JP3595210B2 - 高められたアベルメメクチン生成のためのストレプトミセス・アベルミチリス調節遺伝子 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）を生成するための組成物及び方法に向けられ、そして主に、動物の健康の分野に関する。より具体的には、本発明は、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）におけるアベルメクチンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）発現及びアベルメクチン生合成の調節に関与する、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子として本明細書において言及される２種の新規遺伝子の同定及び特徴づけに関する。本発明は、それらの遺伝子の不活性化がＳ．アベルミチリスにより生成されるアベルメクチンの量の上昇をもたらすという発見に基づかれる。
【０００２】
【従来の技術】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の種は、効果的な駆虫及び殺昆虫活性を有する８種の関連する１６−員の大環状ラクトンを含んで成る広範囲の二次代謝物、たとえばアベルメクチンを生成する。８種の異なっているが、しかし密接に関連している化合物は、Ａ１ａ，Ａ１ｂ，Ａ２ａ，Ａ２ｂ，Ｂ１ａ，Ｂ１ｂ，Ｂ２ａ、及びＢ２ｂとして言及される。“ａ”シリーズの化合物は、天然のアベルメクチンを意味し、ここでＣ２５位置での置換基が（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルであり、そして“ｂ”シリーズは、Ｃ２５位置での置換基がイソプロピルである化合物を意味する。
【０００３】
名称“Ａ”及び“Ｂ”は、Ｃ５での置換基がそれぞれ、メトキシ及びヒドロキシであるアベルメクチンを意味する。数字“１”は、二重結合がＣ２２，２３位置で存在するアベルメクチンを意味し、そして数字“２”は、Ｃ２２位置で水素及びＣ２３位置でヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。関連するアベルメクチンの中で、Ｂ１タイプのアベルメクチンは、最とも効果的な駆虫及び殺虫活性を有するものとして認識され、そして従って、最とも商業的に所望するアベルメクチンである。
【０００４】
アベルメクチン類、及びＳ．アベルミチリスの株の好気性発酵によるそれらの生成が、特に、アメリカ特許第４，３１０，５１９号及び第４，４２９，０４２号に記載されている。
二次代謝物及び他のストレプトミセス抗生物質の生成に関与する多くの遺伝子のようにアベルメクチン（ａｖｅ）遺伝子は、細菌染色体上に一緒に群がって見出される。アベルメクチン生合成のためのａｖｅ遺伝子クラスターは、アベルメクチンポリケチドシンターゼ（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｍｔｈａｓｅ）（ＰＫＳ）をコードするＤＮＡを包含する９５ｋｂのＤＮＡゲノムに及ぶ（ＭａｃＮｅｉｌ など．， １９９２， Ｇｅｎｅ １１５： １１９−１２５）。
【０００５】
ストレプトミセスにおける抗生物質生合成の調節は、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）において、おそらく最もよく特徴づけられている。Ｓ．コリエカラーにより生成される４種の抗生物質は、アクチノルボシン（Ａｃｔ）、ウンデシルプロジギオシン（Ｒｅｄ）、カルシウム−依存性抗生物質（ＣＤＡ）及びメチルノマイシン（Ｍｍｙ）を包含する。それらの抗生物質の個々は、遺伝的に異なった遺伝子の異なったクラスターによりコードされる。それぞれ、Ａｃｔ生合成遺伝子クラスター又はＲｅｄ生合成遺伝子クラスターの発現を特異的に調節する生成物をコードする、Ａｃｔ遺伝子クラスター又はＲｅｄ遺伝子クラスターのいづれかに連結される遺伝子が同定されている。
【０００６】
１つよりも多くの抗生物質生合成遺伝子クラスターを全体的に調節する遺伝子を含む多くの遺伝子座がまた、同定されている。たとえば、２種の独立した遺伝子座、ａｂｓＡ及びａｂｓＢにおける突然変異は、Ｓ．コエリカラーにおけるすべての４種の抗生物質の合成をブロックすることが示されている（Ｂｒｉａｎ など．， １９９６， Ｊ．Ｂａｃｔ． １７８： ３２２１−３２３１ ）。ａｂｓＡ遺伝子座はクローン化され、そして特徴づけられており、そしてその遺伝子生成物は、Ｓ．コエリカラーにおける抗生物質合成の全体的な負のレギュレーターとして通常、作用するシグナルトランスダクション経路に関与することが示されている（Ｂｒｉａｎ など．， １９９６ 、上記）。
【０００７】
アメリカ特許第５，７０７，８３９号（Ｄｅｎｏｙａ）及びアメリカ特許第５，７２８，５６１号（Ｄｅｎｏｙａなど．）は、ストレプトミセスの枝分れ鎖のα−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードするＤＮＡ配列に関する。タイプＩポリケチドシンターゼ発現がＳ．アベルミチリスにおいて調節される機構の理解は、アベルメクチンの生成を高めるためにａｖｅ遺伝子の遺伝的操作を可能にするであろう。
【０００８】
【発明の要約】
本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ａｖｅＲ１遺伝子生成物は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【０００９】
本発明はさらに、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様において、ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅＲ１−関連の相同ポリペプチドのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成る。非制限的であるが、特定の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の副配列から成るペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（フランキング）１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎｔ２３１８〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（フランキング）ヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１２】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子における個々のフランキング配列、及びその相同体は、好ましくは、少なくとも約２００ｎｔの長さでである。非制限的態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦを天然において端に有し、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、そしてさらに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ１−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列又はその実質的な部分を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】
本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ａｖｅＲ２遺伝子生成物は、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様おいては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３（注：配列番号３は配列番号１と同一である）に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１４】
本発明はさらに、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物又はａｖｅＲ２−関連の相同ポリペプチドのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成る。非制限的であるが、特定の態様において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列のサブ配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から成るペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ２３１３、及び約ｎｔ３０２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号３のヌクレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１７】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子中の個々のフランキング配列は、好ましくは、少なくとも約２００ｎｔの長さである。非制限的態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接し（ｆｌａｎｋｉｎｇ）、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、そしてさらに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ２−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列又はその実質的な部分を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、前記ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物は、それぞれ配列番号２及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ３０２１の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１９】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。非制限的態様においては、本発明は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者をコードするヌクレオチド配列を含んで成る前記ポリヌクレオチド分子のいづれか、又はそれに対して相同である前記ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る。非制限的であるが特定の態様においては、ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列から成る。非制限的であるが特定のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるようなａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列から成る。
【００２２】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎｔ３０２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチド分子における個々のフランキング配列、又はその相同体は好ましくは、少なくとも約２００ｎｔの長さでである。
【００２３】
非制限的態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同であり、そしてさらに、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子のいづれか又は両者をコードする本発明の１つの前記ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子及びその実質的な部分を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、本発明の前記ポリヌクレオチド分子又はその一部のいづれかを増幅するためにプライマーとして有用であり、又はａｖｅ遺伝子発現及びアベルメクチン生成の調節において有用なアンチセンス分子をコードし、又はその分子として作用するために使用され得るオリゴヌクレオチド分子を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、クローニングベクター、発現ベクター、前記ベクターのいづれかを含んで成る形質転換された宿主細胞、及びそれに由来する新規株又は細胞系を包含する、本発明のポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子のいづれかをクローニングし、そして発現するための組成物及び方法を提供する。非制限的な態様においては、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子の発現のために必要な１又は複数の調節要素と作用可能に関連して前記ポリヌクレオチド分子を含んで成る組換え発現ベクターを提供する。非制限的ではあるが、特定の態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の完全なＯＲＦを含んで成るプラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされる実質的に精製された、又は単離されたポリペプチドを提供する。非制限的であるが特定の態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るａｖｅＲ１遺伝子生成物である。非制限的であるが特定のもう１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るａｖｅＲ２遺伝子生成物である。本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物のいづれかに対して相同である実質的に精製され又は単離されたポリペプチドを提供する。本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同ポリペプチドの実質的に精製され又は単離されたペプチドフラグメントを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、特定のコードされた遺伝子生成物、ポリペプチド、又はペプチドフラグメントの発現の助けとなる条件下で、本発明の組換え発現ベクターにより形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、そして細胞培養物から発現された遺伝子生成物、ポリペプチド又はペプチドフラグメントを回収することを含んで成る、本発明の実質的に精製され、又は単離されたａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリペプチド又はペプチドフラグメントの調製方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、遺伝子構造体、たとえば遺伝子置換ベクターを包含する、ストレプトミセスの種又は株の細胞を遺伝子的に修飾するための組成物及び方法を提供する。本発明により提供される場合、ストレプトミセスの種又は株の細胞は、遺伝子的に修飾され、そのように修飾されていない同じ種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量とは検出できるほど異なっている多量のアベルメクチンが生成される。好ましい態様においては、ストレプトミセスの種又は株の細胞は遺伝子的に修飾され、そのように修飾されていない同じ種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンが生成される。
【００２９】
さらなる好ましい態様において、ストレプトミセスの種はＳ．アベルミチリスである。本発明によれば、そのような遺伝子修飾は好ましくは、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発することを含んで成り、ここでそのような突然変異は、遺伝子突然変異を担持しない株の細胞に比較して、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子の両者において突然変異を担持するＳ．アベルミチリスの株の細胞により生成されるアベルメクチンの量の検出できる上昇をもたらす。
【００３０】
ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然変異は、標準の突然変異誘発技法、たとえば化学的突然誘発物質又は放射線への暴露により、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発するために、本発明により提供される遺伝子構造体、たとえば遺伝子置換ベクターを用いることによって、ヌクレオチドを付加し、欠失し、又は置換することによって、又はフレームシフトを導入することによって、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中に異なった又は異種のヌクレオチド配列を挿入することによって、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の一部又はすべてを欠失することによって、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の一部又はすべてを、異なった又は異種のヌクレオチド配列により置換することによって、又はそのような突然変異の組合せによって実施され得る。
【００３１】
本発明はさらに、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めることができる、ストレプトミセスの種又は株におけるａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然変異を同定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）ストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を測定し；（ｂ）前記種又は株の細胞の、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子中に、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に突然変異を導入し；そして（ｃ）遺伝子突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量に、段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量を比較することを含んで成り；段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量が遺伝子突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量よりも検出できるほど高い場合、アベルメクチンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然変異が同定されることを特徴とする。好ましい態様において、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。
【００３２】
本発明はさらに、ストレプトミセスの種又は株の修飾されていない細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成する、ストレプトミセスの特定の種又は株からの遺伝子的に修飾された細胞を調製するための方法を提供し、ここで前記方法は、ストレプトミセスの種又は株の細胞におけるａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発し、そして遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成する突然変異誘発された細胞を選択することを含んで成る。
【００３３】
好ましい態様においては、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。下記実施例（９−１）に記載される、非限定的であるが特定の態様においては、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者は、異種遺伝子により個々の遺伝子のＯＲＦの一部を置換することによって突然変異誘発され、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子がそのように突然変異誘発されていないＳ．アベルミチリスの株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成するＳ．アベルミチリス細胞がもたらされる。
【００３４】
実施例（９−２）に記載される、非制限的であるが特定のもう１つの態様においては、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２遺伝子が、異種遺伝子をａｖｅＲ２のＯＲＦ中に挿入することによって突然変異誘発され、ａｖｅＲ２遺伝子がそのように突然変異誘発されていないＳ．アベルミチリスの株の細胞に比較して、検出できるほどに高められた量のアベルメクチンを生成するＳ．アベルミチリスがもたらされる。
【００３５】
本発明はさらに、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの株の細胞に比較して、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者への１又は複数の突然変異の結果として、検出できるほどに高められた量のアベルメクチンを生成するストレプトミセスの新規株の細胞を供給する。好ましい態様においては、ストレプトミセスの株は、種Ｓ．アベルミチリスからである。本発明の新規株は、アベルメクチン、たとえば商業的に所望されるドラメクチンの大規模生成において有用である。
【００３６】
