JP3594483B2 - Fatty acids or salts thereof, fatty acid extracts, isolation methods and uses thereof - Google Patents

Description

【０００６】
〔式中、Ｒ¹がＯＨかつＲ³がＨであり、Ｒ ² が−（ＣＨ＝ＣＨ） ₃ −ＣＯＣＨ ₂ ＣＨ ₃ である場合に、次式のいずれか：
【化２２】

または
【化２３】

で表される脂肪酸又はその塩が提供される。
【０００７】
また、低級脂肪族アルコールに可溶性であり、モロヘイヤから抽出、単離し得る、上記脂肪酸又はその塩を少なくとも１種含有することからなる脂肪酸抽出物が提供される。
さらに、モロヘイヤを低級脂肪族アルコールで抽出処理し、抽出液を濃縮するかせずして酢酸エチル−水で分配処理し、得られる酢酸エチル層から上記脂肪酸又はその塩を少なくとも１種含有する脂肪酸抽出物を単離し、さらに該脂肪酸抽出物から、上記脂肪酸又はその塩を個々に単離することからなる単離法が提供される。
【０００８】
また、有効成分として上記脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸抽出物の少なくとも１種と、医薬的に受容な賦形剤とからなる医薬組成物が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、モロヘイヤから抽出される成分は、上記式（Ｉ）に示されたとおりの新規の脂肪酸、及びその他に既知化合物であるアゼライン酸（ａｚｅｌａｉｃ ａｃｉｄ）、トランス−３−ドデセンジ酸（ｔｒａｎｓ−３−ｄｏｄｅｃｅｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、イソケルシトリン（ｉｓｏｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、アストラガリン（ａｓｔｒａｇａｌｉｎ）ならびにコルコイオノシド（ｃｏｒｃｈｏｉｏｎｏｓｉｄｅ）Ａ等を含む。本発明者は、これら６種の新規の脂肪酸についてそれぞれコーコリ脂肪酸Ａ〜Ｆと命名した。コーコリ脂肪酸Ａ〜Ｆは、具体的には以下の構造式を有するものである。
【００１０】
【化７】

【００１１】

【００１２】
【化８】

【００１３】

【００１４】
【化９】

【００１５】

【００１６】
【化１０】

【００１７】

【００１８】
【化１１】

【００１９】

【００２０】
【化１２】

【００２１】

上記式から明らかなように、コーコリ脂肪酸Ｃ及びＤは、それぞれＡ及びＢの１２位、１３位がシス型の構造となっている立体異性体である。
本発明においては、上記式で示される脂肪酸は、脂肪酸を分離、精製する際に使用される溶媒との間で形成し得る溶媒和物又は水和物を含む。また、これら脂肪酸は塩基により形成された医薬的に受容な塩であってもよく、該塩基としては例えばナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属及びこれらの水酸化物、アンモニア等の無機塩基、又はピリジン、キノリン、ピペリジン、コリジン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、イミダゾール、モルホリン等の有機塩基等が挙げられる。
【００２２】
本発明の脂肪酸は、モロヘイヤを低級脂肪族アルコールで抽出処理し、抽出液を濃縮するかせずして酢酸エチル−水で分配処理し、酢酸エチル層を得ることからなる。
原料となるモロヘイヤは、種類又は産地等により、成分の種類及び量等に若干の差があると考えられる。また、茎等を含んでいてもよいが、主に葉を用いることが好ましい。葉は、そのままでも、乾燥させて用いてもよい。
【００２３】
モロヘイヤは、低級脂肪族アルコールで抽出処理する。低級脂肪族アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等を使用することができる。好ましくは、メタノールである。この抽出処理は、常温で行ってもよいが、使用する低級脂肪族アルコールが煮沸する程度に加熱して行うことが好ましい。この抽出処理は、数回繰り返すことが好ましく、１回の低級脂肪族アルコールの使用量は、モロヘイヤの２〜６倍（重量）程度が好ましい。
【００２４】
次いで、この抽出液を任意に濃縮する。この際の濃縮は減圧下で行うことが好ましい。なお、得られた濃縮物を、先に使用した同様の低級脂肪族アルコールを用いてろ別し、ろ液をさらに濃縮してもよい。
得られた抽出液（濃縮物）を、酢酸エチル−水で分配処理する。この分配処理は、▲１▼抽出液（濃縮物）を水と酢酸エチルの混液と振盪するか、▲２▼抽出液（濃縮物）を水に懸濁し、酢酸エチルとともに振盪する等のいずれの方法で行ってもよい。目的とする成分は、このように処理することにより主に酢酸エチル層に移行される。なお、この分配処理は、常温で行うことが好ましい。▲１▼において、混液中の水と酢酸エチルとの割合は、１：０．５〜１：５（重量比）程度が好ましく、１：１程度がより好ましい。▲２▼においては、抽出液（濃縮物）をほぼ同量の水に懸濁し、これに２〜５倍（重量）程度の酢酸エチルを加えて振盪し、この処理を２〜３回程度繰り返すことにより、目的とする成分が酢酸エチル層に移行する。
【００２５】
このようにして得られる酢酸エチル層を、好ましくは減圧下で濃縮する。この濃縮は乾固するまで行ってもよい。
得られた濃縮物は、精製処理に付すことが好ましい。精製処理方法としては、例えば、順相シリカゲルクロマトグラフィー、逆相シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、遠心液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のいずれか、又はそれらを組み合わせて使用する方法がある。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、用いる溶媒等により適宜調節することができる。また、以下の別の精製処理と組み合わせて使用してもよい。
【００２６】
また、別の精製処理方法としては、得られた濃縮物を、約３０％以下の低級脂肪族アルコール含有水に溶解させ、この溶液を吸着性樹脂に接触させて吸着させた後、低級脂肪族アルコール又は約３０％以上の低級脂肪族アルコール含有水で溶離する方法が挙げられる。この際に使用される低級脂肪族アルコールは、上述したとおりであり、なかでもメタノールが好ましい。吸着性樹脂としては、通常当該分野の精製処理に使用されるものであれば特に限定されるものではなく、例えば巨大網状構造で多孔性の架橋されたポリスチレン系樹脂が挙げられる。
【００２７】
溶離する際に用いられるものとしては、約３０％以上、好ましくは３５〜９９％の低級脂肪族アルコール含有水が挙げられる。低級脂肪族アルコールは上記と同様のものを用いることができ、なかでもメタノールが好ましい。
このようにして得られた脂肪酸は、そのまま本発明の医薬組成物の有効成分として使用することができる。つまり、モロヘイヤに含有される脂肪酸類について、ＮＯ産生抑制作用を検討したところ、上記式（Ｉ）に示す脂肪酸に強い阻害作用が認められた。
【００２８】
ＮＯは、循環系、免疫系及び神経系で重要な役割を果たしており、生体内で３種の合成酵素（ＮＯＳ）により生産される。このうち、各種サイトカインやＬＰＳ（リポポリサッカライド）により合成されるＮＯＳ−２は、他の合成酵素と比較して約１００倍の量のＮＯを生産するため、ＮＯＳ−２により生産されるＮＯは、その過剰な量から生理的作用よりむしろ病理的作用が問題となっている。
【００２９】
これに対し、式（Ｉ）に示す本発明の脂肪酸はＮＯ産生抑制作用を有することから、多量のＮＯが病因となっている敗血症性疾患（エンドトキシンショック）、低血圧症、炎症性組織障害、虚血性疾患、アレルギー性疾患、抗菌作用や抗腫瘍作用の低下といった自己免疫疾患等の予防及び治療に対し、単一物、抽出物あるいは混合物の形態で、医薬組成物としての使用が可能であると考えられる。
したがって、この発明の脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸抽出物は、医薬的に受容な賦形剤とからなる医薬組成物として使用することができる。
【００３０】
本発明の脂肪酸は、上述の塩基を用いて、常法により適切な医薬的に受容な塩を形成することができる。また、脂肪酸抽出物は、以下の実施例に詳細に示すとおり、低級脂肪族アルコールで適宜得ることができる。
【００３１】
組成物は、経口用又は非経口用のいずれであってもよく、常法又はその他の適切な方法で製造することができる。経口用組成物としては、通常散剤、錠剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、舌下錠、液剤（チンキ剤、流エキス剤、舌下エアゾール、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤、シロップ剤等）等が挙げられる。また、非経口用組成物としては、軟膏剤、硬膏剤、液剤（注射剤、チンキ剤、ローション剤、酒精剤、噴霧剤、エアゾール等）、湿布剤（パップ剤、パスタ剤、貼付剤、貼付錠等）、塗布剤、散布剤、リニメント剤、クリーム剤、乳剤等が挙げられる。なお、これら組成物は、徐放性処理が施されていてもよい。
【００３２】
また、この発明の組成物は、所望により緩衝剤、安定化剤、希釈剤、甘味剤、粘滑剤、防腐剤ならびに着香剤及び着色剤等のような通常の添加剤を含んでいてもよい。
上記で使用される賦形剤としては、当該分野で公知の固体又は液体の賦形剤を使用することができる。例えば、散剤、その他の経口粉末剤における賦形剤としては、乳糖、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成及び天然のケイ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母等が挙げられる。外用散剤の場合は、酸化亜鉛、タルク、澱粉、カオリン、硼酸末、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、次没子酸ビスマス、硫酸アルミニウムカリウム末等が挙げられる。液剤における賦形剤としては、水、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、脂肪油、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール等が挙げられる。軟膏剤における賦形剤としては、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、グリセリン、ミツロウ、パラフィン、流動パラフィン、樹脂、高級アルコール、グリコール類、界面活性剤等を挙げることができる。
【００３３】
これら組成物の服用量は、経口用製剤の場合、式（Ｉ）の脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸抽出物を成人１日当たり０．１〜１．５ｍｇ程度、好ましくは０．３〜０．８ｍｇ程度を数回に分けて投与することによって効力を発揮することができる。非経口用製剤の場合、例えば式（Ｉ）の脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸抽出物を０．０１〜１０％濃度で配合した製剤として使用することができる。
【００３４】
しかし、服用量は、用いられる脂肪酸の活性、患者の年齢、体重、通常の健康状態、投与時間、投与方法及び薬剤の組合せを含む様々な因子により変化すると解される。
【００３５】
【実施例】
実施例１．モロヘイヤ成分の抽出及び単離
モロヘイヤ（ベトナム産）の葉 ６．５ｋｇをメタノール（１２リットル）で３時間熱抽出を３回繰り返した後、減圧下条件でメタノールを留去し、メタノール抽出エキス（７００．０ｇ）を得た。
【００３６】
得られたメタノール抽出エキス（７００．０ｇ）を１：１の酢酸エチル−水で分配し、酢酸エチル移行部エキス（２２７．７ｇ、 ３．９％（固形物重量、以下同じ））および水移行部エキス（４６２．３ｇ、 ８．０％）を得た。
酢酸エチル移行部エキス２２７．７ｇを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔３．０ｋｇ、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ （５０：１→２０：１→１０：１→５：１→１：１）→ＭｅＯＨ〕で分画して、１０個のフラクション〔フラクション１ （１６．２ｇ）、フラクション２ （１１．３ｇ）、フラクション３ （１１０．９ｇ）、フラクション４（７．２ｇ）、フラクション５（３．８ｇ）、フラクション６ （１１．２ｇ）、フラクション７ （１０．６ｇ）、フラクション８ （１０．８ｇ）、フラクション９ （７５．６ｇ）、フラクション１０（２．２ｇ）〕に分画した。
【００３７】
フラクション３ （１１０．９ｇ）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔２．０ｋｇ 、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ （１００：１→１０：１）→ＭｅＯＨ〕で分画して、フラクション ３−１（１．８ｇ）、フラクション ３−２ （４１．０ｇ）、フラクション ３−３（８．４ｇ）、フラクション ３−４（２６．７ｇ） 、フラクション ３−５ （１１．９ｇ）、フラクション ３−６（７．１ｇ）、フラクション ３−７（２．２ｇ）、フラクション ３−８ （１１．１ｇ）、フラクション ３−９（１．１ｇ）を得た。
【００３８】
さらに、フラクション ３−８ （１１．１ｇ）は逆相シリカゲルクロマトグラフィー〔１６７．０ｇ、ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ （６０：４０→８０：２０）→ＭｅＯＨ→ＣＨＣｌ_３〕で分画して、フラクション ３−８−１（１．４ｇ）、フラクション ３−８−２ （６４１．１ｍｇ）、フラクション ３−８−３（１．１ｇ）、フラクション ３−８−４（７１２．８ｍｇ） 、フラクション ３−８−５（３８５．５ｍｇ） 、フラクション ３−８−６ （２８１．９ｍｇ）、フラクション ３−８−７（９．３ｇ）とした。
【００３９】
次に、フラクション ３−８−２（２８９．１ｍｇ） を逆相 ＨＰＬＣ （カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ， ２５０ｍｍ×内径２０、溶媒：６０％メタノール、流速： ９．０ｍｌ／分）で分離精製し、アゼライン酸（７、１７．８ｍｇ） 、トランス−３−ドデセンジ酸（８、３５．８ｍｇ）およびコーコリ脂肪酸Ｅ（５、１５．３ｍｇ）を単離した。
フラクション ３−８−３（１．１ｇ）は順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔５３．０ｇ 、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ （３０：１→５：１）→ＭｅＯＨ〕で分画して、フラクション ３−８−３−１（５８８．１ｍｇ） 、フラクション ３−８−３−２（５２．４ｍｇ）、フラクション ３−８−３−３ （２７６．５ｍｇ ）、フラクション ３−８−３−４（３３．２ｍｇ）とし、フラクション ３−８−３−１（２２２．３ｍｇ） を逆相 ＨＰＬＣ （カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ， ２５０ｍｍ×内径２０、溶媒：６０％メタノール、流速： ９．０ｍｌ／分）で分離精製し、コーコリ脂肪酸Ａ（１、１７．２ｍｇ） 、Ｂ（２、４０．４ｍｇ） 、Ｃ（３、１１．３ｍｇ）およびＤ（４、１０．０ｍｇ）を単離した。
【００４０】
また、フラクション８ （１０．８ｇ）も逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔３２０ｇ、ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ （５０：５０→８０：２０→９０：１０）→ＭｅＯＨ→ＣＨＣｌ_３〕で同様に分画して、フラクション ８−１（９６９．３ｍｇ） 、フラクション ８−２（１．２ｇ）、フラクション ８−３ （９６１．１ｍｇ）、フラクション ８−４ （６５４．３ｍｇ）、フラクション ８−５（１．２ｇ）、フラクション ８−６ （８９４．９ｍｇ）、フラクション ８−７ （２６２．４ｍｇ）、フラクション ８−８（３．７ｇ）、フラクション ８−９（１．５ｇ）を得た。フラクション ８−２（１．２ｇ）は順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔５３．５ｇ、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ （１０：１→５：１）→ＭｅＯＨ〕で分画して、フラクション ８−２−１ （４５０．３ｍｇ）、フラクション ８−２−２ （５１０．８ｍｇ）、フラクション ８−２−３（７１．９ｍｇ）とした。
【００４１】
次に、フラクション ８−２−２（４１１．８ｍｇ） をゲル濾過クロマトグラフィー〔２１．０ｇ、ＭｅＯＨ〕で分画し、フラクション ８−２−２−１（１４７．１ｍｇ） を得るとともに、フラボノール配糖体イソケルシトリン（９、 ２５２．２ｍｇ）を単離した。
フラクション ８−２−２−１ （１４７．０ｍｇ）は逆相 ＨＰＬＣ （カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ、２５０ｍｍ ×内径２０、溶媒：６０％メタノール、流速： ９．０ｍｌ／分）で分離精製し、ヨノン配糖体 コルコイオノシドＡ （１０、 ９．０ｍｇ）を単離した。 また、フラクション ８−３ （２２２．７ｍｇ）を逆相 ＨＰＬＣ （カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ、２５０ｍｍ×内径２０、溶媒：６０％メタノール、流速： ９．０ｍｌ／分）で分離精製し、フラボノール配糖体アストラガリン （１１、 ９．８ｍｇ）を単離した。
【００４２】
さらに、フラクション６から、同様にしてコーコリ脂肪酸Ｆ（６） を単離した。
【００４３】
【化１３】

