加水分解陽性、硝酸塩還元能を呈する好塩基性バチルスであることからバチルス・アルカロフィルス（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）が示唆されるものの、ソルビトール、キシロースからの酸産生が認められないため該微生物は、バチルス属に属するものであるが、バチルス属のいずれかの種に分類することは適当ではないと考えられ、バチルスｓｐ．Ｍ−７株と命名されている。バチルスｓｐ．Ｍ−７株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列と近縁にあると考えられる細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の相違性を表４に示し、それに基づく近隣結合法による系統樹を図１に示す。
【００１６】
【表４】

【００１７】
さらに、バチルスｓｐ．Ｍ−７株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列に関するＢＬＡＳＴサーチの結果を、相同性の高いものから１０番目の菌株まで表５に示す。表５中のスコアはＢＬＡＳＴサーチによる相同性の評点を示す。
【００１８】
【表５】

【００１９】
本発明の芳香族塩素化合物の分解処理方法は、前記した芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物を用いることに特徴を有しており、該微生物を芳香族塩素化合物とともに培養する工程を含む。芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物として、好ましくはバチルスｓｐ．Ｍ−７株を用いる。以下に分解処理方法の例として、バチルスｓｐ．Ｍ−７株を用いた場合について説明するが、これに限定されるものではない。本明細書において「分解処理」とは、分解対象成分が対照に対して著しく減少することをいう。
【００２０】
芳香族塩素化合物の具体例としては、クロロベンゼン、ポリ塩化ナフタレン、塩素化ダイオキシン、ビレン、フルオランテン、ポリ塩化ビフェニル、ｐ−クロロ−安息香酸、ｏ−クロロ安息香酸等およびそれらの混合物が挙げられる。
【００２１】
本発明において分解処理の対象となるＰＣＢｓは、置換塩素数が少なくとも１つの塩素を有する化合物である。
【００２２】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株は、至適生育ｐＨが塩基性にある好塩基性微生物である。芳香族塩素化合物の分解処理方法に好塩基性微生物を用いることは、好気的条件下で分解が進行し、かつ分解条件の一つが２８〜３０℃とマイルドな温度範囲で行える等の観点から好適である。
【００２３】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株を芳香族塩素化合物とともに培養する工程は、適当な培地、例えば炭酸ナトリウムによって培地をアルカリ側に調整した培地を用い、少量のビフェニルを生育基質とし、振盪や攪拌のできる環境において行われる。使用する培地は、特に限定されるものではないが、リン酸、マグネシウム及びその他の鉄、亜鉛等の微量成分を含み、窒素源として塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウム又はペプトンなどの有機物分解を用い、ｐＨをアルカリ側に調整したものである。
【００２４】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株を芳香族塩素化合物とともに培養するとは、芳香族塩素化合物を培地に添加して培養することをいう。
【００２５】
培養に添加する菌体数は、分解効率の観点から、一般には、培養液に対して１×１０^５／ｍｌ〜１×１０^６／ｍｌである。
【００２６】
培養温度は、本発明の菌株の生育及びＰＣＢ分解速度の観点から、２０〜４０℃の範囲内が好ましく、２５〜３５℃の範囲内がさらに好ましく、２７〜３２℃の範囲内が特に好ましい。
【００２７】
培養におけるｐＨは、本使用株の生育及びＰＣＢ分解速度の観点から、ｐＨ９〜ｐＨ１１．３が好ましく、ｐＨ９．５〜ｐＨ１１がさらに好ましく、ｐＨ１０．３〜ｐＨ１０．８が特に好ましい。
【００２８】
培養時間は、生育環境維持の観点から、一般に、４〜７日間である。
【００２９】
本発明の分解処理方法において、芳香族塩素化合物の分解処理をモニターするために、培養液を成分分析に供することができる。成分分析は、通常使用される方法が用いられ、例えば、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーが使用される。