本発明はさらに、ストレプトミセスの培養により生成されるアベルメクチンの量を高めるための方法を提供し、ここで前記方法は、遺伝子突然変異を担持しない種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めるよう作用する、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者における突然変異を含んで成る、ストレプトミセスの種又は株の細胞を、それからアベルメクチンの生成を可能にし又は誘発する条件下で、培養培地において培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含んで成る。好ましい態様において、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。この方法は、アベルメクチンの生成効率を高めるために有用である。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントに対して向けられる抗体を提供する。
図１．Ａ．Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ヒスチジンキナーゼ相同体（ａｂｓＡ１）及びＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子によりコードされる推定されるアミノ酸配列の比較は、約３２％の配列同一性を示す。Ｂ．Ｓ．コエリカラー応答レギュレーター相同体（ａｂｓＡ２）及びＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子によりコードされる推定されるアミノ酸配列の比較は、約４５％の配列同一性を示す。高度に保存されたアミノ酸は肉太活字型で存在する。
【００３８】
図２．Ａ．ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）。Ｂ．ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ２１０。
図３．Ａ．ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの一部を置換しているｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ２１４。Ｂ．ａｖｅＲ２のＯＲＦ中に挿入されるｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ２１６。
図４．同定される５種のオーバーラップするコスミドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５，ｐＳＥ６６，ｐＳＥ６７，ｐＳＥ６８，ｐＳＥ６９）と共に、Ｓ．アベルミチリスからのアベルメクチン ポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図。
【００３９】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の同定及び特徴化、及びそれらの遺伝子の突然変異が生成されるアベルメクチンの量を調節できる発見に関する。例によれば、本発明は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるような又はプラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）に存在するようなａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３（注：配列番号３は配列番号１と同一である）に示されるような又はプラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）に存在するようなａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子、及びそれらに由来する突然変異誘発されたヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子について、下記セクションにおいて記載される。
【００４０】
配列番号１及び３に示されるヌクレオチド配列、及びその実質的な部分に関する、本明細書における言及は、特にことわらない限り、プラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）に存在するような、それぞれの対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部分を意味するためにも意図される。さらに、配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列、及びそのペプチドフラグメントに関する、本明細書における言及はまた、特にことわらない限り、プラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）に存在する、対応するａｖｅＲ１−及びａｖｅＲ２−コードのヌクレオチド配列によりコードされる、それぞれの対応するアミノ酸配列及びそのペプチドフラグメントを言及するためにも意図される。
【００４１】
ポリヌクレオチド分子
本明細書において使用される場合、用語“ポリヌクレオチド分子”、“ポリヌクレオチド配列”、“コード配列”、“リーディングフレーム（ＯＲＦ）”及び同様のものは、一本鎖又は二本鎖のいづれかであり得る、ＤＮＡ及びＲＮＡの両分子を言及する。コード配列又はＯＲＦは、原核配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、及び化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００４２】
本明細書に開示される、ポリヌクレオチド分子及びオリゴヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者の範囲内であり、そして中でも、次の文献に記載される組換え技法に従って実施され得る：Ｍａｎｉａｔｉｓなど． １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌなど．， １９８９， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ； Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ｉｎｎｉｓなど．（ｅｄｓ）， １９９５， ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ； Ｅｒｌｉｃｈ（ｅｄ）， １９９２， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄなど．， １９８５， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， Ｕ．Ｋ．； それらのすべては引用により、本明細書中に組込まれる。
【００４３】
ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ａｖｅＲ１遺伝子生成物は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるような、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００４４】
本発明はさらに、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。用語“相同”とは、これに関して使用される場合、（ａ）約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１と同じポリペプチドをコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従って、ヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＮのＮａＨＰＯ_４ 、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合されたＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける４２℃での洗浄下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を意味し（Ａｕｓｕｂｅｌ など． （ｅｄｓ．）， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， 及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ ２．１０．３ を参照のこと）、そして本発明の実施において有用である。
【００４５】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、高い緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ下でフィルター結合されたＤＮＡに対する６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける６８℃での洗浄下でハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記）、そして本発明の実施において有用である。さらなる好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
【００４６】
本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子は、“本発明の実施において有用であり”、ここでポリヌクレオチド分子が、特定部位の突然変異誘発、たとえば相同組換えによりＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ中に突然変異を導入するために、又は標準の増幅技法を用いて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を増幅するために、使用され得る。そのような相同ポリヌクレオチド分子は、Ｓ．コエリカラーを除く、ストレプトミセスの他の種、又はＳ．アベルミチリスの他の株に存在する天然に存在するａｖｅＲ１遺伝子、及び天然に存在するか、化学的に合成されるか、又は遺伝的に構築されるかにかかわらず、突然変異誘発されたａｖｅＲ１対立遺伝子を包含することができる。
【００４７】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言及するために本明細書において使用される場合、用語“相同”とは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを意味するが、しかしその１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されており、そしてその得られるポリペプチドは、本発明の実施において有用である。
【００４８】
保存性アミノ酸置換は、当業界において良く知られている。そのような置換を製造するための規則は、中でも、Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ．Ｄ．， １９７８， Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｖｏｌ．５， Ｓｕｐ．３ により記載されるものを包含する。より具体的には、保存性アミノ酸置換は、側鎖の酸度、極性度又は嵩密度に関連するアミノ酸ファミリー内で一般的に生じるものである。
【００４９】
遺伝子的にコードされたアミノ酸は、一般的に、４種のグループに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはまた、共同で、芳香族アミノ酸として分類される。いづれかの特定の基内の１又は複数の置換、たとえばイソロイシン又はバリンによるロイシンの、又はグルタミン酸によるアスパラギン酸の、又はセリンによるトレオニンの、又は構造的に関連するアミノ酸残基、たとえば類似する酸度、極性度又は嵩密度、又はそれらのいくらかの組合せでの類似性を有するアミノ酸残基によるいづれか他のアミノ酸残基の置換が一般的に、ポリペプチドの機能に対して微々たる効果を有するであろう。
【００５０】
本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ１−関連ポリペプチドは、“本発明の実施において有用”であり、ここで前記ポリペプチドは、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物に対して抗体を生ぜしめ、又はストレプトミセスにおけるａｖｅＲ１活性又はアベルメクチン生成を調節する化合物についてスクリーンするために使用され得る。
【００５１】
本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅＲ１−関連相同ポリペプチドの完全なコード配列よりも少ない配列から成るが、しかし前記ヌクレオチド配列の少なくとも約２０％及びより好ましくは、少なくとも約３０％を含んで成り、そして有用性がａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００５２】
非制限的態様においては、ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅＲ１−関連相同ポリペプチドのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成る。ａｖｅＲ１−関連ポリペプチドの“ペプチドフラグメント”は、十分な長さのａｖｅＲ１遺伝子生成物又は相同ポリペプチドのアミノ酸配列の副配列から成るポリペプチドを意味し、ここで前記副配列は、十分な長さのａｖｅＲ１遺伝子生成物又は相同ポリペプチドよりも長さが短かく、そして有用性がａｖｅＲ１−関連ポリペプチドについて上記に定義されるように、本発明の実施において有用である。好ましい態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の副配列から成るペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を供給する。本発明のペプチドフラグメントは、好ましくは少なくとも約１５個のアミノ酸残基の長さである。
【００５３】
本明細書に開示されるａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＲ１遺伝子生成物を発現するために、ａｖｅＲ１遺伝子が突然変異誘発されているストレプトミセスの新規株を調製するために、又は既知の技法を用いて、他の細菌種又は株におけるａｖｅＲ１相同体遺伝子を同定するために使用され得る。従って、本発明はさらに、ａｖｅＲ１相同体遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。
【００５４】
本明細書において使用される場合、“ａｖｅＲ１相同体遺伝子生成物”とは、ストレプトミセスの異なった種又は密接に関連するサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ）属からの遺伝子として定義され、そして約８０％以上のヌクレオチド配列同一性の程度に基づいて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１遺伝子の相同体として当業者により、又は２−成分シグナリングシステムのヒスチジンキナーゼ成分に典型的には見出される保存された活性部位残基を含むことによって認識されるａｖｅＲ１相同体遺伝子によりコードされる遺伝子生成物として定義される。たとえば、Ｎａｒ／Ｄｅｇサブグループからの真正細胞２−成分システムとのａｖｅＲ１相同性の比較は、自己−リン酸化の部位であるヒスチジン残基（Ｈ）、及び自己キナーゼ活性のために必要とされるアスパラギン酸残基（Ｎ）の１００％保存性を示す。
【００５５】
ａｖｅＲ１相同体遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、当業界において知られている。たとえば、Ｓ．アベルミチリスａｖｅＲ１のＯＲＦの一部を含んで成るポリヌクレオチド分子は、検出できるようにラベルされ得、そして興味ある生物に由来するＤＮＡから構成されるゲノムライブラリーをスクリーンするために使用され得る。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性は、興味ある生物に対する対照生物（この例においては、Ｓ．アベルミチリス）の関係に基づいて選択され得る。異なった緊縮性条件についての必要性は、当業者によく知られており、そしてそのような条件は、ライブラリー及びラベルされた配列が由来する特定の生物に依存して変化するであろう。
【００５６】
ゲノムＤＮＡライブラリーは、中でも、バクテリオファージに関しては、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， １９７７， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６： １８０、及びプラスミドライブラリーに関しては、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ， １９７５， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７２： ３９６１−３９６５ に示される技法を用いて、ａｖｅＲ１相同体遺伝子コード配列についてスクリーンされ得る。配列番号１で示されるようなａｖｅＲ１のＯＲＦ、又はその一部を表わすオリゴヌクレオチド分子を含むことが知られているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、それらのスクリーニング実験においてプローブとして使用され得る。他方では、精製されたａｖｅＲ１遺伝子生成物のアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブが合成され得る。
【００５７】
ａｖｅＲ１相同体遺伝子コード配列を含むものとして同定されるクローンが、適切な生物学的機能について試験され得る。たとえば、クローンは、適切なリーディングフレーム、及び開始及び終結シグナルを同定するために配列分析にゆだねられ得る。次に、クローン化されたＤＮＡ配列が、ａｖｅＲ１の相補性についての試験を可能にされた、Ｓ．アベルミチリスの株の細胞を形質転換する適切な発現ベクター中に挿入され得る。次に、形質転換されたＳ．アベルミチリス宿主細胞が、たとえば下記セクション６．６．に記載されるように、発酵生成物のＨＰＬＣ分析のような方法を用いて、アベルメクチン生成について分析され得る。
【００５８】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎｔ２３１８〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００５９】
本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列に対して相同であり、ここでその相同ヌクレオチド配列は、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合されるＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける４２℃での洗浄下で、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦを天然において端に有するヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記を参照のこと）、そしてａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子について有用性が上記に定義されるように、本発明の実施において有用である。
【００６０】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子における個々のフランキング配列、又はその相同体は、好ましくは、少なくとも約２００ｎｔの長さのものである。非制限的な態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同であり、そしてさらに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ１−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分を供給する。
【００６１】
ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ａｖｅＲ２遺伝子生成物は、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるような、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００６２】
本発明はさらに、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。用語“相同”とは、これに関して使用される場合、（ａ）約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３と同じポリペプチドをコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従って、ヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＮのＮａＨＰＯ_４ 、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合されたＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける４２℃での洗浄下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を意味し（Ａｕｓｕｂｅｌ など． （ｅｄｓ．）， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， 及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ ２．１０．３ を参照のこと）、そして本発明の実施において有用である。
【００６３】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の補体に対して、高い緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ下でフィルター結合されたＤＮＡに対する６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける６８℃での洗浄下でハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記）、そして本発明の実施において有用である。さらなる好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