【００４４】

【００４５】
【化１４】

【００４６】

【００４７】
【化１５】

【００４８】

実施例２．モロヘイヤ抽出物コーコリ脂肪酸Ａ〜Ｆの構造解明
（ａ）コーコリ脂肪酸Ａ（１）
白色粉末、
〔α〕_Ｄ ^２６＋１３．０°（ｃ＝０．４， ａｃｅｔｏｎｅ）

ＵＶλ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３１０（４．６）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ ^−１）：３４３１， ２９２６， ２８５３， １７３６， １６５５， １６０５， １００１、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ，δ）：１．１２ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２６−１．３９ （８Ｈ， ｍ， ４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５６ （２Ｈ， ｄｔ−ｌｉｋｅ， ８−Ｈ_２）， １．６３ （２Ｈ， ｔｔ−ｌｉｋｅ， ３−Ｈ_２）， ２．３４ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ２．５８ （２Ｈ， ｑ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １７−Ｈ_２）， ４．２１ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．１， ６．１Ｈｚ， ９−Ｈ）， ５．９２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．１， １５．０Ｈｚ， １０−Ｈ）， ６．１８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．５Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．３１（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．０Ｈｚ， １３−Ｈ）， ６．３３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．０Ｈｚ， １１−Ｈ）， ６．５９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．０Ｈｚ， １２−Ｈ）， ７．１９（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．５Ｈｚ， １４−Ｈ）、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ）：表１に記載
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３０８（Ｍ^＋）， ２９０（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）， ２６１， ２３３（Ｍ ^＋−Ｈ_２Ｏ−Ｃ_３Ｈ_５Ｏ）， １７１， １６５， １３７ （１００）
【００４９】
コーコリ脂肪酸Ａは、ＥＩ−ＭＳ において分子イオンピークがｍ／ｚ ３０８ （Ｍ^＋）にフラグメントイオンピークがｍ／ｚ ２９０ （Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）、２３３ （Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ−Ｃ_３Ｈ_５Ｏ）に認められ、高分解能 ＥＩ−ＭＳ測定により分子式 Ｃ_１８Ｈ_２８Ｏ_４ を有する化合物であることが明らかとなった。また ＩＲ スペクトルにおいて、水酸基（３４３１ ｃｍ^−１）、カルボニル基（１７３６ ｃｍ^−１）、共役二重結合（１６５５， １６０５ ｃｍ^−１）に由来する吸収が認められ、更に、ＵＶスペクトルにおいて、３１０ ｎｍ （ｌｏｇ ε ４．６）に極大吸収が認められたことから、トリエノン構造を有することが示唆された。
【００５０】
^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ（表１に記載）スペクトルデータの解析により、末端メチル基〔δ１．１２ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ），δ_ｃ８．３〕、水酸基〔δ４．２１ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．１， ６．１Ｈｚ），δ_ｃ７２．３〕、トランス型オレフィン〔δ５．９２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．１， １５．０Ｈｚ）， δ_ｃ１４１．０ ； δ６．３３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．０Ｈｚ），δ_ｃ１２９．４ ； δ６．５９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．０Ｈｚ），δ_ｃ１４０．５ ； δ６．３１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．０Ｈｚ），δ_ｃ１３０．６ ； δ７．１９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １５．５Ｈｚ），δ_ｃ１４１．９ ： δ６．１８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．５Ｈｚ）， δ_ｃ１２９．２〕、カルボニル基〔δ_ｃ２０１．１〕、カルボン酸〔δ_ｃ１７８．６〕、８個のメチレン基〔δ_ｃ２４．６， ２５．２， ２８．９， ２９．１， ２９．３， ３３．８， ３３．９， ３７．２〕の存在が明らかになった。
【００５１】
さらに、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルより下式の太線部分で示す部分構造が判明し、 ＨＭＢＣ スペクトルにおいて下式に示すプロトンとカーボン間に相関が認められたことから９位水酸基および１６位カルボニル基の位置が確認された。^１３Ｃ−^１Ｈ ＣＯＳＹ スペクトルデータの考察と考え合わせ、各シグナルが完全に帰属され、平面構造が決定された。
【００５２】
また、カルボン酸の数を確認するために、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−ｐ−トルエン−スルホンアミドから調製した ＣＨ_２Ｎ_２エーテル溶液（約１．０ｍｌ）をコーコリ脂肪酸Ａ （３．０ｍｇ）のメタノール（０．５ｍｌ）溶液に加えて室温で１０分間撹拌後、反応液を減圧下溶媒留去し、得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー〔１．０ｇ， ｎ−ｈｅｘａｎｅ ： ａｃｅｔｏｎ （２０：１）〕で精製しモノメチルエステル体１ａ（３．１ｍｇ）を得た。その物理データの解析からもその構造が確認された（下式）。
【００５３】
【化１６】

【００５４】
１ａ：白色粉末、

ＵＶ λ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３１０（４．６）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ^−１）：３４５３， ２９３２， ２８５５， １７３４， １７１８， １６０１， １５８１， １０３０、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ， δ）：１．１２ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２８−１ ．３３ （８Ｈ， ｍ， ４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５６ （２Ｈ， ｄｔ−ｌｉｋｅ， ８−Ｈ_２）， １．６１ （２Ｈ， ｔｔ−ｌｉｋｅ， ３−Ｈ_２）， ２．３０ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．６Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ２．５９ （２Ｈ， ｑ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １７−Ｈ_２）， ３．６６ （３Ｈ， ｓ， ＯＭｅ）， ４．２１ （１Ｈ， ｄｔ−ｌｉｋｅ， ９−Ｈ）， ５．９３（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．３， １５．１Ｈｚ， １０−Ｈ）， ６．１９ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．４Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．３２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １４．８Ｈｚ， １３−Ｈ）， ６．３４ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １５．１Ｈｚ， １１−Ｈ）， ６．５９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １４．８Ｈｚ， １２−Ｈ）， ７．１９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．４Ｈｚ， １４−Ｈ）、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ）：表１に記載
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３２２（Ｍ^＋）， ３０４（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）， ２３３， １３７ （１００）， １８５， １６５
【００５５】
【表１】

