JP3595607B2

JP3595607B2 - 安定な亜鉛インスリン類似化合物結晶の製造

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Publication number: JP3595607B2
Application number: JP14732095A
Authority: JP
Inventors: ジェフリー・クレイトン・ベイカー; ナンシー・デロリス・カーター; ブルース・ヒル・フランク
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: FI952930L; IL114152A; PL309099A1; FI952930A0; FI952930A7; KR100369951B1; HU9501715D0; IL114152A0; DE69529708T2; AU2168195A; NO952334L; CO4410205A1; KR960000922A; YU39595A; ES2188637T3; RO113529B1; CN1128271A; NZ272358A; EP0692489A1; CA2151563A1

Description

【０００１】
本発明は、ヒトインスリンのモノマー類似化合物に関する。とりわけ、本発明は、結晶性インスリン類似化合物の製造方法に関する。該方法は、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンの精製および製造に有用である。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンは、糖尿病の処置に有用である。
【０００２】
１９２０年代にインスリンが導入されて以来、糖尿病の処置を改良しようと絶え間無い進歩が遂げられてきた。インスリンの純度、および有効性において大きな進歩が遂げられてきた。異なった時間−作用を有する種々の製剤もまた開発されてきた。こういった改良がなされてきたにもかかわらず、皮下注射療法は今だ、患者に好都合な調節や正常化した血糖コントロールを与えるには至っていない。患者が一生涯にわたり正常な血糖レベルから頻繁に逸脱すると、高血糖症または低血糖症、および網膜症、神経障害、腎症、並びに細小血管症および大血管症（ｍａｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）を含む長期合併症を招く。
【０００３】
極端な血糖レベルにならないよう、糖尿病患者は多数回にわたる注射療法を行うことが多いが、これにより、インスリンを食事毎に投与する。しかし、この治療法はまだ完全であるとは言えない。最も迅速に作用する市販のインスリンは、注射後、ピークに達するのが遅すぎて長く持続しすぎるので、グルコースレベルを最適にコントロールすることができない。近年、皮下吸収過程の動態を変えるインスリン製剤およびインスリン類似化合物製剤を作り出そうと、相当な努力がはらわれてきた。
【０００４】
市販されているインスリンの医薬品製剤は全て、自己会合した状態で、主に亜鉛−ヘキサマーの形でインスリンを含有するので、皮下注射貯留部位から血流へインスリンが吸収されるにあたっての律速段階は、自己凝集したインスリンヘキサマーの解離であると考えられている。この吸収過程を促進するために、モノマーインスリン類似化合物が開発されてきた。これらのモノマー類似化合物は、天然ヒトインスリンの生理学的活性を保持する一方で、インスリンより比較的迅速な活性発現を有する。モノマー類似化合物は迅速に吸収されて、インスリンの注射時間や作用ピークを食事に対する応答に伴う食後のグルコース可動域へより近似する。
【０００５】
本発明は、そのようなモノマー類似化合物の１つであるＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン（Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ）結晶の新規製造方法を提供する。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩは、ＥＰＯ公開第３８３４７２号に開示されている。しかし、商業的に実行可能な結晶性Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの製造方法は開示されていない。
【０００６】
インスリンの結晶化は当業界において周知である。最初の発見は、エーベル（Ａｂｅｌ）がブルシン、ピリジン、および酢酸アンモニウムで酸性度を調節した溶液から等電域においてインスリンを結晶化した１９２６年にさかのぼる［ＡｂｅｌＪ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．１２：１３２（１９２６）］。ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）らは、インスリン結晶および製剤並びにそれらを製造するための方法を米国特許第２，９２０，１０４号に記載している。今日、インスリンを結晶化するための商業的方法は、０．２５Ｎの酢酸、約２ｇ／ｌのインスリン、および２％の亜鉛を含むインスリン溶液の塩基性度を塩基、好ましくは水酸化アンモニウムでｐＨ５．６〜６．０に調節することからなる［ＪｅｎｓＢｒａｎｇｅ，ＧＡＬＥＮＩＣＳＯＦＩＮＳＵＬＩＮ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）］。最も重要なことは、ヒトインスリンがいずれかの亜鉛結晶を形成することのできる条件下にＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩをおいても、そのような結晶化は起こらないということである。
【０００７】
