JP3601602B2 - 無毒性微生物及びその使用：サルモネラ - Google Patents

Description

関連出願へのクロスリファレンス
本出願は1990年11月９日出願の審査中の米国出願07/612,001号のCIP（コンティニュアス イン パート）であり、それは1988年６月１日出願の米国出願200,934号のCIPであり、それは1987年６月４日出願の審査中の米国出願058,360号；米国出願200,934号は又1988年10月３日出願で審査中の米国出願251,304号のCIPであり、それは1987年10月７日出願で審査中の米国出願106,072号のCIPである。これらの出願はここで引用によって合体される。
本発明の分野
本発明は無毒性微生物、それらの精製方法及びそれらのワクチンにおける使用に関する。特に、これは無毒性Ｓ．タイフィに関する。
本発明の背景
チフス菌によって引き起こされる腸チフスは、低開発国の住民、工業国から風土性地域を訪れた旅行者、及び熟達試験を実行する研究所の臨床微生物学者に対する重要な大衆健康問題として残っている。現在認可されている腸管外で殺された全ての細胞の腸チフスのワクチンは防御するが許容させ得ない高い頻度でマークされた全身系のそして局所副作用を引き起こす（プロットキンSA,モーティマーEA Jr.（eds）におけるレビン、腸チフスワクチン：ワクチン。フィラデルフィフ、WBサウンダース、1988年、333乃至361頁）。代替ワクチンには最近認可された経口的生ワクチン菌株Ty21a及び実験に基づく腸管外のVi多糖ワクチンが含まれている。
経口的ワクチンの利点は局所対応が最大に刺激される粘膜免疫系への複製生体の導出である。更に、弱毒性腸 チフス菌が外来性抗体をイクスプレスするキャリアワクチンとして作用しそれらを人間免疫系に導出する誘因候補である。しかし、このアプローチを人間を免疫化するために成功するように使用するための臨界前要件は免疫系への外来性タンパク質及び多糖抗原を導出するために高度に免疫原性であり未だ安全な腸チフス菌の弱毒性菌株を存在せしめることである。
Ty21aに基づく最近の経口的ワクチンは種々の欠点を有する。Ty21aは比較的低い免疫原性のものであり免疫化のために多数回の経口的投与が必要となる。成育可能な生体の産出はそれが大規模に発酵し凍結乾燥されたときに低い。更に、Ty21aは不確定なままのqa1E及びviaに加えて多数回の突然変異を有する。（ホーン他、（1987）,J.インフェクト．ディス．156:167−174;ホーン他、（1988）,J.インフェクト．イミュン．56:1326−1333）。
ソネ赤痢菌（フォーマル他、（1981），インフェクト．ニミュン．34:764−750）のＯ抗原又はコレラ菌01抗原型イナバ（フォレスト他、（1989）,J.インフェクト．ディス.159:145−146）のＯ抗原をイクスプレッシングするTy21aの構成物は人間における臨床試験を受けている。北米ボランティアにおいて試験されたTy21a/Ｓ．ソネ構成物の２ロットが病原性のＳ．ソネを用いた実験による挑戦に対する有意な防御を提供し、そこにはロットからロットへの変化があり他のロットは防御的であった（ブラック他、J.インフェクト．ディス．（1987），155:1260−1627;ヘリングトン他（1990），ワクチン８:353−357）。Ty21a/イナバ構成物はワクチンの少数のみで及び低力価で血清イナバビブリオサイダル抗体及び腸SIgA抗イナバＯ抗体を誘発した（タケット他、（1990），インフェクト．ニミュン.1620−1627）。病原性V.コレラエ01を用いた実験による挑戦研究において、構成物の宿主は下痢に対して全体に渡って有意的に防御されなかったが、穏やかな下痢を有し、より少ない野性V.コレラエ細胞（タケット他,Id.）をシェドした。
候補キュリア菌株としてのTy21aの使用の欠点はその制限された免疫原性、そのアテニュエイションの分子ベース上での正確な情報の欠如及びその菌株（例えば、トランスフォーメーション、エレクトロポレーション、及び組み換え頻度において）の細菌遺伝子手技における実施上の困難さを含む。それは又凍結乾燥培養の再構成の後の非常に乏しい生存度を示している。
本出願人は無毒性に通ずる障害が食餌によって又は動物宿主によって供給されるあらゆるものによっても回復され得ない毒性因子のトランスポゾン誘発された無毒性突然変異株を使用したワクチンを用いた有毒感染に対する防御の新たな方法を開示した。ネズミチフス菌のアデニル酸シクラーゼ遺伝子（cya）及び環状AMP受容タンパク質遺伝子（crp）における遺伝子欠失突然変異の導入による無毒性微生物を製造する方法を含む出願人の最初の研究の内のいくつかがEPO Pub.No.315,682（1989年５月17日に公表された）、及びPCT Pub.No.88/09669（1988年12月15日に公表された）に述べられている。出願人は又、組み換え抗原のイクスプレッションのためのキャリア細胞として所望される無毒性突然変異型細胞の他の種類の生産の方法を提供した。これらの細胞は酵素が本質的な細胞壁構造成分の生合成における過程に触媒作用を及ぼす細胞生存のために本質的な酵素を符号化する機能擦る自生遺伝子の欠如及び最初の組み換え遺伝子が欠損染色体遺伝子を置換することができない自生酵素のための機能置換である酵素を符号化する最初の組み換え遺伝子の存在によって特徴付けられる。これらの細胞に最初の組み換え遺伝子は構造的に所望の産物を符号化する２番目の組み換え遺伝子に連鎖されている。最初の組み換え遺伝子の損失は細胞を溶解させる。これらの方法はWO 89/03427（1989年４月20日公表された）に記載されている。上記の特許出願の開示は、あらゆる対応する国家特許出願と同様に、引用によってここで合体される。
発明の簡単な説明
本発明は、幾分、EPO Pub.No.315,682に開示されていない新たな無毒性Ｓ．タイフィ派生物に基づく。本発明にはこれらの新たなＳ．タイフィ派生物の出願が、インターエリイア、商業ワクチン、Ｓ．タイフィの免疫原性抗原に応答する免疫系を刺激する方法、及び病原の免疫原性抗原に応答する免疫系を刺激する方法において、含まれる。ここで提供される菌株はＳ．タイフィによって引き起こされる病気を防止するための商業ワクチン、及びその抗体を用いてＳ．タイフィが交叉反応する他の腸の細菌の生産に直接的及び関節的に適当である。これらの菌株は又細菌細胞において組み換え遺伝子上で符号化されたイクスプレッション産物の生産のためのキャリア微生物として役に立つ。
従って、本発明の一実施例は生理学的に許容される賦形剤において、cya遺伝子における突然変異を用いたチ フス菌（Ｓ．タイフィ）の無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。
本発明の他の実施例はcya遺伝子における突然変異を用いた分離されたＳ．タイフィの無毒性菌株である。
本発明の更に他の実施例はcrp遺伝子における突然変異を用いたＳ．タイフィの無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。
本発明の更に他の実施例はcrp遺伝子における突然変異を用いたＳ．タイフィの分離された無毒性菌株である。
本発明のその他の実施例はＳ．タイフィの無毒性派生物、cya遺伝子における突然変異及びcrp遺伝子における突然変異を用いた該派生物である。
本発明の更に他の実施例はcya遺伝子及びcrp遺伝子における突然変異を用いたＳ．タイフィの分離された無毒性菌株である。
本発明の更に他の実施例はcdt遺伝子における突然変異を用いたサルモネラの無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。
本発明のその他の実施例はcdt遺伝子における突然変異を含むサルモネラの分離された無毒性派生物である。
本発明の更に他の実施例は菌株χ3958,χ4323,χ3926,χ3927,4297,χ4346,χ3940,χ4073及びその派生物のグループから選択された分離された菌株である。
本発明のその他の実施例はcya遺伝子における突然変異よりなる無毒性のＳ．タイフィの菌株を利用する方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。
本発明の更に他の実施例はcrp遺伝子における突然変異よりなる無毒性Ｓ．タイフィの菌株の利用方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。
本発明の更に他の実施例はcdt遺伝子における突然変異よりなる無毒性サルモネラの菌株の利用方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。
本発明の他の実施例はcdt突然変異株であるＳ．タイ フィの分離された菌株である。
【図面の簡単な説明】
図1Aはχ3633（Δ〔crp−cysG〕−10）の9x10⁸CFU、χ3737（pSD110⁺/Δ〔crp−cysG〕−10）の1x10⁹及びχ3339（自生型）の1x10⁹CFUを用いた経口接種の後スペシファイされた回数の生後８周間BALB/cマウスのペヤーズパッチからのCFUの回復を示すグラフである。３匹のマウスが各時点で犠牲になった。幾何平均±標準偏差として与えられる。
図1Bはχ3633（Δ〔crp−cysG〕−10）の9x10⁸CFU、χ3737（pSD110⁺/Δ〔crp−cysG〕−10）の1x10⁹及びχ3339（自生型）の1x10⁹CFUを用いた経口接種の後スペシファイされた回数の生後８周間BALB/c雌マウスの脾臓からのCFUの回復を示すグラフである。３匹のマウスが各時点で犠牲になった。幾何平均±標準偏差として与えられる。
図２はpYA1077部分限定マップである。λgt11クローンL14からの1.0kb Ｍ．レプラエ挿入DNA片がpYA292内のEcoR I部位にサブクローンされた。Ｍ．ラプラエ挿入DNA内に単一非対照Sa1 I部位がある。下記のエンドヌクレアーゼ；BamH I,Hind III,Pst I,及びXba Iに関するＭ．ラプラエ挿入DNA内には部位がない。
図３はＳ．タイフィ、Ｓ．タイフィムリウム及びpYA1077及びpYA1078をハーバーするＥ．コリ菌株によって生産されるタンパク質のウェスタンブロットを示すハーフトーン再生である。ニトロセルロースフィルタ上のそのタンパク質は21らい腫らい患者からのプールされた血清を用いて反応された。レーン1,分子サイズマーカー（サイズはブロットの左へ示されている）；レーン2,pYA292を用いてＳ．タイフィχ4297によってスペシファイされたタンパク質；レーン３乃至5,各々がpYA1078を含む３つの独立Ｓ．タイフィχ4297隔離集団によってスペシファイされたタンパク質；レーン６乃至8,各々がpYA1077を含むＳ．タイフィχ4297隔離集団の３つの独立隔離集団によってスペシファイされたタンパク質；レーン9,pYA1077を用いてＳ．タイフィムリウムχ4072によってスペシファイされたタンパク質；レーン10,pYA1075（それがpYA1077においてそうであるようにラクＺプロモータの血縁である同じ指向におけるλgt11クローンL14からの1.0kb Ｍ．ラプラエDNA挿入を含むpUC8−２派生物）を用いてＳ．タイフィムリウムによってスペシファイされたタンパク質。注：それがβガラクトシダーゼのアルファー領域を用いた融合タンパク質であるためpYA1075によってスペシファイされた免疫反応性タンパク質はpYA1077によってスペシファイされたものよりも僅かに大きい。
図４はλgt11::Ｍ．ラプラエクローンL14及びＳ．タ イフィ、pYA292,pYA1077及びpYA1078をハーバーしているＳ．タイフィムリウム及びＥ．コリ菌株によって生産されたウェスタンブロットを示すハーフトーン再生である。
図５は人間血清における37℃でのＳ．タイフィTy2及びISP1820の自生及び野性菌株の成長を示すグラフである。
本発明を実行するためのモード
本発明はある突然変異が実質的にその免疫原性に影響を及ぼさずに微生物を無毒性にし得るという発見に基づいている。特に、この発明は微生物が夫々アデニル酸シクラーゼ（ATPピロフォスフェートリアーゼ（環化する）EC4.6.1.1）及び環状AMP受容タンパク質（CRP）を合成する能力を除去する遺伝子欠失（オープントライアングル又はデルタ）突然変異Δcya及び／又はΔcrpをキャリーする微生物ワクチンに関する。
環状−3'5'−AMP（cAMP）及び環状AMP受容タンパク質は大量のカタボリティーの輸送及び衰弱に関する大量の遺伝子及びオペロンの転写に必要である。燃料／炭素源を輸送するために使用される系が全て、いくつかのアミノ酸透過酵素であることから、cAMPろによる正制御の下にあるということを示す証拠が提供された。異化におけるその非常に重要な役割に加えて、細胞におけるcAMP濃縮は又温度ファージ、フィムブリエの合成、べん毛の合成及び少なくとも一つの外膜タンパク質の合成による溶原化に影響を及ぼす。cAMPは哺乳類細胞内に存するが、大食細胞及びサルモネラが侵入及び増殖し得る他の細胞内に存するその濃縮は野性型表現型インビトロを表すΔcya突然変異株を許容するのに必要な0.1乃至1.0mM cAMPの濃縮以下である。更に、Δcrp突然変異の包含は、本質的にそのようなΔcya突然変異株によるcAMPインビト ロ又はインビボの理解から生ずるであろういかなる恩恵をも廃止するであろう。
突然変異のＳ．タイフィのcya及びcrpへの導入は、他のサルモネラ菌株からＳ．タイフィへの突然変異の移入のために、トランスポゾンの使用によって完成され得る。トランスポゾンは細菌染色体へ多くの点において付加され得る。トランスポゾン挿入及び遺伝子欠失の特徴はクロックナー他（1977）、モル．ボイル．116:125において再調査された。例えば、テトラサイクリンへ耐性（及びフザリク酸に感受性を）与えるトランスポゾンTn10はΔcya及びΔcrp突然変異を、例えば、Ｅ．コリ及びＳ．タイフィムリウムを含む様々な細菌種において製造するのに使用され得る。Ｓ．タイフィムリウムにおいてこれらの突然変異株を製造及び検出する方法はEPO Pub.No.315,682に記載されており、方法は又後にTn10を使用する例にて提供する、これらの突然変異は好ましくは高度に病原性であるＳ．タイフィの様々な隔離集団へ転位され得る。Ｓ．タイフィムリウムから野性型Ｓ．タイ フィ菌株へのΔcya及びΔcrp突然変異の転移の例は後に例にて示す。
Δcya及び／又はΔcrp突然変異の導入によって一旦無毒性となったら、その微生物はその微生物に対する免疫を誘発するワクチンの免疫原性成分として役に立つ。
本発明の他の実施例において、cya突然変異株及び／又はcrp突然変異株であるＳ．タイフィは、好ましくは遺伝子欠失によって、サルモネラの毒性を調節する、cr p遺伝子の付近の遺伝子において、突然変異される。この遺伝子，cdt遺伝子における突然変異は、例えば脾臓のような深い組織に効果的に定着する細菌の能力を減少させる。crp ^＋遺伝子を有する核外遺伝子がΔ（crp−cd t）を用いて菌株内に配置された際、それはその無毒性及び免疫原性を保有しよってcya及びcrp突然変異株と同様の表現型を有する。核外遺伝子上にcrp ^＋遺伝子を含むΔ（crp−cdt）突然変異を用いた突然変異株は腸道及びGALTに定着する通常の能力を保有するが、より深い組織に定着する減少された能力を有する。その例においては、元のΔ（crp−cdt）突然変異はχ3622において分離されアルギニン及びシステインの成長のための要求を課するargD及びcysG遺伝子を削除した；この突然変異株対立遺伝子はΔ（crp−cysG）−10と名付けられた。アルギニン要求を課さなかったより短い遺伝子欠失を含む第２の突然変異株が分離された；これはχ3931内に存しΔ（crp−cysG）−14と名付けられた。Ｓ．タイフィにおけるcdtにおける突然変異は直接製造され得るとともに例に示されたようなＳ．タイフィムリウム菌株からの転位を介して導入され得る。更に、cdt突然変異は知られた技術、及びここに記載された特徴を使用した表現型選択を使用してサルモネラの他の菌株において製造され得る；代わりに、Δcdt突然変異が例に記載されたＳ．タ イフィムリウムから他のサルモネラの菌株へ知られた技術であるトランスポゾン突然変異誘発の技術を使用して転位され得る。
本発明の更に他の実施例において病原性Ｓ．タイフィの無毒性派生物がGALT,例えば回腸のペヤーズパッチへ選択された抗原を送出するキャリア細菌として使用され得る。サルモネラはペヤーズパッチ（カーター、P.B.及びF.M.コリンズ、J.イクスプ．メド.139:1189（1974））へ帰ることが知られている。Ｓ．タイフィムリウ ム−Ｅ．コリ雑種が又マウスにおいてペヤーズパッチを定着させることが示された（ハーマン、A.W.他、インフ ェクト．及びイミュン．22:763（1978））。もしこれらのキャリア細菌が病原性生体からの組み換え遺伝子を含みイクスプレスすると、その病原から説明生産された抗原遺伝子産物に対する抗原が誘発される。あろう。組み換えDNA遺伝子技術の出現によって、特異性抗原が生産されるユニークワクチンを総合的に発生させることが、病因因子によってでなく、その抗原に関して遺伝子をイクスプレッシングすることができる細菌の他の宿主菌株によって、今可能となっている。抗原が哺乳類の宿主の抗原を用いて交叉反応しよって自己免疫の誘発を相乗作用する可能性があるとき、その遺伝子を変更する組み換え遺伝子技術を使用することが又可能でありその結果影響を及ぼす交叉反応抗原決定郡は生産されない。よって組み換えDNA技術は脊椎動物宿主を用いた交叉反応をなし得る又は自己免疫状態を誘発し得るいかなる物質も有しないワクチンの発生のために使用され得る。
生体、特にキャリア細菌として機能し得るサルモネラを準備する方法は、WO 89/03427（1989年４月20日発行）にて記載され、米国シリアルナンバー07/251,304において、1988年10月３日に出願され、それは共通に所有されている。これらの引例の双方はここで引用によって合体される。一般に、サルモネラは、その酵素が重要な細胞壁構造成分の生合成において過程に触媒作用を及ぼす、細胞生存に重要な酵素を符号化する染色体遺伝子において突然変異を引き起こすとみなされている。染色体外の遺伝的要素、例えば組み換えベクターは突然変異株細胞に導入される。この遺伝的要素は自生酵素に関する機能的な置換である酵素を符号かする第１の組み換え遺伝子を含むが、その第１の組み換え遺伝子は欠損染色体遺伝子を置換し得ない。第１の組み換え遺伝子は構造的に所望の産物を符号化する第２の組み換え遺伝子に連鎖されており、それはキャリア微生物においてイクスプレスされるべきものである。第１の組み換え遺伝子の喪失はその細胞が第１の組み換え遺伝子のイクスプレッションによる産物が欠けている環境にあるときその細胞を溶解させる。
重要な細胞壁構造成分の生合成において過程に触媒作用を及ぼす、細胞生存に重要な酵素を符号化する遺伝子の数は、例えばasd遺伝子によって符号化されるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（Asd）に関する技術において知られている。Ｓ．タイフィ利用トランスポゾン突然変異生成のasd遺伝子において遺伝子欠損突然変異を導入する方法が例に示されている。無毒性キャリアＳ．タイフィにおいてイクスプレスされるべき抗原を符号化する遺伝子に連鎖された、asd遺伝子に関する機能的置換をキャリーする遺伝的要素の構造が又例に示されている。
本発明が局所免疫が重要でありかつ防御の第１線となる可能性のある細菌、菌類、寄生生物、又はウイルス病因子に対する効果的なワクチンの開発に広く適用できることは明らかである。いくつかの例はトラコーナクラミジアによって引き起こされる眼の伝染病のみではなくペスト菌によって引き起こされる肺ペスト、淋菌によって引き起こされる淋病、梅毒トリポネーマによって引き起こされる梅毒、及び性病の制御に関するワクチンである。咽喉炎又は心臓病を引き起こす種のような、グループＡ及びグループＢの双方からの連鎖状球菌、骨膜炎 菌、肺炎マイコプラスマ、インフルエンザ菌、百日咳 菌、ヒト型結核菌、らい菌、ボルデテラアビウム、大腸 菌、連鎖球菌エキ、肺炎球菌、ウシ流産菌、パスツレラ ヘモリティカ、コレラ菌、赤痢菌種、及びレジュネラニ ューモフィラ菌がそれらから遺伝子から得られる本発明の範囲内の細菌の更なる例である。インフルエンザウイルスに対して生産されているようなウイルスワクチンは又本発明によって包含される。ウイルスワクチンは又、例えばパポウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、ミクソウイルス、パラミクソウイルス、又はレトロウイルス綱からの他のウイルス、DNA及びRNAウイルスの夫々に対しても製造され得る。病原性菌類、原生動物、及び寄生生物による伝染病に対して防御するワクチンは又本発明によって熟慮される。
更なる実施例において、ワクチンの免疫原性成分が宿主のアレルゲンであるときそのようなワクチンはアレルギーの宿主を特別に知覚鈍麻させるように設計されたエクスポージャー養生において使用され得る。
その実施例の一つにおいて、本発明は病原性微生物の生無毒性派生物を含む脊椎動物又は無脊椎動物の免疫化のためのワクチンとして説明し得、該派生物は機能的なアデニル酸シクラーゼ及びcAMP受容タンパク質を生産し得ず該動物の病原である又は該動物のアレルゲンを生産する生体から派生される組み換え遺伝子をイクスプレッシングし得る。
更に他の実施例において本発明の無毒性微生物は様々な宿主タンパク質の合成のためのベクターとして使用し得る。本発明の無毒性微生物は宿主への導入の後にGALT,腸管膜リンパ腺及び脾臓を含む様々な免疫担当構造をトラバースし得るため、そのような細菌は様々な免疫抑制産物をターゲットするために使用され得る。よって、免疫抑制タンパク質又はペプチドを符号化する一又はそれ以上の遺伝子がその微生物がテイクアップしたときに適当な免疫担当組織における滞留が宿主における免疫応答を抑圧、促進又は一時的変位させる組み換え産物をイクスプレッシングし得るような無毒性微生物へ組み換えで導入し得る。免疫抑制分子の例は、コロニー刺激因子（大食細胞、顆粒細胞、又は混合された），マクロファージケモトキシン、マクロファージ抑制因子、白血球抑制因子、リンフォトキシン、芽球化因子、インターフェロン、及びインターロイキンを含むがしかしそれに限定されない。
本発明の更に他の実施例はここで熟慮された無毒性微生物の様々な生理学上の機能（即ち、成長率、血圧、他）を刺激又は抑制する可能性のある薬物学的活動性産物の送出及び生産のための使用である。
上記の全てを熟慮する実施例において、本発明の主題はcya及び／又はcrp遺伝子における突然変異をキャリーするＳ．タイフィの無毒性菌株である。
cdtにおける突然変異株、及び／又はキャリア微生物における突然変異株をも含むＳ．タイフィのcya及び／又はcrp突然変異株の製造は他の知られた技術を使用して又完成され得る。これらの技術は例えば突然変異生成の標準技術及び／又は組み換えDNA技術の使用を含む。所望の突然変異株が表現型特徴に基づいて選択され、それらのいくつかは例において後に述べ、それらは表８に示される。本発明のこれらの実施例における各々の用語は下記の記載によって分析される。
免疫原性因子によって、免疫系の一又はそれ以上の機能が増加され免疫原性因子に差し向けられるように、生きた生体の免疫系を刺激するために使用される因子が意味される。免疫原性因子はワクチンを含む。免疫原性因子は、知られた技術を使用して、分離された多クローン性抗体及び単クローン性抗体の夫々の抗体の生産に使用され得る。
ワクチンによって将来の害に対する防御が提供されるように生きた生体の免疫系を刺激するために使用される因子が意味される。免疫化はＴリンパ球を殺しかつ又他の細胞（例えば食細胞）を生体内でそうさせるように活性化し得、生体がそれまでに作用を受けた病原又は抗原に対して差し向けられる連続したハイレベルの抗体及び／又は細胞性免疫応答を誘発する過程を呼ぶ。「免疫系」という語は異物の存在への単細胞生体の反応、例えばインターフェロン生産を包含し得るが、本出願においてはその語はそれによって多細胞が生体の細胞又は生体の細胞外液に侵入する抗原物質に対する抗体を生産する解剖学的特徴及び機構に限定される。そのように生産される抗体は、免疫グロブリンA,D,E,G,又はＭのような免疫綱のどれでもに属し得る。個別の興味のものであるのは、本発明のワクチンはIgA生産を刺激するものに限定されないが、これが温血動物の分泌系によって生産される免疫グロブリンの原理であることから免疫グロブリンＡ（IgA）の生産を刺激するワクチンである。例えば、ここで説明される自然のワクチンはIgA:〕形成、例えば細胞及び体液性免疫に加えて広い範囲の多の免疫応答を生産するようである。抗原に対する免疫応答は良く研究され広く報告されている。免疫学の調査はバレット、ジェイムス、T.免疫学の教科書：第４版、C.V.モスビー会社、セントロウイス、MO（1983）において与えられ、その全ては引用によって合体される。