【００６４】
本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子は、“本発明の実施において有用であり”、ここでポリヌクレオチド分子が、特定部位の突然変異誘発、たとえば相同組換えによりａｖｅＲ２のＯＲＦ中に突然変異を導入するために、又は標準の増幅技法を用いて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を増幅するために、使用され得る。そのような相同ポリヌクレオチド分子は、Ｓ．コエリカラーを除く、ストレプトミセスの他の種、又はＳ．アベルミチリスの他の株に存在する天然に存在するａｖｅＲ２遺伝子、及び天然に存在するか、化学的に合成されるか、又は遺伝的に構築されるかにかかわらず、突然変異誘発されたａｖｅＲ２対立遺伝子を包含することができる。
【００６５】
本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言及するために本明細書において使用される場合、用語“相同”とは、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを意味するが、しかしその１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されており、そしてその得られるポリペプチドは、本発明の実施において有用である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ２−関連ポリペプチドは、“本発明の実施において有用”であり、ここで前記ポリペプチドは、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２遺伝子生成物に対して抗体を生ぜしめ、又はストレプトミセスにおけるａｖｅＲ２活性又はアベルメクチン生成を調節する化合物についてスクリーンするために使用され得る。
【００６７】
本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物又はａｖｅＲ２−関連相同ポリペプチドの完全なコード配列よりも少ない配列から成るが、しかし前記ヌクレオチド配列の少なくとも約２５％及びより好ましくは、少なくとも約３０％を含んで成り、そして有用性がａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子について上記のように定義される場合、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００６８】
非制限的態様においては、ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物又はａｖｅＲ２−関連相同ポリペプチドのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成る。ａｖｅＲ２−関連ポリペプチドの“ペプチドフラグメント”は、十分な長さのａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同ポリペプチドのアミノ酸配列の副配列から成るポリペプチドを意味し、ここで前記サブ−配列は、十分な長さのａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同ポリペプチドよりも長さが短かく、そして有用性がａｖｅＲ２−関連ポリペプチドについて上記に定義されるように、本発明の実施において有用である。好ましい態様において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列の副配列から成るペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を供給する。本発明のペプチドフラグメントは、好ましくは少なくとも約１５個のアミノ酸残基の長さである。
【００６９】
本明細書に開示されるａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＲ２遺伝子生成物を発現するために、ａｖｅＲ２遺伝子が突然変異誘発されているストレプトミセスの新規株を調製するために、又は既知の技法を用いて、他の細菌種又は株におけるａｖｅＲ２相同体遺伝子を同定するために使用され得る。従って、本発明はさらに、ａｖｅＲ２相同体遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７０】
本明細書において使用される場合、“ａｖｅＲ２相同体遺伝子生成物”とは、ストレプトミセスの異なった種又は密接に関連するサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ）属からの遺伝子として定義され、そして約８０％以上のヌクレオチド配列同一性の程度に基づいて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２遺伝子の相同体として当業者により、又は２−成分シグナリングシステムの応答レギュレーター成分に典型的には見出される保存された活性部位残基を含むことによって認識されるａｖｅＲ２相同体遺伝子によりコードされる遺伝子生成物として定義される。たとえば、Ｎａｒ／Ｄｅｇサブグループからの真正細胞２−成分システムとのａｖｅＲ２相同性の比較は、２つのアスパラギン酸残基（Ｄ）（この１つは、リン酸化の部位である）、及び保存されたリシン残基（Ｒ）の１００％保存性を示す。
【００７１】
ａｖｅＲ２相同体遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、当業界において知られている。たとえば、Ｓ．アベルミチリスａｖｅＲ２のＯＲＦの一部を含んで成るポリヌクレオチド分子は、検出できるようにラベルされ得、そして興味ある生物に由来するＤＮＡから構成されるゲノムライブラリーをスクリーンするために使用され得る。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性は、興味ある生物に対する対照生物（この例においては、Ｓ．アベルミチリス）の関係に基づいて選択され得る。
【００７２】
ゲノムＤＮＡライブラリーは、セクション５．１．１において引用される技法を用いて、ａｖｅＲ２相同体遺伝子コード配列についてスクリーンされ得る。配列番号３で示されるようなａｖｅＲ２のＯＲＦ、又はその一部を表わすオリゴヌクレオチド分子を含むことが知られているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、それらのスクリーニング実験においてプローブとして使用され得る。他方では、精製されたａｖｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブが合成され得る。
【００７３】
ａｖｅＲ２相同体遺伝子コード配列を含むものとして同定されるクローンが、適切な生物学的機能について試験され得る。たとえば、クローンは、適切なリーディングフレーム、及び開始及び終結シグナルを同定するために配列分析にゆだねられ得る。次に、クローン化されたＤＮＡ配列が、ａｖｅＲ２の相補性についての試験を可能にされた、Ｓ．アベルミチリスの株の細胞を形質転換する適切な発現ベクター中に挿入され得る。次に、形質転換されたＳ．アベルミチリス宿主細胞が、たとえば下記セクション６．６．に記載されるように、発酵生成物のＨＰＬＣ分析のような方法を用いて、アベルメクチン生成について分析され得る。
【００７４】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦを天然において端に有する１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ２３１３、及び約ｎｔ３０２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号３のヌクレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７５】
本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列に対して相同であり、ここでその相同ヌクレオチド配列は、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合されるＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける４２℃での洗浄下で、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記を参照のこと）、そしてａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子について有用性が上記に定義されるように、本発明の実施において有用である。
【００７６】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子における個々のフランキング配列、又はその相同体は、好ましくは、少なくとも約２００ｎｔの長さのものである。非制限的な態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同であり、そしてさらに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ２−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分を供給する。
【００７７】
ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物（“ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２”として下記で言及される）の両者をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子をさらに提供する。好ましい態様においては、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物は、それぞれ、配列番号２及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、単離されたａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２ポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。
【００７８】
さらなる非制限的態様においては、単離されたａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２ポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ３０２１の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号１のヌクレオチド配列は、ａｖｅＲ１のＯＲＦとａｖｅＲ２のＯＲＦとの間での部分的オーバーラップを示すが、しかしながら、本発明はまた、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２についてのＯＲＦがオーバーラップしないａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２ポリヌクレオチド分子も包含する。
【００７９】
本発明はさらに、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８０】
用語“相同”とは、これに関して使用される場合、（ａ）それぞれ、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２と同じポリペプチドをコードするが、しかし遺伝子コード縮重に従って、ヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る第１ポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の補体に対して、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合されたＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける４２℃での洗浄下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を意味し（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、前記）、そして本発明の実施において有用である。
【００８１】
好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る第１ポリペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、高い緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ下でフィルター結合されたＤＮＡに対する６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける６８℃での洗浄下でハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記）、そして本発明の実施において有用である。さらなる好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、それぞれ約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１で示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
【００８２】
本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子は、“本発明の実施において有用であり”、ここでポリヌクレオチド分子が、特定部位の突然変異誘発、たとえば相同組換えによりＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦもしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者中に突然変異を導入するために、又は標準の増幅技法を用いて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦもしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を増幅するために、使用され得る。
【００８３】
そのような相同ポリヌクレオチド分子は、Ｓ．コエリカラーを除く、ストレプトミセスの他の種、又はＳ．アベルミチリスの他の株に存在する天然に存在するａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２遺伝子、及び天然に存在するか、化学的に合成されるか、又は遺伝的に構築されるかにかかわらず、突然変異誘発されたａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２対立遺伝子を包含することができる。
【００８４】
本発明はさらに、それぞれ配列番号２及び４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有する第１及び第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言及するために本明細書において使用される場合、用語“相同”とは、それぞれ配列番号２及び４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを意味するが、しかしその１又は複数のアミノ酸残基が、上記で定義される保存性アミノ酸置換のように、異なったアミノ酸残基により保存的に置換されており、そしてその得られるポリペプチドは、本発明の実施において有用である。
【００８５】
本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者、又は本発明のａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２−関連相同ポリペプチドの両者をコードするために必要とされる完全なコード配列よりも少ない配列から成るが、しかし前記ヌクレオチド配列の少なくとも約１０％及びより好ましくは、少なくとも約２０％を含んで成り、そして有用性がａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子について上記のように定義されるように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００８６】
好ましい態様においては、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成物又はＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物のいづれか、又はその相同ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成る。非限定的であるが、特定の態様においては、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるようなａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列から成る。非限定的であるが、特定のもの１つの態様においては、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるようなａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列から成る。
【００８７】
本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦを天然において端に有する１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎｔ３０２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８８】
本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列に対して相同であり、ここでその相同ヌクレオチド配列は、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ_４ 、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合されるＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける４２℃での洗浄下で、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記を参照のこと）、そしてａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子について有用性が上記に定義されるように、本発明の実施において有用である。
【００８９】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子における個々のフランキング配列、又はその相同体は、好ましくは、少なくとも約２００ｎｔの長さのものである。非制限的な態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同であり、そしてさらに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか又は両者をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００９０】
オリゴヌクレオチド分子
本発明は、本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかにハイブリダイズし、又は本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかの相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子を提供する。そのようなオリゴヌクレオチド分子は好ましくは、少なくとも約１０個の長さのヌクレオチドであるが、しかし本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかのサブ−配列の長さで延長することができ、そして適度な又は高い緊縮条件下で、１又は複数の前記ポリヌクレオチド分子にハイブリダイズすることができる。
【００９１】
より短いオリゴヌクレオチド分子に関しては、高い緊縮条件の例は、約１４−塩基オリゴヌクレオチドに関しては、約３７℃、約１７−塩基オリゴヌクレオチドに関しては、約４８℃、約２０−塩基オリゴヌクレオチドに関しては、約５５℃、及び約２３−塩基オリゴヌクレオチドに関しては、約６０℃での６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を包含する。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち、約１００ｎｔ以上）に関しては、適度な及び高い緊縮条件の例は、相同ポリヌクレオチド分子に関して上記セクション５．１に記載される。ハイブリダイゼーション条件は、使用される特定のオリゴヌクレオチド分子に依存して、当業界において知られているようにして適切に調節され得る。
【００９２】
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子、又は配列番号１のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする。
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、種々の目的のために、たとえばａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子生成物コードのポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーとして、又はストレプトミセスにおけるａｖｅ遺伝子の調節及びアベルメクチン生合成の調節において有用なアンチセンス分子として有用である。
【００９３】