【００３０】
本発明の分解処理方法により処理された芳香族塩素化合物の分解処理物は、最終的には水と二酸化炭素であり、遊離した塩素は培地組織によってＫＣｌ又はＮａＣｌ等の塩として廃棄することができる。
【００３１】
【実施例】
本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
ＰＣＢｓ分解菌の分離は、ＰＣＢｓの炭素骨格であるビフェニルを資化する菌を探すことから開始した。ビフェニル分解菌の分離に使用した分離用液体培地の成分および調製方法を以下に示す。
【００３３】
分離用液体培地成分：
Ａ液（蒸留水、１０００ｍｌ当たり）
Ｋ_２ＨＰＯ_４、１ｇ
ＮＨ_４Ｃｌ、１ｇ
ＣＡＰＳ、１１．１ｇ；および
Ｂ液（蒸留水、１０００ｍｌ当たり）
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２０ｇ
ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２ｇ
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ
Ｌ−アスコルビン酸、１ｇ。
【００３４】
Ａ液の調製方法：Ｋ_２ＨＰＯ_４；１ｇ、ＣＡＰＳ；１１．１ｇを蒸留水約９７０ｍｌに溶解後、ｐＨを１０．０に調整し、９８０ｍｌにメスアップする。その後１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。室温に戻してから、ＮＨ_４Ｃｌ１ｇ／２０ｍｌをろ過滅菌して加えた。
【００３５】
Ｂ液の調製方法：適量の蒸留水に各成分を順次溶解後、１０００ｍｌにメスアップし、１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。その後冷蔵保存する。
【００３６】
分離用液体培地の調製：Ａ液１００容に対してＢ液１容の割合で混合し、使用する。
【００３７】
分離用寒天培地の調製：Ｋ_２ＨＰＯ_４；１ｇ、ＣＡＰＳ；１１．１ｇを蒸留水約９７０ｍｌに溶解後、ｐＨを１０．０に調整し、９８０ｍｌにメスアップする。寒天２０ｇを加え１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。５０℃付近に保温。ＮＨ_４Ｃｌ１ｇを含む蒸留水２０ｍｌをろ過滅菌して加え、シャーレに約２０ｍｌ分注する。
【００３８】
ビフェニル分解菌の分離方法：３００ｍｌの三角フラスコに分離用液体培地３０ｍｌ、唯一の炭素源として粉末ビフェニル（約５ｍｇ）、土壌より採集した試料を適量加え、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養をおこなった。添加したビフェニルの減少を目視で確認できたフラスコの培養上清１ｍｌを新しい分離用液体培地に移し振盪培養を続けた。数日後、培養上清の一部をとり、分離用寒天培地に塗布した。粉末ビフェニル（約５００ｍｇ）を置いたシャーレのフタに、培養上清を塗布した寒天表面を下にして重ね、シャーレの縁にビニールテープを巻き、３０℃で静置培養する。寒天培地上に出現してきたコロニーは、新しい分離用寒天培地に塗布し、上記と同様の操作を繰り返し行い、純化を行った。
【００３９】
純化した株のビフェニル分解能は、次の条件によって分析した。
【００４０】
ビフェニルの抽出：培養上清４ｍｌをとり、１ＮＨＣｌ溶液を用いてｐＨを２〜３に調整する。調整後、上清を分液ロートに移し、酢酸エチル２ｍｌを加え、両者をよく混和した。静置後、酢酸エチル層を分取した。同様の操作を繰り返し行い分取した酢酸エチル層を前回分と併せた。全量を４ｍｌにメスアップ後、酢酸エチル層を適量の硫酸ナトリウムを加え脱水し、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００４１】
ＨＰＬＣ分析条件：使用カラム；コスモシール５Ｃ１８（ナカライテスク）、移動相；７０％アセトニトリル、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度；４０℃、吸収波長；２７０ｎｍ、インジェクション量；２０μｌ。
【００４２】
ビフェニル分解能を示した菌の一つについて、前記する菌学的性質を調べたところ、バチルス属の細菌であることが判明し、バチルスｓｐ．Ｍ−７株と命名した。バチルスｓｐ．Ｍ−７株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年８月２４日に寄託した（ＦＥＲＭＰ−１８４８２）。