【００５６】
（ｂ）コーコリ脂肪酸Ｂ（２）
白色粉末、
〔α〕_Ｄ ^２８＋１７．３°（ｃ＝０．２， ａｃｅｔｏｎｅ）、

ＵＶ λ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３０９（４．３）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ^−１）：３４３０， ２９３２， ２８５７， １７１９， １６５５， １６０５， １００７ 、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ， δ）：０．９４ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２４−１．３６ （６Ｈ， ｍ， ４，５，６−Ｈ_２）， １．５２−１．６４ （６Ｈ， ｍ， ３，７，１７−Ｈ_２）， ２．３１ （２Ｈ， ｔ−ｌｉｋｅ， ２−Ｈ_２）， ２．５２ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．２Ｈｚ， ８−Ｈ_２）， ４．１５ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．１，６．７Ｈｚ， １６−Ｈ）， ５．９３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．１， １５．１Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．１７（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．５Ｈｚ， １０−Ｈ）， ６．３１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．４Ｈｚ，１２−Ｈ）， ６．３２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １５．１Ｈｚ， １４−Ｈ）， ６．６０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １５．４Ｈｚ， １３−Ｈ）， ７．１８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．５Ｈｚ，１１−Ｈ）、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ） ：表１に記載
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３０８（Ｍ^＋）， ２９０（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）， ２３３ （１００）， ２２３， １７１， １６５， １３７， ７９
【００５７】
コーコリ脂肪酸Ｂは、ＥＩ−ＭＳ において分子イオンピークがｍ／ｚ ３０８ （Ｍ^＋）に認められ、その高分解能 ＥＩ−ＭＳ測定により分子式 Ｃ_１８Ｈ_２８Ｏ_４ を有する化合物であることが明らかとなった。また ＩＲ スペクトルにおいて、水酸基（３４３０ ｃｍ^−１）、カルボニル基（１７１９， １７１０ ｃｍ^−１）、共役二重結合（１６５５， １６０５ ｃｍ^−１）に由来する吸収が認められ、更に、ＵＶスペクトルにおいて、３０９ ｎｍ （ｌｏｇ ε ４．３）に極大吸収が認められたことから、トリエノン構造を有することが示唆された。
【００５８】
^１Ｈ−ＮＭＲ及び ^１３Ｃ−ＮＭＲ（表１に記載）スペクトルデータの解析により、末端メチル基〔δ０．９４ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ），δ_ｃ８．３〕、水酸基〔δ４．１５ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．１， ６．７Ｈｚ），δ_ｃ７３．５〕、トランス型オレフィン〔δ５．９３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．１， １５．１Ｈｚ）， δ_ｃ１４０．９ ； δ６．３２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １５．１Ｈｚ），δ_ｃ１２９．４ ； δ６．６０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １５．４Ｈｚ），δ_ｃ１４０．７ ； δ６．３１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．４Ｈｚ），δ_ｃ１３０．５ ； δ７．１８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．５Ｈｚ），δ_ｃ１４２．３ ： δ６．１７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．５Ｈｚ）， δ_ｃ１２９．３〕、カルボニル基〔δ_ｃ２００．３〕、カルボン酸〔δ_ｃ１７８．７〕、８個のメチレン基〔δ_ｃ２４．３， ２４．８， ２８．８， ２８．９， ２９．２， ３０．１， ３３．９， ４０．７〕の存在が明らかになった。
【００５９】
更に、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルの解析より下式の太線部分で示す部分構造が判明し、 ＨＭＢＣ スペクトルにおいて下式に示すプロトンとカーボン間に相関が認められたことから１６位水酸基および９位カルボニル基の位置が確認された。更に^１３Ｃ−^１Ｈ ＣＯＳＹ スペクトルデータの考察と合わせ、各シグナルが完全に帰属され、平面構造が決定された。
【００６０】
また、コーコリ脂肪酸Ａと同様に、ＣＨ_２Ｎ_２によりコーコリ脂肪酸Ｂ（３．０ｍｇ、０．００９７ｍｍｏｌ） からモノメチルエステル体２ａ（３．１ｍｇ）を得（下式）、２ａは種々の物理データの解析の結果、海洋植物アクロシフォニア コアリタ（Ａｃｒｏｓｉｐｈｏｎｉａ ｃｏａｌｉｔａ）から単離されているメチル（１６Ｓ）−ヒドロキシ−９−オキソ−（１０Ｅ， １２Ｅ， １４Ｅ）−オクタデカトリエネートと同定した。以上の結果からコーコリ脂肪酸Ｂの構造を決定した。
【００６１】
【化１７】

【００６２】
２ａ：白色粉末

ＵＶλ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３１０（４．６）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ ^−１）：３４５３， ２９３０， ２８５７， １７４３， １６５０， １５９８， １１２５、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ，δ）： ０．９５ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２６−１．３８ （６Ｈ， ｍ， ４，５，６−Ｈ_２）， １．５０−１．６３ （６Ｈ， ｍ， ３，７，１７−Ｈ_２）， ２．３０ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．５Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ２．５４ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．５Ｈｚ， ８−Ｈ）， ３．６６ （３Ｈ， ｓ， ＯＭｅ）， ４．１６ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．４， ６．４Ｈｚ， １６−Ｈ）， ５．９３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．４， １５．４Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．１７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．４Ｈｚ， １０−Ｈ）， ６．３１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．４Ｈｚ， １２−Ｈ）， ６．３４ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．９， １５．４Ｈｚ， １４−Ｈ）， ６．６０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１０．９， １５．４Ｈｚ， １３−Ｈ）， ７．１８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．１， １５．４Ｈｚ， １１−Ｈ） 、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ）：表１に記載、
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３２２（Ｍ ^＋）， ３０４（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）
【００６３】
（ｃ）コーコリ脂肪酸Ｃ（３）
白色粉末、
〔α〕_Ｄ ^２３＋３３．１°（ｃ＝０．２， ａｃｅｔｏｎｅ）、

ＵＶ λ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３１１（４．４）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ^−１）：３４３２， ２９３０， ２８５５， １７１７， １６５３， １５９７， １００９、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ， δ）： １．１３ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２５−１．３８ （８Ｈ， ｍ， ４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５５ （２Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．４， ７．０Ｈｚ， ８−Ｈ_２）， １．６１ （２Ｈ， ｔｔ， Ｊ＝７．０， ７．３Ｈｚ， ３−Ｈ_２）， ２．３５ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ２．６０ （２Ｈ， ｑ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １７−Ｈ_２）， ４．２６ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．３， ６．４Ｈｚ， ９−Ｈ）， ５．９２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．３， １４．９Ｈｚ， １０−Ｈ）， ６．１０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １１．６Ｈｚ， １３−Ｈ）， ６．２１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．０Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．３６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １１．３Ｈｚ， １２−Ｈ）， ６．８３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １４．９Ｈｚ， １１−Ｈ）， ７．６６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．６， １５．０Ｈｚ， １４−Ｈ） 、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ）：表１に記載
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３０８（Ｍ ^＋）， ２９０（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）， ２６１， ２３３（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ−Ｃ_３Ｈ_５Ｏ）， １７１， １３７ （１００）
【００６４】
コーコリ脂肪酸Ｃは、ＥＩ−ＭＳ において分子イオンピークがｍ／ｚ ３０８ （Ｍ^＋）にフラグメントイオンピークがｍ／ｚ ２９０ （Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）に認められ、高分解能 ＥＩ−ＭＳ 測定により分子式 Ｃ_１８Ｈ_２８Ｏ_４ を有する化合物であることが明らかとなった。また ＩＲ スペクトルにおいて、水酸基（３４３２ ｃｍ^−１）、カルボニル基（１７１７ ｃｍ^−１）、共役二重結合（１６５３， １５９７ ｃｍ^−１）に由来する吸収が認められた。さらに、ＵＶスペクトルにおいて、３１１ ｎｍ （ｌｏｇ ε ４．４）に極大吸収が認められたことから、トリエノン構造を有することが示唆された。
【００６５】
コーコリ脂肪酸Ｃの ＮＭＲデータをＡと比較すると、１１位から１４位を除いて殆ど類似しており、また、コーコリ脂肪酸Ｃの ^１Ｈ−ＮＭＲ のデータにおいてシスオレフィン〔δ６．３６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １１．３Ｈｚ， １２−Ｈ），δ６．１０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １１．６Ｈｚ， １３−Ｈ）〕が確認されたことから、コーコリ脂肪酸ＣはＡの１２位、１３位がシス型の構造であることが明らかとなった。
【００６６】
また、ＣＨ_２Ｎ_２エーテル溶液を用いてコーコリ脂肪酸Ｃ（３．０ｍｇ、０．００９７ｍｍｏｌ） からモノメチルエステル体３ａ（３．１ｍｇ）が得られその物理データの比較考察からその構造を確認した（下式）。以上の結果を考え合わせることによりコーコリ脂肪酸Ｃの構造を決定した。
【００６７】
【化１８】

【００６８】
３ａ：白色粉末、

ＵＶ λ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３１０（４．４）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ^−１）：３４５３， ２９３０， ２８５５， １７４３， １６５５， １５９８， １０１０、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ， δ）：１．１３ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２５−１．３６ （８Ｈ， ｍ， ４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５５ （２Ｈ， ｄｔ−ｌｉｋｅ， ８−Ｈ_２）， １．６１ （２Ｈ， ｔｔ−ｌｉｋｅ， ３−Ｈ_２）， ２．３１ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．６Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ２．６１ （２Ｈ， ｑ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， １７−Ｈ）， ３．６７ （３Ｈ， ｓ， ＯＭｅ）， ４．２５ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．４， ６．４Ｈｚ， ９−Ｈ）， ５．９２（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．４， １５．３Ｈｚ， １０−Ｈ）， ６．１２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １１．９Ｈｚ， １３−Ｈ）， ６．２０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．４Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．３５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １１．９Ｈｚ， １２−Ｈ）， ６．８２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．９， １５．３Ｈｚ， １１−Ｈ）， ７．６５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．９， １５．４Ｈｚ， １４−Ｈ） 、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ）：表１に記載、
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３２２（Ｍ^＋）， ３０４（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）， ２６１， ２３３， １８５， １６５， １３７（１００）
【００６９】
（ｄ）コーコリ脂肪酸Ｄ（４）
白色粉末、
〔α〕_Ｄ ^２６＋１９．７°（ｃ＝０．４， ａｃｅｔｏｎｅ）