脊椎動物は脊椎動物亜門、魚類動物、両生類動物、爬虫類動物、鳥類動物、及び哺乳類動物を含むせき索動物門の一次門のどれでものメンバーであり、それらの全ては分節骨又は軟骨性脊柱によって特徴付けられる。全ての脊椎動物は機能的な免疫系を有し抗体の生産によって抗原に応答する。よって全の脊椎動物はワクチンに応答し得る。ワクチンは人間又は犬（狂犬病ワクチン）等の哺乳動物に非常に一般的に与えられているが、魚類動物及び鳥類動物等の商業的に飼養されている他の綱の脊椎動物に関するワクチンも、その種がここで説明されていれば、本発明の範囲内にある。
その脊椎動物を除いた動物界のどのようなメンバーも無脊椎動物である。そのような動物は無脊椎動物門を構成し背骨又は脊柱を有しない。この分類は魚類動物、両生類動物、爬虫類動物、鳥類動物及び哺乳類動物を除く全ての動物を含む。多くの無脊椎動物が抗原刺激への原子免疫応答をイリサイティングし得哺乳動物に感染させ本発明によってここで開示されている同じ微生物によって影響されやすい。そのような無脊椎動物の典型は甲殻類及びモルーセス及び他の関連動物である。無脊椎動物の防御におけるワクチンの使用はここまで良くは記載されていないが、等業者は本発明がそれらの原子免疫系の使用によって無脊椎動物にも適用可能であることを理解するであろう。例えば、及び本発明によって、甲殻類のサルモネラによる感染症に対する影響されやすさはサル モネラ種の無毒性菌株の導入を許容しそれらよって原子免疫系が応答するためのポテンシャルを提供するであろう。よって、無脊椎動物を感染させることができる病原性微生物の無毒性派生物の病原に対する該無脊椎動物に存する免疫系からの応答を刺激する使用は本発明の範囲内にある。
本発明のワクチンを用いて取り扱われる「個体」はここで全ての脊椎動物、例えば在来鳥類動物、特に農業的重要性のものを含む哺乳動物を含むものとして定義される。更に、軟体類及びある他の無脊椎動物が原子免疫系を有し「個体」に含まれる。
本発明の一実施例は病原又はアレルゲンに対する抗体応答に使用される遺伝子産物キャリアとしてのGALT又はBALTに付着し、そこに侵入し、そこで生存する病原微生物の無毒性派生物の使用である。無毒性はその属又は種の微生物が病原としてもう機能し得ないということを意味するのではなく、使用されている個々の微生物が取り扱われている個々の動物に関して無毒であるということを意味する。その微生物は通常病原性であるが無毒性である菌株に属しているべきである属又は種にまで属している可能性がある。病原性によって病気を引き起こす又は通常の生理学的機能を損ない得る能力が意味される。無毒性菌株は通常その毒性病原性カウンターパートと組み合わされた病気の全組を含むことが出来ない。ここで使用されている微生物は細菌、原生動物、及び単細胞菌類を含む。
遺伝物質を第１の生体から通常遺伝物質を第１の生体を用いて交換しない第２の生体に転移する技術が急激に膨張する組み換えDNA技術の結果最近広く得られるようになった。本出願において、一生体から第２へ第２の生体の再生産が同じ遺伝物質を含むディセンデントを起こすように転移された遺伝物質が組み換え遺伝子と呼ばれる。用語遺伝子はここでどんな遺伝の生物単位をも表現するその最も広い意味において使用されている。組み換え遺伝子は親生体に存するような完全な遺伝子である必要はなく、それは高分子、例えば機能するポリペプチドの生産を生産し又は抑制することができた。その遺伝子は単に抗原産物の生産におけるガイドとして使用されるテンプレートとして役に立つことが必要である。その産物はその親生体におけるその正確な形において見出されなかったものの一つであってもよい。例えば、100アミノ酸残基よりなるポリペプチド抗原に関して暗号づけする機能的遺伝子は75のみ又は100ものアミノ酸よりなるペプチドが宿主細胞の細胞機構によって生産されるように部分的にキャリア微生物に転移されてもよい。しかし、もしこの遺伝子産物が親生体に存する同様な抗原に対する抗体の形成を引き起こすであろう抗原である場合、その遺伝子は本発明において定義された用語遺伝子の範囲内にあると考えられる。その代わりに、もし個々の抗原のアミノ酸配列又はその破片が知られている場合、そのDNA片又はそのアナログをオートメイテッド遺伝子シンセサイザー又は同様のものによって化学的に合成し該DNA配列を適当なイクスプレッションベクターに導入することが可能である。そのスペクトルの他端においていくつかの遺伝子産物に関して暗号づけするDNAの長い節があり、その一つ又は全てが抗原性である得る。よって、ここで定義され請求されているような遺伝子は抗原を生産し得る遺伝のどんな単位でもある。その遺伝子は染色体、核外遺伝子、又はウイルスオリジンのものである得る。
遺伝子を免疫応答の誘発において効果的にするために、その遺伝子はイクスプレスされなければならない。遺伝子のイクスプレッションはその遺伝子の構造（DNAベースの配列）において固有の情報がRNA分子、ポリペプチド又は他の生物分子の形における物理的産物にその遺伝子が位置する細胞の生化学的機構によって形質転換するということを意味する。そのように生産された生物分子は遺伝子産物と称される。ここで使用されている用語遺伝子産物は遺伝子の制御の下で起きる生化学反応の結果生産されるどんな生物産物をも呼ぶ。遺伝子産物は、例えばRNA分子、ペプチド、又は酵素の制御の下で生産される産物又はその遺伝子の最初の産物、即ち代謝産物である他の分子であってもよい。例えば、遺伝子はその遺伝子が見出された元の細胞の外側の環境においてグリカンの形成を制御する酵素へリボソームの動作によって翻訳されるRAN分子の合成を最初に制御してもよい。そのRNA分子、酵素、及びグリカンはここて使用されている用語としての全ての遺伝子産物である。糖タンパク質及び多糖のような、多くの多種の遺伝子産物ばかりではなくこれらのどれも動物の免疫系に導入されたら抗原として作用する。糖タンパク質及びリポタンパク質を含むタンパク質遺伝子産物はワクチンにおける抗原として使用するのに好ましい遺伝子産物である。
ワクチンを抗原の生産において効果的にするために、抗原物質がワクチン接種された動物の抗原生産機能が活動し始めるように放出されなければならない。よって、その遺伝子産物の微生物キャリアはその動物に導入されなければならない。前述の如くGALT又はBALT細胞の好ましい応答を刺激するたに、その微生物又は遺伝子産物の導入は、静脈、筋肉、皮下注射又は乳房内又は陰茎内又は膣内投与のようなワクチン投与の他の方法が可能であるが、経口投与、胃挿管法によって又はエアロゾルの形でのようにその腸又は気管支に直接導入されることが好ましい。
無毒性微生物がキャリア微生物として使用されととき、そして一旦そのキャリア微生物が動物内に存したとき、その抗原はその動物の免疫系で役に立つようになる必要がある。これはそのキャリア微生物がその抗原分子が放出されるように死ぬことによって完成される。もちろん、溶解無しにその周辺質の内容物を放出する「漏出」無毒性突然変異株の使用が又可能である。その代わりに、その細胞の死の前に外部環境へのそのキャリア細胞によって得ることができるようにされるであろう抗原の生産を制御する遺伝子が選択されてもよい。この方法においては、ワクチン接種された動物において、例えばそのペヤーズパッチにおいて生存しそして抗原を生産し続け、それによって連続的に抗体形成を誘発する生存可能な微生物を使用することが可能である。これらの環境の下の好ましい遺伝子産物は細胞膜を介して外部環境へ転移される産物又はその遺伝子産物の全てまたは部分がその環境に曝されるように外膜に付着又は埋設される産物である。この後者種の遺伝子産物の典型は通常それに対して防御が所望される生体の表面上で見出される抗原である。もしこれらの抗原が通常の方法で細胞表面に輸送された場合、その抗原に対する抗体形成が強化される。
抗原を他の病原からGALT又はBALTへ送出するという病原の使用はもしそれが仮にそのような病原がペヤーズパッチ又はBALTを定着させる能力の保有の間に無毒性とされ得るというような事実に関するものでは無い場合不適当となるであろう。
そこから組み換え遺伝子が派生する生体はワクチン接種されている動物のどんな病原であってもよく又その動物のアレルゲン又は他の抗原を生産した生体であってもよい。アレルゲンはアレルギー性反応を引き起こす物質であり、この場合それらに対してワクチン接種される動物におけるものである。動物のふけ及び花粉等の多数の異なる物質がアレルゲンとなり得、個々の動物のアレルギー性反応はどのような個々のアレルゲンに対するかによって異なる。通常アレルギー性反応を示す動物においてアレルゲンに対する寛容を誘発することが可能である。寛容を誘発する方法は良く知られておりそして一般に増加する供与量におけるその動物へのアレルゲンの投与よりなる。寛容誘発の更なる記載は前に引用したバレット教科書において与えられる。最後に宿主生体それ自体は他の薬物学的な活動物質に関する免疫抑制遺伝子がそのベクターによってイクスプレスされているときに遺伝物質の源として役に立つ。
上に開示された種の生ワクチンの動物への投与はどのような知られた又は標準の技術によってもよい。これらは経口摂取、胃挿管法、又は気管支−鼻−眼噴霧を含む。これらの全ての方法は生ワクチンがGALT又はBALT細胞に容易に到達し抗体形成を誘発することを許容し投与の好ましい方法である。静脈注射等のそのキャリア微生物がその動物の血流に到達することを許容する他の投与方法も許容され得る。静脈、筋肉、又は乳房内注射は本発明の他の実施例を用いて、後述する如くに又許容され得る。
投与の好ましい方法が経口摂取、エアロゾル噴霧及び胃挿管法であることから、好ましいキャリア微生物はワクチン接種されている動物の腸又はブロンキーのリンパ上皮構造のどれでもに付着し、侵入しそこで生存する種に属するもにである。これらの菌株は腸病原性菌株の遺伝的操作によって生産される腸病原性菌株の無毒性派生物とするのに好ましい。ペヤーズパッチに付着し、侵入しそこで生存し、よって直接IgAの生産を刺激する菌株が最も好ましい。動物においてこれらはサルモネラの特定な菌株、及びペヤーズパッチへ帰るサルモネラ−Ｅ．コリ雑種を含む。
組み換えDNA技術は今十分に良く知られており日常の手順として考えられるように広く広まった。非常に一般的で広い用語いおいて、この方法は、遺伝物質か又はより通常には遺伝物質の部分の、その転移された遺伝物質がそれが転移された先の生体の遺伝物質の一部となるように一生体から第２の生体への転移よりなる。これは通常最初の核外遺伝子又は親染色体のいずれかからの親生体からのDNAの小さい破片の獲得よりなる。核外遺伝子（又は染色体外要素と称される）はその細胞の染色体から物理的に分離された遺伝単位である。DNAはどのようなサイズのものでもよくしばしば特定のベースペア部位においてDNA分子を分割するように作用する制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用によって得られる。組み換え分子を形成するための核外遺伝子、ファージ又はコスミッドベクターへの結さつに続きその組み換え分子はエレクトロポレーションを含む形質転換（外部環境からの裸のDNAの取込みであり、それはカルシウムイオンのような様々な因子の存在によって人為的になされ得る）のような様々な手段によって宿主細胞に転移され得る。組み換えDNAが形質導入ファージのようなファージ又はコスミッドベクター内でパッケージされる形質導入等の他の方法も又適用可能である。一旦組み換えDNAがキャリア細胞内にあると、それは分離された破片（一般に完全な伝達された核外遺伝子の真）として存在し続け得るか又はそれは宿主細胞染色体へ挿入され細胞分裂の間のその染色体を用いて再生されて得る。
転移遺伝物質は相対的にまっすぐであるが、結果的にどの転移がイクスプレスされた遺伝子に到るのかを予測することは未だに可能ではない。この選択過程は、しかし、本発明に対してどのような困難も与えない。宿主微生物が転移された遺伝子をイクスプレスしそれによって抗原を生産しなければならないことから、「ショットガン」アプローチがうまくゆく。抗体は所望の抗原、例えば病原微生物からの細胞膜の破片に対して標準の技術によって最初に生産される。その抗原の源である生体からのDNAはエンドヌクレアーゼによって多数破片へ分割され、そしてその破片はランダムに病原抗原に対する抗体を用いたそれらの反応によって容易に確認し得病原から抗原をイクスプレスするキャリア微生物に挿入される。抗原イクスプレッシング微生物は選択され所望の組み換え生体を与えるためにクローンされ得る。ショットガンクローニングは良く知られており、マニチアティス、T.、他、分子クローニング、第２版、コールドスプリングハーバー研究所（1989）において詳述されており、それはここで引用によって合体される。遺伝子転移の技術は本発明の部分として考慮されず、無毒性微生物においてイクスプレスされる生体からの遺伝子よりなる組み換え生体を生産し得るどのような方法も十分である。
その種が通常遺伝情報を交換する場合接合、形質転換又は形質導入等の遺伝子転移のより古典的方法が使用され得る。
無毒性微生物の派生物は又本発明の範囲内にあると熟慮される。派生によって性的、無性的に派生される後代及び単一又は多数ベース置換、遺伝子欠失、挿入又は機能的アデニル酸シクラーゼ及び／又はcAMP受容タンパク質及び／又はcdt遺伝子のイクスプレッションの自然に発生する毒性核外遺伝子を用いた又は用いない生産に対する無能性を保有する逆位を含む無毒性菌株の突然変異株が意味される。例えば4062及び4064のような菌株はここで菌株をが従う経口接種を介して菌株に追随するための便利な標識として使用されてきたナリジクス酸耐性を与えるgyrA突然変異をキャリーする。しかし、薬剤耐性はワクチンとして素養される菌株にとって望まれる属性ではない。よってgyrA突然変異は野性型gyrA＋（ナリジクス酸に対する感受性を与える）の菌株への近接して連鎖されているTn10の遺伝に関する選択による形質導入そしてフザリク酸耐性に関する選択を用いてgyrA ^- 対立遺伝子をキャリーする親菌株上に増殖されたファージ溶解産物を用いた形質導入によるTn10の除去によって容易に除去され得る。
必要な供与量はその遺伝子産物の抗原性によって異なるであろうし単に存在するワクチンの免疫応答典型を誘発するのに十分な量であることが必要とされるであろう。日常の実験はその必要な量を容易に確立するであろう。多数倍の供与量が所望レベルの防御の提供に必要なように使用される。
製薬のキャリア又はそこでそのワクチンが懸濁又は溶解する賦形剤がどのような溶剤又は個体であり得又は接種された動物に対して無害でありキャリア生態又は抗原性遺伝子産物と適合する物質において包囲され得る。適当な製薬のキャリアが技術において知られており、例えば通常塩類液及び生理的濃度における又はそれに近い濃度における他の無害塩等の液体キャリア、及び滑石又はショ糖等のそして飼養又は農場動物へ又合体され得る個体キャリアを含む。望ましければアジュバントを抗原性の増強のために付加され得る。気管支を介した投与に使用されるとき、ワクチンはエアロゾルの形であることが望ましい。適当な製薬キャリア及びアジュバント及び供与様式の準備が、例えばレミングトンの製薬化学、第17版、（ゲナロ、Ed.,マック出版会社、イーストン、ペンシルバニア、1985）に説明されている。
病原派生遺伝子産物を用いた免疫化は又は病原からの組み換え遺伝子によってスペシファイされた遺伝子産物をイクスプレスするキャリアとして作用する病原微生物の無毒性派生物を用いた前の免疫化に関連して使用され得る。そのような腸管外免疫化はその病原派生遺伝子産物に対する分泌免疫系がGALT又はBALTのリンパ系細胞を刺激するためのその病原派生遺伝子産物をイクスプレッシングするキャリア細胞を用いた免疫化によってプライムされるやいなや分泌免疫応答のイクスプレッションを増強するブースターとして役に立ち得る。その増強された応答は第２の、ブースター、又は既往応答として知られその結果宿主の延長された免疫防御がなされる。ブースター免疫化は有益な結果と共に多数回繰り返され得る。
上記の開示は本発明の概略を説明する。引き続くここに単に例証の目的で提供され特記されない限り限定が意図されない特定例の参照によってより完全な理解が得られ得る。
例
例１
本例はcAMP合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入による無毒性細菌の分離及び利用及び表現型の安定、完全無毒性及び高免疫原性を与える突然変異を用いた菌株の確認を説明する。
細菌菌株。大腸菌及びネズミチフス菌菌株が表1.A.及びB.に記載される。それらは５％グリセロールを含む１％バクト−ペプトン内に懸濁され−70℃でデュープリケートにおいて貯蔵のためにドライアイス−エタノールで高速凍結され更に又通常使用のために−20℃て貯蔵するために50％グリセノールを含む１％バクト−ペプトン内で懸濁される凍結培養として保存された。
培地。通常培養のための複合培地はＬ肉汁（レノックス、ウイルス学 １:190−206,（1965））及びルリア肉汁（ルリア及びブロウス、Ｊ．バクテリオル.74:461−476,（1957））であった。ディフコ寒天がルリア肉汁にベース寒天に関して1.2％及び軟寒天に関して0.65％付加された。ペナセイ寒天が細菌の通常のエニュメレーションのために使用された。醗酵が適当な炭水化物の１％最終濃度を用いてマッコンキーベース寒天又はエオシンメチレンブルー寒天（カーティス、遺伝学 58:9−54,（1968））の補足によって評価された。
合成培地は最小液体（ML）及び前述（カーティス、バ クテリオル 89:28−40,（1965））の如くの適正レベルでの栄養素を用いて補足された最小寒天（MA）であった。ゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）（カーティス、1965 前に）が通常希釈液として使用された。
形質導入。細菌ウイルスP22HTintが通常標準方法（ダビス他、「人．ゲネットに関して.Eng.Adv.細菌遺伝学」。コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、NY,（1979））を使用した形質導入に関して使用された。供与菌菌株の夜通しの培養は予め温められたルリア肉汁に1:20で希釈され、37℃での振とうを用いて60分間成長させられそして0.01の多重度でP22HTintを用いて感染させられた。その感染交合は略15時間夜通し振とうされ、クロロホルムが37℃で更に10分間の振とうを増して許容し、懸濁がセントリフュージ（ソルバル RC5C,SS−34ローター、7,000rpm,10分間）し細菌デブリを除去した。ファージ（ca.10¹⁰/ml）を含む上澄みが４℃でクロロホルム上に貯蔵された。12.5μg/mlの濃度に対するテトラサイクリンがTn10挿入及びTn10^-誘発突然変異の形質導入の選択に使用された。
Tn10の喪失に関するフザリク酸選択。マロイ及びヌン（Ｊ．バクテリオル．145:1110−1112,（1981））によって説明された培地及び方法が使用された。Tn10誘発突然変異は37℃で12.5mg テトラサイクリン/mlを含むＬ肉汁内で略5x10⁸CFL/mlまで夜通し成長した。培養はそこで略2x10⁹力価までテトラサイクリン無しの予め温められたＬ肉汁に1:40希釈され37℃で通気された。BSGで希釈された適当多数の細胞（即ち、10⁷乃至10⁸）がフザリク酸含入培地上に載置され48時間37℃でインキューベートされた。フザリク酸耐性隔離集団が同じ選択培地上で精製された。単一隔離集団が採集され成長させられそして12.5μｇテトラサイクリン/mlを用いて及び用いずペナッセイ上でテトラサイクリン感受性に関して試験された。
マウス。雌BALB/cマウス（生後６乃至８週間）（サクソ、オマハ、NB）が感染性及び／又は免疫化実験に関して使用された。動物は実験に使用される前に１週間隔離室に置かれる。実験マウスはワイヤフロアを用いたナルゲネフィルターカバードケージに置かれた。食料と水は不断で与えられた。動物室は22乃至23℃で12時間照明で保持された。
動物感染性。Ｓ．タイフィムリウム菌株の毒力は経口（p.o.）又は腹腔内（i.p.）接種に従って決定された。マウスにおける接種に関する細菌はＬ肉腫内で37℃でスタンディングカルチャーとして夜通し成長させられた。これらの培養は予め温められたＬ肉腫に1:50希釈され略0.8乃至1.0のOD₆₀₀まで37℃で略４時間通気された。その細胞はBSGにおける懸濁に続くソルバルRCTC遠心器において４℃で10分間、7,000rpm、GSAローターでの遠心沈澱法によって50フォルド濃縮された。力価決定に関してペナッセイ寒天上にそしてCya/Crp表現型を確かめるために１％マルトースを用いたマッコンキー寒天上に適当な希釈溶液が置かれた。Ｓ．タイフィムリウムを用いた全てのp.o.接種に関して、マウスは感染の前に４時間食料と水が与えられなかった。それらはそして30mlピペットマンP20を使用したBSG内に懸濁された20μｌのＳ．タイフィムリウムのp.o.フィーディグの10乃至15分前にピベットマンP200を使用して10％（w/v）重炭酸塩ナトリウム30mlが与えられた。食料と水は経口接種の30分後に戻された。マウスの罹患率及び死亡率が30日の間観察された。アンファステッドBALB/cマウスの腹腔内接種が26ゲージ3/8"ニードルを使用してBSGに希釈された100μｌのＳ．タイフィムリウム細菌懸濁を送出するために実行された。マウスの罹患率及び死亡率は30日の間観察された。
防御免疫の評価。最初の実験において、どのようなＳ．タイフィムリウム突然変異株菌株にによる感染にもかかわらず30日間生存したどのようなマウスも野性型マウス−毒性Ｓ．タイフィムリウム親菌株を用いた10³乃至10⁴倍LD₅₀供与量をp.o.経路にて31日に挑戦させられた。その後、マウスのグループは様々な毒性突然変異株の供与量によって経口的に免疫化されそして最初の免疫化の後に様々な倍数で様々な供与量の毒性野性型親細胞に挑戦させられた。罹患率及び死亡率は実験の間通して及び野性型親による挑戦の後少なくとも30日の間観察された。
S.タイフィムリウム菌株のΔcya−12及びΔcrp−11突 然変異を用いた分離。野性型、マウスパッセージド毒性Ｓ．タイフィムリウムSL1344菌株は遺伝的に下記の如くにカーティス及びケリー（1987）によって説明されたものと同様に古典的遺伝的方法を使用してモディファイされた。手順は001037からの元のcrp−773::Tn10突然変異及びPP1002からの元のcya::Tn10突然変異の高度に毒性及びインベイシブなＳ．タイフィムリウムSL1344菌株χ3339への形質導入そして最も大きい遺伝子型安定ばかりでなくマウスにおける完全な無毒性及び最も高度な免疫原性のための多数の独立フザイク酸耐性、テトラサイクリン感受性遺伝子欠失突然変異株のスクリーニングよりなる。
crp及びcya遺伝子におけるTn10挿入の形質導入はcrp −773::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株PP1037上での高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物及びc ya::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株PP1002上での他の溶解産物の最初の製造によって促進される。結果として得られるP22HTint溶解産物はその後宿主Ｓ．タイフィムリウムχ3339に0.3の多重度で感染させそれをマルトースネガティブ表現型に関するスクリーニングを用いてテトラサイクリン耐性へ形質導入するのに使用される。そのファージ細菌感染混合は12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフロ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で20分間インキュベートされた。37℃での略26時間インキュベーションの後、P22HTint（PP1037）→χ3339感染の結果得られたテトラサイクリン耐性、マルトースネガティブコロニー及びP22HTint（PP1002）→χ3339感染の結果得られたテトラサイクリン耐性、マルトースネガティブコロニーが0.5mlBSGへ採集され同じ選択培地上に線条接種された。結果的に得られたχ3339派生物はχ3604（cya::Tn10）及びχ3605（crp−773::Tn10）と称された（表1.A.）。