増幅は、標準の技法、たとえばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（但し、当業界において知られている他の増幅技法も可能である）、たとえばリガーゼ鎖反応と共に、適切に企画されたオリゴヌクレオチド分子を用いて実施され得る。たとえば、ＰＣＲに関しては、適切に企画されたプライマー、増幅されるべきヌクレオチド配列を含んで成る鋳型、及び適切なＰＣＲ酵素及び緩衝液を含んで成る混合物が、鋳型の特定のａｖｅＲ１−又はａｖｅＲ２−関連ポリペプチド分子を増幅するために、標準のプロトコールに従って、調製され、そして処理される。
【００９４】
組換え発現システム
発現ベクター
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えクローニングベクター及び組換え発現ベクターを供給し、ここで前記ベクターは、前記ポリヌクレオチド分子、たとえばＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦもしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者を含んで成るポリヌクレオチド分子のクローニング、又は発現において有用である。非限定的態様においては、本発明は、Ｓ．アベルミチリスの完全なａｖｅＲ１のＯＲＦ及び完全なａｖｅＲ２のＯＲＦを含んで成るプラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）を提供する。
【００９５】
次の記載は、特にことわらない限り、上記で定義されたように、本発明の前記ポリヌクレオチド分子及びポリペプチドのすべてに適用するために意図される：たとえば、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか又は両者を含んで成るポリヌクレオチド分子及びそれらの遺伝子生成物、及びすべての相同ポリヌクレオチド分子、相同ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチド分子の実質的な部分、及びそのような遺伝子生成物及びポリペプチドのペプチドフラグメント。
【００９６】
次の種々の異なったベクターが、ストレプトミセスへの特定の使用のために開発されて来た：たとえば、中でも、ファージ、高コピー数のプラスミド、低コピー数のプラスミド、自殺プラスミド、感温性プラスミド、及びＥ．コリ−ストレプトミセス シャトルベクター、そしてそれらのいづれかが本発明の実施に使用され得る。多くの耐薬物性遺伝子がまた、ストレプトミセスからクローン化されており、そしてそれらの遺伝子のいくつかが選択マーカーとしてベクター中に組込まれている。ストレプトミセスへの使用のための現在のベクターの例は、中でも、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， １９８０， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６： １６９−１９０に示されている。
【００９７】
本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のためのコード配列が、ポリペプチドを生成するためにコード配列の転写及び翻訳のために必要な１又は複数の調節要素と操作的に関連して存在するよう構成される。本明細書において使用される場合、用語“調節要素”とは、誘発性及び非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びポリヌクレオチドコード配列の発現を駆動し、そして／又は調節するよう作用する当業界において知られている他の要素をコードするヌクレオチド配列を包含するが、但しそれだけには限定されない。また、本明細書において使用される場合、コード配列は、そのコード配列の転写、又はそのｍＲＮＡの翻訳、又は両者を効果的に調節し、そして可能にする１又は複数の調節要素と“作用可能に関連して”存在する。
【００９８】
本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう構築され得る典型的なプラスミドベクターは、中でも、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ， ｐＣＲ２．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）， ｐＧＥＭ３Ｚｆ （Ｐｒｏｍｅｇａ） 、及びシャトルベクターｐＷＨＭ３ （Ｖａｒａなど．， １９８９， Ｊ．Ｂａｃｔ． １７１： ５８７２−５８８１ ）を包含する。
それらのベクターの調節要素は、それらの強さ及び特異性において異なることができる。使用される宿主／ベクターシステムに依存して、多くの適切な転写及び翻訳要素のいづれかが使用され得る。細菌のための転写調節領域又はプロモーターの非制限的な例は、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左及び右プロモーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター、及びより特定には、ストレプトミセスのためのプロモーターｅｒｍＥ，ｍｅｌＣ及びｔｉｐＡ、等を包含する。
【００９９】
適切な調節要素と作用可能に関連する特定のコード配列を含む組換えベクターを構成するための方法は、当業界においてよく知られており、そしてそれらのいづれかが本発明の実施に使用され得る。それらの方法は、インビトロ組換え技法、合成技法及びインビボ遺伝子組換えを包含する。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓなど．， １９８９ 、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， １９８９ 、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９ 、上記；Ｉｎｎｉｓ など．， １９９５ 、上記；Ｅｒｌｉｃｈ， １９９２、上記；及びＨｏｐｗｏｏｄ など．， １９８５ 、上記に記載される技法を参照のこと。
【０１００】
融合タンパク質発現ベクターが、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物−融合タンパク質を発現するために使用され得る。精製された融合タンパク質は、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物に対する抗血清を生ぜしめるために、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の生化学性質を研究するために、異なった生化学活性を有するａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２融合タンパク質を構築するために、又は組換え発現システムにおける発現されたａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の同定又は精製を助けるために使用され得る。可能な融合タンパク質発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合体、マルトース結合融合体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体及びポリヒスチジン融合体（キャリヤー領域）をコードする配列を組込むベクターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０１】
ＡｖｅＲ１及びＡｖｅＲ２融合タンパク質は、精製のために有用な領域を含むよう構築され得る。たとえば、ＡｖｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−マルトース−結合タンパク質融合はアミロース樹脂を用いて精製され得；そしてＡｖｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−グルタチオン−Ｓ−トランスファーゼ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズを用いて精製される。そしてＡｖｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−ポリヒスチジン融合は二価のニッケル樹脂を用いて精製され得る。他方では、キャリヤータンパク質又はペプチドに対する抗体が融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために使用され得る。
【０１０２】
たとえば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列が、調節要素と操作的に関連して発現ベクター中に構築され、そして発現されるエピトープがＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドに融合されるよう、位置決定され得る。たとえば、親水性マーカーペプチドである、ＦＬＡＧ^ＴＭエピトープ標識（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ）をコードするヌクレオチド配列は、標準技法により、ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に対応する点で発現ベクター中に挿入され得る。次に、発現されたＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチド−ＦＬＡＧ^ＴＭエピトープ融合生成物が検出され、そして市販の抗−ＦＬＡＧ^ＴＭ抗体を用いて、アフィニティー精製され得る。
【０１０３】
ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２融合タンパク質をコードする発現ベクターはまた、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含むよう構築され得、その結果、発現されたＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドが特定のプロテアーゼによる処理によりキャリヤー領域又は融合パートナーから開放され得る。たとえば、融合タンパク質ベクターは、中でも、トロンビン又は第Ｘａ因子切断部位をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１０４】
ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２のＯＲＦの上流に存在し、そしてそれと読取り枠を整合して存在するシグナル配列が、発現される遺伝子生成物のトラフィキング及び分泌を指図するために、既知の方法により発現ベクター中に構築され得る。シグナル配列の非制限的例は、中でも、α−因子、免疫グロブリン、外層膜タンパク質、ペニシリナーゼ、及びＴ−細胞受容体からのものを包含する。
【０１０５】
本発明のクローニング又は発現ベクターにより形質転換され、又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助けるために、ベクターは、レポーター遺伝子生成物又は他の選択マーカーのためのコード配列をさらに含むよう構築され得る。そのようなコード配列は好ましくは、上記のように、調節要素コード配列と操作的に関連して存在する。本発明において有用であるレポーター遺伝子は、当業界において良く知られており、そして中でも、緑色螢光タンパク質、ルシフェリン、ｘｙｌＥ、及びチロシナーゼをコードするそれらのものを包含する。
【０１０６】
選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、当業界において良く知られており、そして抗生物質又は抗−代謝物に対する耐性を付与する遺伝子生成物をコードし、又は栄養要求性必要条件を供給するそれらのものを包含する。そのような配列の例は、中でもエリスロマイシン、チオストレプトン又はカナマイシンに対する耐性をコードするそれらのものを包含する。
【０１０７】
宿主細胞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含んで成る形質転換された宿主細胞、及びそれらに由来する新規株又は細胞系を供給する。本発明の実施において有用な宿主細胞は、好ましくは、ストレプトミセス細胞であるが、但し、他の原核細胞又は真核細胞もまた使用され得る。そのような形質転換された宿主細胞は典型的には、微生物、たとえば組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡベクターにより形質転換された細菌、又は組換えベクターにより形質転換された酵母を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０８】
細菌細胞が一般的に、宿主細胞として好ましい。本発明のポリヌクレオチド分子はストレプトミセス細胞において機能するよう意図されるが、しかしまた、たとえばクローニング又は発現目的のために、他の細菌又は真核細胞を形質転換することができることが理解されるべきである。Ｅ．コリの株、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ （受託番号３１３４３）又は市販源（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手できるＤＨ５α株が典型的には使用され得る。好ましい真核宿主細胞は、酵母細胞を包含するが、但し哺乳類細胞又は昆虫細胞もまた、効果的に使用され得る。
【０１０９】
本発明の組換え発現ベクターは好ましくは、実質的に均質の細胞培養物の１又は複数の宿主細胞を形質転換し又はトランスフェクトする。発現ベクターは一般的に、次の既知技法に従って、宿主細胞中に導入される：たとえばプロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換えされたウィルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、トランスダクション、接合、又はマイクロプロジェクティル衝撃。形質転換体の選択は、標準の方法、たとえば選択マーカー、たとえば上記のように、組換えベクターと関連する耐抗生物質性を発現する細胞についての選択により実施され得る。
【０１１０】
発現ベクターが宿主細胞中に導入されるとすぐに、宿主細胞染色体における又はエピソームにおける、ａｖｅＲ１−，ａｖｅＲ２−、又はａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連コード配列の組込み及び維持が、標準技法、たとえばサザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、ＰＣＲ分析、たとえば逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）、又は予測される遺伝子生成物を検出するための免疫学的アッセイにより確かめられ得る。
【０１１１】
組換えａｖｅＲ１−，ａｖｅＲ２−又はａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連コード配列を含み、そして／又は発現する宿主細胞が、当業界において良く知られている次の少なくとも４種の一般的アプローチのいづれかにより同定され得る：（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ、又はＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｉｉ）“マーカー”遺伝子機能の存在の検出；（ｉｉｉ） 宿主細胞におけるａｖｅＲ１−又はａｖｅＲ２−特異的ｍＲＮＡ転写体の発現により測定されるような転写のレベルの評価；及び（ｉｖ）たとえばイムノアッセイにより、又はＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２生物学的活性の存在により測定されるような成熟ポリペプチド生成物の存在の検出。
【０１１２】
組換えａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の発現及び特徴化
ａｖｅＲ１−，ａｖｅＲ２−、又はａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連コード配列が適切な宿主細胞中に安定して導入されると、形質転換された細胞宿主がクローン的に増殖され、そしてその得られる細胞が、ａｖｅＲ１−、及び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物の最大生成の助けとなる条件下で増殖せしめられる。そのような条件は典型的には、細胞の高密度への増殖を包含する。発現ベクターが誘発性プロモーターを含んで成る場合、適切な誘発条件、たとえば温度シフト、栄養物の消耗、必要のない誘発物質（たとえば、炭水化物の類似体、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））の添加、過剰の副生成物の蓄積、又は同様のことが、発現を誘発する必要がある場合に使用される。
【０１１３】
発現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物が宿主細胞内に保持される場合、細胞は収穫され、そして溶解され、そして生成物が、タンパク質分解を最少にするために当業界において知られている抽出条件、たとえば４℃で、又はプロテアーゼインヒビターの存在下で、又は両者において、前記溶解物から単離され、そして精製される。発現されたａｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ２遺伝子生成物が宿主細胞から分泌される場合、消耗された栄養培地が単純に集められ、そして生成物がそれから単離される。
【０１１４】
発現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物は、次の標準方法を用いて、細胞溶解物又は培養培地から適切なように、単離され、又は実質的に精製され得る：たとえば次の方法のいづれかの組合せ（但し、それらだけには限定されない）：硫酸アンモニウム沈殿、サイズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、及びアフィニティークロマトグラフィー。発現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物が生物学的活性を示す場合、調製物の上昇する純度が、適切なアッセイの使用により精製工程の個々の段階でモニターされ得る。発現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物が生物学的活性を示すか、又は示さないにかかわらず、個々は、たとえばサイズ、又はＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２に対して特異的な抗体との反応性に基づいて、又は融合標識の存在により検出され得る。
【０１１５】
従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされる、実質的に精製され、又は単離されたポリペプチドを供給する。非限定的であるが、特定の態様においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るＳ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物である。非限定的であるが、特定のもう１つの態様においては、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るＳ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２遺伝子生成物である。本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物のいづれかに対して相同である、実質的に精製され、又は単離されたポリペプチドを供給する。
【０１１６】
本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同ポリペプチドのペプチドフラグメントを供給する。本発明の実質的に精製され、又は単離されたポリペプチドは、種々の目的、たとえばａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物機能を変更する化合物についてスクリーンし、それにより、アベルメクチン生合成を調節するために、及びａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物に対して向けられた抗体を生ぜしめるために有用である。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、ポリペプチドは、そのポリペプチドが特定の調製物において材料の重量の大部分を構成する場合、“実質的に精製されている”。また、本明細書において使用される場合、ポリペプチドは、そのポリペプチドが特定の調製物において少なくとも約９０重量％の材料を構成する場合、“単離されている”。
【０１１８】
本発明はさらに、実質的に精製され又は単離されたａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリペプチド又はペプチドフラグメントの調製方法を提供し、ここで前記方法は、それぞれ、ａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントをコードする、１又は複数の調節要素と操作的に関連して存在するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで成る組換え発現ベクターにより、特定の遺伝子生成物、ポリペプチド、又はペプチドフラグメントの発現の助けとなる条件下で、形質転換され、又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、そして実質的に精製され、又は単離された形で、細胞培養物から、発現された遺伝子生成物、ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを回収することを含んで成る。
【０１１９】
十分な純度のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物が得られると、それは、標準の方法、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、アベルメクチン生合成路における適切な生成物の生成における生物学的活性、等により特徴づけられ得る。たとえば、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列は、標準のペプチド配列決定技法を用いて決定され得る。ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物はさらに、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の疎水性及び親水性領域を同定するために、親水性分析（たとえば、Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ， １９８１， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ３８２４を参照のこと）、又は類似ソフトウェアアルゴリズムを用いて特徴づけられ得る。