本発明は、該分子独特の、すなわち、ヒトインスリンを結晶化しない条件下でのＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの結晶化方法を提供する。その方法により、高品質の亜鉛結晶が高収率で大規模に製造される。結晶は、分子の安定な固体の形で得られる。結晶性固体が特に有利であるが、これは、それらが無定形の固体より容易に特徴付けられ、精製されて、製薬的にも高品質だからである。従って、該方法は商業的応用に適当である。
【０００８】
本発明は、結晶性Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンの製造方法であって、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン、亜鉛、酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択される少なくとも０．３Ｎの有機酸、およびフェノール系化合物を含む溶液から、ｐＨ約５．５〜約６．５でＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンを結晶化することよりなる方法を提供する。
【０００９】
上記のように、本発明は、結晶性Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンを製造するための方法を提供する。「Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン」または「Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ」という用語は、ダイマー化したり、自己会合したりする傾向の少ない速効性のインスリン類似化合物である。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩは、ＥＰＯ公開第３８３４７２号［このＥＰＯ公開に記載された内容は本明細書の一部をなす］に記載されているように、Ｂ鎖のＢ２８位に位置するプロリンがリジンで置換されていて、またＢ鎖のＢ２９位に位置するリジンがプロリンで置換されているヒトインスリンである。
【００１０】
本開示中で使用するアミノ酸の略号は全て、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２（ｂ）（２）で詳述されているように、米国特許商標局が認可したものである。
【００１１】
本明細書中で使用する「フェノール系化合物」または「フェノール誘導体」という用語は、フェノール、レゾルシノール、ｍ−クレゾール、またはメチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、もしくはそれらの混合物を集合的に意味する。
【００１２】
本発明中で使用する「結晶化する」という用語は、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン結晶の形成を示す。
【００１３】
「生理学的に許容し得る塩基」という用語は、ある当業者に知られている。生理学的に許容し得る塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムが包含される。好ましくは、該塩基は水酸化アンモニウムである。
【００１４】
結晶性インスリンの形成は、広く研究されてきた。ヒトインスリンは、０．２５Ｎの酢酸、１．６〜２．１ｇ／ｌのインスリン、および２％の亜鉛の存在下、ｐＨ５．９５〜６．０５で商業的に結晶化される。その結晶化は、塩基、一般的には水酸化ナトリウムの添加で酸性側から結晶化が開始されることにより起こる。最も意外には、インスリン結晶の既知の製造条件下では、可溶性Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩが結晶化しない。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩは、自己会合および凝集が最小限となるよう設計されている。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩが凝集しないという観察結果は、ブレムス（Ｂｒｅｍｓ）らのＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５：６，５２７−５３３（１９９２）により初めて記載された。類似化合物をモノマーとする最小限の自己会合および凝集は、インスリンに関して開発された条件下では、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩが結晶化しないことの原因であると考えられている。
【００１５】
本発明は、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩが亜鉛およびフェノール化合物と共に結晶化して、安定な結晶性固体を形成する条件を記載する。好ましいフェノール系化合物は、フェノール、レゾルシノール、またはそれらの混合物よりなる群から選択される。亜鉛およびフェノール系化合物は両方共、結晶化を成し遂げるのに重要である。
【００１６】
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの溶液は、インスリン類似化合物を水性希釈剤に溶解することにより製造する。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ濃度は約１．８ｇ／ｌ〜約２．５ｇ／ｌである。最も好ましくは、類似化合物濃度は約２ｇ／ｌである。一般に酸溶解として知られていることにより、すなわち、生理学的に許容し得る酸、好ましくは塩酸を用いてｐＨを約３．０〜３．５まで下げることにより、溶解を助長することができる。他の生理学的に許容し得る酸には、酢酸、クエン酸、およびリン酸が包含される。
【００１７】
酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択される有機酸濃度は、少なくとも０．３Ｎである。０．３Ｎより低いと、主として無定形の生成物が得られる結果となる。好ましくは、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを約０．８〜約１．２Ｎの酢酸に溶解する。最も好ましくは、１Ｎの酢酸に溶解する。
【００１８】
添加する亜鉛濃度は、最終濃度が約４０ｍｇ〜約４００ｍｇ／ｇ（類似化合物）となるようにする。亜鉛は塩として添加するのが好ましい。亜鉛塩の典型的な例には、酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨウ化亜鉛および硫酸亜鉛が包含される。当業者には、本発明の方法においてまた使用することのできる亜鉛塩が他に多く存在することが分かるであろう。好ましくは、酢酸亜鉛または塩化亜鉛を使用するが、これは、これらの塩なら、商業的に許容し得る製法に新たな化学イオンを添加することにはならないからである。結晶化における最適な亜鉛濃度は、約１００〜約３００ｍｇ／ｇ（Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ）である。
【００１９】
結晶化条件は、フェノール系化合物、塩基および亜鉛濃度に影響されやすい。すなわち、該方法を行うある当業者は、はっきりした結晶が得られるよう、本明細書中で記載するパラメーターを調節する。各々のフェノール系化合物−塩基の組合せに対する最適条件は、開示された範囲内で種々に変化する。好ましくは、フェノール系化合物は、濃度が約０．１５〜約０．２５％（ｖ／ｖ，最終濃度）のフェノールである。さらに好ましくは、濃度が０．２％のフェノールである。
【００２０】
本発明の方法には、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを溶液に溶解する方法、またはフェノール系化合物、亜鉛、およびＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを溶液に添加する順序は重要ではない。しかし、フェノール系化合物をＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの等電点より低いｐＨでＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩと相互作用させることは重要である。従って、亜鉛を添加することにより、または生理学的に許容し得る塩基の添加で溶液の塩基性度を酸性ｐＨから約５．５〜６．５へ調節することにより、結晶化を開始することができる。生理学的に許容し得る塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムが包含される。好ましくは、塩基は水酸化アンモニウムである。
【００２１】
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン、亜鉛、酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択される少なくとも０．３Ｎの有機酸、およびフェノール系化合物を含む溶液の塩基性度を生理学的に許容し得る塩基でｐＨ約５．５〜約６．５に調節することにより、結晶化を行うことができる。好ましくは、ｐＨをｐＨ約５．９〜６．２に調節する。ｐＨを調節すると、結晶が形成される。
【００２２】
さらに好ましくは、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを約１Ｎの酢酸に溶解する（溶解を助長するのに必要ならば、ｐＨを３．０〜３．５に調節してよい）。次いで、その溶液にフェノール系化合物を添加して、平衡となるまで放置する。溶液のｐＨを生理学的に許容し得る塩基でｐＨ約５．５〜約６．５に調節する。好ましくは、塩基は水酸化アンモニウムであり、ｐＨはｐＨ約５．９〜６．２に調節する。次いで、亜鉛を添加することにより、結晶化を開始する。
【００２３】
結晶化するためにどちらの方法を利用しても、撹拌しながら、または撹拌せずに結晶は形成されるので、これを集めて洗浄することができる。好ましくは、結晶化は撹拌しながら行う。所望により、濾過が容易に行われるよう、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを再結晶することができる。従来の方法により、結晶を集めて乾燥することができる。結晶を濾過により集めるならば、さらに亜鉛を濾液、または母液に添加して、さらにＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを回収することができる。本発明の方法により製造した結晶は高品質であり、商業的規模では高収率である。結晶は、効力を満たし／完全なものとするよう、保持し、調合して与えるのに適当な、塊状薬物の安定な固体の形で得られる。その結晶化方法により、原料の純度または凝集動態は変化しない。
【００２４】
結晶化温度は重要ではない。許容し得る温度範囲は約４℃〜約２６℃である。好ましくは、温度は約２２℃〜約２４℃である。
【００２５】
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩは、古典（溶液）法、固相法、半合成法、およびごく最近では組換えＤＮＡ法を含め、認可されている種々のペプチド合成法の幾つかにより製造することができる。例えば、ＣｈａｎｃｅらのＥＰＯ公開第３８３４７２号では、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンの製造を開示している。
【００２６】
以下の実施例は、単にインスリン類似化合物の製造および本発明をさらに説明するために示すものである。本発明の範囲は、単に以下の実施例からなるものとして構成されるものではない。
【００２７】
実施例１