菌株χ3604及びχ3605はＬ肉汁＋12.5μｇテトラサンクリン/mlで成長され緩衝生理食塩水にゼラチン（BSG）を用いて1:10希釈され菌株の100μｌサンプルはフザリク酸含入（FA）培地（マロイ及びヌン、1981）のプレート10枚上に塗布された。そのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。各プレートからの５つのフザリク酸耐性コロニーが0.5mlBSGに採集されFA培地上で精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され37℃で混濁へ成長されTn10（テトラサイクリン感受性）の損失に関してチェックされた。一つのテトラサイクリン感受性派生物が10枚のFA培地のプレーティングから選択され完全LPS（P22HTint感受性によって）、栄養素要求性又は原栄養菌性、遺伝子欠失の安定性、及びテトラサイクリン耐性のリバージョンに関して特徴付けられた。これらの過程の結果10の独立して分離されたχ3604からのΔcya突然変異株及び10の独立して分離されたχ3605からのΔcrp突然変異株及が得られた。
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。
生ワクチンとして経口投与されるべき菌株はそれらの無毒性及びそれらり免疫原性属性に関する完全な安定性を有しなければならない。10の独立したΔcya突然変異株及び10の独立したΔcrp突然変異株の各々の50フォルド濃縮された培養及び様々な希釈（略10⁹,10⁷,10⁵,10³CFU/プレート）が0.5％のそれらの成長を支えることのないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを含む（22μｇシステイン/ml及び22μｇアルギニン/mlを用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされ、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。一双プレートの内の１セットが紫外線照射（５ジュール/m²/秒）され暗がりで37℃でインキュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて37℃でインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は48時間成長期間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がテトラサイクリン感受性野性型親菌株に関して観察され得たよりも高頻度でフザリク酸耐性Δcya及びΔcrp突然変異株から回復され得たかどうかに関して研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
Δcrp及びΔcya突然変異株の毒性及び免疫原性。結果として得られた10のΔcrp及び10のΔcya突然変異は最低の毒性及び外皮（スクラフィ対円滑）の外観、食欲、活動性（高低）によって示される如くの病気症候学を決定するために経口的接種によってBALB/cマウスにおいてスクリーニングされた。グループ当たり５匹のマウスが独立したΔcya又はcrp遺伝子欠失突然変異株の各々の略10⁹CFUを用いてp.o.接種された。動物は上記判断基準で採点され30日の実験で生存者は野性型毒性親菌株χ3339の10⁸CFUを用いて挑戦させられた。cya又はcyp遺伝子欠失突然変異株によって感染された20グループの内の３つにおいて、５匹のマウスの内の５匹がΔcya−12，Δcrp− 11及びΔcrp−10突然変異株による感染にもかかわらず生存し又野性型挑戦の10⁴LD₅₀に対して完全に防護された。特に一グループ、Δcrp−10突然変異株、は無毒性、免疫原性及び安定性において匹敵するものがなかった。これらの実験の後、マウスはΔcrp−10突然変異株（例3,表６参照）のp.o.又はi.p.を与えられたどのような供与量によっても全く影響を及ぼされていないようであった。
選択された突然変異株菌株の特性。Δcya−12，Δcrp −10及びΔcrp−11の夫々のχ3615,χ3622及びχ3623は少なくとも毒性、高免疫原性及び極度に安定な表現型及び遺伝子型であると判断された。３つの菌株の表現型特性上のデータは表２に示される。表３は毒性野性型親χ3339及び夫々cya::Tn10及びcrp−773::Tn10突然変異を用いたχ3604及びχ3605菌株を用いた結果の比較におけるこれらの菌株の無毒性及び免疫原性上のデータを示す。親χ3339におけるhisG突然変異による要求されるヒスチジンに加えて、Δcrp−10突然変異がアミノ酸アルギニン及びシステインに関するχ3622要求上で課された。この観察に関するベース及びΔcrp−10突然変異の特性の他の分析は例３で与えられる。