【００４３】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株による上記ビフェニル分解実験では、培養から７日目にはほとんど全てのビフェニルが分解されていた。
【００４４】
実施例２
ビフェニル分解能を有するバチルスｓｐ．Ｍ−７株を用いてＰＣＢｓ分解実験を行った。本実施例では、ＰＣＢｓとして、ＫＣ−４００（ジーエルサイエンス社製、１分子内に２〜６個の塩素置換を有するＰＣＢｓを下記の比で含む：２塩素置換ＰＣＢｓ；３％、３塩素置換ＰＣＢｓ３３％、４塩素置換ＰＣＢｓ：４４％、５塩素置換ＰＣＢｓ：１６％、６塩素置換ＰＣＢ：５％）を使用した。ＰＣＢｓ分解実験に使用したＰＣＢｓ分解用液体培地の成分および調製方法を以下に示す。
【００４５】
ＰＣＢｓ分解用液体培地の成分：
Ｂ液（実施例１で使用したもの）：および
Ｃ液（蒸留水１０００ｍｌ当たり）
Ｋ_２ＨＰＯ_４、１ｇ
ポリペプトン、０．５ｇ
Ｎａ_２ＣＯ_３、１０ｇ。
【００４６】
Ｃ液の調製：Ｋ_２ＨＰＯ_４；１ｇ、ポリペプトン；０．５ｇを蒸留水９６０ｍｌに溶解し、１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。室温に戻してから、蒸留水４０ｍｌに溶かしたＮａ_２ＣＯ_３；１０ｇをろ過滅菌して加えた。
【００４７】
ＰＣＢｓ分解用液体培地の調製方法：Ｃ液１００容に対してＢ液１容の割合で混合して調製した。
【００４８】
ＰＣＢｓ標準液（ＫＣ−４００を８．７μｇ／ｍｌの濃度でヘキサンに溶解させたもの）のＨＰＬＣ分析の結果を図２により示す。
【００４９】
ＨＰＬＣ分析条件：使用カラム；コスモシール５−ＰＹＥ（ナカライテスク）、移動相；ヘキサン、流速；０．７ｍｌ／ｍｉｎ、吸収波長；２５４ｎｍ、カラム温度；２５℃、インジェクション量；２０μｌ
【００５０】
図２中の各ピークについては、それぞれ、保持時間４．６７分が３塩素置換ＰＣＢであり、保持時間５．２３分および５．３５分が４塩素置換ＰＣＢｓであり、保持時間６．１２分および６．７１分が５塩素置換ＰＣＢｓであり、保持時間７．６８分および８．５７分が６塩素置換ＰＣＢｓであると考えられる。４〜６塩素置換ＰＣＢｓのピークがそれぞれ２つ存在するのは、ビフェニルにおける塩素の置換位置の差異が保持時間に影響したものと考えられる。
【００５１】
ＰＣＢｓ分解実験：３００ｍｌ容三角フラスコにＰＣＢｓ分解用液体培地３０ｍｌ、ＫＣ−４００２３４μｇ（終濃度７．８μｇ／ｍｌ）、播種細胞（バチルスｓｐ．Ｍ−７株）数１．５×１０^５を加え、３０℃、１５０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行い、ＰＣＢｓ分解能を調べた。
【００５２】
ＰＣＢｓ抽出：培養液３０ｍｌを分液ロートに移し、ヘキサン３ｍｌを加え両者をよく混和する。静置後、分離したヘキサン層を分取する。同様の操作をさらに二回繰り返す。分取したヘキサン層をあわせ、ヘキサンで１０ｍｌにメスアップする。ヘキサン層に適量の硫酸ナトリウムを加え脱水し、ＨＰＬＣ分析を行なった。
【００５３】
ＨＰＬＣ分析条件は、前記ＰＣＢｓ標準液のＨＰＬＣ分析に使用した条件と同一である。
【００５４】
バチルスｓｐ．Ｍ−７株によるＰＣＢｓ分解実験のＨＰＬＣ分析を図３に示す。図２のＰＣＢ標準液のＨＰＬＣ分析との比較から、ＰＣＢｓのほとんどがバチルスｓｐ．Ｍ−７株によって分解されていることがわかる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の微生物による芳香族塩素化合物の分解処理方法は、常温常圧において脱塩素が可能であり、特殊な装置を必要とすることなく、低コストでの分解処理が可能であるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バチルスｓｐ．Ｍ−７と近縁の細菌との近隣結合法による系統樹を示す図である。
【図２】図２は、ＰＣＢｓ標準液のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図３】図３は、バチルスｓｐ．Ｍ−７株によるＰＣＢｓ分解実験のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for decomposing an aromatic chlorine compound using a basophile having the ability to decompose an aromatic chlorine compound.