ステンレス鋼製のドラム中、精製水（２６０．６Ｌ）および氷酢酸（１９．４４Ｌ）を用い、プロセス・ストリーム８４６．５ベースグラムのＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの酢酸緩衝液（１１６Ｌ）を２７６ｎｍでの吸光度が２．２５となるまで希釈して、最終濃度を１Ｎの酢酸とした。その溶液に２ｍｌ／Ｌの割合で液化フェノール（合計７９２ｍｌ）を加えて、その結果得られる溶液のｐＨがｐＨ３より低いことを確認した。水酸化アンモニウム２４Ｌを加えることにより、その溶液をｐＨ６．０１に調節した後、２２℃まで温めた。温めた後、塩化亜鉛溶液（２％ｗ／ｖ水溶液）５．３５Ｌを加えた。溶液のｐＨが望ましい範囲（５．９〜６．１）にあることを再確認して、溶液を１２時間撹拌した。その溶液を８℃まで冷却して、撹拌を停止し、２〜８℃で１８時間以上放置して結晶を析出させた。結晶が析出した後、上澄み液３７０Ｌを傾斜して流し出し、さらに沈殿させるため、傾斜して流し出した上澄み液の一部を元のドラムを濯ぐのに用いて、残りの上澄み液と結晶層をより小さなドラムに移し入れた。１４時間析出させた後、上澄み液６１Ｌを傾斜して流し出すと、湿った結晶層と上澄み液約９Ｌが残った。
【００２８】
結晶をこの容積にてスラリー化し、１リットルの遠心分離用ボトル６本に分け入れて、ＤＰＲ６０００遠心分離機を用い、４０００ｒｐｍ（約４０００×Ｇ）で４５分間遠心分離を行った。ボトル６本に結晶スラリーを全て入れるには、２回行わなければならなかった。遠心分離して得られた上澄み液（ｃｅｎｔｒａｔｅ）を傾斜して流し出した。遠心分離用ボトル１本につき精製水５００ｍｌを用いて、結晶（ボトル１本につき約２５０ｍｌ）をスラリー化し、再び４０００ｒｐｍで４５分間遠心分離を行った。次いで、ボトル１本につき冷却しておいた（２〜８℃）アルコールＳＤＮｏ．３ＡＡｂｓｏｌｕｔｅ５００ｍｌを用いて、結晶を再び遠心分離用ボトルにスラリー化し、再び４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。遠心分離して得られたアルコールの上澄み液（ａｌｃｏｈｏｌｃｅｎｔｒａｔｅ）を傾斜して流し出し、アルコール洗浄を２回以上繰り返し行った。アルコール洗浄した結晶（湿重量１．９ｋｇ）を減圧下に乾燥した。
【００２９】
実施例２
約２ｇ／ＬのＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ溶液を調製して、最終濃度を１Ｍの酢酸（２８０ｎｍでの吸光度により測定する）とする。その溶液に液化フェノール（３．３ｍｌ／Ｌの溶液）を加えた後、濃水酸化アンモニウムでｐＨ５．９〜６．２に調節して、塩化亜鉛を２％（ｗ／ｖ）または２０％（ｗ／ｖ）溶液として加え、最終濃度を４０〜１６０ｍｇ（塩化亜鉛）／ｇ（Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ）とする。その結果得られる結晶を放置して析出させ、傾斜して流し出すことにより母液を取り除いた後、遠心分離を行う。引き続き、結晶を水でスラリー化して遠心分離を行い、最後、減圧下に乾燥する前に無水エタノールで洗浄する。１６０ｍｇ／ｇのＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを限度として、母液に亜鉛を添加することにより、第２回目に得られる結晶を得ることができる。
【００３０】
実施例３
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン（２２２ｍｇ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水１００ｍｌに溶解した。その溶液をＨＰＬＣ分析により測定すると、溶液１ｍｌにつきＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを２．０ｍｇ含有していた。その溶液を１０％のＨＣｌでｐＨ約３．０に調節することにより清澄した。５ｍｌ量を４回分取し、氷酢酸を加えることにより１Ｎの酢酸溶液として、ｐＨが３．５より低いことを確認した。各々の試料に液化フェノール１０μｌを加えた後、塩化亜鉛溶液（２０％ｗ／ｖ水溶液）６μｌを加えた。各々に、濃水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム（１０％ｗ／ｖ溶液）、または水酸化カリウム（１０％ｗ／ｖ溶液）のいずれかを加えることにより、ｐＨを６．０に調節した。その溶液を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておいた。約２時間後には、３つの溶液全てに、はっきりした菱面体結晶が観察されたが、結晶は水酸化カリウムで調節した溶液中で最も迅速に形成された。
【００３１】
実施例４
氷酢酸１．２ｍｌを含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ水２０ｍｌのどちらか一方にＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２ ^９−ｈＩ約４２ｍｇを溶解した。液化フェノール４４μｌを最初の試料に加え、液化フェノール３４μｌをもう一方の試料に加えた。どちらの場合も、濃水酸化アンモニウムを加えることでｐＨを６．０に調節した後、塩化亜鉛溶液（２０％ｗ／ｖ水溶液）４５μｌを加えた。その溶液を約５分間撹拌して、蓋をし、室温で静置しておいた。約２４時間後には、はっきりした菱面体結晶が観察された。
【００３２】
実施例５