例２
本例は無毒性細菌の構造を遺伝子欠失突然変異影響cAMP合成の導入及び表現型の安定性、完全無毒性及び高免疫原性に関する二つの遺伝子欠失突然変異を用いた菌株の利用と特徴付けによって説明する。
細菌菌株。使用されている大腸菌及びネズミチフス菌菌株は表1.A.及びB.に記載されている。これらの菌株の維持と貯蔵は例１に記載されている如くである。
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認に関する複合培地は例１に説明されている如くである。
Tn10の損失に関する形質導入及びフザリク酸選択。培地及び方法は例１に述べた如くである。
動物感染及び防護免疫の評価。Ｓ．タイフィムリウム菌株の毒性及び免疫原性は例１にて説明された如く決定された。
Δcya−12及びΔcrp−11遺伝子欠失突然変異を用いた S.タイフィムリウムの構造。効験の見地からの最良のワクチン菌株は意味のある定着能力及び侵入性を示す高毒性菌株の弱毒化によって得られるようである。SL1344（χ3339）、UK−１（χ3761）及び798のようなこれらの高病原性Ｓ．タイフィムリウム野性型菌株の選択に関する判断基準はマウス毒性アッセイ、抗生物質感受性、毒性核外遺伝子の保有、遺伝的操作（細菌ウイルスP22HTint又はP1感受性、形質転換能力及び動員された核外遺伝子を受け取る容易性）の容易性、及びコリシン感受性において低LD₅₀値（表４参照）を含んだ。
野性型毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株SL1344（χ3339）,793及びUK−１（χ3761）はカーティス及びケリー（1987）において記載されたものと同様の古典的遺伝的方法を使用して遺伝的に下記の如くに一時的変異された。手順はＳ．タイフィムリウムSL1344（例１にて説明した如く）においてΔcya−12又はΔcrp−11突然変異の近くでトランスポゾンTn10（テトラサイクリン耐性を符号化する）の載置によって分離され特徴付けられたcrp及びcya遺伝子の動員遺伝子欠失及び連鎖された形質の高毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株UK−１ χ3761,798及びSL1344 χ3339へのテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いたP22HTint媒介形質導入を介した形質導入よりなる。何れの挿入も単独ではＳ．タイフィムリウムの毒性に影響を与えない。
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の遺伝子導入はΔcrp−11及びzic−1431::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3773上の高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物及びΔcya−12及びzid−62::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3711上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたP22HTint溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ3339,798及びχ3761へ形質導入するために使用された。
Ｓ．タイフィムリウムχ3773（Δcrp−11 zhc−143 1::Tn10）上で増殖されたP22HTintはMal^-に関するスクリーニングを用いて毒性菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージー細菌感染混合は100μｌサンプルが12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で20分間インキュベートされた。37℃で略26時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Mal^-形質導入体が同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られた798派生物はχ3825と称されUK−１派生物はχ3828と称された。菌株χ3773,χ3825及びχ3828は遺伝子型Δcrp−11 zhc−1431::Tn10（表1.B.）を有する。これらの菌株はＬ肉汁＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）へ1:10希釈され、各々の100μｌはフザリク酸含入（FA）培地（マロイ及びヌン、1981）上に塗布され、そのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは0.5ml BSGへ採集されFA培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ37℃で成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPSの存在及び栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は双方が遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc −1431::Tn10〕の遺伝子型を有するχ3876（798）及びχ3954（UK−１）及びχ3623（SL1344 Δcrp−11は元々例１にて説明した如くに分離された）（表1.B.）と称された。
Cya^-及びCrp^-突然変異株の表現型は同じ（Mal^-,Stl^-,Mtl^-,他）であるので、クローンされたcrp ^＋遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロッツ、Ｊ．バクテリオル 167:616−622（1986））を与える、核外遺伝子、pSD110,がΔcya突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔcrp突然変異を補足するために使用された。χ3623,χ3876及びχ3954のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ3670上に増殖されたP22THintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む（表1.B.）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml上でなされた。26時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Mal⁺コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋100μｇアンピシリン/ml上に精製され双方が遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−14 31::Tn10〕pSD110⁺を有するχ3938（798）及びχ3961（UK−１）並びに遺伝子型Δcrp−11 pSD110⁺を有するχ3774（SL1344）と称された。
菌株χ3774,χ3938及びχ3961はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/mlにおいて成長させられ連鎖されたΔcya−12及びzid−62::Tn10突然変異を導入するために各々は独立してχ3711上に増殖されたP22THintを用いて形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上に載置された。アンピシリン耐性（pSD110⁺）、テトラサイクリン耐性（zid−62::Tn10）、Mal^-（Δcya）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なLPS及び栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は双方が遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc− 1431::Tn10〕pSD110⁺Δcya−12 zid−62::Tn10を有するχ3978（798）及びχ3962（UK−１）並びに遺伝子型Δcrp−11 pSD110⁺Δcya−12 zid−62::Tn10を有するχ3936（SL1344）と称された。χ3936,χ3978及びχ3962の培養はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて混濁に成長させられ、BSGに1:10希釈され、そして各培養の100μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されFA培地上に精製された。精製されたFA耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS及び栄養素要求性に関してチェックされた。pSD110核外遺伝子はpSD110を消去するために二つの過程を必要とするSL1344派生物を除いてその結果アンピシリン感受性を得るこの過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は双方が遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−1431::Tn10〕Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕を有するχ4039（798）及びχ3985（UK−１）並びに遺伝子型Δcrp−11 Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕を有するχ3939（SL1344）と称された（表1.B.）。
無毒性突然変異株の遺伝子型及び表現型安定性。遺伝的形質の安定性を決定する方法は例１に説明した如くである。Δcya Δcrp突然変異による全ての遺伝子型及び表現型形質は運動性を除いて完全に安定である。機能的べん毛の合成及び運動性の表出が野性型cya及びcrp遺伝子機能に依存しているとはいえ、cfs（構成性べん毛合成）遺伝子における抑圧遺伝子突然変異がべん毛合成及び運動性がcya及びcrp遺伝子機能から独立するように容易に選択され得る。Ｓ．タイフィムリウムΔcya Δcrp菌株において、運動型突然変異株は菌株構成過程間ですでに選択された。べん毛抗原への免疫は防護的であり得るので全てのワクチン菌株の運動型突然変異株が選択された。
Ｓ．タイフィムリウムグループＢ Ｏ−抗原合成は抗血清を用いたスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、MI）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるP22HTint細菌ウイルスによって確認された。
二つの突然変異株菌株の様々な炭素源上での砂糖の醗酵及び成長は表２に記載された如くのΔcrp又はΔcya単独を用いた菌株に対して等しい。表現型は環状AMPに関する要求及びカタボリック活性に関する環状AMP受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものであった。
フザリク酸耐性テトラサイクリン感受性派生物の選択に続く構成における核過程において、テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株が親テトラサイクリン感受性野性型菌株に関して観察され得たより高頻度で回復され得たかに関する研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
マウスに関する突然変異株菌株の毒性。Ｓ．タイフィ ムリウムの毒性上の予備情報は個体マウスを10⁸突然変異株細胞を用いて経口的に感染させ罹患率及び死亡率を記録培地することによって得られた。表４はＳ．タイフ ィムリウム野性型親菌株、及びΔcya−12 Δcrp−11派生物χ3985及びχ4039を用いて経口的に感染させられたマウスの罹患率及び死亡率のデータを示す。

無毒性突然変異株を用いた免疫化の有効性。表５はＳ．タイフィムリウムΔcya Δcrp突然変異株χ3985及びχ4039のその後の完全毒性野性型Ｓ．タイフィムリウ ム細胞のLD₅₀供与量10⁴倍を用いた経口挑戦に対する免疫を誘発する能力上のデータを示す。これらの高供与量挑戦の下で、健康を維持し食し正常に成長したχ4039を用いて免疫化されたマウスを除いて多くのマウスが減少した食料消費と共にかなりの病気であることを示している。

例３
本例はcrp遺伝子及びサルモネラの毒性を又制御する付近の遺伝子を包含する遺伝子欠失突然変異を所有する無毒性細菌の分離を示す。
細菌菌株。使用される大腸菌及びネズミチフス菌菌株は表1.A.及びB.に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１にて説明した如くである。
培地。通常の細菌の培養、エニュメレーション及び確認に関する複合培地は例１にて説明した如くである。
形質導入及びTn10の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
動物感染及び防護的免疫の評価。Ｓ．タイフィムリウ ム菌株の毒性及び免疫原性は例１にて説明した如くに決定された。
Δcrp−10突然変異を用いたS.タイフィムリウムの分 離。例１にて説明した如く、10のΔcrp突然変異の内の一が（argＤの遺伝子欠失による）アルギニン及び（cysＧの遺伝子欠失による）システインに関する栄養素要求性を与えるχ3605において分離された。Ｓ．タイフィム リウムSL1344菌株χ3622における突然変異は元々Δcrp −10として参照されていたが、システインに関する栄養素要求性のために今はΔ〔crp−cysG〕−10と称される。10⁹χ3622細胞を用いて経口的に感染された５匹のBALB/cマウスのグループは健康を維持し総合的に影響を及ぼされなかった（表３）。更に、これらのマウスは10⁸親χ3339細胞を用いた経口挑戦に対する高レベルの免疫原性を得た（表３）。
菌株の系列はχ3622の表現型特徴の各々を独立して評価するように構成された。クローンされたcrp ^＋遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドゴロゴッツ、Ｊ．バクテリオル.167:616−622（1986））を与える核外遺伝子、pSD110が染色体においてΔcrp突然変異を補足するために使用された。χ3622のＬ肉汁培養がＳ．タイフィムリウム上に増殖されたP22HTintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml上でなされた。26時間後、アクピシリン耐性、Mal⁺コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋100μｇアンピシリン/ml上で精製されχ3706と称された。χ3706は経口的にマウスに接種され脾臓から再分離された。その動物通過菌株はχ3737と称された。Arg^-又はCys^-栄養素要求形質を与えない二つの他のcrp突然変異株、χ3605（crp−773::Tn10）及びχ3623（Δcrp−11）が又、夫々、形質導入によってpSD110核外遺伝子を用いて補足されχ3731及びχ3774と称された。独立してcysG及びarg突然変異をキャリーするＳ．タイフィムリウム菌株が構成されχ3910（cysG::Tn1 0），χ4063及びχ4071（arg::Tn10）と称された。
二つの他の高病原性Ｓ．タイフィムリウム菌株がΔcr p−10突然変異の導入による弱毒化に関して選択された。χ3761（UK−１）及び798は瀕死の馬及びブタから、夫々略1X10⁵CFUのマウスにおけるLD₅₀を用いて分離された毒性、侵入性菌株である。連鎖されたトランスポゾンzhc−1431::Tn10を用いたΔcrp−10の形質導入がＳ．タイフィムリウム菌株χ3712（表1.B.参照）上の高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物の最初の製造によって促進された。そのファージ溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ3761及び798へ形質導入するのに使用された。テトラサイクリン耐性コロニーがMal^-,Arg^-及びCys^-表現型に関して選択されスクリーンされ結果的に得られた798派生物はχ4246と称されχ3761（UK−１）派生物はχ4248（表１）と称された。
crp突然変異はcrp ^＋野性型対立遺伝子をキャリーするpSD110のχ4246及びχ4248への導入によって補足された。χ4246及びχ4248のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィ ムリウムχ3670上に増殖されたP22HTintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む（表１）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋110μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上でなされた。26時間後、各菌株のアンピシリン、Mal⁺コロニーが同じ培地上に採集され精製されそして双方共が遺伝子型pSD110⁺/Δcrp−10 zhc−1431::Tn10を有するχ4247（798）及びχ4262（UK−１）と称された。
S.タイフィムリウムχ3622,χ3731,χ3737、χ3774, χχ3910,χ4063及びχ4071の毒性。表６はＳ．タイフ ィムリウム菌株χ3622,χ3731,χ3737,χ3910,χ4063及びχ4071によって経口的に感染させられたマウスの罹患率及び死亡率上のデータを示す。菌株χ3737は野性型χ3339親菌株に関するLD₅₀供与量の10⁴倍を受けたマウスに関して完全に無毒性であった。30日観察期間を通してマウスは全く病気となってはいないようであった。この実験に関する制御として、χ3605におけるcrp−773::Tn10突然変異が野性型Crp⁺表現型（χ3731）へのpSD110による補足がなされそしてマウスは感染し死んだ。略1x10⁵CFU供与量はχ3731及びχ3774（pSD110⁺/ΔCrp−11）によってp.o.接種された５匹のマウスの内４匹を殺した。Cys^-及びArg^-表現型を用いた菌株の毒性を独立して試験するために菌株χ3910（cysG::Tn10），χ4063（ar g::Tn10）及びχ4071（arg::Tn10）がBALB/cマウスにp.o.接種された。χ3910,χ4063及びχ4071が同様の又はより低い供与量がp.o.接種されたときに殺した。よってΔ〔crp−cysG〕−10突然変異に関する無毒性は単にcrp遺伝子の遺伝子欠失によるものではなくargD又はcysG座の何れかの遺伝子欠失によって与えられるものではなかった。むしろ、Ｓ．タイフィムリウム毒性に関する他の遺伝子がcrp遺伝子に近い染色体の領域に局在しなければならない。

χ3622,χ3737、χ4247及びχ4262を用いた免疫化の 有効性。完全毒性野性型Ｓ．タイフィムリウム細胞のLD₅₀供与の10⁴倍を用いたその後のp.o.又はi.p.挑戦に対する免疫を誘発するχ3622,χ3737、χ4247及びχ4262の能力上のデータが表７に示されている。野性型親菌株の過度の供与量が与えられた全てのマウスは実験の30日間を通して全く病気にはなっていないようであった。よってΔ〔crp−cysG〕−10突然変異は双方がＳ．タイフ ィムリウムを完全に無毒性とし高免疫原性とする少なくとも二つの遺伝子を欠失させる。