[0002]
[Prior art]
Many aromatic chlorine compounds represented by polychlorinated biphenyls (PCBs) are toxic to humans and animals. When taken into the body from the skin or digestive organs, it causes skin and liver injuries. Furthermore, since it is not easily decomposed in living organisms or the environment, it has the property of accumulating and being concentrated through the food chain. So far, heat treatment technology, chemical treatment technology, microorganism treatment technology and the like have been developed as PCBs decomposition treatment technology. In the heat treatment technique, it is difficult to control the temperature for completely mineralizing PCBs. It has been pointed out that when the operating temperature of the furnace decreases, the generation of harmful dioxin occurs. Chemical processing techniques often use high-temperature, high-pressure processing conditions, and sometimes use reagents that exhibit intense reactivity, such as sodium metal. Therefore, the device becomes large-scale, and there is a safety problem depending on conditions. Examples of treatment methods using microorganisms are disclosed in JP-A-4-37097, JP-A-2000-279551, and the like. However, in these microorganisms, when the number of substituted chlorines in PCBs increases, the microorganisms may be used. However, there is a problem that some dechlorination treatment is required because the resolution of the film is lowered.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention uses, in an alkaline solution, a basophile that promotes the dechlorination reaction of an aromatic chlorine compound, has an optimum growth area in an alkaline area, and has the ability to decompose an aromatic chlorine compound. An object of the present invention is to provide a method for decomposing an aromatic chlorine compound. Another object of the present invention is to provide such a microorganism.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention
(1) Bacillus sp. Comprising the step of M-7 strain (FERM P-18482) is cultured with polychlorinated biphenyls, cracking process of polychlorinated biphenyls, and (2) Bacillus having the ability to degrade aromatic chlorine compounds sp. M-7 strain (FERM P-18482),
About.
[0005]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
First, a basophile having an ability to degrade an aromatic chlorine compound used in the decomposition treatment method of the present invention will be described.
[0006]
In the present invention, the “aromatic chlorine compound” refers to an aromatic compound having one or more chlorine atoms in the molecule or a mixture thereof.
[0007]
In the present invention, "having the ability to decompose an aromatic chlorine compound" means that when the aromatic chlorine compound is given as a carbon source of a medium component, it is assimilated and decomposed. The ability to degrade aromatic chlorine compounds was determined by gas chromatography (hereinafter, referred to as GC), high performance liquid chromatography (hereinafter, referred to as HPLC), and mass spectrometer (hereinafter, referred to as HPLC) as described in Example 2 below. MS), and those that show a decrease in the amount of aromatic chlorine compounds to be degraded compared to those without degrading bacteria are considered to have the ability to degrade aromatic chlorine compounds. Is determined.
[0008]
In the present invention, a "basophile" is a microorganism capable of growing in a basic environment, preferably at a pH of 8 to 11.5.
[0009]
Examples of the basophile having the ability to decompose an aromatic chlorine compound include microorganisms belonging to the genus Bacillus, and are not particularly limited. As an example, Bacillus sp. M-7 strain. The strain was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary on August 24, 2001 as FERM P-18482.
[0010]
Bacillus sp. The optimal growth pH of the M-7 strain is 10.4, and the pH range at which it can grow is 9-11.3. The optimum growth temperature is 30 ° C, and the temperature range at which growth is possible is 20 to 40 ° C.
[0011]
Bacillus sp. Tables 1 to 3 show the bacteriological properties of the M-7 strain.
[0012]
[Table 1]

[0013]
[Table 2]

[0014]
[Table 3]

[0015]
The microorganism is considered to be of the genus Bacillus because it is a spore-forming bacillus exhibiting aerobic growth. Physiological property tests suggest that Bacillus alcalophilus is Bacillus alcalophilus because it is a basophilic bacillus that produces acid from glucose, mannose, and melibiose, is positive for gelatin hydrolysis, and exhibits nitrate reducing ability. Since no acid production from xylose is observed, the microorganism belongs to the genus Bacillus. However, it is considered that it is not appropriate to classify the microorganism into any species of the genus Bacillus, and Bacillus sp. It has been named strain M-7. Bacillus sp. Table 4 shows the differences between the DNA sequence of the 16S rRNA gene of the M-7 strain and the DNA sequence of the 16S rRNA gene of the bacterium which is considered to be closely related, and FIG.