【０１２０】
構造分析は、特定の二次構造体を想定する、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の領域を同定するために実施され得る。生物理学的方法、たとえばＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ， １９７４， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ． １１： ７ 〜１３）、コンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ ａｎｄ Ｚｏｌｌｅｒ （ｅｄｓ）， １９８６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）が、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物とそれらの基質との間の相互作用の部位をマッピングし、そして研究するために使用され得る。それらの研究から得られる情報は、より所望するアベルメクチン生成特徴を有するストレプトミセスの新規株の開発を助けるために、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２のＯＲＦにおける突然変異のための新規部位を選択するために使用され得る。
【０１２１】
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２変異体の構成
本発明はさらに、遺伝子構造体、たとえば遺伝子置換ベクターを包含する、ストレプトミセスの種又は株の細胞を遺伝子的に修飾するための組成物及び方法を提供する。好ましい態様においては、ストレプトミセスの種又は株の細胞は、修飾されていない種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量とは検出できるほど異なっている多量のアベルメクチンを生成するために遺伝子的に修飾される。
【０１２２】
より好ましい態様においては、Ｓ．アベルミチリスの株の細胞が、修飾されていない同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンの量に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成するよう遺伝子的に修飾される。本発明によれば、そのような遺伝子修飾は好ましくは、ａｖｅＲ１遺伝子、ａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両方を突然変異誘発することを含んで成り、ここでそのような突然変異は、遺伝子突然変異を担持しない同じ株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するＳ．アベルミチリスの株の細胞により生成されるアベルメクチンの量の検出できる上昇をもたらす。
【０１２３】
本発明によれば、突然変異は、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に、現在知られているか、又は未来において開発されるいづれかの技法を用いて導入され得る。たとえば、ランダム突然変異誘発は、標準の突然変異誘発技法、たとえば紫外線又はＸ−線、又は化学的突然変異誘発物質、たとえばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸、又は窒素マスタードにストレプトミセス細胞を暴露し、そして次にａｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ２遺伝子における１又は複数の突然変異の結果として、検出できるほど高められたアベルメクチン生成を示す細胞を選択する技法を用いて実施され得る。たとえば、突然変異誘発技法の総説としては、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９８９ 、上記を参照のこと。
【０１２４】
他方では、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者に対する突然変異は、種々の既知の組換え方法のいづれか、たとえばエラー傾向ＰＣＲ又はカセット突然変異誘発を用いて、特定部位態様で実施され得る。たとえば、相同組換えを利用する特定部位の突然変異誘発は、１又は複数の突然変異をそれらの遺伝子中に特異的に導入するために、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はフランキング配列、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者、又はフランキング配列を特異的に変更するために利用され得る。さらに、ランダム断片化、突然変異誘発の反復されたサイクル、及びヌクレオチドシャフリング（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を包含する、アメリカ特許第５，６０５，７９３号に記載される方法は、ａｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ２突然変異をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の大きなライブラリーを生成するために使用され得る。
【０１２５】
本発明の実施において有用である、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者に対する突然変異は、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者、又はフランキング領域における１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換、又はそれらのいくつかの組合せを包含し、そしてそれは、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの同じ種又は株の細胞に比較して、所望する結果、すなわち遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの株の細胞により生成されるアベルメクチンの量の検出できる上昇性をもたらす。
【０１２６】
そのような突然変異は、１又は複数の新規制限部位、終結コドン又はフレームシフトを、ＯＲＦ配列のいづれか又は両者中に、又は遺伝子転写に関与するフランキング調節領域中に導入するよう作用することができる。他の有用な突然変異は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子のいづれか又は両者中に異なった又は異種ヌクレオチド配列を挿入し；又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子のいづれか又は両者のすべて又は一部を欠失し；又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子のいづれか又は両者のすべて又は一部を、異なった又は異種ヌクレオチド配列により置換し；そして所望する結果、すなわち遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの同じ種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量の検出できる上昇性をもたらす突然変異を包含する。
【０１２７】
部位特定突然変異は、特に、それらが、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者における１又は複数の保存されたアミノ酸残基を変更するよう作用する場合に有用である。たとえば、図１Ａ及び１Ｂに示されるように、Ｓ．コエリカラーからの類似する遺伝子生成物と、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物との推定されるアミノ酸配列の比較は、それらの種間のアミノ酸残基の有意な保存性の部位を示す。１又は複数のそれらの保存されたアミノ酸残基を欠失するか又は非保存的に置換する特定部位の突然変異誘発は、アベルメクチン生成において所望する変更を示す新規変異体株の生成において特に効果的である。
【０１２８】
好ましい態様においては、１又は複数の突然変異は、本発明により供給される遺伝子構造体、たとえば遺伝子置換ベクターを用いて、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に、相同組換えにより導入される。
【０１２９】
前記遺伝子構造体は、完全なａｖｅＲ１のＯＲＦ又はその相同ポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分；又は完全なａｖｅＲ２のＯＲＦ又はその相同ポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分；又は完全なａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者又はその相同ポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分；又はＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ又はａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者を天然において端に有するヌクレオチド配列；又はそれらの組合せを含んで成り；そして前記遺伝子構造体は、遺伝子突然変異を担持しない同じ種又は株の細胞に比較して、前記遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量の検出できる上昇性をもたらす突然変異を、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に導入するために使用され得る。
【０１３０】
非制限的であるが特定の態様において、本発明の実施に使用するための遺伝子構造体は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１のＯＲＦもしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者、又はそれらの実質的な部分のヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含んで成り、そしてさらに、１又は複数の突然変異、すなわち１又は複数のヌクレオチド欠失、挿入、置換又はそれらの組合せを含んで成るプラスミドであり、ここで前記プラスミドは、前記突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量が、前記遺伝子突然変異を担持しない同じ種又は株の細胞に比較して、検出できるほど高められるよう、それぞれ、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の活性又は生物学的機能を破壊し又は変更するために、又はそれぞれ、ａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅＲ２遺伝子生成物のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者の活性又は生物学的機能を破壊し、又は変更するために、ストレプトミセスの細胞を形質転換し、そしてそれにより、突然変異を、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に導入するために使用され得る。そのようなプラスミドは、好ましくは、さらに、選択マーカーを含んで成る。
【０１３１】
ストレプトミセスの宿主細胞の形質転換に続いてすぐに、遺伝子構造体のポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者に相同組換えにより特異的に標的化され、そしてａｖｅＲ１遺伝子又はその一部、又はａｖｅＲ２遺伝子又はその一部、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者又はそれらの一部を置換し、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中に挿入する。
【０１３２】
この組換え現象の結果として、宿主細胞のａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者、又はそれによりコードされる遺伝子生成物が、部分的に又は完全に無能される。形質転換された細胞は、好ましくは、遺伝子構造体における選択マーカーの存在を利用することによって選択され、そして形質転換されていない株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成するそれらの細胞について、標準の技法、たとえば下記の実施例の（６）に記載されるそれらの技法によりスクリーンされる。
【０１３３】
下記実施例の（９−１）に例示される、非制限的であるが特定の態様においては、遺伝子置換ベクターが、異種ヌクレオチド配列（ｅｒｍＥ）により個々の遺伝子のＯＲＦの一部を選択することによって、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を破壊するために使用された。下記実施例の（９−２）に例示される、非限定的であるが特定のもう１つの態様においては、遺伝子置換ベクターが、ａｖｅＲ２のＯＲＦ中に異種ヌクレオチド配列（ｅｒｍＥ）を挿入することによって、ａｖｅＲ２遺伝子を破壊するために使用された。
【０１３４】
それらの遺伝子置換ベクターの個々は、Ｓ．アベルミチリスの種の細胞を別々に形質転換し、そして相同組換えにより染色体中に組込まれた。それらの新規ストレプトミセス形質転換体の個々の発酵分析は、それらの遺伝子突然変異のいづれも担持しない株の細胞に比較して、それらの遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量の有意な上昇性を示す。
【０１３５】
本発明はさらに、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然変異を同定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）ストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を測定し；（ｂ）段階（ａ）のストレプトミセスの種又は株の細胞の、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中に、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に突然変異を導入し；そして（ｃ）遺伝子突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量に、段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量を比較することを含んで成り；段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量が遺伝子突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量よりも検出できるほど高い場合、生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の突然変異が同定されることを特徴とする。好ましい態様では、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。
【０１３６】
本発明はさらに、ストレプトミセスの種又は株の修飾されていない細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成する、同じ種又は株からの遺伝子的に修飾された細胞の調製方法を提供し、ここで前記方法は、ストレプトミセスの種又は株の細胞におけるストレプトミセスのａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発し、そして遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成する突然変異誘発された細胞を選択することを含んで成る。好ましい態様において、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。
【０１３７】
本発明はさらに、ストレプトミセスの新規株を提供し、その細胞は、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子への、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者への１又は複数の突然変異の結果として、検出できるほどに高められた量のアベルメクチンを生成する。好ましい態様において、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。本発明の新規株は、アベルメクチン、たとえば商業的に所望のドラメクチンの大規模生成において有用である。
【０１３８】
本発明はさらに、ストレプトミセスの培養により生成される高められた量のアベルメクチンを生成するための方法に関し、ここで遺伝子突然変異を担持しない種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めるよう作用する、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者における突然変異を含んで成る、ストレプトミセスの種又は株の細胞を、それからアベルメクチンの生成を可能にし又は誘発する条件下で、培養培地において培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含んで成る。好ましい態様においては、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。この方法は、アベルメクチンの生成効率を高めるために有用である。
【０１３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポザイム
また、本発明の範囲内に、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２ ｍＲＮＡの翻訳を退化せしめ、そして／又は阻害するために結合機能する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート及びリボザイムを包含するオリゴヌクレオチド配列が存在する。
【０１４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、たとえばアンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡに結合し、そしてタンパク質翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻害するよう作用する。たとえば、ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のユニーク領域に対して相補的な、少なくとも約１５個の塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、たとえば従来のホスホジエステル技法により合成され得る。
【０１４１】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレオライティク分解を包含する。ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２ ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレオライティク分解を特異的に且つ効率良く触媒する構築されたハンマーヘッドモチーフリボゾーム分子もまた、本発明の範囲内である。
【０１４２】
いづれかの可能性あるＲＮＡ標的物内の特定のリボザイム切断部位は、次の配列、ＧＵＡ，ＧＵＵ及びＧＵＣを包含するリボザイム切断部位について標的分子を走査することによって最初同定される。同定されるとすぐに、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、予測される構造特徴、たとえばオリゴヌクレオチド配列を不適切にする二次構造について評価され得る。候補体標的物の適合性がまた、たとえばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそれらの接近性を試験することによって評価され得る。
【０１４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両者は、既知方法により調製され得る。それらは、たとえば固相ホスホアミット化学合成による化学合成のための技法を包含する。他方では、アンチセンスＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写により生成され得る。そのようなＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、たとえばＴ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターを組込む広範囲の種類のベクター中に組込まれ得る。
【０１４４】
本発明のオリゴヌクレオチドの種々の修飾が、高まる細胞内安定性及び半減期の手段として導入され得る。可能な修飾は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分子の５′及び／又は３′端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、又はオリゴヌクレオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホロチオエート又は２′−Ｏ−メチルの使用。
【０１４５】
抗体