Δcrp−14突然変異を用いたS.タイフィムリウム菌株 の分離。crp−773::Tn10の不正確な削除結果がargDからcysGに及ぶ遺伝子の欠失を発生させたため、他の手順は無毒性を与える遺伝子の位置をcrpの付近の領域に配置するよう設計された。χ3910（cysG::Tn10）の突然変異株の20の独立した欠失がフザリク酸含入培地上で選択されテトラサイクリン感受性及びマルトース負表現型に関してスクリーンされた。χ3910の20のフザリク酸耐性派生敷設の内の一は遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−14を有し、アルギニンではなくヒスチジン及びシステインに関する栄養素要求性を与えた。χ3931と称されたこの菌株は野性型crp ^＋遺伝子をキャリーするpSD110を導入するためにχ3670上で成長させられたP22HTint溶解産物を用いて形質導入された。アンピシリン耐性、マルトース正形質導入体は同じ培地上に採集され精製され結果的に得られた菌株はχ3955と称された。
S.タイフィムリウムpSD110 ⁺ /Δ〔crp−cysG〕−14 χ3955の毒性。表７は経口的にＳ．タイフィムリウムχ3955によって感染させられたマウスの罹患率及び死亡率を示す。菌株χ3955は略10⁹CFUを受けたマウスに関して完全に無毒であった。30日間を通してマウスは全く病気ではなかったようだ。
χ3955を用いて免疫化の有効性。表７はその後のχ3955の完全毒性野性型Ｓ．タイフィムリウム細胞のLD₅₀供与量の10⁴倍によるp.o.挑戦に対する免疫を誘発する能力を示す。親菌株の過度の供与量が与えられたマウスは実験の間の30日を通して全く病気ではなかったようだ。
野性型菌株χ3339に関するχ3633（Δ〔crp−cysG〕 −10）及びχ3737（pSD110 ⁺ Δ〔crp−cysG〕−10）によ る腸道、GALT及び脾臓への定着。Ｓ．タイフィムリウムχ3622及びχ3737は成長させられ例１で説明した如く生後８週間雌BALB/cマウスの経口接種のために準備された。9.4x10⁸CFU（χ3622）、1.2x10⁹CFU（χ3737）又は1.1x10⁹CFU（χ3339）によるp.o.接種の野他1,3,5及び７日経過後に犠牲となった。グループ毎に３匹のマウスがランダムに選択され、安楽死させられそして組織サンプルが収集された。各マウスからの脾臓、ペヤーズパッチ、回腸の10−cm切片及び小さい腸内容物がBSGを用いてポリプロピレンチューブ内に載置され、ブ連鎖マン組織ホモジナイザーによって均質化されそして氷上に載置された。希釈されない又は希釈されたサンプル（100μｇ）は直接マッコンキー寒天＋１％ラクトース＋50μｇストレプトマイシン/ml（χ3339及びχ3737）上に及びマッコンキー寒天＋１％マルトース＋50μｇストレプトマイシン/ml（χ3622）上に載置されそのプレートは37℃で26時間インキュベートされた。そのパースペクティブ組織における力価は各時間間隔及びサンプリングの各時間におけるグループ毎３匹のマウスに関して計算された幾何平均に関して決定された。
この分析の結果は図１に示される。χ3622において付加的に弱毒化する突然変異、それは依然としてCrp⁺（pSD110⁺）派生物χ3737において発現しているが、効果的に深い組織に定着する能力を非常に減少させることが明らかである。Δ〔crp−cysG〕−10突然変異によって欠失させられた責任のある遺伝子がそれ故cdtと称されている。χ3633及びχ3737のCdt^-表現型はΔcrp−11突然変異を有するＳ．タイフィムリウムによる又は組み合わせられたΔcrp及びΔcya突然変異（カーティス及びケリー、1987年）によるマウスのp.o.接種に引き続いて観察されるどのような脾種の不在によっても又発現させられる。菌株χ3737はχ3622よりも速く成長した。χ3622における付加的弱毒化突然変異はcrp突然変異がそうであるごとくには成長率を減少させない。
与えられる表現型に関する突然変異の分離及び分析に基づいてＳ．タイフィムリウム染色体における遺伝子順序がargD crp cdt cysGであるべき推論される。
cdt突然変異でもあるΔ〔crp−cysG〕−10又はΔ〔cr p−cysG〕−14突然変異の含有が生弱毒化サルモネラワクチン菌株の安全性を増強しながらその免疫原性を減少させないであろうことは明らかである。これは非宿主種、Ｓ．タイフィムリウム及びＳ．エンテリティディス等の侵入性サルモネラ種ばかりではなく、Ｓ．タイフ ィ、S.パラタイフィ Ａ（S.ショットムエレリ），Ｓ．パラタイフィ Ｂ（S.ヒルシュフェルディー），Ｓ．パ ラタイフィ Ｃ（全ての感染人），Ｓ．コレラエスイス（感染豚），Ｓ．デュブリン（感染牛），Ｓ．ガリナル ム、及びＳ．プロルム（双方とも感染家禽）等の宿主適応侵入性サルモネラ種に関して特に重要である可能性がある。
例４
本例はcAMP合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入及び利用及びサルモネラの毒性を深い組織の定着に影響を及ぼすことによって又制御する付近の遺伝子及び表現型の安定性、完全無毒性及び高免疫原性に関する二つの遺伝子欠失突然変異を用いた菌株の特徴によって無毒性細菌の構造を説明する。
細菌菌株。使用される大腸菌及びネズミチフス菌菌株は表1.A.及びB.に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
形質導入及びTn10の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
Δcya−12及びΔ〔crp−cysG〕−10遺伝子欠失突然変 異によるS.タイフィムリウム菌株の構造。効験の見地での最良ワクチン菌株は意味ある定着能力及び侵入性を示す高毒性菌株の弱毒化によって得られるようである。SL1344（χ3339）、UK−１（χ3761）及び798等のこれらの高病原性Ｓ．タイフィムリウム野性型菌株の選択の基準は例２にて説明した。
野性型、毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株SL1344,798及びUK−１は遺伝的に下記の如くに、カーティス及びケリー（1987年）にて説明されているものと同様な古典的遺伝的方法を使用して一時的変異された。手順は（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンTn10をΔcya−12又はΔ〔crp−cysG〕−10突然変異の近くに載置し連鎖された形質をテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いてP22HTint媒介形質導入を介して高毒性Ｓ．タイフィム リウム菌株UK−１ χ3761,798及びSL1344 χ3339へ形質導入することによってＳ．タイフィムリウムSL1344（例１にて説明した如くに）において分離され特徴付けられたcrp及びcya遺伝子の動員遺伝子欠失よりなる。Δ〔crp−cysG〕−10に連鎖されたzhc−1431::Tn10及びΔcya−12に連鎖されたzid−62::Tn10がこの目的のために使用された。いずれの挿入も単独ではＳ．タイフィムリ ウムの毒性に影響を及ぼさない。
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔ〔crp−cysG〕−10及びzic−1431::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3712上の高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物及びΔcya−12及びzid−6 2::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3711上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたP22HTint溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ3339,798及びχ3761へ形質導入するために使用された。
Ｓ．タイフィムリウムχ3712（Δ〔crp−cysG〕−10 zhc−1431::Tn10）上で増殖されたP22HTintはMal^-に関するスクリーニングを用いて毒性菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は100μｌサンプルが12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で20分間インキュベートされた。37℃で略26時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Mal^-形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られた798派生物はχ3777と称されUK−１派生物はχ3779と称された。菌株χ3712,χ3777及びχ3779は全て遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 zhc−1431::Tn10（表1.B.）を有する。χ3777及びχ3779はＬ肉汁＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）へ1:10希釈され、各々の100μｌはフザリク酸含入（FA）培地（マロイ及びヌン、1981）上に塗布され、そのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは0.5ml BSGへ採集されFA培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ37℃で成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPSの存在及び栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は双方が遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔zhc−143 1::Tn10〕の遺伝子型を有するχ3784（UK−１）及びχ3806（798）と称された。χ3622（SL1344 Δ〔crp−cys G〕−10）は元々例１にて説明した如くに分離された）（表1.B.）。
Cya^-及びCrp^-突然変異株の表現型は同じ（Mal^-,Stl^-,Mtl^-,他）であるので、クローンされたcrp ^＋遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル 167:616−622（1986））を与える、核外遺伝子、pSD110,がΔcya突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔcrp突然変異を補足するために使用された。χ3622,χ3874及びχ3806のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ3670上に増殖されたP22THintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む（表１）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml上でなされた。26時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Mal⁺コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋100μｇアンピシリン/ml上に精製され双方が遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕pSD110⁺を有するχ3901（798）及びχ3945（UK−１）並びに遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 pSD110⁺を有するχ3706（SL1344）と称された。
菌株χ3706,χ3901及びχ3945はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/mlにおいて成長させられ連鎖されたΔcya−12及びzid−62::Tn10突然変異を導入するために各々はχ3711上に増殖されたP22THintを用いて独立して形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上に載置された。アンピシリン耐性（pSD110⁺）、テトラサイクリン耐性（zid−62::Tn10）、Mal^-（Δcya）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なLPS及び栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は双方が遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕pSD110⁺Δcya−12 zid−62::Tn10を有するχ3902（798）及びχ3956（UK−１）並びに遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 pSD110⁺Δcya−12 z id−62::Tn10を有するχ3722（SL1344）と称された。χ3722,χ3902及びχ3956の培養はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて混濁に成長させられ、BSGに1:10希釈され、そして各培養の100μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されFA培地上に精製された。精製されたFA耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS及び栄養素要求性に関してチェックされた。pSD110核外遺伝子はpSD110を消去するために二つの過程を必要とするSL1344及びUK−１派生物を除いてこのその結果アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は双方が遺伝子型Δ〔crp−cys G〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕Δcya−12 Δ〔zid− 62::Tn10〕を有するχ4038（798）及びχ3958（UK−１）並びに遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕を有するχ3724（SL1344）と称された。（表1.B.）。
無毒性突然変異株の遺伝子型及び表現型安定性。遺伝的形質の安定性を決定する方法は例１に説明した如くである。Δcya Δcrp突然変異による全ての遺伝子型及び表現型形質は運動性を除いて完全に安定である。機能的べん毛の合成及び運動性の表出が野性型cya及びcrp遺伝子機能に依存しているとはいえ、cfs（構成性べん毛合成）遺伝子における抑圧遺伝子突然変異がべん毛合成及び運動性がcya及びcrp遺伝子機能から独立するように容易に選択され得る。Ｓ．タイフィムリウムΔcya Δcrp菌株において、運動型突然変異株は菌株構成過程間ですでに選択された。べん毛抗原への免疫は防護的であり得るので全てのワクチン菌株の運動型突然変異株が選択された。
Ｓ．タイフィムリウムグループＢ Ｏ−抗原合成は抗血清を用いたスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、MI）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるP22HTint細菌ウイルス感受性によって確認された。
二つの突然変異株菌株の様々な炭素源上での砂糖の醗酵及び成長は表２に記載された如くのΔcrp又はΔcya単独を用いた菌株に対して等しい。表現型は環状AMPに関する要求及びカタボリック活性に関する環状AMP受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものであった。
フザリク酸耐性テトラサイクリン感受性派生物の選択に続く構成における核過程において、テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がテトラサイクリン感受性野性型親菌株に関して観察され得たより高頻度で回復され得たかに関する研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
例５
本例は無毒性細菌の構造を表現型の安定性及び完全無毒性に関して二つの遺伝子欠失突然変異を用いてcAMP合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異及び利用及び特徴付けによって説明する。
細菌菌株。使用されるネズミチフス菌及びＳ．タイフ ィ菌株は表1.B.及びC.に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
形質導入及びTn10の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。遺伝的形質の安定性の決定に関する方法は例１にて説明した如くである。
マウス。雌CFW−１ マウス（18−20g）（チャールズリバー、ウィルミングトン、MA）が全ての感染実験に使用された。動物は実験に使用される前に１週間隔離室に置かれる。実験マウスはワイヤフロアを用いたナルゲネフィルターカバードケージに置かれた。食料と水は不断で与えられた。動物室は22乃至23℃で12時間照明で保持された。
動物感染性。Ｓ．タイフィ菌株の毒力は去勢豚の胃粘素を用いて腹腔内（i.p.）接種に従って決定された。マウスにおける接種に関する細菌はＬ肉腫内で37℃でスタンディングカルチャーとして夜通し成長させられた。その培養は予め温められたＬ肉腫に1:50希釈され略0.8乃至1.0のOD₆₀₀まで37℃で略４時間通気された。力価決定に関してペナッセイ寒天上にそしてCya/Crp表現型を確かめるために１％マルトースを用いたマッコンキー寒天上に適当な希釈溶液が置かれた。
アンファステッドCFW−１マウスの腹腔内接種が26ゲージ3/8"ニードルを使用して15％去勢豚の胃粘素（ウィルソン ロット ＃0347A001）において懸濁されたＳ．タイフィの500μｌを送出するために実行された。その粘液懸濁はＳ．タイフィ細胞の付加に先立って10分間121゜F（15p.s.i.）オートクレービング、pH7への中性化及びml当たり３μｇのフェリックアンモニウムシトレート（シグマ、St.ロウイス、MO）の付加によって準備された。野性型親のLD₅₀値及びΔcrp−11 Δcrp−12派生物の毒性は10日間の罹患率及び死亡率の記録の後に決定された。
cya及びcrp突然変異を用いたS.タイフィ菌株の構造。野性型、毒性Ｓ．タイフィTy2（E1型）、ISP1820（46型）及びISP2822（E1型）菌株は下記の如くにカーティス及びケリー（1987）によって説明されたものと同様の古典的遺伝的方法を用いて遺伝的に一時的変異された。ISP1820及びISP2822は最近チリにおける腸チフス流行の間に分離されＳ．タイフィの標準実験室Ty2菌株より侵入的であるようである。それらの弱毒化はよってTy2から派生されるものより効能があるであろうワクチン菌株を生成する可能性がある。その構成手順はΔcya又はΔc rp突然変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンの載置によってＳ．タイフィムリ ウムSL1344において分離され特徴付けられたcrp及びcya遺伝子の動員遺伝子欠失及びテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いたP22HTint媒介形質導入を介した高毒性Ｓ．タ イフィ菌株Ty2,ISP1820及びISP2822菌株へ連鎖された形質の形質導入よりなる。crpに連鎖されたzhc−1431::Tn10及びcyaに連鎖されたzid−62::Tn10がこの目的のために使用された。いずれの挿入も単独ではＳ．タイフィム リウムの毒性に影響を及ぼさない。
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔcrp−11及びzhc−1431::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3773上の高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物及びΔcya−12及びzid−62::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3711上の他の溶解産物の最初の構造によって促進された。その結果得られたP22HTint溶解産物はそこで遺伝形質を宿主Ｓ．タ イフィTy2,ISP1820及びISP2822菌株へ形質導入するために10の感染多重によって感染させるために使用された。
Ｓ．タイフィムリウムχ3773（Δcrp−11 zhc−143 1::Tn10）上で増殖されたP22HTintはMal^-に関するスクリーニングを用いて毒性Ｓ．タイフィTy2,ISP1820及びISP2822菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は100μｌサンプルが12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で20分間インキュベートされた。37℃で略26時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Mal^-形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られたTy2派生物はχ3853と称されISP1820派生物はχ4298と称されISP2822派生物はχ3852と称された。全てのこれらの菌株は遺伝子型Δcrp−11 zhc−1431::Tn10（表1.C.）を有する。菌株χ3852,χ3853及びχ4298はＬ肉汁＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）へ1:10希釈され、各々の100μｌはフザリク酸含入（FA）培地（マロイ及びヌン、1981）上に塗布され、そのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは0.5ml BSGへ採集されFA培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ37℃で成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS及びVi抗原の存在及びシステイン及びトリプトファン（全てのその親菌株によって要求される二つのアミノ酸）に関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は全てが遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−1431::Tn10〕の遺伝子型を有しχ3877（ISP2822），χ3878（Ty2）及びχ4299（ISP1820）と称された（表1.C.）。
Cya^-及びCrp^-突然変異株の表現型は同じ（Mal^-,Stl^-,Mtl^-,他）であるので、クローンされたcrp ^＋遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル 167:616−622（1986））を与える、核外遺伝子、pSD110,がΔcya突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔcrp突然変異を補足するために使用された。χ3877,χ3878及びχ4299のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ3670上に増殖されたP22THintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む（表1.B.）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml上でなされた。26時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Mal⁺コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋100μｇアンピシリン/ml上に精製され全てが遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−14 31::Tn10〕pSD110⁺を有するχ3879（ISP2822）、χ3880（Ty2）及びχ4300（ISP1820）と称された。
菌株χ3879,χ3880及びχ4300はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/mlにおいて成長させられ連鎖されたΔcya−12及びzid−62::Tn10突然変異を導入するために各々はχ3711上に増殖されたP22THintを用いて独立して形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上に載置された。アンピシリン耐性（pSD110⁺）、テトラサイクリン耐性（zid−62::Tn10）、Mal^-（Δcya）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なLPS、Vi抗原及びシステイン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は全てが遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−1431::Tn10〕pSD110⁺Δcya−12 zid−62::Tn10（表1.C.）を有するχ3921（ISP2822）、χ3922（Ty2）及びχ4316（ISP1820）と称された。χ3921,χ3922及びχ4316の培養はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて混濁に成長させられ、BSGに1:10希釈され、そして各培養の100μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されFA培地上に精製された。精製されたFA耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS、Vi抗原及びシステイン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。pSD110核外遺伝子はその結果アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は全てが遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc −1431::Tn10〕Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕（表1.C.）を有しχ3926（ISP2822），χ3927（Ty2）及びχ4322（ISP1820）と称された。Ｓ．タイフィVi抗原合成は抗血清を用いたViへのスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、MI）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるVi II細菌ウイルス感受性によって確認された。ベン毛の合成は機能的cya及びcrp遺伝子に依存する。しかし、ベン毛がポテンシャリーに重要な抗原であるので、Δcya Δcrp Ｓ．タイフィ菌株の運動型派生物は、cf s（構成性ベン毛合成）遺伝子（シルバーマン及びシモン、Ｊ．バクテリオル．120:1196−1203（1974）における突然変異の故に、運動性寒天において選択された。χ3926及びχ3927は有ベン毛及び運動型として分離されたが菌株χ4323はχ4222のベン毛運動型派生物として選択された。
表８には砂糖の醗酵及び様々な炭素源上での成長、LPSプロフィール、Vi抗原及び平均世代時間に関して全ての突然変異株菌株の表現型特性及びそれらの親が記載されている。表現型は環状AMPに関する要求及びカタボリック活性に関する環状AMP受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものである。

無毒性突然変異株の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与されるべき菌株はそれらの無毒性及びそれらの免疫原性属性に関する完全な安定性を有しなければならない。Δcya Δcrp Ｓ．タイフィ菌株の50フォルド濃縮された培養及び様々な希釈（略10⁹,10⁷,10⁵,10³CFU/プレート）が0.5％のそれらの成長を支えるべきでないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを含む（要求されるアミノ酸を用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされたとき、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。一双プレートの内の１セットが紫外線照射（５ジュール/m²/秒）され暗がりで37℃でインキュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて37℃でインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は48時間成長期間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がその親菌株に関して観察され得たよりも高頻度で回復され得たかどうかに関して研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
マウスに関する突然変異菌株の毒性。表９はマウスχ3926又はχ3927の何れかの略50倍LD₅₀供与量の感染にもかかわらずマウスは生存するということを示しているデータを含む。Ｓ．タイフィの自然の宿主は人である。よって去勢豚胃粘素がマウスにおけるＳ．タイフィ細胞の毒性エンハンサーとして使用され、よってこのモデルシステムにおいてＳ．タイフィワクチン候補の毒性を最大限にする。