ＵＶ λ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ （ｌｏｇ ε）：３１１（４．３）、
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ^−１）：３４３１， ２９３２， ２８５７， １７２６， １６５５， １５９７， １１１５、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ， δ）：０．９６ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．５Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２８−１．３９ （６Ｈ， ｍ， ４，５，６−Ｈ_２）， １．５７−１．６６ （６Ｈ， ｍ， ３，７，１７−Ｈ_２）， ２．３４ （２Ｈ， ｔ−ｌｉｋｅ， ２−Ｈ_２）， ２．５７ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．１Ｈｚ， ８−Ｈ_２）， ４．２２ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝５，８，６．１Ｈｚ， １６−Ｈ）， ５．９３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝６．１， １５．３Ｈｚ， １５−Ｈ）， ６．１０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．０， １１．３Ｈｚ， １２−Ｈ）， ６．１９ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．３Ｈｚ）， １０−Ｈ）， ６．３６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １１．３ＨＺ， １３−Ｈ）， ６．８５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １５．３Ｈｚ， １４−Ｈ）， ７．６４ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１．３， １５．３Ｈｚ， １１−Ｈ）、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ， δｃ） ：表１に記載、
ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３０８ （Ｍ）^＋， ２９０ （Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）， ２６１， ２３３（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ−Ｃ_３Ｈ_５Ｏ）， ２２３， １７１， １３７， ４１ （１００）
【００７０】
コーコリ脂肪酸Ｄは、ＥＩ−ＭＳ において分子イオンピークがｍ／ｚ ３０８ （Ｍ^＋）のほかにフラグメントイオンピークがｍ／ｚ ２９０ （Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）に認められ、その高分解能 ＥＩ−ＭＳ測定により分子式 Ｃ_１８Ｈ_２８Ｏ_４ を有することが明らかとなった。また ＩＲ スペクトルにおいて、水酸基（３４３１ ｃｍ^−１）、カルボニル基（１７２６ ｃｍ^−１）、共役二重結合（１６５５， １５９７ ｃｍ^−１）に由来する吸収が認められた。さらに、ＵＶスペクトルにおいて、３１１ ｎｍ （ｌｏｇ ε ４．３）に極大吸収が認められたことから、トリエノン構造を有することが示唆された。
【００７１】
コーコリ脂肪酸Ｄの ＮＭＲデータをＣと比較すると、水酸基とカルボニル基の位置が異なっていることが示唆され、また、コーコリ脂肪酸ＤとＢを比較すると１１位から１４位のシグナルを除いて非常に類似していた。
また、各種二次元 ＮＭＲの解析の結果 ^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ スペクトルにおいて下式の太線部分で示すトランス−シス−トランス型トリエノン部分を含む部分構造が判明した。ＨＭＢＣスペクトルにおいて下式に示すプロトンとカーボン間に相関が認められたことから、コーコリ脂肪酸ＤはＢの１２位、１３位シス体であることが明らかとなり、コーコリ脂肪酸Ｄの化学構造を下式に示すように決定した。
【００７２】
【化１９】

【００７３】
（ｅ）コーコリ脂肪酸Ｅ（５）
無色油状物、
〔α〕_Ｄ ^２４＋１４．２°（ｃ＝０．７， ＣＨＣｌ_３）

ＩＲ （ｆｉｌｍ， ｃｍ^−１）：３４１０， ２９３０， ２８５６， １７０９， ９９１ 、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ２７０ＭＨｚ， δ）：１．２０−１．４２ （８Ｈ， ｍ， ４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５１ （２Ｈ， ｍ， ８−Ｈ_２）， １．６２ （２Ｈ， ｍ， ３−Ｈ_２）， ２．３３ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ４．１０ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．３， ６．３Ｈｚ， ９−Ｈ）， ５．１０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１０．６Ｈｚ）， ５．２１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．５Ｈｚ）， （１１−Ｈ_２）， ５．８６ （１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１０．６， １７．５Ｈｚ， １０−Ｈ）、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ６８ＭＨｚ， δｃ） ：表１に記載、
Ｐｏｓ． ＦＡＢ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ２０１ （Ｍ＋Ｈ）^＋
【００７４】
コーコリ脂肪酸Ｅは、 ＦＡＢ−ＭＳ において分子イオンピークがｍ／ｚ ２０１ （Ｍ＋Ｈ）^＋に認められ、その高分解能 ＦＡＢ−ＭＳ 測定により分子式 Ｃ_１１Ｈ_２１Ｏ_３ を有することが明らかとなった。また ＩＲ スペクトルにおいて、水酸基（３４１０ ｃｍ^−１）、カルボニル基（１７０９ ｃｍ^−１）に由来する吸収が認められた。
【００７５】
^１Ｈ−ＮＭＲおよび ^１３Ｃ−ＮＭＲ（表１に記載）スペクトルデータの解析により、末端オレフィン〔δ５．１０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１０．６Ｈｚ）， ５．２１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．５Ｈｚ）， δ_ｃ１１４．７ ； δ５．８６ （１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝６．３， １０．６， １７．５Ｈｚ），δ_ｃ１４１．２〕、水酸基〔δ４．１０ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．３， ６．３Ｈｚ），δ_ｃ７３．３〕、カルボン酸〔δ_ｃ１７９．４〕、７個のメチレン基〔δ_ｃ２４．７， ２５．２， ２８．９， ２９．１， ２９．３， ３４．１， ３７．０〕の存在が明らかになった。さらに、 ^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ スペクトルより下式の太線部分で示す部分構造が判明した。
【００７６】
また ＣＨ_２Ｎ_２エーテル溶液を用いてコーコリ脂肪酸Ｅ（３．０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）からモノメチルエステル体５ａ（３．０ｍｇ）が得られその物理データの比較考察からその構造を確認した（下式）。以上の結果を考え合わせることによりコーコリ脂肪酸Ｅ（５）の構造を決定した。
【００７７】
【化２０】

【００７８】
５ａ：無色油状物、

ＩＲ （ｆｉｌｍ， ｃｍ^−１）：３４１０， ２９３０， ２８５６， １７０９、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ２７０ＭＨｚ， δ）：１．２０−１．４０ （１０Ｈ， ｍ， ３，４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５１ （２Ｈ， ｍ， ８−Ｈ_２）， １．６２ （２Ｈ， ｍ， ３−Ｈ_２）， ２．３０ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．４Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ３．６６（３Ｈ， ｓ， ＯＭｅ）， ４．０９ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝６．３， ６．３Ｈｚ， ９−Ｈ）， ５．１０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１．３， １０．６Ｈｚ）， ５．２１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１．３， １７．２Ｈｚ）（１１−Ｈ_２）， ５．８７ （１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝６．３， １０．６， １７．２Ｈｚ， １０−Ｈ） 、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ６８ＭＨｚ，δｃ）：表１に記載、
Ｐｏｓ． ＦＡＢ−ＭＳ （ｍ／ｚ）：２３７（Ｍ＋Ｎａ）^＋， ２１５ （Ｍ＋Ｈ）^＋
【００７９】
（ｆ）コーコリ脂肪酸Ｆ（６）
白色粉末、
〔α〕_Ｄ ^２４−１０．５°（ｃ＝０．７， ＭｅＯＨ） 、

ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ^−１）：３３６８， ２９２６， ２８４９， １７０５， １０７２ 、
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ， ５００ＭＨｚ，δ）：０．９６ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．６Ｈｚ， １８−Ｈ_３）， １．２４−１．４２ （８Ｈ， ｍ， ４，５，６，７−Ｈ_２）， １．５４ （２Ｈ， ｍ， ８−Ｈ_２）， １．６１ （２Ｈ， ｍ， ３−Ｈ_２）， ２．０６ （２Ｈ， ｄｑ−ｌｉｋｅ， Ｊ＝７．６Ｈｚ， １７−Ｈ_２）， ２．１３， ２．３４ （１Ｈ ｅａｃｈ， ｂｏｔｈ ｍ， １４−Ｈ_２）， ２．２７ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．６Ｈｚ， ２−Ｈ_２）， ３．４５ （１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝４．３， ５．５， ８．３Ｈｚ， １３−Ｈ）， ３．９５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝５．２， ５．５Ｈｚ， １２−Ｈ）， ４．０５ （１Ｈ， ｄｔ−ｌｉｋｅ， ９−Ｈ）， ５．４５ （２Ｈ， ｍ， １５， １６−Ｈ）， ５．７１ （２Ｈ， ｍ， １０， １１−Ｈ）、
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ， １２５ＭＨｚ， δｃ）：表１に記載
Ｐｏｓ． ＦＡＢ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３５１ （Ｍ ＋Ｎａ）^＋， ３２９ （Ｍ＋Ｈ）^＋、
Ｎｅｇ． ＦＡＢ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ： ３２７ （Ｍ−Ｈ）⁻
【００８０】
コーコリ脂肪酸Ｆは、 ＦＡＢ−ＭＳ において擬似分子イオンピークがｍ／ｚ ３５１ （Ｍ＋Ｎａ）^＋， ３２９ （Ｍ＋Ｈ）^＋に認められ、その高分解能 ＦＡＢ−ＭＳ 測定により分子式 Ｃ_１８Ｈ_３２Ｏ_５ を有する化合物であることが明らかとなった。また ＩＲ スペクトルにおいて、水酸基（３３６８ ｃｍ^−１）、カルボニル基（１７０５ ｃｍ^−１）に由来する吸収が認められた。
【００８１】
^１Ｈ−ＮＭＲ 及び ^１３Ｃ−ＮＭＲ （表１に記載）スペクトルデータの解析により、末端メチル基〔δ０．９６ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．６Ｈｚ），δ_ｃ１４．６〕、水酸基〔δ４．０５ （１Ｈ， ｄｔ−ｌｉｋｅ），δ_ｃ７３．３〕、カルボン酸〔δ_ｃ１７９．４〕、７個のメチレン基〔δ_ｃ２５．２， ２４．７， ２５．２， ２９．１， ２９．３， ３４．１， ３７．０〕の存在が明らかになった。さらに、 ^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ スペクトルより下式の太線部分で示す部分構造が判明し、 ＨＭＢＣ スペクトルにおいて下式に示すプロトンとカーボン間に相関が認められたことから水酸基及びカルボニル基の位置などが明らかとなり、コーコリ脂肪酸Ｆの平面構造を決定した。
【００８２】
更に ＣＨ_２Ｎ_２エーテル溶液を用いて既知化合物であるモノメチルエステル６ａ（３．１ｍｇ）を誘導することにより、立体配置を含めた構造を決定した（下式）。
【００８３】
【化２１】

【００８４】
実施例３．モロヘイヤ脂肪酸のＮＯ産生抑制活性
ＬＰＳ誘発マウス腹腔内マクロファージ活性化に対する、モロヘイヤの葉から得られた既知および新規脂肪酸のＮＯ産生抑制活性について検討した。
その結果、コーコリ脂肪酸Ｂ（２）、Ｃ（３）は濃度依存的な抑制作用を示し、コーコリ脂肪酸Ｂは低濃度においても抑制作用が認められ、１００μＭの濃度においてはコーコリ脂肪酸Ａ（１）、Ｂ、Ｃのいずれにも同等の抑制作用が認められた。また、１００μＭの濃度においてアゼライン酸（７）にも抑制活性が認められたが、その抑制作用はコーコリ脂肪酸Ａ、Ｂ、Ｃに比べて弱いものであった。
【００８５】
【表２】