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリン（２２２ｍｇ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水１００ｍｌに溶解して、その溶液をＨＰＬＣ分析により測定すると、溶液１ｍｌにつきＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを２．０ｍｇ含有していた。その溶液を１０％のＨＣｌでｐＨ約３．０に調節することにより清澄した。５ｍｌ量を４回分取し、氷酢酸を加えることにより１Ｎの酢酸溶液として、ｐＨが３．５より低いことを確認した。各々に、ｍ−クレゾール（１２μｌ）、フェノール（１０μｌ）、レゾルシノール（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液２．１μｌ）、またはメチルパラベン（１０ｍｇ／ｍｌの水溶液１．６ｍｌ）のいずれかを加えると、フェノール系化合物に対して同様なペプチドのモル比を有する結晶化溶液が生成した。各々の試料に塩化亜鉛溶液（２０％ｗ／ｖ水溶液）６μｌを加え、濃水酸化アンモニウムでｐＨを６．０に調節した。その溶液を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておいた。約２４時間後には、フェノールを含有する溶液に、はっきりした菱面体結晶が観察された。メチルパラベンを含有する溶液には、あまりはっきりしない平面結晶が生じた。これらの条件下、ｍ−クレゾールおよびレゾルシノールを含有する溶液には、結晶が生じなかった。
【００３３】
１０分の１量のレゾルシノールを用い、また水酸化ナトリウム（１０％ｗ／ｖ溶液）で調節して、同様の方法を行うと、はっきりした菱面体結晶が結果として得られた。この実施例から、一般に条件を最適化することにより、はっきりした結晶がフェノール系化合物で形成され得ることが実証される。
【００３４】
実施例６
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩ（２２２ｍｇ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水１００ｍｌに溶解して、その溶液をＨＰＬＣ分析により測定すると、溶液１ｍｌにつきＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩを２．０ｍｇ含有していた。その溶液を１０％のＨＣｌでｐＨ約３．０に調節することにより清澄した。５ｍｌ量を１回分取し、氷酢酸を加えることにより０．２５Ｎの酢酸溶液として、ｐＨが３．５より低いことを確認した。塩化亜鉛溶液（２％ｗ／ｖ水溶液）２０μｌを試料に加えた。濃水酸化アンモニウムを加えることによりｐＨを６．０に調節した。その溶液を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておいた。約２４時間後では、溶液に結晶は全く観察されなかったが、無定形の沈澱物が容器の底に沈澱していた。
【００３５】
対照として、５ｍｌ量をもう１回分取して、実施例１に記載した水酸化アンモニウム処置を行った。Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩのはっきりした菱面体結晶が形成された。ヒトインスリン（１Ｎの酢酸中、２．３ｍｇ／ｍｌ）を水酸化アンモニウムを使用する実施例１に記載した条件下においても、７日以内では、結晶は全く形成されなかった。
【００３６】
この実験から、生合成的なヒトインスリンの結晶化において一般に利用される条件は、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ヒトインスリンの結晶化には不適当であり、また同様に、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの結晶化に関して記載した結晶化条件では、ヒトインスリンの結晶は生じないであろうことが実証される。
【００３７】
実施例７
１Ｎの酢酸の代わりに１Ｎのクエン酸を使用し、実施例１と同じ方法で行った。その結晶化により、はっきりしたＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９−ｈＩの結晶が生じた。

Claims

結晶性のＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンの製造方法であって、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン；亜鉛；酢酸、クエン酸及びグリシンよりなる群から選択される、少なくとも０．３Ｎの有機酸；及びフェノール化合物を含む、ｐＨ約５．５〜約６．５の溶液からＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２４ヒトインスリンを結晶化させることを含み、フェノール系化合物はＬｙｓ ^Ｂ２８Ｐｒｏ ^Ｂ２４ヒトインスリンの等電点以下でＬｙｓ ^Ｂ２８Ｐｒｏ ^Ｂ２４ヒトインスリンと相互作用させる方法。
Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンの濃度が約１．８〜約２．５ｇ／Ｌであり；フェノール化合物がフェノールであり；亜鉛の濃度がＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン１ｇ当たり約４０ｍｇ〜４００ｍｇである請求項１に記載の方法。
ｐＨが約５．９〜約６．２である請求項１に記載の方法。
結晶性のＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンの製造方法であって、
ａ）約１Ｎ酢酸中の約１．８〜約２．５ｇ／ＬのＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン溶液に、最終容積ベースで０．１５％〜０．２５％のフェノールを添加し、フェノールをＬｙｓ ^Ｂ２８Ｐｒｏ ^Ｂ２４ヒトインスリンの等電点以下でＬｙｓ ^Ｂ２８Ｐｒｏ ^Ｂ２４ヒトインスリンと相互作用させ；
ｂ）水酸化アンモニウムでｐＨを約５．９〜約６．２に調節し、そして
ｃ）Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン１ｇあたり約４０〜約〜約４００ｍｇの亜鉛の最終濃度となるまで亜鉛塩溶液を添加する；
ことを含む方法。