本発明はさらに、ａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、又は相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントに結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。そのような抗体は、生来のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物を精製し、又はａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の活性又は生物学的機能を分析するために親和性試薬として使用され得る。
【０１４６】
抗体は、本発明のａｖｅＲ１−又はａｖｅＲ２−関連ポリペプチドのいづれかに対して生ぜしめられ得る。種々の宿主動物、たとえば牛、馬、ウサギ、ヤギ、羊及びマウス（但し、それらだけには限定されない）が、抗−ＡｖｅＲ１又は抗−ＡｖｅＲ２−特異的抗体を生成するために既知の方法に従って使用され得る。当業界において知られている種々のアジュバントが抗体生成を増強するために使用され得る。
【０１４７】
ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から得られ、そして標準の技法を用いて、抗−ＡｖｅＲ１又は抗−ＡｖｅＲ２特異性について試験され得る。他方で、ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養における連続細胞系による抗体的の生成を提供するいづれかの技法を用いて調製され得る。
【０１４８】
それらは、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ， １９７５， ２５６： ４９５−４９７ ）により最初に記載されるハイブリドーマ技法；ヒトβ−細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ、など．， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２； Ｃｏｔｅ，など．， １９８３， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２０２６−２０３０）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ、など．， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６ ）を包含するが、但し、それらだけには限定されない。他方では、一本鎖抗体の生成のために記載される技法（例えば、アメリカ特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）は、ＡｖｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−特異的一本鎖抗体を生成するために適合され得る。それらの出版物は、引用により本明細書中に組込まれる。
【０１４９】
ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドのための特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、本発明内に包含され、そして既知の技法により生成され得る。そのようなフラグメントは、損なわれていない抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ′）_２ 、及びＦ（ａｂ′）_２ フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントを包含するが、但し、それらだけには限定されない。他方では、Ｆａｂ発現ライブラリーが、ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドに対する所望する特異性を有するＦａｂフラグメントの急速な同定を可能にするために構成され得る（Ｈｕｓｅなど．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５〜１２８１）。
【０１５０】
モノクローナル抗体及び抗体フラグメントの生成のための技法は、当業界において良く知られており、そしてさらに、中でも次の文献に記載されている：Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｇ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ；及びＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ， １９８６， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ． 上記すべての出版物は、引用により本明細書中に組込まれる。
【０１５１】
アベルメクチンの使用
アベルメクチンは、駆虫剤、外部駆虫剤、殺昆虫剤及びダニ駆虫剤としての特別な利用性を有する高い活性の抗寄生虫剤であり、そして本発明の組成物及び方法を用いて調製されるアベルメクチンはそれらの目的のいづれかのために有用である。
本発明に従って調製されるアベルメクチンは、ヒトにおける種々の疾病又は病状を処理するために、特に、それらの疾病又は病状が当業界において知られているような、寄生体感染により引き起こされる場合に有用である。たとえば、Ｉｋｅｄａ ａｎｄ Ｏｍｕｒａ， １９９７， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９７ （７）： ２５９１−２６０９を参照のこと。
【０１５２】
本発明に従って調製されるアベルメクチンは、内部寄生体により引き起こされる種々の病状、たとえば寄生線虫のグループにより最とも頻繁に引き起こされ、そしてヒトにおいて疾病を引き起こし、そしてブタ、羊、家禽類、馬及び牛において重度の経済的損失を引き起こし、そして家畜の健康に影響を及ぼす蠕虫病の処理において効果的である。
【０１５３】
従って、本発明に従って調製されたアベルメクチンは、ヒトに影響を及ぼす線虫、及び種々の動物種に影響を及ぼす線虫、たとえば犬におけるジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ）、ヒトに感染する種々の寄生体、たとえば胃腸寄生体、たとえばアンシロストマ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ）、ネカトル（Ｎｅｃａｔｏｒ ）、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ）、トリンキネラ（Ｔｒｉｎｃｈｉｎｅｌｌａ）、カピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、トリクリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ）、エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、及び血液又は他の組織又は器官に見出される寄生体、たとえばフィラリア、及びストロンギロイデス及びトリンキネラの腸寄生状態に対して効果的である。
【０１５４】
本発明に従って調製されたアベルメクチンはまた、外部寄生体感染、たとえばマダニ、ダニ、シラミ、ノミ、ハエ、昆虫、又は牛及び馬に影響を及ぼす移動性双翅類幼虫により引き起こされる、哺乳類及び鳥類の節足動物侵入の処理においても有用である。
本発明に従って調製されたアベルメクチンはまた、日常の害虫、たとえばゴキブリ、蛾、甲虫類及びハエ、並びにクモ、ダニ、アリマキ、イモムシ、及び直翅類、たとえば中でも、バッタに対する殺昆虫剤としても有用である。
本発明のアベルメクチンにより処理され得る動物は、羊、牛、馬、シカ、ヤギ、ブタ、鳥、たとえば家禽、及び犬及びネコを包含する。
【０１５５】
本発明に従って調製されたアベルメクチンは、特定の意図された使用に適切な配合物に投入され、特定種の宿主動物及び関与する寄生体又は昆虫が処理される。駆虫剤としての使用のためには、本発明のアベルメクチンは、カプセル、ボーラス、錠剤又は液体飲薬の形で経口投与され得、又は他方では、注入物として、注射により、又は移植物として投与され得る。そのような配合物は、標準の獣医学的実施に従って、従来の態様で調製される。
【０１５６】
従って、カプセル、ボーラス又は錠剤は、活性成物を、適切な細かく分割された希釈剤又はキャリヤー、さらに、砕解剤及び／又は結合剤、たとえばスターチ、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、等と共に混合することによって調製され得る。飲薬配合物は、分散又は湿潤剤、等と共に水溶液において活性成分を分散することによって調製され得る。注射用配合物は、血液と等張の溶液を製造するために、他の物質、たとえば十分な塩及び／又はグルコースを含むことができる無菌溶液の形で調製され得る。
【０１５７】
そのような配合物は、患者、又は処理されるべき宿主動物の種類、感染の重症度及び型、及び宿主の体重に依存して、活性化合物の重量に関して変化するであろう。一般的に、経口投与のためには、１〜５日間、一回の用量として又は分割された用量で与えられる、患者又は動物体重１ｋｇ当たり約０．００１〜１０ｍｇの活性化合物の用量が満足のいくものであろう。しかしながら、より高いか又はより低い投与量範囲が、たとえば医者又は獣医により決定されるように、臨床学的徴候に基づいて示される場合が存在する。
【０１５８】
他の選択として、本発明に従って調製されたアベルメクチンは、動物飼料と組合して投与され得、そしてこの目的のためには、濃縮された飼料添加剤又はプレミックスが、通常の動物用飼料と共に混合するために調製され得る。
殺昆虫剤としての使用のためには、及び、農業用害虫を処理するためには、本発明の化合物は、標準の農業実施に従って、噴霧、微粉、エマルジョン、及び同様のものとして適用され得る。
次の例は単なる例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１５９】
【実施例】
実施例：ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の単離
この例は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物をコードし、そしてアベルメクチン生合成の調節に関与する２種の新規Ｓ．アベルミチリス遺伝子の単離及び特徴化を記載する。
【０１６０】
（１）ＤＮＡ単離のためにＳ．アベルミチリスの増殖
Ｓ．アベルミチリスＡＴＣＣ ３１２７２の単一コロニー（単一コロニー単離物＃２）を、次のものを含む１／２強さのＹＰＤ−６培地上で単離した：Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物−５ｇ；Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−ペプトン−５ｇ；デキストロース−２，５ｇ；ＭＯＰＳ−５ｇ；Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ寒天−１５ｇ。最終体積をｄＨ_２ Ｏにより１ｌに調整し、ｐＨを７．０に調節し、そして培地を１２１℃で２５分間、オートクレーブ処理した。上記培地において増殖される菌糸体を用いて、２８℃で４８〜７２時間、振盪しながら（３０００ｒｐｍ ）、維持される２５ｍｍ×１５０ｍｍの管における１０ｍｌのＴＳＢ培地（１２１℃で２５分間、オートクレーブ処理された、１ｌのｄＨ_２ Ｏ中、Ｄｉｆｃｏ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ ）を接種した。
【０１６１】
（２）Ｓ．アベルミチリスからの染色体ＤＮＡ単離
上記の増殖された菌糸体のアリコート（０．２５ｍｌ又は０．５ｍｌ）を、１．５ｍｌの微小遠心分離管に配置し、そして細胞を、１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離により濃縮した。上清液を捨て、そして細胞を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む０．２５ｍｌのＴＳＥ緩衝液（１．５ｍＭのスクロース２０ｍｌ、１ＭのトリスＨＣｌ ２．５ｍｌ、ｐＨ８．０、１ＭのＥＤＴＡ ２．５ｍｌ、ｐＨ８．０及びｄＨ_２ Ｏ ７５ｍｌ）。サンプルを、３７℃で２０分間、振盪しながら、インキュベートし、ＡｕｔｏＧｅｎ ５４０^ＴＭ自動核酸単離装置（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ ）中に負荷し、そしてゲノムＤＮＡを、製造業者の説明に従って、Ｃｙｃｌｅ１５９（装備ソフトウェア）を用いて単離した。
【０１６２】
他方では、菌糸体５ｍｌを、１７ｍｍ×１００ｍｍの管に配置し、細胞を３，０００ｒｐｍ での５分間の遠心分離により濃縮し、そして上清液を除いた。細胞を１ｍｌのＴＳＥ緩衝液に再懸濁し、３，０００ｒｐｍ での５分間の遠心分離により濃縮し、そして上清液を除いた。細胞を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１ｍｌのＴＳＥ緩衝液に再懸濁し、そして振盪しながら、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、１０％のＳＤＳ ０．５ｍｌを添加し、そして細胞を；溶解が完結するまで、３７℃でインキュベートした。
【０１６３】
溶解物を６５℃で１０分間インキュベートし、室温に冷却し、２つの１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分け、そして０．５ｍｌのフェノール／クロロホルム（０．５Ｍのトリス（ｐＨ８．０）により前もって平衡化された５０％フェノール；５０％クロロホルム）により１度抽出した。水性相を除き、そして２〜５回、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）により抽出した。
【０１６４】
ＤＮＡを、１／１０体積の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を添加し、その混合物を氷上で１０分間インキュベートし、前記混合物を１５，０００ｒｐｍ で１０分間５℃で遠心分離し、そして１体積のイソプロパノールが添加されている清浄した管に前記上清液を移すことによって沈殿せしめた。次に、前記混合物を氷上で２０分間インキュベートし、１５，０００ｒｐｍ で２０分間、５℃で遠心分離し、上清液を除き、そしてＤＮＡペレットを７０％エタノールにより１度洗浄した。ペレットを乾燥した後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。
【０１６５】
（３）Ｓ．アベルミチリスからのプラスミドＤＮＡの単離
菌糸体のアリコート（１．０ｍｌ）を、１．５ｍｌの微小遠心分離管に配置し、そして細胞を、１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離により濃縮した。上清液を捨て、細胞を１０．３％のスクロース１．０ｍｌに再懸濁し、そして１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離により濃縮し、そして上清液を捨てた。次に、細胞を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む０．２５ｍｌのＴＳＥ緩衝液に再懸濁し、３７℃で２０分間、振盪しながらインキュベートし、そしてＡｕｔｏＧｅｎ ５４０^ＴＭ自動核酸単離装置中に負荷した。プラスミドＤＮＡを、製造業者の説明に従って、Ｃｙｃｌｅ１０６（装備ソフトウェア）を用いて単離した。
【０１６６】
他方では、菌糸体１．５ｍｌを、１．５ｍｌの微小遠心分離管に配置し、そして細胞を１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離により濃縮した。上清液を捨て、細胞を１０．３％のスクロース１．０ｍｌに再懸濁し、そして１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離により濃縮した。細胞を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む０．５ｍｌのＴＳＥ緩衝液に再懸濁し、そして３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、０．２５ｍｌのアルカリ性ＳＤＳ（０．３ＮのＮａＯＨ、２％のＳＤＳ）を添加し、そして細胞を５５℃で１５〜３０分間、又は溶液が透明になるまで、インキュベートした。次に、酢酸ナトリウム（０．１ｍｌ、３Ｍ、ｐＨ４．８）を、ＤＮＡ溶液に添加し、それを氷上で１０分間インキュベートした。
【０１６７】
ＤＮＡサンプルを、１４，０００ｒｐｍ で１０分間５℃で遠心分離した。上清液を清浄した管に移し、そして０．２ｍｌのフェノール：クロロホルム（５０％フェノール：５０％クロロホルム）を添加し、そして軽く混合した。ＤＮＡ溶液を１４，０００ｒｐｍ で１０分間５℃で遠心分離し、そして上方の層を、清浄したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移した。イソプロパノール（０．７５ｍｌ）を添加し、そしてその溶液を軽く混合し、そして次に、室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡ溶液を１４，０００ｒｐｍ で１５分間５℃で遠心分離し、上清液を除き、ＤＮＡペレットを７０％エタノールにより洗浄し、乾燥せしめ、そしてＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１６８】
（４）Ｅ．コリからのプラスミドＤＮＡ単離
単一の形質転換されたＥ．コリコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンにより補充された５ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ （ＬＢ）培地（Ｂａｃｔｏ−トリプトン−１０ｇ；Ｂａｃｔｏ−酵母−５ｇ；及び１ｌのｄＨ_２ Ｏ中、ＮａＣｌ−１０ｇ、ｐＨ７．０、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理されている）中に接種した。その培養物を一晩インキュベートし、そして１ｍｌのアリコートを１．５ｍｌの微小遠心分離管に配置した。培養物サンプルを、ＡｕｔｏＧｅｎ ５４０^ＴＭ自動核酸単離装置中に負荷し、そしてプラスミドＤＮＡを、製造業者の説明に従って、Ｃｙｃｌｅ３（装備ソフトウェア）を用いて単離した。
【０１６９】
（５）Ｓ．アベルミチリスプロトプラストの調製及び形質転換
Ｓ．アベルミチリスの単一コロニーを、１／２強度のＹＰＤ−６上で単離した。菌糸体を用いて、２５ｍｍ×１５０ｍｍの管中の１０ｍｌのＴＳＢ培地を接種し、次に、２８℃で４８時間、振盪しながら（３００ｒｐｍ ）インキュベートした。１ｍｌの菌糸体を用いて、５０ｍｌのＹＥＭＥ培地を接種した。ＹＥＭＥ培地は１ｌ当たり次の成分を含む：Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物−３ｇ；Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−ペプトン−５ｇ；Ｄｉｆｃｏ麦芽抽出物−３ｇ；及びスクロース−３００ｇ。１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した後、次のものを添加した：２．５ＭのＭｇＣｌ_２ ・６Ｈ_２ Ｏ（１２１℃で２５分間、別々にオートクレーブ処理された）−２ｍｌ；及びグリシン（２０％）（フィルター殺菌された）−２５ｍｌ。
【０１７０】
菌糸体を３０℃で４８〜７２時間、増殖せしめ、そして５０ｍｌの遠心分離管（Ｆａｌｃｏｎ）においての３，０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離により収穫した。上清液を捨て、そして菌糸体を、次のものを含むＰ緩衝液に再懸濁した：スクロース−２０５ｇ；Ｋ_２ ＳＯ_４ −０．２５ｇ；ＭｇＣｌ_２ ・６Ｈ_２ Ｏ−２．０２ｇ；Ｈ_２ Ｏ−６００ｍｌ；Ｋ_２ ＰＯ_４ （０．５％）−１０ｍｌ；微量元素溶液^＊ −２０ｍｌ；ＣａＣｌ_２ ・２Ｈ_２ Ｏ（３．６８％）−１００ｍｌ；ＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ６．５）−１０ｍｌ。（^＊ 微量元素溶液は１ｌ当たり次の成分を含む：ＺｎＣｌ_２ −４０ｍｇ；ＦｅＣｌ_３ ・６Ｈ_２ Ｏ−２００ｍｇ；ＣｕＣｌ_２ ・２Ｈ_２ Ｏ−１０ｍｇ；ＭｎＣｌ_２ ・４Ｈ_２ Ｏ−１０ｍｇ；Ｎａ_２ Ｂ_４ Ｏ_７ ・１０Ｈ_２ Ｏ−１０ｍｇ；（ＮＨ_４ ）_６ Ｍｏ_７ Ｏ_２４・４Ｈ_２ Ｏ−１０ｍｇ）。ｐＨを６．５に調整し、最終体積を１ｌに調整し、そして培地を０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。
【０１７１】
菌糸体を３，０００ｒｐｍ で２０分間の遠心分離によりペレット化し、上清液を捨て、そして菌糸体を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む２０ｍｌのＰ緩衝液に再懸濁した。菌糸体を３５℃で１５分間、振盪しながらインキュベートし、そして顕微鏡で調べ、プロトプラスト形成の程度を決定した。プロトプラスト形成が完結した場合、そのプロトプラストを８，０００ｒｐｍ で１０分間、遠心分離した。上清液を除き、そしてプロトプラストを１０ｍｌのＰ緩衝液に再懸濁した。プロトプラストを８，０００ｒｐｍ で１０分間、遠心分離し、上清液を除き、プロトプラストを２ｍｌのＰ緩衝液に再懸濁し、そして約１×１０^９ 個のプロトプラストを、２．０ｍｌの極低温バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に分配した。
【０１７２】
１×１０^９ 個のプロトプラストを含むバイアルを、８，０００ｒｐｍ で１０分間、遠心分離、上清液を除き、そしてプロトプラストを０．１ｍｌのＰ緩衝液に再懸濁した。２〜５μｇの形質転換ＤＮＡを、プロトプラストに添加し、続いてすぐに、０．５ｍｌの作用Ｔ緩衝液を添加した。Ｔ緩衝液基材は次のものを含む：ＰＥＧ１０００（Ｓｉｇｍａ）−２５ｇ；スクロース−２．５ｇ；及びＨ_２ Ｏ−８３ｍｌ。ｐＨを１ＮのＮａＯＨ（フィルター殺菌された）により８．８に調整し、そしてＴ緩衝液基材をフィルター殺菌し、そして４℃で貯蔵した。使用される同じ日に製造された作用Ｔ緩衝液は、次のものを含む：Ｔ緩衝液基材−８．３ｍｌ；Ｋ_２ ＰＯ_４ （４ｍＭ）−１．０ｍｌ；ＣａＣｌ_２ ・２Ｈ_２ Ｏ（５Ｍ）−０．２ｍｌ；及びＴＥＳ（１Ｍ，ｐＨ８）−０．５ｍｌ。作用Ｔ緩衝液中の個々の成分をフィルター殺菌し、そして４℃で貯蔵した。
【０１７３】