【００８６】
更に、細胞毒性についても検討したが、いずれの濃度においても毒性は認められなかった。活性が認められた脂肪酸についてその構造を比較すると次のようなことが明らかとなった。
１）９位にケトン構造を有するものは９位に水酸基を有するものより強い活性が認められた。
【００８７】
２）トリエノン構造を有するものにより強い活性が認められた。
３）１２位、１３位間のオレフィンはシス配置の方がトランス配置よりも強い活性が認められた。
以上の結果を総合すると、今回活性試験を行うことができなかったコーコリ脂肪Ｄ（４）は、コーコリ脂肪酸Ａ、Ｂ、Ｃに比べてより強い活性が認められると推察された。
【００８８】
（試験方法）
ｄｄｙ系雄性マウスを頚部脱臼致死下、腹腔内を約６〜７ｍｌの冷 ＰＢＳにて洗浄し、腹腔内滲出細胞を回収した。得られた細胞を１０％ ＦＣＳ含有 ＲＰＭＩ１６４０ 培地に懸濁した。細胞を平底９６穴マイクロプレートに播種した（１ウェルに ５ ｘ １０^５細胞／１００μｌ ）。
【００８９】
５％ＣＯ_２ 存在下、１時間３７℃にてインキュベートした後、ウェル内を ＰＢＳにて洗浄し非付着性の細胞を取り除いた。その後、培地をＬＰＳ（サルモネラ エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来、シグマ社製）及び被験薬物を含む ＲＰＭＩ１６４０ 培地（１０％ ＦＣＳ含有）に交換し、５％ＣＯ_２ 存在下、２０時間３７℃にてインキュベートした。培養上清 １００μｌ をとり、グリエス（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬を用いて培養上清中のＮＯを測定した。尚、標準溶液には ＮａＮＯ_２溶液を用いた。
【００９０】
数値は平均値±標準誤差で表し、対照群と被験薬物投与群の平均値の差の検定には、ダネット （Ｄｕｎｎｅｔｔ）の方法を用いた。
被験薬物の細胞毒性の検出には、ＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド〕アッセイを用いた。即ち、培養上清 １００μｌ を取り除いた後に各ウェルに１０μｌ のＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）溶液を添加し、５％ＣＯ_２ 存在下で４時間３７℃にてインキュベートした。培地を取り除いた後、イソプロパノール （０．０４Ｎ ＨＣｌ 含有） １００μｌ を添加し生成したホルマザンを溶解した。マイクロプレートリーダーにて吸光度を測定した（測定波長 ５７０ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fatty acid or a salt thereof, a fatty acid extract, an isolation method and use thereof, and more particularly, to a novel fatty acid or a salt thereof named Cocolic fatty acid AF, a fatty acid extract, and an isolation method thereof. And a pharmaceutical composition containing the fatty acid as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Moloheiya (Corchorus olitorius L.) is an annual plant of the linden family, mainly grown in the eastern Mediterranean region such as northeastern Africa and the Middle East, and growing to 2 m in only half a year.
In Moroniya medicine and Ayurvedic medicine, Moroheiya is considered a tonic, especially in fresh leaves and stems, minerals such as potassium calcium, beta carotene and vitamins are very rich in content compared to other vegetables, At the same time, since it contains a large amount of viscous polysaccharide having a neutral fat lowering action and a blood sugar lowering action, its use as a functional vegetable or health food has increased in recent years.
[0003]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor has conducted research on various active ingredients contained in Moroheiya, and as a result, has found that Moroheiya contains fatty acids and glycosides, and further discovered that Moroheiya contains novel fatty acids. In addition, by conducting various studies on these fatty acids, it has been surprisingly found that these fatty acids contained in Moroheiya have an activity of inhibiting nitric oxide (NO) production, thereby completing the present invention. .
[0004]
That is, according to the present invention, the formula (I)
[0005]
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[0006]
[Wherein, R¹Is OH and R^ThreeIs HR ^Two Is-(CH = CH) _Three -COCH _Two CH _Three Then one of the following equations:
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Or
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Or a salt thereof is provided.
[0007]
Further, there is provided a fatty acid extract comprising at least one of the above-mentioned fatty acids or salts thereof, which is soluble in lower aliphatic alcohols and can be extracted and isolated from Moroheiya.
Further, Moroheiya is subjected to an extraction treatment with a lower aliphatic alcohol, and the extraction solution is subjected to a partition treatment with ethyl acetate-water without concentrating the extract. The present invention also provides an isolation method comprising isolating the above-mentioned fatty acid or a salt thereof from the fatty acid extract.
[0008]
Also provided is a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, at least one of the above-mentioned fatty acids or salts thereof, or a fatty acid extract, and a pharmaceutically acceptable excipient.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the components extracted from Moroheiya are a novel fatty acid as shown in the above formula (I), and other known compounds such as azelaic acid and trans-3-dodesendiic acid (trans). -3-dodecenedioic acid, isoquercitrin, astragalin, corchoionoside A and the like. The inventor has named these six novel fatty acids as cocolic fatty acids AF, respectively. The cocolic fatty acids A to F specifically have the following structural formula.
[0010]
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[0011]

[0012]
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[0013]

[0014]
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[0015]

[0016]
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[0017]

[0018]
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[0019]

[0020]
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[0021]

As is clear from the above formula, the cocolic fatty acids C and D are stereoisomers having a cis-type structure at positions 12 and 13 of A and B, respectively.
In the present invention, the fatty acid represented by the above formula includes a solvate or hydrate that can be formed with a solvent used when separating and purifying the fatty acid. These fatty acids may also be pharmaceutically acceptable salts formed with bases, such as alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as calcium and magnesium, and water salts thereof. Examples thereof include inorganic bases such as oxides and ammonia, and organic bases such as pyridine, quinoline, piperidine, collidine, triethylamine, triethanolamine, imidazole, and morpholine.
[0022]
The fatty acid of the present invention comprises extracting Moroheiya with a lower aliphatic alcohol, partitioning the extract with ethyl acetate-water without concentrating the extract, and obtaining an ethyl acetate layer.
It is considered that there are slight differences in the types and amounts of the components of Moroheiya as a raw material depending on the type or the production place. Further, it may contain stems and the like, but it is preferable to mainly use leaves. The leaves may be used as they are or after drying.
[0023]
Moroheiya is extracted with a lower aliphatic alcohol. As the lower aliphatic alcohol, for example, methanol, ethanol, propanol, butanol and the like can be used. Preferably, it is methanol. This extraction treatment may be performed at normal temperature, but is preferably performed by heating the lower aliphatic alcohol to be used to the extent that it is boiled. This extraction treatment is preferably repeated several times, and the amount of the lower aliphatic alcohol used at one time is preferably about 2 to 6 times (weight) of Moroheiya.
[0024]
The extract is then optionally concentrated. The concentration at this time is preferably performed under reduced pressure. In addition, the obtained concentrate may be filtered off using the same lower aliphatic alcohol used previously, and the filtrate may be further concentrated.
The obtained extract (concentrate) is partitioned with ethyl acetate-water. This partitioning treatment can be performed by either (1) shaking the extract (concentrate) with a mixture of water and ethyl acetate, or (2) suspending the extract (concentrate) in water and shaking with ethyl acetate. The method may be performed. The target component is mainly transferred to the ethyl acetate layer by such treatment. Note that this distribution process is preferably performed at room temperature. In (1), the ratio of water to ethyl acetate in the mixture is preferably about 1: 0.5 to 1: 5 (weight ratio), more preferably about 1: 1. In (2), the extract (concentrate) is suspended in approximately the same amount of water, and about 2 to 5 times (weight) of ethyl acetate is added thereto and shaken. This process is repeated about 2 to 3 times. Thereby, the target component is transferred to the ethyl acetate layer.
[0025]
The ethyl acetate layer thus obtained is concentrated, preferably under reduced pressure. This concentration may be performed until the solution is dried.
The obtained concentrate is preferably subjected to a purification treatment. Examples of the purification method include normal phase silica gel chromatography, reverse phase silica gel chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), centrifugal liquid chromatography, column chromatography, thin layer chromatography, and the like, or a combination thereof. There is a method to use. Purification conditions such as the carrier and the elution solvent at this time can be appropriately adjusted depending on the solvent and the like to be used. It may be used in combination with another purification treatment described below.
[0026]
Further, as another purification treatment method, the obtained concentrate is dissolved in about 30% or less of water containing lower aliphatic alcohol, and this solution is contacted with an adsorbent resin to be adsorbed, and then the lower aliphatic alcohol is adsorbed. Elute with alcohol or water containing about 30% or more lower aliphatic alcohol. The lower aliphatic alcohol used at this time is as described above, and among them, methanol is preferable. The adsorptive resin is not particularly limited as long as it is generally used for purification treatment in the field, and examples thereof include a porous crosslinked polystyrene resin having a giant network structure.
[0027]
What is used at the time of elution includes about 30% or more, preferably 35 to 99%, of water containing a lower aliphatic alcohol. As the lower aliphatic alcohol, those similar to the above can be used, and among them, methanol is preferable.
The fatty acid thus obtained can be used as it is as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention. In other words, when the NO production inhibiting action of fatty acids contained in Moroheiya was examined, a strong inhibitory action was found on the fatty acid represented by the above formula (I).
[0028]
NO plays an important role in the circulatory, immune, and nervous systems and is produced in vivo by three types of synthases (NOS). Of these, NOS-2 synthesized by various cytokines and LPS (lipopolysaccharide) produces about 100 times the amount of NO as compared with other synthases. However, pathological effects rather than physiological effects are problematic due to the excessive amount.
[0029]
On the other hand, since the fatty acid of the present invention represented by the formula (I) has an NO production inhibitory action, a large amount of NO causes septic disease (endotoxin shock), hypotension, inflammatory tissue disorder, For the prevention and treatment of ischemic diseases, allergic diseases, autoimmune diseases such as reduced antibacterial and antitumor effects, it can be used as a pharmaceutical composition in the form of a single substance, extract or mixture. it is conceivable that.
Therefore, the fatty acid or salt thereof, or fatty acid extract of the present invention can be used as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable excipient.
[0030]
The fatty acid of the present invention can form a suitable pharmaceutically acceptable salt by a conventional method using the above-mentioned base. In addition, the fatty acid extract can be appropriately obtained with a lower aliphatic alcohol as shown in detail in the following examples.
[0031]
The composition may be oral or parenteral and may be manufactured by conventional or other suitable methods. Oral compositions usually include powders, tablets, emulsions, capsules, granules, sublingual tablets, liquids (tinctures, liquid extracts, sublingual aerosols, alcoholic beverages, suspensions, limonades, syrups, etc. ) And the like. Parenteral compositions include ointments, plasters, liquids (injections, tinctures, lotions, spirits, sprays, aerosols, etc.), poultices (patches, pasta, patches, patches) Tablets, etc.), liniments, sprays, liniments, creams, emulsions and the like. In addition, these compositions may be subjected to a sustained release treatment.
[0032]
The compositions of the present invention may also contain, if desired, conventional additives such as buffers, stabilizers, diluents, sweeteners, demulcents, preservatives and flavoring and coloring agents. .
As the excipient used above, a solid or liquid excipient known in the art can be used. For example, excipients in powders and other oral powders include lactose, starch, dextrin, calcium phosphate, calcium carbonate, synthetic and natural aluminum silicate, magnesium oxide, dry aluminum hydroxide, magnesium stearate, sodium bicarbonate And dried yeast. In the case of an external powder, zinc oxide, talc, starch, kaolin, powdered boric acid, zinc stearate, magnesium stearate, magnesium carbonate, precipitated calcium carbonate, bismuth hypogallate, potassium aluminum sulfate, and the like can be mentioned. Excipients in the liquid preparation include water, glycerin, propylene glycol, simple syrup, ethanol, fatty oil, ethylene glycol, polyethylene glycol, sorbitol and the like. Excipients in ointments include fats, fatty oils, lanolin, petrolatum, glycerin, beeswax, paraffin, liquid paraffin, resins, higher alcohols, glycols, surfactants and the like.
[0033]
In the case of oral preparations, the dose of these compositions is about 0.1 to 1.5 mg, preferably 0.3 to 0.8 mg of the fatty acid of formula (I) or a salt thereof, or a fatty acid extract per adult day. Efficacy can be exerted by administering the drug in several divided doses. In the case of a parenteral preparation, for example, it can be used as a preparation containing a fatty acid of the formula (I) or a salt thereof, or a fatty acid extract at a concentration of 0.01 to 10%.
[0034]
It is understood, however, that the dosage will vary depending on various factors, including the activity of the fatty acids used, the age and weight of the patient, their general health, the time of administration, the manner of administration and the combination of drugs.
[0035]
【Example】
Example 1. Extraction and isolation of moroheiya components
After 6.5 kg of leaves of Moroheiya (from Vietnam) were repeatedly subjected to heat extraction with methanol (12 L) for 3 hours three times, methanol was distilled off under reduced pressure to obtain a methanol extract (700.0 g).
[0036]
The obtained methanol-extracted extract (700.0 g) was partitioned with 1: 1 ethyl acetate-water, and the ethyl acetate transfer extract (227.7 g, 3.9% (solid weight, the same applies hereinafter)) and water transfer. Part extract (462.3 g, 8.0%) was obtained.
227.7 g of ethyl acetate transition extract was subjected to normal phase silica gel column chromatography [3.0 kg, CHCl 3₃: MeOH (50: 1 → 20: 1 → 10: 1 → 5: 1 → 1: 1) → MeOH] and fractionated into 10 fractions [fraction 1 (16.2 g), fraction 2 (11. 3 g), fraction 3 (110.9 g), fraction 4 (7.2 g), fraction 5 (3.8 g), fraction 6 (11.2 g), fraction 7 (10.6 g), fraction 8 (10.8 g) , Fraction 9 (75.6 g) and fraction 10 (2.2 g)].
[0037]
Fraction 3 (110.9 g) was subjected to normal phase silica gel column chromatography [2.0 kg, CHCl 3₃: MeOH (100: 1 → 10: 1) → MeOH], fraction 3-1 (1.8 g), fraction 3-2 (41.0 g), fraction 3-3 (8.4 g), Fraction 3-4 (26.7 g), fraction 3-5 (11.9 g), fraction 3-6 (7.1 g), fraction 3-7 (2.2 g), fraction 3-8 (11.1 g), Fraction 3-9 (1.1 g) was obtained.
[0038]
Further, fraction 3-8 (11.1 g) was subjected to reverse phase silica gel chromatography [167.0 g, MeOH: H₂O (60: 40 → 80: 20) → MeOH → CHCl₃And fraction 3-8-1 (1.4 g), fraction 3-8-2 (641.1 mg), fraction 3-8-3 (1.1 g), fraction 3-8-4 ( 712.8 mg), fraction 3-8-5 (385.5 mg), fraction 3-8-6 (281.9 mg), and fraction 3-8-7 (9.3 g).
[0039]
Next, the fraction 3-8-2 (289.1 mg) was subjected to reverse phase HPLC (column: YMC-pack R & D-ODS-5-A, 250 mm x inner diameter 20, solvent: 60% methanol, flow rate: 9.0 ml / min). ) And purified by azelaic acid (7, 17.8 mg), trans-3-dodesendiic acid (8, 35.8 mg) and cocolic fatty acid E (5, 15.3 mg).
Fraction 3-8-3 (1.1 g) was subjected to normal phase silica gel column chromatography [53.0 g, CHCl 3₃: MeOH (30: 1 → 5: 1) → MeOH], fraction 3-8-3-1 (588.1 mg), fraction 3-8-3-2 (52.4 mg), fraction 3 -8-3-3 (276.5 mg), fraction 3-8-3-4 (33.2 mg), and fraction 3-8-3-1 (222.3 mg) were subjected to reverse phase HPLC (column: YMC-pack). R & D-ODS-5-A, 250 mm x inner diameter 20, solvent: 60% methanol, flow rate: 9.0 ml / min)1, 17.2 mg), B (2, 40.4 mg), C (3, 11.3 mg) and D (4, 10.0 mg).
[0040]
Fraction 8 (10.8 g) was also subjected to reverse phase silica gel column chromatography [320 g, MeOH: H₂O (50: 50 → 80: 20 → 90: 10) → MeOH → CHCl₃And fraction 8-1 (969.3 mg), fraction 8-2 (1.2 g), fraction 8-3 (961.1 mg), fraction 8-4 (654.3 mg), fraction 8-5 (1.2 g), fraction 8-6 (894.9 mg), fraction 8-7 (262.4 mg), fraction 8-8 (3.7 g), and fraction 8-9 (1.5 g). Was. Fraction 8-2 (1.2 g) was subjected to normal phase silica gel column chromatography [53.5 g, CHCl 3₃: MeOH (10: 1 → 5: 1) → MeOH], fraction 8-2-1 (450.3 mg), fraction 8-2-2 (510.8 mg), fraction 8-2-3 (71.9 mg).
[0041]
Next, the fraction 8-2-2 (411.8 mg) was fractionated by gel filtration chromatography [21.0 g, MeOH] to obtain a fraction 8-2-2-1 (147.1 mg) and a flavonol distribution. The saccharide isoquercitrin (9, 252.2 mg).
Fraction 8-2-2-1 (147.0 mg) was subjected to reverse phase HPLC (column: YMC-pack R & D-ODS-5-A, 250 mm x inner diameter 20, solvent: 60% methanol, flow rate: 9.0 ml / min). And purified by yonone glycoside corcoionoside A (10, 9.0 mg) was isolated. Further, fraction 8-3 (222.7 mg) was separated by reversed-phase HPLC (column: YMC-pack R & D-ODS-5-A, 250 mm x inner diameter 20, solvent: 60% methanol, flow rate: 9.0 ml / min). Purified flavonol glycoside Astragalin (119.8 mg) was isolated.
[0042]
Further, from the fraction 6, the cocolic fatty acid F (6) Was isolated.
[0043]
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[0044]