例６
本例はcAMP合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入及び利用による無毒性最近及び深い組織の定着に影響を及ぼすことによってサルモネラの毒性を制御する付近の遺伝子の構造を示す。
細菌菌株。使用されるネズミチフス菌及びＳ．タイフ ィ菌株は表1.B.及びC.に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
形質導入及びTn10の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。遺伝的形質の安定性の決定に関する方法は例１に説明した如くである。
Δcya−12及びΔ〔crp−cysG〕−10突然変異によるS. タイフィ菌株の構造。Ｓ．タイフィ菌株は人に関して高侵入性である。Δcya−12及びΔcrp−11突然変異を用いたＳ．タイフィ菌株は無毒性に見えるが、免疫原性を妥協することなく更に安全性を増強させることは付加的弱毒化突然変異を付加することを考えることは慎重であると見えるであろう。Ｓ．タイフィムリウム菌株（例1,3及び４）におけるΔ〔crp−cysG〕−10突然変異の特性はＳ．タイフィを無毒性及び免疫原性とするためにそれを使用することを正当化した。この突然変異は又腸道及びGALTへの定着の意味ある減少無くネズミチフス菌による深い組織への定着を制御するcdt遺伝子を欠失させる。
野性型、毒性Ty2（E1型）,ISP1820（46型）及びISP2822（E1型）菌株遺伝的に下記の如くに、カーティス及びケリー（1987年）にて説明されているものと同様な古典的遺伝的方法を使用して一時的変異された。ISP1820及びISP2822は最近チリにおける腸チフス流行の間に分離されＳ．タイフィの標準実験室Ty2菌株より侵入的であるようである。それらの弱毒化はよってTy2から派生されるものより効能があるであろうワクチン菌株を生成する可能性がある。その構成手順はΔcya又はΔcrp突然変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンの載置によって（例１に説明された如く）Ｓ．タイフィムリウムSL1344において分離され特徴付けられたcrp及びcya遺伝子の動員遺伝子欠失及びテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いたP22HTint媒介形質導入を介したＳ．タイフィTy2及び高毒性Ｓ．タイフィISP1820及びISP2822菌株への連鎖された形質の形質導入よりなる。〔crp−cysG〕−10に連鎖されたzhc−1431::Tn10及びcyaに連鎖されたzid−62::Tn10がこの目的のために使用された。いずれの挿入も単独ではＳ．タイフィムリウ ムの毒性に影響を及ぼさない。
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔ〔crp−cysG〕−10及びzhc−1431::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3712上の高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物及びΔcya−12及びzid−6 2::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3711上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたP22HTint溶解産物はそこで遺伝形質を宿主Ｓ．タイフィTy2,ISP1820及びISP2822菌株へ形質導入するために使用された。
Ｓ．タイフィムリウムχ3712（Δ〔crp−cysG〕−10 zhc−1431::Tn10）上で増殖されたP22HTintはMal^-に関するスクリーニングを用いて毒性Ｓ．タイフィTy2,ISP1820及びISP2822菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は100μｌサンプルが12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で20分間インキュベートされた。37℃で略26時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Mal^-形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られたISP2822派生物はχ3791と称され、Ty2派生物はχ3792と称されISP1820派生物はχ4324と称された。全てのこれらの菌株は遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−1 0 zhc−1431::Tn10（表1.C.）を有しシステイン、トリプトファン及びアルギニン（表1.C.）に関する栄養素要求性を有した。菌株χ3791,χ3792及びχ4324はＬ肉汁＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて成長させられた。各培養はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）へ1:10希釈され、各々の100μｌはフザリク酸含入（FA）培地（マロイ及びヌン、1981）上に塗布され、そのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは0.5ml BSGへ採集されFA培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ37℃で成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS及びVi抗原の存在及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は全てが遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔z hc−1431::Tn10〕（表1.C.）を有しχ3802（ISP2822），χ3803（Ty2）及びχ4325（ISP1820）と称された。Cya^-及びCyp^-/Cdt^-突然変異株の表現型は同じ（Mal^-,Stl^-,Mtl^-,他）であるので、クローンされたcrp ^＋遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル 167:616−622（1986））を与える、核外遺伝子、pSD110,がΔcya突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔcrp突然変異を補足するために使用された。χ3802,χ3803及びχ4325のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ3670上に増殖されたP22THintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む（表1.B.）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml上でなされた。26時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Mal⁺コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋100μｇアンピシリン/ml上に精製され全てが遺伝子型Δ〔crp−cy sG〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕pSD110⁺を有しχ3824（Ty2）、χ3845（ISP2822）及びχ4331（ISP1820）と称された。
菌株χ3824,χ3845及びχ4331はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/mlにおいて成長させられ各々は連鎖されたΔc ya−12及びzid−62::Tn10突然変異を導入するためにχ3711上に増殖されたP22THintを用いて独立して形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上に載置された。アンピシリン耐性（pSD110⁺）、テトラサイクリン耐性（zid−62::Tn10）、Mal^-（Δcya）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なLPS、Vi抗原及びシステイン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は全てが遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔z hc−1431::Tn10〕pSD110⁺Δcya−12 zid−62::Tn10を有しχ3919（Ty2）、χ3920（ISP2822）及びχ4340（ISP1820）と称された。χ3919,χ3920及びχ4340の培養はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて混濁に成長させられ、BSGに1:10希釈され、そして各培養の100μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されFA培地上に精製された。精製されたFA耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS、Vi抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。pSD110核外遺伝子はその結果アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は全てが遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕（表1.C.）を有しχ3924（Ty2），χ3925（ISP2822）及びχ4345（ISP1820）と称された。Ｓ．タイフィVi抗原合成は抗血清を用いたViへのスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、MI）によって及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるVi II細菌ウイルス感受性によって確認された。ベン毛の合成は機能的cya及びcrp遺伝子に依存する。しかし、ベン毛がポテンシャリーに重要な抗原であるので、Δcya Δcrp Ｓ．タイフィ菌株の運動型派生物は、cfs（構成性ベン毛合成）遺伝子（シルバーマン及びシモン、Ｊ．バクテリオ ル．120:1196−1203（1974）における突然変異の故に、運動性寒天において選択された。χ3940（ISP2822），χ4072（Ty2）及びχ4346（ISP1820）は夫々χ3925,χ3924及びχ4245のベン毛正運動型派生物として選択された。
Δ〔crp−cysG〕−10突然変異株菌株の砂糖の醗酵及び様々な炭素源上での成長はΔcrp−11突然変異株菌株に関して観察されものと同様であった。表現型は環状AMPに関する要求及びカタボリック活性に関する環状AMP受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものである。
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与されるべき菌株はそれらの無毒性属性に関する完全な安定性を有しなければならない。Δcya Δcrp Ｓ．タイフィ菌株の50フォルド濃縮された培養及び様々な希釈（略10⁹,10⁷,10⁵,10³CFU/プレート）が0.5％のそれらの成長を支えるべきでないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを含む（要求されるアミノ酸を用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされたとき、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。一双プレートの内の１セットが紫外線照射（５ジュール/m²/秒）され暗がりで37℃でインキュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて37℃でインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は48時間成長期間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がその親菌株に関して観察され得たよりも高頻度で回復され得たかどうかに関して又研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
例７
本例は様々な感染症に対して免疫原性するための経口ワクチンとして使用するための外来の抗原をイクスプレッシングする組み換え無毒性Ｓ．タイフィ菌株の構造を説明する。
細菌菌株。使用されるＥ．コリ、Ｓ．タイフィムリウ ム及びＳ．タイフィ菌株は表１に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
形質導入及びTn10の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
ΔasdA1突然変異を用いたS.タイフィ菌株の構造。野性型、毒性Ｓ．タイフィTy2（E1型）は下記の如くにカーティス及びケリー（1987）及びナカザワ、ケリー及びカーティス（1987）によって説明されたものと同様の古典的遺伝的方法を用いて遺伝的に一時的変異された。Δcya−12 Δcrp−11突然変異を含むχ3927及び菌株χ4323の構造は例５に説明された。Δ〔crp−cysG〕−10突然変異を含む菌株χ4346の構造は例６で説明された。無毒性サルモネラ菌株における組み換え核外遺伝子上のクローンされた遺伝子の安定な維持及びハイレベルなイクスプレッションは平衡致死宿主ベクター系の使用に依存する。これに関し、アスパーテイトβセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを符号化するasd遺伝子の染色体突然変異は細菌細胞壁の硬い層の重要な成分であり動物において合成されないジアミノピメリン酸（DAP）に関する真正要求を課するためにΔcya Δcrp突然変異株へ導入される。染色体Δasd突然変異はそこで野性型asd ^＋遺伝子をプロセッシングする核外遺伝子クローニングベクターによって補足それる。核外遺伝子の損失の結果DAP無し死及び細胞溶解が生ずる。このような平衡宿主ベクター組み合わせは免疫化された動物宿主において数週間安定でありサルモネラのみではなくクローンされた遺伝子産物に対しても強い免疫応答を引き出す。
構成手順はＳ．タイフィムリウムLT2−Ｚ（χ3520）において分離され特徴付けられたΔasdA1突然変異のΔc ya Δcya Ｓ．タイフィ菌株への動員よりなる。これはΔasdA1突然変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンTn10の載置及び連鎖された形質のＳ．タイフィ Ty2 Δcya−12 Δcrp−11 菌株χ3927,Ｓ．タイフィ ISP1820 Δcya−12 Δcrp −11 菌株χ4323,及びＳ．タイフィ Ty2 Δcya−12 Δ〔crp−cysG〕−10 菌株χ4346へのP22HTint形質導入を介したテトラサイクリン耐性に関する選択及びジアミノピメリン酸（DAP）負表現型に関するスクリーニングを用いた形質導入によって完成された。ΔasdA1へ連鎖されたzhf−４::Tn10がこの目的のために使用された。
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠損の形質導入はΔasdA1及びzhf−４::Tn10突然変異を含むＳ．タ イフィムリウム上の高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物の最初の製造によって促進された。結果的に得られたP22HTint溶解産物はそこで10の多重感染における感染及び遺伝子形質を宿主Ｓ．タイフィ Ty2菌株χ3927,ISP1820菌株χ4323及びχ4346へ形質導入するために使用された。
ファージ−細菌感染混合は100μｌサンプルが50μｇ DAP/mlを含むペナッセイ寒天（ディフコ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で略20分間インキュベートされ12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された。37℃での略26時間インキュベーションの後、形質導入体は同じ培地に採集され精製された。５つのテトラサイクリン耐性コロニーのスクリーニングはDAP要求で又ある５つの形質導入体の内の略４を産する。結果として得られたTy2派生物はχ4296と称され遺伝子型Δc rp−11 Δ〔zhc−1431::Tn10〕 Δcya−12 Δ〔zid −62::Tn10〕 ΔasdA1 zhf−４::Tn10を有する。結果として得られたISP1820派生物はχ4416と称され遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕 Δcy a−12 Δ〔zid−62::Tn10〕 ΔasdA1 zhf−４::Tn10を有し、χ4434と称され遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc− 1431::Tn10〕 Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕 Δas dA1 zhf−４::Tn10を有する。菌株χ4296,χ4416及びχ4434はＬ肉汁＋50μｇ DAP/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上で成長させられゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）に1:10希釈されフザリク酸含入（FA）＋50μｇ DAP/ml培地（マロイ及びヌン、1981）上に塗布されそのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。フザリク酸耐性コロニーは0.5ml BSGへ採集されFA＋50μｇ DAP/ml培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁＋50μｂ DAP/mlに採集され37℃で混濁に成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全LPS及びVi抗原の存在及びシステイン、トリプトファン、メチオニン、スレオニン及び最小培地上のDAPに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株はχ4297（Ty2）と称され、遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−1431::Tn10〕 Δcya−12 Δ〔z id−62::Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf−４::Tn10〕を有し；χ4417（ISP1820），遺伝子型Δ〔crp−cysG〕−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕 Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕 ΔasdA1 〔zhf−４::Tn10〕を有し；χ4435,遺伝子型Δcrp−11 Δ〔zhc−1431::Tn10〕 Δcya−12 Δ〔zid−62::Tn10〕 ΔasdA1 〔zhf−４::Tn10〕を有する。
野性型親菌株のAsd^-派生物がCrp⁺Cya⁺バックグラウンド対Crp^-Cya^-バックグラウンドによるイクスプレスされる組み換え抗原の生産の比較の目的のために構成された。Ty2 ΔasdA1菌株がP22HTint（Χ3520）を用いたＳ．タイフィTy2菌株Χ3769及びＳ．タイフィISP1820菌株Δ3744の同時形質導入、テトラサイクリン耐性の選択及びジアミノピメリン酸負表現型に関するスクリーニングによって構成された。結果的に得られたTy2派生物はΧ4456と称されISP1820派生物はΧ4454と称され双方は遺伝子型ΔasdA1 zhf−４::Tn10を有する。菌株Χ4456及びΧ4454はＬ肉汁＋50μｇ DAP/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/mlで成長させられゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）へ1:10希釈され100μｌサンプルはフザリク酸含入＋50μｇ DAP/ml培地（マロイ及びヌン,1981年）上に塗布されそのプレートは37℃で略35時間インキュベートされた。フザリク酸耐性コロニーがＬ肉汁＋50μｇ DAP/mlに採集され37℃で混濁に成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全LPS及びVi抗原の存在、及びシステイン、トリプトファン、メチオニン、スレオニン及び最小培地上のDAPに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株はΧ4457（Ty2）及びΧ4455と称されΔasdA1 Δ〔zhf−４::Tn1 0〕を有する。
ミコバクテリウムラプラエ抗原の無毒性組み換えS.タ イフィにおけるイクスプレッション。λgt11::ミコバク テリウムラプラエクローンL14（又クローン7.8とも称される）が21らい種（LL）らい患者（サシッシュ、エッセル、ソール及びクラーク−カーティス、インフェクト、イミュン、58,1327−1336（1990））からのプールされた血清を用いてλgt11::Ｍ．ラプラエの遺伝学的スクリーニングによって確認され。クローンL14は略158及び153kDaの二つのタンパク質をスベシファイし、双方はプールされたLL患者の血清（サシッシュ他、1990年）において非常に強く反応する。これらのタンパク質は又血清が独立して試験（クラーク−カーティス、ソール、サシッシュ、ボゼッカー、セラ、デカルバルホ及びエッセル、微生物学におけるレス．印刷中）されるとき21のLL患者の血清の内の14における抗原を用いて反応する。
1.0kb Ｍ．ラプラエ挿入DNA破片が、アガロースゲル電気泳動法による消化破片の分離によって従われる、Ec oR Iを用いた組み換えファージDNAの消化によってλgt11クローンL14から除去された。Ｍ．ラプラエ破片はゲルから精製されAsd⁺ベクターpYA292（ガラン、ナカザワ及びカーティス、遺伝子（1990年），94:29）のEcoR I部位にクローンされた。２種類の組み換え核外遺伝子が生成された：それがlacZプロモータと関連するのと同じtr cプロモータと関連する指向においてＭ．ラプラエ挿入DNAがpYA292へクローンされたpYA1077、及びＭ．ラプラ エ破片がtrcプロモータに関する対向する指向においてクローンされたpYA1078。pYA1077の部分的限定マップが図２に示されている。双方の組み換え核外遺伝子が大腸 菌Ｋ−12菌株χ6060及びＳ．タイフィムリウム菌株χ3730へ形質転換されその形質転換体によってスペシファイされたタンパク質がウェスタンブロッティングによって分析された。クローンpYA1077は略30kDaの単一融合タンパク質をスペシファイし、それはプールされたLL患者の血清において抗体に強く反応する。クローンpYA1078は患者の血清を用いて反応するいかなるタンパク質をもスペシファイしない。
細菌ウイルスP22HTint溶解産物がＳ．タイフィムリウ ムχ3730＋pYA1077及びχ3730＋pYA1078上に準備された；これらの溶解産物はＳ．タイフィχ4297,χ4417,χ4435,χ4455及びχ4457を形質導入するために使用された。３つのランダムに選ばれたpYA1077を用いたχ4297の各形質導入体によって生産されたタンパク質のウェスタンブロット分析は各形質導入体はプールされたLL患者の血清を用いて反応する30kDaのタンパク質をスペシファイしたがpYA1078をハーバーリングする３つの独立χ4297形質同流体は遺伝学的反応性タンパク質をスペシファイしなかった（図３）。
更に、pYA1077からの遺伝学的反応性タンパク質のイクスプレッションはχ4417,χ4435,χ4455,及びχ4457において又示された。図４はλgt11::Ｍ．ラプラエクローンL14及びＳ．タイフィによって生産されたタンパク質のウェスタンブロットを示し、Ｓ．タイフィムリウム及びＥ．コリ菌株がpYA292,pYA1077及びpYA1078をハーバーリングしている。ニトロセルロースフィルター上のタンパク質は21のらい種らい患者からのプールされた血清を用いて反応させられた。正抗原抗体がサシッシュ、エッセル、ソール及びクラーク−カーティス（1990年）58:1327によって説明された技術によって検出された。更に個別には、第２の抗体はアルカリフォスファターゼコンジュゲーティド抗ポリスペシフィック抗体であり色素産生の基質はニトロブルーテトラゾリウム及び５ブロモ４クロロ３インドリルリン酸塩、ｐトルイジン塩であった。図のレーンは下記の通りである：（レーン１）分子サイズ標識；（レーン２）pYA1077を用いたＳ．タイ フィχ4297;（レーン３）pYA1077を用いたＳ．タイフィχ4417;（レーン４）pYA1077を用いたＳ．タイフィχ4435;（レーン５）pYA1077を用いたＳ．タイフィχ4455;（レーン６）pYA1077を用いたＳ．タイフィχ4457;（レーン７）pYA292を用いたＳ．タイフィχ4297;（レーン８）pYA292を用いたＳ．タイフィχ4435;（レーン９）pYA292を用いたＳ．タイフィχ4455;（レーン10）pYA292を用いたＳ．タイフィχ4457;（レーン11）pYA292を用いたＳ．タイフィχ4417;（レーン12）pYA1077を用いたＥ．コリχ6097;（レーン13）λgt11::Ｍ．ラプラエクローンL14からのタンパク質；（レーン14）pYA1078を用いたＳ．タイフィムリウムχ4072。λgt11::Ｍ．ラプラ エクローンL14によってスペシファイされた遺伝学的反応正タンパク質はβガラクトシダーゼを用いた融合タンパク質であるためサイズにおいてより大きい。
pYA1077組み換えベクターを用いたＳ．タイフィ菌株χ4297,χ4417及びχ4435は腸チフス及びらい病に対して防護するために人を免疫価する候補である。それらのワクチンの効験は防護免疫応答を引き出すであろういくつかのＭ．ラプラエ抗原につき一の確認及びそこで人免疫化試験において使用され得たであろうＳ．タイフィΔcyaΔcrpΔcdtΔasd菌株においてAsd⁺ベクターにおいてクローンされた遺伝子によってそれらをスペシファイさせることに依存するであろう。
例８
本例はＳ．タイフィのΔcyaΔcrp突然変異株の生経口ワクチンの安全性、免疫原性、及び効験を試験する過程を提供する。試験される菌株はTy2,ISP1820及びISP2822のΔcyaΔcrp派生物である。
研究された個体。研究された個体は18乃至39才の健康な大人であるボランティアである。防護的ボランティアは研究前にスクリーンされる。スクリーニング過程は：
1.医学的経歴
2.物理的検査
3.心電図
4.検尿
5.完全血球算定
6.血液化学（BUN,クレアチニン、空腹時血グルコース
7.血清Na⁺、Cl^-、K⁺、HCO₃ ^-
8.VDRL
9.B型肝炎表面抗原
10.ELISAによるHIV抗原
11.妊娠テスト（女性）
12.肝機能テスト（SPGT）
13.心理学的検査及びインタビュー。
研究に参加するボランティアは一般的良好な健康を基準として選択され更に：
1.胆嚢の病気、免疫不全、心臓血管の病気、呼吸器系統の病気、内分泌の病気、肝炎、腎臓及び膀胱の病気の病歴を含む肝臓の病気、前立腺肥大、緑内障、消化器系統の病気、細網内皮系の病気、神経弛緩の病気、入院を要する精神医学の病気、薬物又はアルコール乱用の臨床的に実質的な経歴が無く；
2.正規母集団に関して定義された限界内にある通常そして規則正しい腸習性を持ち即ち：下剤又は下痢止め薬のしばしばの使用なしに少なくとも週に３回の便通及び日に３回未満の便通があり；
3.アモキシリン又はシプロキサシンに対するアレルギーが無く；
4.ワクチン接種の前７日間に抗生物質治療の経歴が無く；
5.陰性妊娠テスト（女性）を受け；
6.陰性HIV抗体テストを受ける。
ボランティアは隔離病室に入室を許可され、そして情報提供され、立会われ、記載された承諾が得られる。