[0016]
[Table 4]

[0017]
Further, Bacillus sp. The results of a BLAST search on the DNA sequence of the 16S rRNA gene of the M-7 strain are shown in Table 5 from the highest homology to the tenth strain. The scores in Table 5 indicate the scores of homology by BLAST search.
[0018]
[Table 5]

[0019]
The method for decomposing an aromatic chlorine compound of the present invention is characterized by using a basophil microorganism having the ability to decompose the above-mentioned aromatic chlorine compound, and culturing the microorganism together with the aromatic chlorine compound. Process. Bacillus sp. Is preferably used as a basophile having the ability to degrade an aromatic chlorine compound. The M-7 strain is used. As an example of the decomposition processing method, Bacillus sp. The case where the M-7 strain is used will be described, but the present invention is not limited to this. As used herein, the term "decomposition treatment" means that the components to be decomposed significantly decrease relative to the control.
[0020]
Specific examples of the aromatic chlorine compound include chlorobenzene, polychlorinated naphthalene, chlorinated dioxin, bilen, fluoranthene, polychlorinated biphenyl, p-chloro-benzoic acid, o-chlorobenzoic acid and the like, and mixtures thereof.
[0021]
PCBs to be decomposed in the present invention are compounds having at least one chlorine atom as the number of substituted chlorine atoms.
[0022]
Bacillus sp. The M-7 strain is a basophile whose basic pH for growth is basic. The use of a basophil in the method for decomposing aromatic chlorine compounds is advantageous in that decomposition proceeds under aerobic conditions, and one of the decomposing conditions can be performed in a mild temperature range of 28 to 30 ° C. It is suitable.
[0023]
Bacillus sp. The step of culturing the M-7 strain together with an aromatic chlorine compound is performed in an environment in which a small amount of biphenyl is used as a growth substrate and a suitable medium, for example, a medium whose alkali medium is adjusted with sodium carbonate, can be shaken or stirred. Is The medium to be used is not particularly limited, but contains a trace component such as phosphoric acid, magnesium and other iron and zinc, uses an organic substance decomposition such as ammonium chloride or ammonium sulfate or peptone as a nitrogen source, and adjusts the pH to alkaline. It is adjusted to the side.
[0024]
Bacillus sp. Culturing the M-7 strain together with an aromatic chlorine compound means adding the aromatic chlorine compound to a medium and culturing the medium.
[0025]
The number of cells to be added to the culture is generally 1 × 10 ⁵ / ml to 1 × 10 ⁶ / ml with respect to the culture solution from the viewpoint of decomposition efficiency.
[0026]
The culture temperature is preferably in the range of 20 to 40 ° C, more preferably in the range of 25 to 35 ° C, and particularly preferably in the range of 27 to 32 ° C, from the viewpoint of the growth of the strain of the present invention and the rate of PCB degradation.
[0027]
The pH in the culture is preferably from pH 9 to pH 11.3, more preferably from pH 9.5 to pH 11, and particularly preferably from pH 10.3 to pH 10.8, from the viewpoint of the growth of this strain and the decomposition rate of the PCB.
[0028]
The culturing time is generally 4 to 7 days from the viewpoint of maintaining the growth environment.
[0029]
In the decomposition treatment method of the present invention, the culture solution can be subjected to component analysis in order to monitor the decomposition treatment of the aromatic chlorine compound. For component analysis, a commonly used method is used, for example, gas chromatography or high performance liquid chromatography.
[0030]
The decomposition product of the aromatic chlorine compound treated by the decomposition treatment method of the present invention is finally water and carbon dioxide, and the released chlorine can be discarded as a salt such as KCl or NaCl depending on the tissue of the culture medium. .
[0031]
【Example】
The present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to only these examples.
[0032]
Example 1
Isolation of PCBs-degrading bacteria was started by searching for bacteria that could utilize biphenyl, the carbon skeleton of PCBs. The components of the liquid medium for separation used for the separation of biphenyl-degrading bacteria and the preparation method are shown below.