[0045]
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[0046]

[0047]
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[0048]

Example 2. Structural elucidation of Moroheija extract cocoli fatty acids AF
(A) Cocolic fatty acid A (1)
White powder,
[Α]_D ²⁶⁺13.0 ° (c = 0.4, acetone)

UVλ_max ^MeOHnm (log ε): 310 (4.6),
IR (KBr, cm^-1): 3431, 2926, 2853, 1736, 1655, 1605, 1001,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 1.12 (3H, t, J = 7.3 Hz, 18-H₃), 1.26-1.39 (8H, m, 4,5,6,7-H₂), 1.56 (2H, dt-like, 8-H₂), 1.63 (2H, tt-like, 3-H₂), 2.34 (2H, t, J = 7.3 Hz, 2-H₂), 2.58 (2H, q, J = 7.3 Hz, 17-H)₂), 4.21 (1H, dt, J = 6.1, 6.1 Hz, 9-H), 5.92 (1H, dd, J = 6.1, 15.0 Hz, 10-H), 6. 18 (1H, d, J = 15.5 Hz, 15-H), 6.31 (1H, dd, J = 11.0, 15.0 Hz, 13-H), 6.33 (1H, dd, J = 11.0, 15.0 Hz, 11-H), 6.59 (1H, dd, J = 11.0, 15.0 Hz, 12-H), 7.19 (1H, dd, J = 11.0, 15.5 Hz, 14-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1.
EI-MS (m / z): 308 (M⁺), 290 (M⁺-H₂O), 261, 233 (M⁺-H₂OC₃H₅O), 171, 165, 137 (100)
[0049]
The cocolic fatty acid A has a molecular ion peak of m / z 308 (M⁺) Has a fragment ion peak of m / z 290 (M⁺-H₂O), 233 (M⁺-H₂OC₃H₅O), and the molecular formula C was determined by high-resolution EI-MS.₁₈H₂₈O₄It became clear that it was a compound which has. In the IR spectrum, a hydroxyl group (3431 cm^-1), Carbonyl group (1736 cm^-1), Conjugated double bond (1655, 1605 cm)^-1) Was observed, and a maximum absorption was observed at 310 nm (log ε 4.6) in the UV spectrum, suggesting that the compound had a trienone structure.
[0050]
¹H-NMR and^ThirteenAnalysis of C-NMR (described in Table 1) spectral data revealed that a terminal methyl group [δ 1.12 (3H, t, J = 7.3 Hz), δ_c8.3], hydroxyl group [δ 4.21 (1H, dt, J = 6.1, 6.1 Hz), δ_c72.3], trans olefin [δ 5.92 (1H, dd, J = 6.1, 15.0 Hz), δ_c141.0; δ 6.33 (1H, dd, J = 11.0, 15.0 Hz), δ_c129.4; δ 6.59 (1H, dd, J = 11.0, 15.0 Hz), δ_c140.5; δ 6.31 (1H, dd, J = 11.0, 15.0 Hz), δ_c130.6; δ 7.19 (1H, dd, J = 11.0, 15.5 Hz), δ_c141.9: δ 6.18 (1H, d, J = 15.5 Hz), δ_c129.2], a carbonyl group [δ_c201.1], carboxylic acid [δ_c178.6], eight methylene groups [δ_c24.6, 25.2, 28.9, 29.1, 29.3, 33.8, 33.9, 37.2].
[0051]
further,¹H-¹The partial structure shown by the thick line in the following formula was found from the H COSY spectrum, and the correlation between the proton and the carbon shown in the following formula was recognized in the HMBC spectrum, whereby the positions of the 9-position hydroxyl group and the 16-position carbonyl group were confirmed. .^ThirteenC-¹In view of the consideration of the H COSY spectral data, each signal was completely assigned and the planar structure was determined.
[0052]
In order to confirm the number of carboxylic acids, CH prepared from N-methyl-N-nitroso-p-toluene-sulfonamide was used.₂N₂The ether solution (about 1.0 ml) was added to a methanol (0.5 ml) solution of cocolic fatty acid A (3.0 mg), and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product. The product was purified by normal-phase silica gel column chromatography [1.0 g, n-hexane: aceton (20: 1)] to obtain a monomethyl ester.1a(3.1 mg) was obtained. Analysis of the physical data also confirmed the structure (formula below).
[0053]
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[0054]
1a: White powder,