研究設計。22人のボランティアが研究される。基線血液及び腸液体標本が収集される。その室での２日間の環境順化の後、空腹のボランティアがランダムにTy2,ISP1820又はISP2822のΔcyaΔcrp派生物のいずれかの5x10⁵を含む重炭酸緩衝一経口供与量を用いて摂取することが許容される。ボランティアは次の15日間副作用に関して観察される（発熱、不快感、悪寒、嘔吐、下痢）（腸チフスの通常のインキュベーション期間は８乃至12日である）。連続した血液及び大便培養が得られる。更に温度の高さが100.8゜Fあるボランティアはだれでも観察がなされる際に血液サンプルが採られる；温度が12時間このレベルに高められたままである場合、経口アモキシリン（各６時間毎に1.0グラム）及び経口シプロフロクサシン（10日間、各12時間毎に750mg）を用いた療法が開始される。十二指腸液培養が7,10及び13日での観察の期間に又得られる。
動物試験。アジュバンドとしての豚胃粘素を用いた腹腔内接種によるマウスにおける親菌株に関するLD₅₀及び弱毒化された派生物が又決定された。
ワクチン接種物の準備。Ｓ．タイフィ候補ワクチン菌株の保存培養が、必要となるまで−70℃で、15％グリセロールによって補足され、トリプチケース大豆肉汁培地（TSB）において細胞懸濁として貯蔵された。各菌株の接種物を製造するためにその懸濁は挑戦の二日前に解かされ羊赤血球寒天（TSAにおける５％srbc）上に載置される。夜通しの37℃でのインキュベーションの後、略20乃至30典型的なコロニーが採集され塩類液において懸濁された。この懸濁はトリプチケース大豆肉汁培地上に接種され、適当に補足され、そしてそのプレートは37℃で夜通しインキュベートされる。ボランティアに経口的にワクチン接種するための準備において、これらのプレート上の成長は各プレート毎に略3ml無菌通常塩類液を用いて収穫される。結果的に得られた懸濁は濁り分析的に標準化される。要求されるサルモネラの濃縮を近似させるために塩類液において希釈がなされた。ワクチン接種物は氷上の隔離室に移動させられた。顕微鏡的検査及びスライド凝集が使用前にＳ．タイフィＯ及びＨ抗血清を用いて実行された。レプリカ塗布プレート定量培養が生存度及び接種物サイズの確認のためにワクチン接種の前後にその接種物から製造された。
ボランティアの接種。そのワクチンは経口経路によってNaHCO₃を用いて投与される。ボランティアはワクチン接種前に90分間NPOである。２グラムのNaHCO₃が５オンスの蒸留水において解かされる。ボランティアは４オンスの重炭酸イオン水を飲み;1分後ボランティアは残った１オンスの重炭酸イオン水に懸濁されたワクチンを接種する。ボランティアは接種後90分間食事と水を採らない。
標本収集に関する過程。
大便標本。ボランティアを通過させられた全ての大便の数、コンシステンシー、及び説明の記録が採られる。各大便（又は大便が通過させられない場合直腸綿棒）の標本が培養に関して収集された。標本の体積が計測された。５点システムでグレード分けされた：
グレード１−硬い大便（通常）
グレード２−柔らかい大便（通常）
グレード３−濃い液体（異常）
グレード４−不透明な水のような（異常）
グレード５−米磨ぎ汁様（異常）。
静脈切開。抗体決定に関する血清がワクチン接種前及び8,21,28,60,及び180日後に得られる。抗体スクリーニング細胞アッセイに関するリンパ球分離に関するヘパリン化血は0,4,7,及び10日に収集された。0,28,60、及び180日に収集された単核細胞はサルモネラに対するリンパ球増殖性応答を査定し抗原を制御するために使用される。最後に0,28,60及び180日からの単核細胞は又、Ｓ．タイフィに対する抗体依存細胞毒性アッセイ及び生体の制御において使用される。血液（5ml）が後ワクチン接種観察期間の3,4,7,8,10,12,及び15日に培養に関してワクチン生体の検出のために得られる。更なる血清の標本及び単核細胞が一次ワクチン接種後180日に得られた。
空腸液吸引。経口ワクチン接種前及び放出の直ぐ前（15日），ボランティアは局所SIgA抗体の測定のために腸液を収集するために口から130cmの距離へポリ塩化ビニル腸チューブをのみ下す。10mgのメトクロプラミドがチューブの摂取の後にその胃から幽門を通して小腸への通過を促進するために傾向的に与えられる。チューブの空腸への載置は距離（130cm）、吸引された液体の色（黄色−緑），及びpH（６）によって証明される。略100mlの空腸液体が各挿管毎に取り去られる。
ゼラチンストリングカプセル。各ワクチン菌株を用いた腸定着率の決定のため、ゼラチンストリングカプセル（エンテロテスト）がボランティアによって入院の期間に３回摂取された。
ボランティアはAM6時からNPOである。水の飲み下しは口及び喉を湿らすためになされた。引き出されたストリングの位置を用いたカプセルはナイロンストリングのループを保持しながら水で飲み下される。その線は顔に向かって確保され、決められた場所で４時間置かれる。ボランティアは任意に水を飲むことを許されるが、他の食料又は飲物は採ることは許されない。４時間後その線は引き抜かれ、胆汁で染められた粘液で浸された末端部が切り取られ無菌ペトリ皿に載置され、それは確認のためにラベルが付けられる。そのストリングはそこで微生物に関して大便標本を用い場合と同じ方法で培養される。
扁桃培養。扁桃リンパ組織のワクチン接種後の可能な侵入を検出するために連続的な扁桃培養が3,4,7,8,10 12及び15日に得られる。
細菌学的分析。大便、直腸綿棒、及び接種されたゼラチンカプセルからの胆汁に染められた十二指腸ストリングの末端15cmがセレナイトＦ豊富肉汁に接種される。扁桃綿棒がGN肉汁に接種される。夜通しの37℃でのインキュベーションの後、副次培養が、双方共ワクチン菌株の栄養素要求性に関して適当に補足されたSS（サルモネラ−シゲラ）寒天培地及びXLD寒天培地上に作られた。疑わしいコロニーが補足されたトリプルシュガーアイアンスラント及びＳ．タイフィViを用いた凝集によってなされる確認に移動させられる。これらの隔離集団は（例えば核外遺伝子の存在に関する又はクローン遺伝子に関する特異遺伝子プローブを用いたサザンブロッティングに関する）更なる分析のためにグリタロールにおいて−70℃で保管される。
血液培養（5ml）は補足されたブレインハートインフュージョン肉汁の50mlに接種される。
免疫学的分析。血清及び空腸液標本はレビン他、（1987年）、J.クリン．インベスト．79:888−902によって説明された過程を使用してELISAによって測定されたＳ．タイフィO,H,及びVi抗原に対するIgA,IgM,及びIgG抗体に関して試験される。Ｈ抗体は又抗原Ｓ．バージニ ア（Ｓ．バージニアはＳ．タイフィと同一のベン毛抗原を分担する）を使用してウィダルチューブ凝集によって測定される。
周辺血液単核細胞が収集されサルモネラ抗原に対する特異な応答の研究に関して分割される。これらは下記のものを含む。
1.抗体分泌細胞：Ｓ．タイフィO,Vi又はＨ抗原に対するIgG,IgA又はIgM抗体を分泌するトラフィッキングリンパ球はカンテーレ他の方法によって測定される。
2.複数リンパ球：周辺血液単核細胞は抗原駆動リンパ球複製を検出するために、上述のレビン他によって説明された如くに、ヒートフェノール不活性Ｓ．タイフィ、Ｓ．タイフィムリウム、Ｓ．ソンプソン、及びＥ．コリと混合される。
3.ADCC:Ｓ．タイフィのプラズマ媒介単核細胞抑制が前述のレビン他で説明された如くの抗体依存細胞様細胞毒性アッセイにおいて測定される。
ワクチン菌株の排出。ワクチン菌株の排出がワクチンの供与量の後１週間以内で終わるであろうということが予測される。排出が７又はそれ以上の日数続いた場合、排出を続けているボランティアはシプロフロクサシン（各12時間毎に750mg）供与量が与えられる。≧２連続日数間の陰性培養が放出のために要求される。
例９
本例は野性型親菌株、Ty2から準備されたΔcyaΔcrp Ｓ．タイフィ菌株χ3927の安全性及び免疫原性を示す。この菌株のマウスに於けるLD₅₀は（去勢豚胃粘素を用いた腹腔内注射を使用して）1.8x10⁴である。
引き続く過程は本質的に前述の例８にて説明したものであった。ボランティアの二つの同齢集団が異なる供与量のワクチンが与えられた研究に使用された。その第１の研究において、17人のボランティアが二重盲検法にてランダマイズされた;6人のボランティアは5x10⁵cfuのχ3927を受け、残りの人は他のＳ．タイフィ菌株の同じ供与量を受けた。第２の研究では、19人のボランティアが二重盲検法にてランダマイズされた;6人のボランティアは5x10⁴cfuのχ3927を受け、残りの人は他のＳ．タイフ ィ菌株の同じ供与量を受けた。ボランティアは15日間（第１の研究）又は24日間（第２の研究）隔離室で厳密に監視された。生存兆候が観察期間中各６時間毎に測定された。各ボランティアからの全ての大便はプラスチック容器に収集され、検査され、５点スケールでグレード分けされ、そして大便がゆるい場合には体積が測定された。ボランティアは医師によって毎日インタビューされ症候について尋ねられた。発熱は口腔の温度≧38.2℃として定義された。下痢は48時間以内の２又はそれ以上のゆるい大便が合計して少なくとも200mlの体積あるか又は一回のゆるい大便≧300mlであるとして定義された。抗生物質療法が発熱又は陽性血液培養を発するボランティアに与えられた。
ワクチンを準備するために−70℃で15％グリセロールを用いたトリプチケース大豆肉汁上で維持されてきたχ3927の貯蔵培養が解かされ補足されたアロ寒天上で成長させられた。37℃でインキュベートされた後、20乃至30のワクチン菌株の典型的なコロニーがアロ寒天から採集され、塩類液において懸濁され、そして再びアロ寒天上に接種された。37℃で夜通しインキュベートされた後、その細菌は食塩加リン酸緩衝液（PBS）の3mlを用いて収穫され細菌の濃度が濁り分析的に標準化された。その懸濁の希釈がミリメーター毎の生存可能な生体の所望の濃度を達成するためにPBSにおいてなされた。接種物の同一性は顕微鏡的検査によって及びＳ．タイフィO,H,及びVi抗血清を用いたサイド凝集によって確認された。複製塗布プレート定量培養が生存可能性及び接種物のサイズの確認のためにワクチン接種の前後にその接種物より作られた。
ワクチン菌株はソディウムバイカーボネートを用いて経口経路によって投与された。ソディウムバイカーボネート（2gm）は150mlの蒸留水において解かされボランティアは胃酸を中和するために120ml飲んだ。一分後、バイカーボネート溶液の残りの30mlに懸濁されているワクチンを飲んだ。ボランティアはワクチン接種の前後の90分間飲まず食わずであった。
ボランティアによって通過させられた各大便（及び大便が通過させられなかった場合には直腸綿棒）がワクチン菌株のために毎日培養された。大便は0.1％PABA及び0.1％PHBによって補足されたグラム陰性肉汁（BBL,コッキースビル、MD）へ及び補足を用いてＳ−Ｓ寒天上に直接接種された。37℃での夜通しのインキュベーションの後、1gの大便が連続的に塩類液において10フォルド希釈され各希釈は上記の如くに補足されたＳ−Ｓ寒天上に載置された。疑わしいコロニーがトリプルシュガーアイアンアガースラントに移動させられ同一性がＳ．タイフィO,H,及びVi抗血清を用いた凝集によって確認された。
ワクチン接種の後7,10,及び13日に絶食しているボランティアは胆汁に染められた十二指腸液のサンプルを収集するためにストリングデバイスを含むゼラチンカプセルを飲み下した。４時間後、そのストリングは除去され末端15cmの色とpHが記録された。十二指腸液はストリングの端から絞られ上記の如く培養された。
ワクチン生体の培養のための血液はワクチン接種の4,5,7,8,10,12及び15日後に及び発熱が発生した場合には再び系統的に収集された。血液の5mlが補足されたアロ肉汁の50mlに接種された。
更に、扁桃培養がそのワクチン菌株の検出のために1,2,4,5,7,8,10,12及び15日に得られた。扁桃に当てられた綿棒は補足を用いたグラム陰性肉汁に24時間及びそこで補足されたサルモネラ−シゲラ寒天に接種された。
免疫が九滴応答を決定するために、下記の過程が続けられた。血清サンプルがワクチン接種のに前及び7,21,28及び60日後に得られた。空腸液が例８にて説明した如くに、ワクチン接種の前及び14日後に収集された。その液体の合計のIgA含有量はELISAによって測定され各標本は100当たり20mgのIgAを含むように標準化された。S.タイフィリポ多糖（LPS）、H,及びVi抗原が血清及び空腸において測定された。
LPS Ｏ抗原に対するIgA抗体がELISAによって検出された。1:100希釈において試験された前及び後ワクチン接種血清間のネット光学濃度≧0.20における上昇は意味のある上昇と考えられた。各マイクロタイタープレートと共に使用された正制御血清はハイレベルのLPS Ｏ抗体を含み、Ty21aワクチンによる免疫化の後に強いIgG LPS Ｏ抗体応答を有した健康な12人のチリ人からの血清のプールを表示した。LPS Ｏ抗原に対するIgA抗体が血清の1:25希釈から開始した２フォルド希釈を使用して測定された。IgA力価は４フォルド上昇が前及び後ワクチン接種過程に発生した場合意味があると考えられた。
Ｓ．タイフィLPS Ｏ抗原に対する腸分泌IgA抗体が又ELISAによって測定された。４フォルド上昇は意味があると考えられた。
Ｈ抗体を測定するために、Ｈ−ｄベン毛抗原がＳ．タ イフィ菌株541Tyから準備された。Ｈ−ｄ抗体に関する血清及び空腸液がELISAによって測定された。力価における４フォルド上昇は意味があると考えられた。
Ｈ抗体に関するウィダールチューブ凝集テストがＳ．タイフィと他の抗原ではなくベン毛抗原ｄを分担するサ ルモネラバージニアを使用して実行された。
Vi抗原がELISAによって血清及び空腸液において測定され;4フォルド上昇が意味があると考えられた。
IgG,IgA,又はIgM抗体をＳ．タイフィO,H,又はVi抗原に対して分泌するガットデライブド、トラフィッキング抗体分泌細胞がフォレスト他（（1988年），ランセット１:81）の方法の変更によってELISA及びELISPOTアッセイの双方を使用して測定された。ヘパリン化血がワクチン接種の前及び７及び10日後に引き抜かれた。簡単に、フィコーグラディエント（オルガノンテクニカ、デュルハム、NC）によって分離された周辺血リンパ球が抗原塗布プレートに付加された。ELISAにおいて、リンパ球によって分泌された抗体の結束が結束された抗IgAコンジュゲートを用いた基質の反応によって生産された光学濃度における変化によって測定された。LPS、H,及びVi抗原に対するに対する意味のある応答がこれらの研究において参加しているボランティアから取られた免疫化前及び４日細胞から生成されたO.D.プラス３ S.D.における差異を使用して決定された。ELISPOTアッセイにおいて、個々のリンパ球によって分泌された特異なIgAが各ウェルへのアガロースオーバーレイの付加及び結束された抗人IgAコンジュゲートを用いた基質の反応によって生産された色付きスポットの計数によって検出された。ワクチン接種後のウェル毎に≧４スポットの検出は正反応として定義され；この数はワクチン接種前に計数されたスポットの平均数プラス２ S.D.に基づいている。
その結果得られたものは下記の通りである。
ワクチン接種後のボランティアの臨床的兆候は二重盲検法において評価された。菌株χ3927を受けた12人のボランティアの内の一人が発熱した。このボランティアはワクチン接種後22日に最高温度40.1℃まで熱が上がった。このボランティアは４乃至13日に深刻な急激な腹痛、不快感、食欲不振、頭痛、及び嘔吐にみまわれたが、彼の発熱は22日までには始まらなかった。彼の兆候はそこでめまい、筋肉及び身体痛、便秘、不眠症、及び茶色の痰を生産するせきを含んだ。このグループの他のボランティアの一人は入院患者監視期間に不快感、急激な腹痛、頭痛、及び吐き気にみまわれた。
細菌学的研究は5x10⁴を受けた６人のボランティア中の一人及びχ3927の5x10⁵cfuを受けた６人のボランティア中の一人が陽性血培養を有することを示した。これらは15日及び８及び12日に夫々発生した。これらのボランティアの何れもどのような兆候も有していなかった。χ3927を受けた12人のボランティアの内の一人は１日の大便において検出されたワクチン生体の一コロニーを有した。これらのボランティアはだれも陽性扁桃又は十二指腸ストリング培養を有しなかった。ボランティアの血及び大便から回復されたχ3927隔離集団は全てΔcyaΔcrp突然変異の存在に関連する予測される表現型を保有した。
免疫学的研究はχ3927を受けた12ワクチン中の６（50％）がIgG抗Ｓ．タイフィLPS応答を発現させることを示した。Ｈ抗原又はViに対する抗体は12人のボランティアの何れにも検出されなかった。12人のボランティア中の一人のみが空腸液におけるLPSに対する分泌IgAを発現した。Ｈ抗体に対する分泌IgA抗体応答がたった一人のボランティアに発生しワクチン接種後分泌抗Vi抗体を持つボランティアは一人もいなかった。12のボランティア中の５人がELISA又はELISPOTアッセイによって検出されたLPSに対するIgAを分泌する循環細胞を発現された。環状AMP調節経路における遺伝子欠失によって与えられる弱毒化の度合いは突然変異株及び親菌株を用いたボランティアの同時挑戦無しには厳密には測定され得なかった。しかし、野性型菌株の同様な供与量が与えられたボランティアを用いた歴史的経験に基づくと、その遺伝子欠失がＳ．タイフィの弱毒化を与えるようである。野性型Ｓ．タイフィ菌株Ty2が重炭酸イオン無しに1x10⁷の供与量で６人のボランティアに与えられたとき、83％が（＞36時間103゜Fの温度として定義される）腸チフス又は（＞５日間の低グレード発熱、意味のある血清学的応答、陽性血培養又はＳ．タイフィの排泄として定義される）感染を発現した。対照的に、Ty2から派生されたχ3927ワクチンを重炭酸イオンを用いて（重炭酸イオン無しの余程高い供与量と同等）10⁴又は10⁵cfu供与量で受けたここで報告された12人のボランティア中、たった一人のボランティアが発熱を発生したった二人のボランティアが陽性血培養を発生した。その上、熱病にみまわれたボランティアは、発熱時に付加的に収集された血培養であるにもかかわらず彼らの血液においてワクチン細菌が検出されなかった。発熱はワクチンによる腸の感染によって刺激されたシトキネスの放出に対する応答において発生したようである。
例10
本例はΔcdt突然変異を含むΔcrp−10 Δcya−12 Ｓ．タイフィ構造物の構造及び特徴を説明する。我々はＳ．タイフィTy2（E1型）及びＳ．タイフィISP1820（チリ人伝染病46型隔離集団）へΔcyaΔcrp突然変異を導入した。Δcya−12及びΔcrp−11突然変異による前者の菌株は既に例９に説明した如くに人ボランティアにおいて評価された。5x10⁴cfuを受けた６人のボランティアの内の一人及び5x10⁵cfuのΔcrp−10 Δcya−12 Ｓ．タイ フィ菌株、χ3927、を受けた６人のボランティアの内の一人が陽性血培養を有した。これらは夫々15日及び８及び12日に発生した。しかし、これらのボランティアはだれもどのような兆候も示さなかった。更に、必ずしも全ての免疫化された個体がＳ．タイフィ抗原に対する高力価抗体応答を発現しなかった。免疫化されたこれらの大多数における防護的免疫の誘発に関するより高い経口供与量を許容するであろう更なる弱毒する突然変異が所望される。我々は減少させられた毒性を結果的に生じよってより高い供与量を許容するはずであるΔcrp−10 Δc ya−12 Ｓ．タイフィ菌株へ導入された更なる遺伝子欠損を確認した。この欠損は深い組織への定着（ｃolonization of ｄeep ｔissure）に関してcdtと称された遺伝子における遺伝子欠失である。Δcya及びΔcdt突然変異に加えてΔcdt突然変異を用いた菌株は又ΔcyaΔcya突然変異のみによる菌株の場合よりも人の血清においてより生存できない。それらはよってよりたやすく取り除かれるはずであり血中にワクチンを有する状態を誘発できないようである。
菌株構造。野性型、毒性Ｓ．タイフィTy2（E2型）及びISP1820（46型）菌株がカーティス及びケリー（（1987年）、インフェクト．イミュン.55::3035−3043）で説明され、例１に説明した方法と同様の方法による古典的遺伝学を使用して遺伝的に一時的変異された。アデニレートシクラーゼ及び環状AMP受容タンパク質が損なわれたネズミチフス菌遺伝子欠失突然変異株は無毒性であり免疫原性である。インフェクト．イミュン.55::3035−3043.（１）。その手順はトランスポゾンTn10（テトラサイクリン耐性を符号化する）のcya又はcrp遺伝子欠失の近くへの載置によってＳ．タイフィムリウムSL1344において分離され特徴付けられたcrp−cdt（Δcdt−10と称された）及びcya遺伝子の遺伝子欠失の形質導入を促進することよりなる。よって我々は夫々Δcrp−10に連鎖されたzhc−1431::Tn10及びΔcya−12に連鎖されたzid −62::Tn10を使用し、テトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いてP22HTintを用いて連鎖された形質を高毒性Ｓ．タイ フィTy2及びISP1820菌株へ同時形質導入した。
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔcrp−10zhc−1431::Tn10突然変異を含むＳ．タ イフィムリウム菌株χ3712上へ高力価細菌ウイルスP22HTint溶解産物を及びΔcya−12 zid−62::Tn10突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ3711上へ別の溶解産物を最初に製造することによって促進された。結果的に得られたP22HTint溶解産物はそこで遺伝的形質を宿主Ｓ．タイフィTy2（χ3769）及びISP1820（χ3744）菌株へ10の多重感染で感染させ形質導入するのに使用された。
Ｓ．タイフィムリウムχ3712（Δcrp−10 zhc−143 1::Tn10）上で増殖されたP22HTintは毒性Ｓ．タイフィTy2及びISP1820菌株をMal^-Tet^rに形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は100μｌサンプルが12.5μｇテトラサイクリン/mlによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、MI）上に塗布される前に37℃で20分間インキュベートされた。37℃で略36時間インキュベートの後、形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られたTy2派生物はχ3792と称されISP1820派生物はχ4324と称された。双方の菌株は遺伝子型Δcrp−10 zhc−1431::Tn10を有する。菌株χ3792及びχ4324はルリア肉汁^１＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）へ1:10希釈された。（^１ルリア肉汁はリッター当たり10gのNaClを含み他方レノックス肉汁はリッター当たり5gのNaClを含む。高容量オスモル濃度培地において成長させられたサルモネラ細胞は組織培養細胞に侵入する増加された能力を示す（ガラン及びカーティス、インフェクト．イミュン．（1990）58:1879−1885;侵入のために要求されるサルモネラ遺伝子のイクスプレッションはDNAスーパーコイリングにおける変化によって調整される。）よって、ルリア肉汁における増加されたNaClレベルはワクチン菌株の最適有効性を確実にする。）各々の菌株の100μｌのサンプルはフザリク酸含入（FA）培地（マロン及びヌン（1981年）,J.バクトリアル.145:1110−1112）上に塗布され、そのプレートは37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは0.5ml BSGへ採集されFA培地上に線条接種によって精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはルリア肉汁に採集され混濁へ37℃で成長させられTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS、Vi抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株はχ3803（Ty2）及びχ4325（ISP1820）と称され、それらは遺伝子型Δcrp−10 Δ〔zhc−1431::Tn1 0〕を有する。
Cya^-及びCrp^-/Cdt^-突然変異株の表現型は同じ（Mal^-,Stl^-,Mtl^-,他）であるので、クローンされた野性型crp ^＋遺伝子をそのプロモーターを用いてキャリーする（シュローダー及びドブロゴッツ（1986）、J.バクテリオル 167:616−622）、核外遺伝子、pSD110,が染色体において（よってその菌株を野性型表現型に回復させる）一時的にΔcrp突然変異を補足しΔcya突然変異を用いた菌株の確認を形質導入後に可能とするために使用された。χ3803及びχ4325のルリア肉汁培養はＳ．タイフィムリ ウムχ3670上に増殖されたP22THintを用いて形質導入され、それは核外遺伝子pSD110を含む。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml上でなされた。26時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Mal⁺コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天上に精製されχ3824（Ty2）及びχ4331（ISP1820）と称されそれらは遺伝子型Δcrp−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕pSD110⁺を有する。
菌株χ3824及びχ4331はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/mlにおいて成長させられ各々はΔcya−12及び連鎖されたzid−62::Tn10突然変異を導入するためにχ3712上に増殖されたP22THintを用いて独立して形質導入された。マルトース負、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性表現型に関する選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上でなされた。アンピシリン耐性（pSD110⁺），テトラサイクリン耐性（zid−62::Tn10）,Mal^-（Δcya）コロニーはマッコンキー寒天＋１％マルトース＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/ml上に採集され精製された。精製されたコロニーはルリア肉汁に採集され混濁へ成長させられその菌株は完全なLPS、Vi抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。正しい表現型の隔離集団はχ3919（Ty2）及びχ4340（ISP1820）と称され、それらは遺伝子型Δcrp−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕pSD110⁺Δcya−12 zid−62::Tn10を有する。χ3919及びχ4340の培養はＬ肉汁＋100μｇアンピシリン/ml＋12.5μｇテトラサイクリン/mlにおいて混濁に成長させられ、BSGに1:10希釈され、そして各培養の100μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され37℃で略36時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されFA培地上に精製された。精製されたFA耐性コロニーはルリア肉汁に採集され、混濁に成長されそしてTn10（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なLPS、Vi抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。pSD110核外遺伝子はアンピシリンの不在における菌株の成長の間自然に失われた。アンピシリン感受性及び核外遺伝子無しの最後の菌株はχ3924（Ty2）及びχ4345（ISP1820）と称されそれらは遺伝子型Δcrp−10 Δ〔zhc−1431::Tn10〕Δcya−12 Δ〔z id−62::Tn10〕を有する。ベン毛の運動性の表示を用いた合成は機能的cya及びcrp遺伝子に部分的に依存しベン毛が重要な抗原であるので、我々はベン毛合成及びcya及びcrp遺伝子機能から独立する機能を許容する抑圧遺伝子突然変異（cfs）を所有するχ3924及びχ4346の派生物を選択した。χ4073はχ3924のベン毛正派生物として選択されχ4326はχ4345のベン毛正派生物として選択された。図10は野性型親菌株及びそれらのcyaΔcrp派生物が記載されている。
菌株χ4073及びχ4346は下記の表現型特徴によって容易にそれらの野性型親と区別され得る：炭素源マルトース、マンニトール、ソルビット、メルビオース及びキシロースを醗酵又は成長させる能力が無いこと、H₂Sを生産する能力が無いこと、増加させられた世代時間、及び意味のある程度に増加させられたマウスLD₅₀値。