プロトプラストへのＴ緩衝液の添加の２０秒以内に、１．０ｍｌのＰ緩衝液をまた添加し、そしてプロトプラストを８，０００ｒｐｍ で１０分間、遠心分離した。上清液を捨て、そしてプロトプラストを０．１ｍｌのＰ緩衝液に再懸濁した。次に、プロトプラストを、次の成分を含むＲＭ１４培地上にプレートした：スクロース−２０５ｇ；Ｋ_２ ＳＯ_４ −０．２５ｇ；ＭｇＣｌ_２ ・６Ｈ_２ Ｏ−１０．１２ｇ；グルコース−１０ｇ；Ｄｉｆｃｏカサミノ酸−０．１ｇ；Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物−５ｇ；Ｄｉｆｃｏオートミール寒天−３ｇ；Ｄｉｆｃｏ麦芽寒天−２２ｇ；及びＨ_２ Ｏ−８００ｍｌ。
【０１７４】
その溶液を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブの後、次のものの無菌ストックを添加した：Ｋ_２ ＰＯ_４ （０．５％）−１０ｍｌ；ＣａＣｌ_２ ・２Ｈ_２ Ｏ（５Ｍ）−５ｍｌ；Ｌ−プロリン（２０％）−１５ｍｌ；ＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ６．５）−１０ｍｌ；微量元素溶液（上記と同じ）−２ｍｌ；シクロヘキシミドストック（２５ｍｇ／ｍｌ）−４０ｍｌ；及び１ＮのＮａＯＨ−２ｍｌ。２５ｍｌのＲＭ１４培地をプレート当たり等分し、そしてプレートを、使用の前、２４時間、乾燥せしめた。
【０１７５】
プロトプラストを、３０℃で２０〜２４時間、９５％湿度下でインキュベートした。エリトロマイシン耐性形質転換体を選択するために、１ｍｌのオーバーレイ緩衝液及び１２５μｇのエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌの最終濃度のエリトロマイシンにされている）を、ＲＭ１４再生プレート上に均等に広げた。オーバーレイ緩衝液は１００ｍｌ当たり次の成分を含む：スクロース−１０．３ｇ；微量元素溶液（上記と同じ）−０．２ｍｌ；及びＭＥＳ（１Ｍ、ｐＨ６．５）−１ｍｌ。プロトプラストを、エリトロマイシン耐性（Ｅｒｍ^ｒ ）コロニーが見られるまで、３０℃で７〜１４日間、９５％湿度下でインキュベートした。
【０１７６】
（６）Ｓ．アベルミチリス株の発酵分析
１／２強度ＹＰＤ−６上で４〜７日間、増殖されたＳ．アベルミチリス菌糸体を、８ｍｌの予備培地及び２種の５ｍｍのガラスビーズを含む１×６インチの管中に接種した。予備培地は次のものを含む：可溶性スターチ（薄煮沸スターチ又はＫＯＳＯ、Ｊａｐａｎ Ｃｏｒｎ Ｓｔａｒｃｈ Ｃｏ．， Ｎａｇｏｙａ ）−２０ｇ／ｌ；Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ （Ｔｒａｄｅｒ’ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｍｅｍｐｈｉｓ ＴＮ）−１５ｇ／ｌ；Ａｒｄｏｍｉｎｅ ｐＨ （Ｃｈａｍｐｌａｉｎ， Ｉｎｃ． Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ ）−５ｇ／ｌ；ＣａＣＯ_３ −２ｇ／ｌ；２×ｂｃｆａ（“ｂｃｆａ”は、枝分れ鎖の脂肪酸を言及する）（培地に次の最終濃度の成分を含む：５０ｐｐｍ の２−（±）−メチル酪酸、６０ｐｐｍ のイソ酪酸、及び２０ｐｐｍ のイソ吉草酸）。ｐＨを７．２に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１７７】
管を１７度の角度で、２１５ｒｐｍ で３日間、２９℃で振盪した。種子培養物の２ｍｌアリコートを用いて、次の成分を含む２５ｍｌの生成培地を含む３００ｍｌの三角フラスコを接種した：スターチ（薄煮沸スターチ又はＫＯＳＯのいづれか）−１６０ｇ／ｌ；Ｎｕｔｒｉｓｏｙ（Ａｒｃｈｅｒ Ｄａｎｉｅｌｓ Ｍｉｄｌａｎｄ， Ｄｅｃａｔｕｒ， ＩＬ ）−１０ｇ／ｌ；Ａｒｄａｍｉｎｅ ｐＨ −１０ｇ／ｌ；Ｋ_２ ＨＰＯ_４ −２ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４ ・４Ｈ_２ Ｏ−２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ_４ ・７Ｈ_２ Ｏ−０．０２ｇ／ｌ；ＭｇＣｌ_２ −０．００２ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ_４ ・７Ｈ_２ Ｏ−０．００２ｇ／ｌ；ＣａＣＯ_３ −１４ｇ／ｌ；及び２×ｂｃｆａ（上記のような）。ｐＨを６．９に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１７８】
接種の後、フラスコを２９℃で１２日間、２００ｒｐｍ で振盪しながらインキュベートした。インキュベーションの後、２ｍｌのサンプルをフラスコから採取し、８ｍｌのメタノールにより希釈し、混合し、そしてその混合物を１２５０×ｇで１０分間、遠心分離し、残骸をペレット化した。次に、上清液を、０．７５ｍｌ／分の流速及び２４０ｎｍでの吸光度測定による検出を伴って、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ）を用いての高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりアッセイした。移動相は、メタノール／水／アセトニトリル（８６／８．９／５．１）であった。
【０１７９】
（７）Ｓ．アベルミチリスＰＫＳ遺伝子の同定及び単離
Ｓ．アベルミチリス（ＡＴＣＣ ３１２７２）染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを調製し、そしてサッカロポリスポラ エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ ）ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子のフラグメントから製造されたケトシンターゼ（ＫＳ）プローブによりハイブリダイズせしめた。コスミドライブラリーの調製についての詳細な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９ 、前記に見出され得る。ストレプトミセス染色体ＤＮＡライブラリーの調製についての詳細な説明は、Ｈｏｐｗｏｏｄ など．， １９８５ 、前記に存在する。
【０１８０】
ケトシンターゼ−ハイブリダイジング領域を含むコスミドクローンを、ｐＥＸ２６（Ｄｒ． Ｐ．Ｌｅａｄｌｅｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫから供給された）からの２．７ｋｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ フラグメントへのハイブリダイゼーションにより同定した。約５μｇのｐＥＸ２６を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ を用いて消化した。反応混合物を、０．８％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ^ＴＭ ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ ）上に負荷した。２．７ｋｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ フラグメントを、電気泳動の後、ゲルから切除し、ＤＮＡを、Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｃｏｌと共にＧＥＬａｓｅ^ＴＭ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｏｓ）を用いてのゲルから回収した。
【０１８１】
２．７ｋｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ フラグメントを、供給者の説明書に従って、ＢＲＬ Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｓ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ ）を用いて、〔α−^３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（デオキシシチジン５′−三リン酸、四（トリエチルアンモニウム）塩、〔α^３２−Ｐ〕−）（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）によりラベルした。５μｌの停止緩衝液の添加の後、ラベルされたＤＮＡを、供給者の説明書に従って、Ｇ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ^ＴＭカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）を用いて、組込まれていないヌクレオチドから分離した。
【０１８２】
約１８００のコスミドクローンを、コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーンした。Ｓ．エリスラエアＫＳプローブに対して強くハイブリダイズした１０個のクローンを同定した。コスミドＤＮＡを含むＥ．コリコロニーを、ＬＢ溶液培地において増殖せしめ、そしてコスミドＤＮＡを、製造業者の説明書に従って、Ｃｙｃｌｅ３（装備ソフトウェア）を用いて、ＡｕｔｏＧｅｎ ５４０^ＴＭ自動核酸単離装置において個々の培養物から単離した。制限エンドヌクレアーゼマッピング及びサザンブロットハイブリダイゼーション分析は、５つのクローンがオーバーラップする染色体領域を含むことを示した。５種のコスミド（すなわち、ｐＳＥ６５，ｐＳＥ６６，ｐＳＥ６７，ｐＳＥ６８，ｐＳＥ６９）のＳ．アベルミチリスゲノムＢａｍＨＩ制限地図を、オーバーラップするコスミド及びハイブリダイゼーションの分析により構成した（図７）。
【０１８３】
（８）調節遺伝子ＯＲＦの同定
次の方法を用いて、ｐＳＥ６８クローンに由来するフラグメントをサブクローン化した。ｐＳＥ６８（５μｇ）を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。その反応混合物を０．８％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ^ＴＭ ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ ）上に負荷し、約１９ｋｂのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、電気泳動の後、ゲルから切除し、そして：ＤＮＡをＦａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ と共にＧＥＬａｓｅ^ＴＭ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてゲルから回収した。約５μｇのｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。
【０１８４】
約０．５μｇの１９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメント及び０．５μｇの消化されたｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）を一緒に混合し、そして１単位のリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）と共に、１５℃で、２０μｌの合計体積において一晩インキュベートした（供給者の説明書に従って）。インキュベーションの後、５ｍｌの連結混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷却し、そしてコンピテントＥ．コリＤＨ５α細胞（ＢＲＬ）を製造業者の説明書に従って形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離し、そして約１９ｋｂのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ挿入体の存在を制限分析により確かめた。このプラスミドをｐＳＥ２００として命名した。
【０１８５】
ｐＳＥ２００をさらに、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の説明書に従って、エキソヌクレアーゼＩＩＩ 消化により修飾した。５μｇのｐＳＥ２００をＣｌｅＩにより消化した。ＣｌａＩは、製造業者の説明書に従ってα−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドによりフィルインされることによって、エキソヌクレアーゼ消化から保護された５′突出物を生成する。次に、ｐＳＥ２００をＥｃｏＲＩにより消化し、そしてアリコートを３０秒〜１２分の範囲の種々の時間、Ｓ１ヌクレアーゼにより消化した。
【０１８６】
ｐＳＥ２００のＳ１ヌクレアーゼ−処理サンプルを一晩、連結し、そして製造業者の説明書に従って、Ｅ．コリＨＢ１０１（ＢＲＬ）コンピテント細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離し、そして挿入体ＤＮＡのサイズを制限酵素分析により決定した。約５．９ｋｂの挿入体を含む１つの単離物を同定し、これをｐＳＥ２０１（図３）と命名し、そしてＡＴＣＣ（受託番号２０３１８２）に寄託した。約８．８ｋｂの挿入体を含む第２単離物を同定し、そしてこれをｐＳＥ２１０（図４）と命名した。
【０１８７】
約１０μｇのｐＳＥ２０１を、プラスミドＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。このＤＮＡを、ＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮＡ配列決定機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ ）を用いて配列決定した。配列データを集め、そしてＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐプログラム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて編集した。調節遺伝子ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦのＤＮＡ配列を、配列番号１及び配列番号３の両者において同等に表わす。ａｖｅＲ１のＯＲＦは、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７からである。ａｖｅＲ２のＯＲＦは、配列番号１のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１からである。
【０１８８】
Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦから推定されるアミノ酸配列の比較は、Ｓ．コエリカラーの推定されるａｂｓＡ１遺伝子生成物に対して３２％の同一性を示す（図１）（Ｂｒｉａｎ など．， １９９６， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄｏｇｙ １７８： ３２２１−３２３１ ）。Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦから推定されるアミノ酸の比較は、Ｓ．コエリカラーの推定されるａｂｓＡ２遺伝子生成物に対して４５％の同一性を示す（図２）。
【０１８９】
（９）遺伝子置換ベクターの構成及び使用
ストレプトミセス遺伝子中への突然変異の導入のための技術の一般的な説明は、Ｋｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ， １９９１， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ． ２０４： ４３０−４５８により提供される。より詳細な説明は、Ａｎｚａｉ など． １９９８， Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ＸＬ１ （２）： ２２６−２３３； Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌなど．， １９９２， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４ （１）： １４４−１４５； 及びＯｈａｎｄ Ｃｈａｔｅｒ， １９９７， Ｊ．Ｂａｃｔ． １７９： １２２−１２７により提供される。それらの出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
【０１９０】
（９−１）ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の不活性化
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を、ｐＳＥ２１０における９８８ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＳｔｕＩフラグメント（図４）を、サッカロポリスポラ エリスラエアからのエリトロマイシン耐性遺伝子により次の通りに置換することによって不活性化した。約５μｇのｐＳＥ２１０をＢｇｌＩＩ及びＳｔｕＩにより消化し、約１０．８ｋｂのフラグメントを開放した。ＢｇｌＩＩ末端を、１×クレノウ緩衝液及び１Ｕのクレノウ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）において、前記ＤＮＡを１００μＭの最終濃度のｄＮＴＰと共に３７℃で３０分間インキュベートすることによってフィルインした。
【０１９１】
約１０．８ｋｂのフラグメントを、アガロースゲルから精製し、そして１×アルカリホスファターゼ緩衝液及び１Ｕのアルカリホスファターゼにおいて５０℃で１時間インキュベートし、末端を脱リン酸化した。インキュベーションの後、脱リン酸化されたフラグメントを、セクション６．３に記載のようにして、フェノール／クロロホルム抽出により精製し、そしてＴＥ緩衝液に再懸した。ｅｒｍＥ遺伝子を、ＢｇｌＩＩによる消化により、ｐＩＪ４０２６（Ｊｏｈｎ Ｉｍｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， Ｕ．Ｋ． により提供される；また、Ｂｉｂｂなど．， １９８５， Ｇｅｎｅ ４１： ３５７−３６８ も参照のこと）から単離し、そしてＢｇｌＩＩ末端を、１×クレノウ緩衝液及び１Ｕのクレノウ酵素において、ｅｒｍＥフラグメントを、１００μＭの最終濃度のｄＮＴＰと共に３７℃で３０分間インキュベートすることによってフィルインした。
【０１９２】
約１．７ｋｂのｅｒｍＥフラグメントをアガロースゲルから精製し、そしてその０．５μｇを、０．５μｇの約１０．８ｋｂのフラグメントと共に混合し、そして連結した。その連結混合物を用いて、コンピテントＥ．コリＨＢ１０１細胞（ＢＲＬ）を、製造業者の説明書に従って形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離し、そしてｅｒｍＥ挿入体の存在を制限分析により確かめた。ｐＳＥ２１４（図５）として命名されたこのプラスミドを用いて、Ｅ．コリＤＭ１（ＢＲＬ）を形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離した。９８８ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＳｔｕＩフラグメントの代わりにｅｒｍＥ遺伝子の挿入は、ａｖｅＲ１遺伝子から７５２ｂｐ及びａｖｅＲ２遺伝子から２３２ｂｐを除去する。
【０１９３】
Ｓ．アベルミチリスにおいて自主的に複製しないであろうｐＳＥ２１４を、次の通りに、組込み遺伝子置換のための遺伝子置換ベクターとして使用した。８μｌのｐＳＥ２１４ ＤＮＡ（１μｇ）を、２μｌの１ＭのＮａＯＨを添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、次に、氷上で急速に冷却し、続いて、１ＭのＨＣｌ ２μｌを添加することによって、Ｏｈ ａｎｄ Ｃｈａｔｅｒ， １９９７ 、前記の方法に従って変性した。Ｓ．アベルミチリスのプロトプラストを、その変性されたｐＳＥ２１４により形質転換した。形質転換体を、宿主細胞染色体中へのプラスミドの組込み遺伝子組換えを誘発するために、エリトロマイシン遺伝子の発現を必要とする選択条件下で再生した。
【０１９４】
前記プラスミドは自主的に複製しないので、エリトロマイシン−耐性−形質転換体は、ｅｒｍ遺伝子を端に有する２つのＤＮＡセグメントの１つと、完全なｐＳＥ２１４ベクターの組込みをもたらすであろう、染色体におけるその相同相対物との間での単一の相同組換え、又は突然変異を端に有する第２ＤＮＡセグメントと、染色体中へのプラスミドからのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２（不活性化された）配列の交換及び染色体からの野生型対立遺伝子及びベクター配列の同時損失をもたらすであろう、染色体におけるその相同相対物との間で、第２の組換え現象が生じる、二重クロス−オーバーのいづれかにより、染色体中に組込まれたプラスミド配列を有するべきである。
【０１９５】
エリトロマイシン−耐性形質転換体を単離し、そしてベクター主鎖の存在についてＰＣＲによりスクリーンした。すべての形質転換体は、ベクター主鎖をミッシングしており、このことは、二重クロス−オーバー現象が起こり、そして染色体ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２配列がａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２欠失配列により置換されたことを示唆する。エリトロマイシン−耐性形質転換体を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析により分析した。ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２欠失を含むＳ．アベルミチリス株は、対照株よりも平均３．４倍、アベルメクチンを生成した（表１）。
【０１９６】
（９−２）ａｖｅＲ２遺伝子の不活性化
ａｖｅＲ２遺伝子を、ｐＳＥ２１０（図４）におけるＢｇｌＩＩ部位中にｅｒｍＥ遺伝子を挿入し、そしてＳ．アベルミチリスにおいて遺伝子置換ベクターとしてその得られるプラスミドを用いることによって不活性化した。約５μｇのｐＳＥ２１０を、ＢｇｌＩＩにより消化した。線状化されたｐＳＥ２１０を、１×アルカリホスファターゼ緩衝液及び１Ｕのアルカリホスファターゼにおいて５０℃で１時間インキュベートし、末端を脱リン酸化した。
【０１９７】