UV λ_max ^MeOHnm (log ε): 310 (4.6),
IR (KBr, cm^-1): 3453, 2932, 2855, 1734, 1718, 1601, 1581, 1030,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 1.12 (3H, t, J = 7.3 Hz, 18-H₃), 1.28-1. 33 (8H, m, 4, 5, 6, 7-H₂), 1.56 (2H, dt-like, 8-H₂), 1.61 (2H, tt-like, 3-H₂), 2.30 (2H, t, J = 7.6 Hz, 2-H₂), 2.59 (2H, q, J = 7.3 Hz, 17-H₂), 3.66 (3H, s, OMe), 4.21 (1H, dt-like, 9-H), 5.93 (1H, dd, J = 6.3, 15.1 Hz, 10-H). , 6.19 (1H, d, J = 15.4 Hz, 15-H), 6.32 (1H, dd, J = 11.1, 14.8 Hz, 13-H), 6.34 (1H, dd) , J = 10.8, 15.1 Hz, 11-H), 6.59 (1H, dd, J = 10.8, 14.8 Hz, 12-H), 7.19 (1H, dd, J = 11). .1, 15.4 Hz, 14-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1.
EI-MS (m / z): 322 (M⁺), 304 (M⁺-H₂O), 233, 137 (100), 185, 165
[0055]
[Table 1]

[0056]
(B) Cocolic fatty acid B (2)
White powder,
[Α]_D ²⁸⁺17.3 ° (c = 0.2, acetone),

UV λ_max ^MeOHnm (log ε): 309 (4.3),
IR (KBr, cm^-1): 3430, 2932, 2857, 1719, 1655, 1605, 1007,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 0.94 (3H, t, J = 7.3 Hz, 18-H₃), 1.24-1.36 (6H, m, 4,5,6-H₂), 1.52-1.64 (6H, m, 3,7,17-H₂), 2.31 (2H, t-like, 2-H₂), 2.52 (2H, t, J = 7.2 Hz, 8-H₂), 4.15 (1H, dt, J = 6.1, 6.7 Hz, 16-H), 5.93 (1H, dd, J = 6.1, 15.1 Hz, 15-H), 6. 17 (1H, d, J = 15.5 Hz, 10-H), 6.31 (1H, dd, J = 11.1, 15.4 Hz, 12-H), 6.32 (1H, dd, J = 10.8, 15.1 Hz, 14-H), 6.60 (1H, dd, J = 10.8, 15.4 Hz, 13-H), 7.18 (1H, dd, J = 11.1, 15.5 Hz, 11-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1.
EI-MS (m / z): 308 (M⁺), 290 (M⁺-H₂O), 233 (100), 223, 171, 165, 137, 79
[0057]
Cocolic fatty acid B has a molecular ion peak of m / z 308 (M⁺) And its high-resolution EI-MS measurement shows the molecular formula C₁₈H₂₈O₄It became clear that it was a compound which has. In the IR spectrum, hydroxyl groups (3430 cm^-1), Carbonyl group (1719, 1710 cm)^-1), Conjugated double bond (1655, 1605 cm)^-1) Was observed, and further, in the UV spectrum, a maximum absorption was observed at 309 nm (log ε 4.3), suggesting that the compound had a trienone structure.
[0058]
¹H-NMR and^ThirteenAnalysis of the C-NMR (described in Table 1) spectral data revealed that a terminal methyl group [δ 0.94 (3H, t, J = 7.3 Hz), δ_c8.3], hydroxyl group [δ4.15 (1H, dt, J = 6.1, 6.7 Hz), δ_c73.5], trans olefin [δ 5.93 (1H, dd, J = 6.1, 15.1 Hz), δ_c140.9; δ 6.32 (1H, dd, J = 10.8, 15.1 Hz), δ_c129.4; δ 6.60 (1H, dd, J = 10.8, 15.4 Hz), δ_c140.7; δ 6.31 (1H, dd, J = 11.1, 15.4 Hz), δ_c130.5; δ 7.18 (1H, dd, J = 11.1, 15.5 Hz), δ_c142.3: δ6.17 (1H, d, J = 15.5 Hz), δ_c129.3], a carbonyl group [δ_c200.3], carboxylic acid [δ_c178.7], eight methylene groups [δ_c24.3, 24.8, 28.8, 28.9, 29.2, 30.1, 33.9, 40.7].
[0059]
Furthermore,¹H-¹From the analysis of the HCOSY spectrum, the partial structure shown by the thick line in the following formula was found, and the correlation between the proton and the carbon shown in the following formula in the HMBC spectrum was confirmed. Was done. Further^ThirteenC-¹Together with the consideration of the H COSY spectral data, each signal was completely assigned and the planar structure was determined.
[0060]
In addition, similar to cocolic fatty acid A, CH₂N₂Monomethyl ester from cocolic fatty acid B (3.0 mg, 0.0097 mmol)2a(3.1 mg) (the following formula),2aAnalyzed various physical data and identified methyl (16S) -hydroxy-9-oxo- (10E, 12E, 14E) -octadecatrienate isolated from the marine plant Acrosiphonia coalita. . From the above results, the structure of the cocolic fatty acid B was determined.
[0061]
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[0062]
2a: White powder

UVλ_max ^MeOHnm (log ε): 310 (4.6),
IR (KBr, cm^-1): 3453, 2930, 2857, 1743, 1650, 1598, 1125,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 0.95 (3H, t, J = 7.3 Hz, 18-H₃), 1.26-1.38 (6H, m, 4,5,6-H₂), 1.50-1.63 (6H, m, 3,7,17-H₂), 2.30 (2H, t, J = 7.5 Hz, 2-H₂), 2.54 (2H, t, J = 7.5 Hz, 8-H), 3.66 (3H, s, OMe), 4.16 (1H, dt, J = 6.4, 6.4 Hz, 16-H), 5.93 (1H, dd, J = 6.4, 15.4 Hz, 15-H), 6.17 (1H, d, J = 15.4 Hz, 10-H), 6.31. (1H, dd, J = 11.1, 15.4 Hz, 12-H), 6.34 (1H, dd, J = 10.9, 15.4 Hz, 14-H), 6.60 (1H, dd) , J = 10.9, 15.4 Hz, 13-H), 7.18 (1H, dd, J = 11.1, 15.4 Hz, 11-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1,
EI-MS (m / z): 322 (M⁺), 304 (M⁺-H₂O)
[0063]
(C) Cocolic fatty acid C (3)
White powder,
[Α]_D ²³⁺33.1 ° (c = 0.2, acetone),

UV λ_max ^MeOHnm (log ε): 311 (4.4),
IR (KBr, cm^-1): 3432, 2930, 2855, 1717, 1653, 1597, 1009,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 1.13 (3H, t, J = 7.3 Hz, 18-H₃), 1.25-1.38 (8H, m, 4,5,6,7-H₂), 1.55 (2H, dt, J = 6.4, 7.0 Hz, 8-H)₂), 1.61 (2H, tt, J = 7.0, 7.3 Hz, 3-H₂), 2.35 (2H, t, J = 7.3 Hz, 2-H₂), 2.60 (2H, q, J = 7.3 Hz, 17-H₂), 4.26 (1H, dt, J = 6.3, 6.4 Hz, 9-H), 5.92 (1H, dd, J = 6.3, 14.9 Hz, 10-H), 6. 10 (1H, dd, J = 11.3, 11.6 Hz, 13-H), 6.21 (1H, d, J = 15.0 Hz, 15-H), 6.36 (1H, dd, J = 11.3, 11.3 Hz, 12-H), 6.83 (1H, dd, J = 11.3, 14.9 Hz, 11-H), 7.66 (1H, dd, J = 11.6, 15.0 Hz, 14-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1.
EI-MS (m / z): 308 (M⁺), 290 (M⁺-H₂O), 261, 233 (M⁺-H₂OC₃H₅O), 171, 137 (100)
[0064]
Cocolic fatty acid C has a molecular ion peak of m / z 308 (M⁺) Has a fragment ion peak of m / z 290 (M⁺-H₂O), the molecular formula C was determined by high-resolution EI-MS.₁₈H₂₈O₄It became clear that it was a compound which has. In the IR spectrum, a hydroxyl group (3432 cm^-1), Carbonyl group (1717 cm^-1), Conjugated double bond (1653, 1597 cm)^-1) Was observed. Furthermore, in the UV spectrum, maximum absorption was observed at 311 nm (log ε 4.4), suggesting that the compound has a trienone structure.
[0065]
Comparing the NMR data of cocolic fatty acid C with A, the results are almost similar except for the 11th to 14th positions.¹In the data of H-NMR, cis olefin [δ6.36 (1H, dd, J = 11.3, 11.3 Hz, 12-H), δ6.10 (1H, dd, J = 11.3, 11.6 Hz, 13-H)] was confirmed, which revealed that the cocory fatty acid C has a cis-type structure at positions 12 and 13 of A.
[0066]
Also, CH₂N₂Monomethyl ester from cocolic fatty acid C (3.0 mg, 0.0097 mmol) using ether solution3a(3.1 mg) was obtained, and its structure was confirmed by comparative consideration of its physical data (the following formula). The structure of cocolic fatty acid C was determined by considering the above results.
[0067]
Embedded image

[0068]
3a: White powder,

UV λ_max ^MeOHnm (log ε): 310 (4.4),
IR (KBr, cm^-1): 3453, 2930, 2855, 1743, 1655, 1598, 1010,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 1.13 (3H, t, J = 7.3 Hz, 18-H₃), 1.25-1.36 (8H, m, 4,5,6,7-H₂), 1.55 (2H, dt-like, 8-H₂), 1.61 (2H, tt-like, 3-H₂), 2.31 (2H, t, J = 7.6 Hz, 2-H₂), 2.61 (2H, q, J = 7.3 Hz, 17-H), 3.67 (3H, s, OMe), 4.25 (1H, dt, J = 6.4, 6.4 Hz, 9-H), 5.92 (1H, dd, J = 6.4, 15.3 Hz, 10-H), 6.12 (1H, dd, J = 11.0, 11.9 Hz, 13-H) , 6.20 (1H, d, J = 15.4 Hz, 15-H), 6.35 (1H, dd, J = 11.0, 11.9 Hz, 12-H), 6.82 (1H, dd) , J = 11.9, 15.3 Hz, 11-H), 7.65 (1H, dd, J = 11.9, 15.4 Hz, 14-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1,
EI-MS (m / z): 322 (M⁺), 304 (M⁺-H₂O), 261, 233, 185, 165, 137 (100)
[0069]
(D) Cocolic fatty acid D (4)
White powder,
[Α]_D ²⁶⁺19.7 ° (c = 0.4, acetone)