[0033]
Liquid medium components for separation:
Solution A (distilled water, per 1000ml)
K ₂ HPO ₄ , 1 g
NH ₄ Cl, 1 g
CAPS, 11.1 g; and liquid B (distilled water, per 1000 ml)
MgSO ₄ · _7H 2 O, 20g
MnSO ₄ · _7H 2 O, 2g
FeSO ₄ · _7H 2 O, 1g
CaCl ₂ · _2H ₂ O, 0.5g
L-ascorbic acid, 1 g.
[0034]
Preparation method of solution A: After dissolving 1 g of K ₂ HPO ₄ ; 11.1 g of CAPS in about 970 ml of distilled water, adjust the pH to 10.0, and make up to 980 ml. Thereafter, the mixture is autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. After returning to room temperature, 1 g / 20 ml of NH ₄ Cl was sterilized by filtration and added.
[0035]
Preparation method of solution B: After dissolving each component sequentially in an appropriate amount of distilled water, make up to 1000 ml and autoclave at 121 ° C. for 15 minutes. Then refrigerate.
[0036]
Preparation of liquid medium for separation: 100 volumes of solution A and 1 volume of solution B are mixed and used.
[0037]
Preparation of agar medium for separation: 1 g of K ₂ HPO _{4 and} 11.1 g of CAPS are dissolved in about 970 ml of distilled water, the pH is adjusted to 10.0, and the volume is increased to 980 ml. 20 g of agar is added and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. Keep the temperature around 50 ° C. 20 ml of distilled water containing 1 g of NH ₄ Cl is sterilized by filtration, and added to a petri dish to about 20 ml.
[0038]
Separation method of biphenyl-degrading bacteria: In a 300 ml Erlenmeyer flask, 30 ml of liquid medium for separation, powdered biphenyl (about 5 mg) as a sole carbon source, and an appropriate amount of a sample collected from soil were added, and shaking culture was performed at 30 ° C and 150 rpm. 1 ml of the culture supernatant of the flask in which the decrease in the added biphenyl was visually confirmed was transferred to a new liquid medium for separation, and the shaking culture was continued. Several days later, a part of the culture supernatant was taken and applied to an agar medium for separation. The agar surface coated with the culture supernatant is placed on the lid of a petri dish on which powdered biphenyl (about 500 mg) is placed, and a vinyl tape is wrapped around the edge of the petri dish. The colonies that appeared on the agar medium were applied to a new agar medium for separation, and the same operation as above was repeated to purify the colonies.
[0039]
The biphenyl resolution of the purified strain was analyzed under the following conditions.
[0040]
Extraction of biphenyl: Take 4 ml of culture supernatant and adjust pH to 2-3 using 1N HCl solution. After the adjustment, the supernatant was transferred to a separating funnel, 2 ml of ethyl acetate was added, and the two were mixed well. After standing, the ethyl acetate layer was separated. The same operation was repeated, and the separated ethyl acetate layer was combined with the previous one. After raising the total volume to 4 ml, the ethyl acetate layer was dehydrated by adding an appropriate amount of sodium sulfate, and subjected to HPLC analysis.
[0041]
HPLC analysis conditions: column used; Cosmoseal 5C18 (Nacalai Tesque), mobile phase; 70% acetonitrile, flow rate: 1 ml / min, column temperature: 40 ° C., absorption wavelength: 270 nm, injection volume: 20 μl.
[0042]
When the mycological properties described above were examined for one of the bacteria that exhibited biphenyl degradability, it was found to be a bacterium belonging to the genus Bacillus, and Bacillus sp. The strain was named M-7 strain. Bacillus sp. The M-7 strain was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary on August 24, 2001 (FERM P-18482).
[0043]
Bacillus sp. In the biphenyl decomposition experiment using the M-7 strain, almost all biphenyl was decomposed on the seventh day from the culture.