χ3744,χ3769,χ4073,及びχ4346に関する成長条件
各菌株の細胞は寒天培地から2mlルリアに肉汁に採集された。培養は37℃で略14時間静止培養としてインキュベートされた。その培養が視覚的に混濁（OD₆₀₀≧0.5）のとき、白金耳量の各培養がいくつかの表現型特性を実証するために表11に記載された培地上の分離された培養に関して線条接種させられた。培養は又ファージ、抗生物質罹病性、野性型LPSを生産する能力、栄養素要求性、運動性、コリシンを生産する能力が無いこと、核外遺伝子DNAの不在、平均世代時間、及び抗血清によるＳ．タイフィ（図11参照）のO,H,及びVi抗原を確認するための凝集に関して試験された。全ての菌株の表現型特性がそれらの野性型親よりも意味がある程度遅く成長するΔcyaΔcrp菌株χ4346及びχ4073を用いて予測された如くであった。

寒天培地上の成長特徴
菌株は37℃でのスタンディングオーバーナイト培養としてのルイア肉汁において成長させられ、ゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（BSG）において希釈され、そして分離されたコロニー形成単位（cfu）を達成するために１％マルトースを含むマッコンキー寒天上に載置された。与えられた菌株の全てのコロニーはサイズ及び色において均一に見える。Δcya crp菌株のそれらの野性型親に比較して遅い成長率によって、マッコンキー寒天上の成長はχ4073及びχ4346のコロニーが容易に目視できる前に37℃で略37＋時間かかる。
突然変異株表現型の安定性
χ4073及びχ4346の50フォルド濃縮培養及び様々な希釈（略10⁹,10⁷,10⁵,10³cfu/プレート）がそれらの成長を保持すべきでない0.5％マルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースの何れかを含む（22μｇ Ｌアルギニン/ml、22μｇ Ｌシステイン及び20μｇ Ｌトリプトファン/mlにしよって補足された）最小寒天培地上にプレートされた。１対のプレートの内の１セットは紫外線照射（５ジュール/m²/秒）され暗がりで37℃でインキュベートされた。他の１セットは証明を用いて37℃でインキュベートされた。復帰突然変異体及び／又は突然変異株は48時間の成長期間の後に検出されらかった。
菌株の貯蔵
各菌株は１％ペプトン−５％グリセロール懸濁において維持され−70℃で貯蔵された。
動物実験に関する接種物の準備
下記はマウスの腹腔内の（i.p.）接種に関する各ワクチン菌株とその親の成長及び懸濁に関する標準化されたプロトコルである。
雌CFWマウス（18乃至20g）（チャールズリバー、ウィルミングトン、MA）が野性型Ｓ．タイフィのLD₅₀値及びΔcrp−10 Δcya−12派生物の毒性の決定のために使用された。静止夜通し培養（37℃）が予め温められたルリア肉汁に1:20希釈されOD₆₀₀≦0.08に達するまで37℃（150rpm）で通気された。野性型及びΔcrp−10 Δcya−1 2 Ｓ．タイフィ細胞が15％（重さ／体積）去勢豚胃粘素（アメリカン研究所、オマハ、NB）において懸濁された。その15％粘素懸濁はpH7への中性化、15p.s.iで121゜Fで10分間のオートクレービングによって準備され、新鮮に準備された無菌第２鉄アンモニウムシトレート/ml（シゲラ、St.ロウイス、MO）の３μｇが適当に希釈されたＳ．タイフィ細胞の付加に先立ち付加された。その細胞懸濁はそこで500μｌ体積において23ゲージニードルを使用してCFWマウスにi.p.投与された。野性型親及びΔcrp−10 Δcya−12派生物のLD₅₀が72時間の死亡率データの記録の後に決定された。野性型親に関するＳ．タイフィ突然変異株の毒性に関する結果に関して表12を参照されたし。

哺乳類細胞培養粘着性及び侵入性アッセイ
Δcrp−10 Δcya−12及びΔcrp−11 Δcya−12菌株のCHO細胞へ粘着及び侵入する能力に関する野性型親菌株と比較したデータが表13に示されている。Ｓ．タイフィ突然変異株は、37℃で、夫々２時間及び４時間を通してCHO細胞の単層に粘着及び／又は侵入する野性型親菌株に比較して減少された能力を示している。

通常人の血清における突然変異株の野性型親に比較した 成長及び残存
成長カーブは先に野性型Ｓ．タイフィを用いて吸収された通常人において実行された。略10⁶cfuのＳ．タイフ ィ Δcya Δcrp及び野性型菌株が５％CO₂室において37℃でHEPESを用いて平衡化された各mlの血清に付加された。補体媒介された溶菌活動性が10分間60℃での血清の不活性化及び60分後のＥ．コリＫ−12の成長のチェックによって実証された。通常の血清において、Ｅ．コリＫ−12細胞は60分後血清において殺された。
特に、χ3744（ISP1820,野性型）、χ3769（Ty2,野性型）、χ4073（Ty2 Δcya−12 Δ〔crp−cysG〕−1 0）、χ4346（ISP1829 Δcya−12 Δ〔crp−cysG〕− 10）、及びχ289（Ｅ．コリ Ｋ−12）かルリア肉汁で37℃でスタンディング夜通し培養として成長させられた。人血清は相同野性型Ｓ．タイフィTy2及びISP1820菌株χ3769及びχ3744の夫々を用いて吸収され、20mM HEPESを用いて緩衝されそしてアッセイに関して5CO₂大気においてインキュベートされた。Ｅ．コリ Ｋ−12 χ289菌株は補体媒介された溶菌に関して正の制御を示し同じ菌株は熱不活性化された血清における成長の際にネット成長によって実証された如く負の制御として作用した。
図５は37℃で24時間を通した各菌株のネット成長及び／又は残存を示す。
菌株の寄託
下記に記載された材料は、米国型培養収集（the American Type Culture Collection）、12301 パークローンドライブ、ロックビレ、メリーランド、をもちいた、ブタペスト条約の条件の下の寄託に関する。示されているアクセッション番号は成功した生存度試験の後に割り当てられ、必要料金が支払わられた。該培養へのアクセスは本特許出願が37 CFR 1.14及び35 USC 122の下でそれに与えられるべきである長官によって決定されるものへ未決定の間可能であろう。公衆に対する該培養の取得可能性に関する全ての制限は本出願に基づいた特許の許可に関して取り消されること無いように除去されるであろう。更に、指名された寄託は寄託の期日から30年間、又は最後の寄託要求から５年間、又は米国特許の実施可能期間の内の長い期間維持される。万一培養が生存不可能となったり又は不注意に破壊され又は、核外遺伝子含有菌株がその核外遺伝子を失った場合、それは同じ分類の種類の生存可能な培養によって取り替えられる。ここで述べられる寄託された材料は便宜を意図しており、本発明をこのここでの説明の観点で実行することを要求されず、そして更に、これらの材料は引用によって合体される。

商業的利用
ここで提供される菌株は直接及び間接に、Ｓ．タイフ ィによって引き起こされる病気を防止する、ワクチンを含む免疫原性成分、及びそれによってに対する抗体が交叉反応する他の腸の細菌の生産に適する。これらの菌株は又細菌細胞において組み換え遺伝子上で符号化されるイクスプレッション産物の生産のためのキャリア微生物として有用である。更に、増給された安全性を用いて使用され得るその菌株は、Ｓ．タイフィに対する、及び無毒性Ｓ．タイフィにおいてイクスプレスされる抗原に対する単一クローン及び多クローンの双方の抗体の生産のために有用である。

Claims (8)

1. サルモネラの毒性を制御するものであって菌株の深い組織に定着する能力を減ずる、cdt遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの分離された無毒性菌株。
2. 特許請求の範囲第１項記載のサルモネラの分離された無毒性菌株であって、cya及びcrp遺伝子から選択された遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの分離された無毒性菌株。
3. 特許請求の範囲第１項記載のサルモネラの分離された無毒性菌株であって、cya遺伝子における突然変異及びcrp遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの分離された無毒性菌株。
4. サルモネラの毒性を制御するものであって 菌株の深い組織に定着する能力を減ずる、cdt遺伝子に おける突然変異よりなるS.タイフィの分離された菌株。
5. 特許請求の範囲第１項記載の菌株及び製薬 的に許容され得る賦形剤よりなる免疫原性因子。
6. サルモネラの毒性を制御するものであって 菌株の深い組織に定着する能力を減ずる、cdt遺伝子に おける突然変異よりなる無毒性サルモネラの菌株を利用 する方法であって、生理的に許容し得る賦形剤における 該菌株の懸濁によって免疫原性因子を調製することより なる方法。
7. 特許請求の範囲第６項記載の無毒性サルモ ネラの菌株を利用する方法であって、該菌株は更にcya 又はcrp遺伝子における突然変異よりなる方法。
8. 特許請求の範囲第６項記載の無毒性サルモ ネラの菌株を利用する方法であって、該菌株は更にcya 遺伝子における突然変異及びcrp遺伝子における突然変 異よりなる方法。

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