UV λ_max ^MeOHnm (log ε): 311 (4.3),
IR (KBr, cm^-1): 3431, 2932, 2857, 1726, 1655, 1597, 1115,
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz, δ): 0.96 (3H, t, J = 7.5 Hz, 18-H₃), 1.28-1.39 (6H, m, 4,5,6-H₂), 1.57-1.66 (6H, m, 3,7,17-H₂), 2.34 (2H, t-like, 2-H₂), 2.57 (2H, t, J = 7.1 Hz, 8-H₂), 4.22 (1H, dt, J = 5, 8, 6.1 Hz, 16-H), 5.93 (1H, dd, J = 6.1, 15.3 Hz, 15-H), 6. 10 (1H, dd, J = 11.0, 11.3 Hz, 12-H), 6.19 (1H, d, J = 15.3 Hz), 10-H), 6.36 (1H, dd, J) = 11.3, 11.3HZ, 13-H), 6.85 (1H, dd, J = 11.3, 15.3Hz, 14-H), 7.64 (1H, dd, J = 11.3) , 15.3 Hz, 11-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 125 MHz, δc): described in Table 1,
EI-MS (m / z): 308 (M)⁺, 290 (M⁺-H₂O), 261, 233 (M⁺-H₂OC₃H₅O), 223, 171, 137, 41 (100)
[0070]
The cocolic fatty acid D has a molecular ion peak of m / z 308 (M⁺) And the fragment ion peak is m / z 290 (M⁺-H₂O) and its high resolution EI-MS₁₈H₂₈O₄It became clear to have. In the IR spectrum, a hydroxyl group (3431 cm^-1), Carbonyl group (1726 cm^-1), Conjugated double bond (1655, 1597 cm)^-1) Was observed. Furthermore, in the UV spectrum, maximum absorption was observed at 311 nm (log ε 4.3), suggesting that the compound has a trienone structure.
[0071]
Comparing the NMR data of cocolic fatty acid D with C suggests that the positions of the hydroxyl group and the carbonyl group are different, and comparing the cocolic fatty acids D and B with each other, except for the signals at positions 11 to 14, which are very similar. Was.
In addition, the results of various two-dimensional NMR analyzes¹H-¹A partial structure including a trans-cis-trans-type trienone moiety indicated by a bold line in the following formula was found in the H COSY spectrum. From the HMBC spectrum, a correlation was observed between the proton and carbon shown in the following formula, which revealed that the cocolic fatty acid D was a cis-isomer at the 12-position or 13-position of B, and the chemical structure of the cocolic fatty acid D was represented by the following formula. Determined as shown.
[0072]
Embedded image

[0073]
(E) Cocolic fatty acid E (5)
Colorless oil,
[Α]_D ²⁴⁺14.2 ° (c = 0.7, CHCl₃)

IR (film, cm^-1): 3410, 2930, 2856, 1709, 991,
¹H-NMR (CDCl₃, 270 MHz, δ): 1.20-1.42 (8H, m, 4,5,6,7-H₂), 1.51 (2H, m, 8-H₂), 1.62 (2H, m, 3-H₂), 2.33 (2H, t, J = 7.3 Hz, 2-H₂), 4.10 (1H, dt, J = 6.3, 6.3 Hz, 9-H), 5.10 (1H, d, J = 10.6 Hz), 5.21 (1H, d, J = 17.5 Hz), (11-H₂), 5.86 (1H, ddd, J = 10.6, 17.5 Hz, 10-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 68 MHz, δc): described in Table 1,
Pos. FAB-MS (m / z): 201 (M + H)⁺
[0074]
The cocolic fatty acid E has a molecular ion peak of m / z 201 (M + H) in FAB-MS.⁺The high-resolution FAB-MS measurement showed the molecular formula C₁₁H₂₁O₃It became clear to have. In the IR spectrum, hydroxyl groups (3410 cm^-1), Carbonyl group (1709 cm^-1) Was observed.
[0075]
¹H-NMR and^ThirteenAnalysis of C-NMR (described in Table 1) spectral data revealed that terminal olefins [δ 5.10 (1H, d, J = 10.6 Hz), 5.21 (1H, d, J = 17.5 Hz), δ]_c5.4.7 (1H, ddd, J = 6.3, 10.6, 17.5 Hz), δ_c141.2], hydroxyl group [δ 4.10 (1H, dt, J = 6.3, 6.3 Hz), δ_c73.3], carboxylic acid [δ_c179.4], 7 methylene groups [δ_c24.7, 25.2, 28.9, 29.1, 29.3, 34.1, 37.0]. further,¹H-¹From the H COSY spectrum, the partial structure shown by the thick line in the following formula was found.
[0076]
Also CH₂N₂Monomethyl ester from cocolic fatty acid E (3.0 mg, 0.015 mmol) using ether solution5a(3.0 mg) was obtained, and its structure was confirmed from comparative consideration of its physical data (the following formula). By considering the above results, the cocolic fatty acid E (5) Was determined.
[0077]
Embedded image

[0078]
5a: Colorless oil,

IR (film, cm^-1): 3410, 2930, 2856, 1709,
¹H-NMR (CDCl₃, 270 MHz, δ): 1.20-1.40 (10H, m, 3,4,5,6,7-H₂), 1.51 (2H, m, 8-H₂), 1.62 (2H, m, 3-H₂), 2.30 (2H, t, J = 7.4 Hz, 2-H₂), 3.66 (3H, s, OMe), 4.09 (1H, dt, J = 6.3, 6.3 Hz, 9-H), 5.10 (1H, dd, J = 1.3, 10.6 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 1.3, 17.2 Hz) (11-H₂), 5.87 (1H, ddd, J = 6.3, 10.6, 17.2 Hz, 10-H),
^ThirteenC-NMR (CDCl₃, 68 MHz, δc): described in Table 1,
Pos. FAB-MS (m / z): 237 (M + Na)⁺, 215 (M + H)⁺
[0079]
(F) Kokoli fatty acid F (6)
White powder,
[Α]_D ²⁴-10.5 ° (c = 0.7, MeOH),

IR (KBr, cm^-1): 3368, 2926, 2849, 1705, 1072,
¹H-NMR (CD₃OD, 500 MHz, δ): 0.96 (3H, t, J = 7.6 Hz, 18-H)₃), 1.24-1.42 (8H, m, 4, 5, 6, 7-H₂), 1.54 (2H, m, 8-H₂), 1.61 (2H, m, 3-H₂), 2.06 (2H, dq-like, J = 7.6 Hz, 17-H₂), 2.13, 2.34 (1H reach, both m, 14-H₂), 2.27 (2H, t, J = 7.6 Hz, 2-H₂), 3.45 (1H, ddd, J = 4.3, 5.5, 8.3 Hz, 13-H), 3.95 (1H, dd, J = 5.2, 5.5 Hz, 12-H) ), 4.05 (1H, dt-like, 9-H), 5.45 (2H, m, 15, 16-H), 5.71 (2H, m, 10, 11-H),
^ThirteenC-NMR (CD₃OD, 125 MHz, δc): described in Table 1.
Pos. FAB-MS (m / z): 351 (M + Na)⁺, 329 (M + H)⁺,
Neg. FAB-MS (m / z): 327 (MH)⁻
[0080]
The cocolic fatty acid F has a pseudo molecular ion peak of m / z 351 (M + Na) in FAB-MS.⁺, 329 (M + H)⁺The high-resolution FAB-MS measurement showed the molecular formula C₁₈H₃₂O₅It became clear that it was a compound which has. In the IR spectrum, a hydroxyl group (3368 cm^-1), Carbonyl group (1705 cm^-1) Was observed.
[0081]
¹H-NMR and^ThirteenAnalysis of C-NMR (described in Table 1) spectral data revealed that a terminal methyl group [δ 0.96 (3H, t, J = 7.6 Hz), δ_c14.6], hydroxyl group [δ 4.05 (1H, dt-like), δ_c73.3], carboxylic acid [δ_c179.4], 7 methylene groups [δ_c25.2, 24.7, 25.2, 29.1, 29.3, 34.1, 37.0]. further,¹H-¹The partial structure shown by the thick line in the following formula was found from the H COSY spectrum, and the correlation between the proton and the carbon shown in the following formula was found in the HMBC spectrum. Was determined.
[0082]
Further CH₂N₂Monomethyl ester, a known compound using ether solution6a(3.1 mg), the structure including the configuration was determined (the following formula).
[0083]
Embedded image

[0084]
Example 3. NO production inhibition activity of Moroheiya fatty acids
The activity of known and novel fatty acids obtained from leaves of Moroheiya to inhibit the production of LPS-induced intraperitoneal macrophages in mice was examined.
As a result, the cocolic fatty acid B (2), C (3) Shows a concentration-dependent inhibitory effect. Cocolic fatty acid B has an inhibitory effect even at a low concentration, and at a concentration of 100 μM, cocolic fatty acid A (1), B and C all exhibited the same inhibitory action. At a concentration of 100 μM, azelaic acid (7) Also exhibited an inhibitory activity, but the inhibitory effect was weaker than that of cocolic fatty acids A, B and C.
[0085]
[Table 2]

[0086]
Furthermore, cytotoxicity was examined, but no toxicity was observed at any concentration. Comparison of the structures of the fatty acids for which the activity was observed revealed the following.
1) Those having a ketone structure at the 9-position showed stronger activity than those having a hydroxyl group at the 9-position.
[0087]
2) Stronger activity was observed for those having a trienone structure.
3) For the olefin between the 12-position and the 13-position, a stronger activity was observed in the cis configuration than in the trans configuration.
Summarizing the above results, it was found that Cocori fat D (4) Was presumed to have stronger activity than cocolic fatty acids A, B, and C.
[0088]
(Test method)
The ddy male mice were killed by dislocation of the cervix and the peritoneal cavity was washed with about 6 to 7 ml of cold PBS to collect exudate cells in the peritoneal cavity. The obtained cells were suspended in RPMI1640 medium containing 10% FCS. Cells were seeded in flat-bottom 96-well microplates (5 × 10 5 per well).⁵Cells / 100 μl).
[0089]
5% CO₂After incubating for 1 hour at 37 ° C in the presence, the wells were washed with PBS to remove non-adherent cells. Thereafter, the medium was replaced with an RPMI1640 medium (containing 10% FCS) containing LPS (from Salmonella enteritidis, Sigma) and a test drug, and 5% CO₂Incubated for 20 hours at 37 ° C. in the presence. 100 μl of the culture supernatant was taken, and NO in the culture supernatant was measured using a Griess reagent. The standard solution contains NaNO₂The solution was used.
[0090]
Numerical values are expressed as mean ± standard error, and Dunnett's method was used to test the difference between the mean of the control group and the test drug-administered group.
MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] assay was used to detect the cytotoxicity of the test drug. That is, after removing 100 μl of culture supernatant, 10 μl of MTT (5 mg / ml in PBS) solution was added to each well, and 5% CO 2 was added.₂Incubated for 4 hours at 37 ° C in the presence. After removing the medium, 100 μl of isopropanol (containing 0.04 N HCl) was added to dissolve the formed formazan. The absorbance was measured with a microplate reader (measurement wavelength: 570 nm, reference wavelength: 655 nm).

Claims (6)

Formula (I):

[In the formula, R ¹ is an OH and R ³ Ri H Der, R ² is - if (CH = CH) is a ₃ -COCH ₂ CH _3, one of the following formulas:

Or

Or a salt thereof. A fatty acid extract comprising at least one fatty acid or a salt thereof according to claim 1 , which is soluble in lower aliphatic alcohols and can be extracted and isolated from Moroheiya. Was extracted with a lower aliphatic alcohol Jew, ethyl acetate was not or concentrated extract - partitioned treated with water, at least one containing a fatty acid or a salt thereof according ethyl acetate layer obtained in claim 1 A method for isolating a fatty acid extract comprising: 4. The method according to claim 3, further comprising individually isolating the fatty acid of formula (I) according to claim 1 or a salt thereof from the fatty acid extract. Fatty acid or a salt thereof according to claim 1 as an active ingredient, or at least one and, a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable excipient fatty extract according to claim 2. The pharmaceutical composition according to claim 5, which is used as a NO production inhibitory active agent.