ｅｒｍＥ遺伝子を、ＢｇｌＩＩによる消化によりｐＩＪ４０２６から単離し、続いて電気泳動し、そして約１．７ｋｂのｅｒｍＥ遺伝子をゲルから精製した。約０．５μｇの線状化されたｐＳＥ２１０及び０．５μｇのｅｒｍＥフラグメントを一緒に混合し、そして連結した。その連結混合物を用いて、コンピテントＥ．コリＨＢ１０１細胞（ＢＲＬ）を、製造業者の説明書に従って形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離し、そしてｅｒｍＥ挿入体の存在を制限分析により確かめた。ｐＳＥ２１６（図６）として命名されたこのプラスミドを用いて、Ｅ．コリＤＭ１（ＢＲＬ）を形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離した。
【０１９８】
Ｓ．アベルミチリスにおいて自主的に複製しないであろうｐＳＥ２１６を、次の通りに、組込み遺伝子置換のための遺伝子置換ベクターとして使用した。８μｌのｐＳＥ２１６ ＤＮＡ（１μｇ）を、２μｌの１ＭのＮａＯＨを添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、次に、氷上で急速に冷却し、続いて、１ＭのＨＣｌ ２μｌを添加することによって、Ｏｈ ａｎｄ Ｃｈａｔｅｒ， １９９７ 、前記の方法に従って変性した。次にＳ．アベルミチリスのプロトプラストを、その変性されたｐＳＥ２１６により形質転換した。
【０１９９】
形質転換体を、宿主細胞染色体中へのプラスミドの組込み遺伝子組換えを誘発するために、エリトロマイシン遺伝子の発現を必要とする選択条件下で再生した。前記プラスミドは自主的に複製しないので、エリトロマイシン−耐性−形質転換体は、ｅｒｍ遺伝子を端に有する２つのＤＮＡセグメントの１つと、完全なｐＳＥ２１６ベクターの組込みをもたらすであろう、染色体におけるその相同相対物との間での単一の相同組換え、又は突然変異を端に有する第２ＤＮＡセグメントと、染色体中へのプラスミドからのａｖｅＲ２（不活性化された）配列の交換及び染色体からの野生型対立遺伝子及びベクター配列の同時損失をもたらすであろう、染色体におけるその相同相対物との間で、第２の組換え現象が生じる、二重クロス−オーバーのいづれかにより、染色体中に組込まれたプラスミド配列を有するべきである。
【０２００】
エリトロマイシン−耐性形質転換体を単離し、そしてベクター主鎖の存在についてＰＣＲによりスクリーンした。すべての形質転換体は、ベクター主鎖をミッシングしており、このことは、二重クロス−オーバー現象が起こり、そして染色体ａｖｅＲ２配列がａｖｅＲ２欠失配列により置換されたことを示唆する。エリトロマイシン−耐性形質転換体を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析により分析した。ａｖｅＲ２欠失を含むＳ．アベルミチリス株は、対照株よりも平均３．１倍、アベルメクチンを生成した（表１）。
【０２０１】
【表１】

【０２０２】
生物学的材料の寄託物
次の生物学的材料は、１９９８年９月９日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ． ２０８５２， ＵＳＡに寄託され、そして次の受託番号が割り当てられた。
【０２０３】

引用される、すべての特許、特許出願、及び出版物は、引用により本明細書中に組込まれる。本発明は、本明細書に記載される特定の態様により限定されるものではなく、前記態様は、発明の個々の観点の単なる例示であって、そして機能的に同等の方法及び成分は、本発明の範囲内である。実際、本発明の種々の修飾は、前述の記載及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、本発明の範囲内である。
【０２０４】
【配列表】

【０２０５】

【０２０６】

【０２０７】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ａｂｓＡ１及びａｖｅＲ１遺伝子によりコードされる推定上のアミノ酸配列の比較（Ａ）を示す。
【図２】図２は、ａｂＡ２及びａｖｅＲ２遺伝子によりコードされる推定上のアミノ酸の比較（Ｂ）を示す。
【図３】図３は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ２０１（Ａ）を示す。
【図４】図４は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ２１０（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、ｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ２１４（Ａ）を示す。
【図６】図６は、ｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ２１６（Ｂ）を示す。
【図７】図７は、５種のコスミドクローンと共に、アベルメクチンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターの制限地図を示す。

Claims (40)

1. 配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
2. 配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列を含んで成る請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子（ ａｖｅＲ１ 遺伝子）。
3. 配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る請求項２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
4. 配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列に対して ８０％より高い配列同一性を有し、上記ヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドの相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）においてアベルメクチンの生産を制御する遺伝子産物をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子。
5. 配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
6. 配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列を含んで成る請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド分子（ ａｖｅＲ２ 遺伝子）。
7. 配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る請求項６記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
8. 配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列に対して ８０％より高い配列同一性を有し、上記ヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドの相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）においてアベルメクチンの生産を制御する遺伝子産物をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子。
9. 配列番号２のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列の両方をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
10. 配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７および配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１を含んで成る、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
11. 配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
12. 請求項１のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
13. 配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列に対して ８０％より高い配列同一性を有し、上記ヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドの相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）においてアベルメクチンの生産を制御する１又は複数の遺伝子産物をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子。
14. 配列番号１のｎｔ１〜ｎｔ１１１１およびｎｔ３０２２〜５０４５のヌクレオチド配列から選択された ２００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド分子。
15. 配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列をコードするかまたは配列番号２のアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との両方をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子であって、１または複数の制御因子に作用可能に関連しているもの、を含んで成る組換えベクター。
16. 選択マーカーまたはレポーター遺伝子産物を更に含んで成る、請求項１５に記載の組換えべクター。
17. 配列番号２のアミノ酸配列が配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列によりコードされており、そして配列番号４のアミノ酸配列が配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列によりコードされている、請求項１５に記載の組換えベクター。
18. 請求項１５の組換えベクターを含んで成る形質転換された宿主細胞。
19. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により生産されるアベルメクチンの量を増加せしめる方法において、
    （ａ）ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の菌株の細胞を得；
    （ｂ）前記工程（ａ）の細胞に、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列の相補体に対して高緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を導入し；
    （ｃ）工程（ａ）の細胞に比べて検出可能に増加した量のアベルメクチンを生産する、工程（ｂ）からのストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞を選択する；
    ことを含んで成り、ここで、前記ポリヌクレオチド分子の導入が内因性ａｖｅＲ１遺伝子の変異をもたらす、
    ことを特徴とする方法。
20. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一であり、そして配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列の少なくとも ２０％を含んで成り、そして配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１７のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項１９に記載の方法。
22. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により生産されるアベルメクチンの量を増加せしめる方法において、
    （ａ）ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の菌株の細胞を得；
    （ｂ）前記工程（ａ）の細胞に、配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の相補体に対して高緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を導入し；
    （ｃ）工程（ａ）の細胞に比べて検出可能に増加した量のアベルメクチンを生産する、工程（ｂ）からのストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞を選択する；
    ことを含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド分子の導入が、内因性ａｖｅＲ２遺伝子の変異をもたらす、
    ことを特徴とする方法。
23. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一であり、そして配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の少なくとも ２５％を含んで成り、そして配列番号３のｎｔ２３１４〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
25. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により生産されるアベルメクチンの量を増加せしめる方法において、
    （ａ）ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の菌株の細胞を得；
    （ｂ）前記工程（ａ）の細胞に、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の相補体に対して高緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を導入し；
    （ｃ）工程（ａ）の細胞に比べて検出可能に増加した量のアベルメクチンを生産する、工程（ｂ）からのストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞を選択する；
    ことを含んで成り、ここで、前記ポリヌクレオチド分子の導入が、内因性ａｖｅＲ１および／またはａｖｅＲ２遺伝子の変異をもたらす、
    ことを特徴とする方法。
26. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一であり、そして配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の少なくとも １０％を含んで成り、そして配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ３０２１のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項２５に記載の方法。
28. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により生産されるアベルメクチンの量を増加せしめる方法において、
    （ａ）ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の菌株の細胞を得；
    （ｂ）前記工程（ａ）の細胞に、配列番号１のヌクレオチド配列の相補体に対して高緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を導入し；
    （ｃ）工程（ａ）の細胞に比べて検出可能に増加した量のアベルメクチンを生産する、工程（ｂ）からのストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞を選択する；
    ことを含んで成り、ここで、前記ポリヌクレオチド分子の導入が、内因性ａｖｅＲ１および／またはａｖｅＲ２遺伝子の変異をもたらす、
    ことを特徴とする方法。
29. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも １０％を含んで成り、そして配列番号１のヌクレオチド配列の相補体に高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項２８に記載の方法。
30. 前記の変異がヌクレオチド置換である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記の変異がヌクレオチドの欠失、または異なるもしくは異種性のヌクレオチド配列の挿入である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記の変異が、ａｖｅＲ１および／またはａｖｅＲ２遺伝子のコード配列のフレームシフトをもたらす欠失または挿入である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記の変異が、ａｖｅＲ１および／またはａｖｅＲ２遺伝子のコード配列内への終止コドンの挿入、あるいはａｖｅＲ１および／またはａｖｅＲ２遺伝子の終止コドンをもたらす置換である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
34. 遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然変異を同定するための方法であって、（ａ）ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を測定し；（ｂ）段階（ａ）のストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の種又は株の細胞の、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子中に、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に突然変異を導入し；そして（ｃ）遺伝子突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量に、段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量を比較することを含んで成り；段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量が遺伝子突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量よりも検出できるほど高い場合、生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の突然変異が同定されることを特徴とする方法。
35. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の修飾されていない細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成する、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の遺伝子的に修飾された細胞の調製方法であって、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞におけるａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発し、そして遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成する突然変異誘発された細胞を選択することを含んで成る方法。
36. 前記突然変異が、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子の一部を欠失することによって、又はａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子の一部を、異なったもしくは異種ヌクレオチド配列により置換することによって実施される請求項３５記載の方法。
37. 前記突然変異が、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の一部を欠失することによって、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の一部を、異なった又は異種ヌクレオチド配列により置換することによって実施される請求項３６記載の方法。
38. 前記突然変異が、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中に、異なった又は異種ヌクレオチド配列を挿入することによって実施される請求項３６記載の方法。
39. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株であって、その細胞が、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の種又は株の細胞に比較して、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者への１又は複数の突然変異の結果として検出できるほど高められた量のアベルメクチンを生成することを特徴とする株。
40. ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の培養により生成される高められた量のアベルメクチンを生成するための方法であって、遺伝子突然変異を担持しない種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めるよう作用する、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者における突然変異を含んで成る、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株の細胞を、それからアベルメクチンの生成を可能にし又は誘発する条件下で、培養培地において培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含んで成る方法。

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