[0044]
Example 2
Bacillus sp. Having biphenyl resolution. A PCBs degradation experiment was performed using the M-7 strain. In this example, as PCBs, KC-400 (manufactured by GL Sciences Inc., containing PCBs having 2 to 6 chlorine substitutions per molecule in the following ratio: dichlorinated PCBs; 3%; trichlorinated PCBs33 %, 4-chlorine-substituted PCBs: 44%, 5-chlorine-substituted PCBs: 16%, and 6-chlorine-substituted PCBs: 5%). The components and the preparation method of the liquid medium for PCBs degradation used in the PCBs degradation experiment are shown below.
[0045]
Components of liquid medium for PCBs degradation:
Liquid B (used in Example 1): and liquid C (per 1000 ml of distilled water)
K ₂ HPO ₄ , 1 g
Polypeptone, 0.5g
Na ₂ CO ₃ , 10 g.
[0046]
Preparation of Solution C: 1 g of K ₂ HPO ₄ ; 0.5 g of polypeptone are dissolved in 960 ml of distilled water, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. After returning to room temperature, 10 g of Na ₂ CO ₃ dissolved in 40 ml of distilled water was sterilized by filtration and added.
[0047]
Preparation method of liquid medium for decomposing PCBs: It was prepared by mixing 100 parts of liquid C with 1 part of liquid B.
[0048]
FIG. 2 shows the result of HPLC analysis of a PCBs standard solution (KC-400 dissolved in hexane at a concentration of 8.7 μg / ml).
[0049]
HPLC analysis conditions: column used; Cosmo Seal 5-PYE (Nacalai Tesque), mobile phase; hexane, flow rate: 0.7 ml / min, absorption wavelength: 254 nm, column temperature: 25 ° C., injection volume: 20 μl
[0050]
For each peak in FIG. 2, the retention time 4.67 minutes is 3-chlorine-substituted PCB, the retention times 5.23 minutes and 5.35 minutes are 4-chlorine-substituted PCBs, and the retention time is 6.12 minutes. And 6.71 minutes are considered 5-chlorinated PCBs, and the retention times 7.68 minutes and 8.57 minutes are considered 6-chlorinated PCBs. The reason why there are two peaks of 4 to 6 chlorine-substituted PCBs is considered that the difference in the substitution position of chlorine in biphenyl affected the retention time.
[0051]
PCBs decomposition experiment: 30 ml of liquid medium for PCBs decomposition, 234 μg of KC-400 (final concentration: 7.8 μg / ml), and 1.5 × 10 ⁵ seeded cells (Bacillus sp. M-7 strain) were added to a 300 ml Erlenmeyer flask. Shaking culture was performed at 150 rpm for 4 days at 30 ° C., and the resolution of PCBs was examined.
[0052]
PCBs extraction: Transfer 30 ml of the culture solution to a separating funnel, add 3 ml of hexane, and mix well. After standing, the separated hexane layer is separated. The same operation is repeated twice more. The collected hexane layers are combined, and the volume is made up to 10 ml with hexane. The hexane layer was dehydrated by adding an appropriate amount of sodium sulfate, and subjected to HPLC analysis.
[0053]
The HPLC analysis conditions are the same as those used for the HPLC analysis of the PCBs standard solution.
[0054]
Bacillus sp. FIG. 3 shows the HPLC analysis of the PCBs degradation experiment using the M-7 strain. From comparison with the HPLC analysis of the PCB standard solution in FIG. 2, most of the PCBs were Bacillus sp. It can be seen that it was degraded by the M-7 strain.
[0055]
【The invention's effect】
The method for decomposing an aromatic chlorine compound by microorganisms of the present invention has an effect that dechlorination can be performed at normal temperature and normal pressure, and the decomposing process can be performed at low cost without requiring a special device. Is done.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a Bacillus sp. It is a figure which shows the phylogenetic tree by the neighborhood joining method of M-7 and a closely related bacterium.
FIG. 2 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a PCBs standard solution.
FIG. 3 shows Bacillus sp. It is a figure which shows the result of HPLC analysis of the PCBs decomposition | disassembly experiment by M-7 strain.

Claims

Bacillus sp. A method for degrading polychlorinated biphenyl , comprising a step of culturing strain M-7 (FERM P-18482) with polychlorinated biphenyl .

Culturing is performed at pH 9-11, according to claim 1 Symbol placement methods.

Bacillus sp. Having the ability to decompose aromatic chlorine compounds. M-7 strain (FERM P-18482).