JP3604554B2

JP3604554B2 - Terphenyl derivatives and uses

Info

Publication number: JP3604554B2
Application number: JP04949398A
Authority: JP
Inventors: 進吾酒井; 哲也佐用; 紳太郎井上; 洋和河岸; 弘晃村上
Original assignee: 株式会社カネボウ化粧品
Priority date: 1998-03-02
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2004-12-22
Anticipated expiration: 2018-03-02
Also published as: JPH11246545A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化粧料、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している乾皮症，乾せん，あれ肌，乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待できるヒアルロン酸分解阻害剤及び治療剤、並びにあれ肌又は乾燥肌防止剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリクスを形成することに基づく細胞の保持、臓器組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力への抵抗、及び細菌感染の防止等多くの機能を有している（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、８巻、３４６頁、１９９１年）。
【０００３】
さらに、近年ヒアルロン酸はその分子量によってさまざまな生理作用を持つことがわかってきた。例えば、生体内で合成されていると考えられている高分子ヒアルロン酸（分子量１００万以上）はプロテオグリカン遊離抑制作用，ブラジキニン関節疼痛抑制作用，損傷軟骨修復作用，関節炎抑制作用を持つことから炎症抑制効果を持ち（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、１１巻、６３２頁、１９９１年）、その分解（低分子化）産物である低分子化ヒアルロン酸は、血管新生促進作用（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８巻，１３２４頁，１９８５年）、白血球走化性促進作用（特公平６─８３２３号公報）を持つことから炎症促進作用を持つと考えられている。そして老化による皮膚のヒアルロン酸の減少は皮膚の水分環境や柔軟性、張りやしわの形成に大きく関与していると考えられている（ＩｎｔＪＤｅｒｍａｔｏｌ（１９９４），３３，１１９−１２２）（ＩｎｔＪＤｅｒｍａｔｏｌ（１９９６）３５，５３９−５４４）。
【０００４】
以上のことからヒアルロン酸の低分子化は肝炎，歯肉炎（炎症、４巻、４３７頁、１９８４年），関節リウマチ，変形性関節症（結合組織、２５巻、２４３頁、１９９４年），悪性腫瘍（Ｊ．ＣｅｌｌａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６０巻，２７５頁，１９９４年）の症状悪化に密接に関連すると考えられ、さらに老化によるヒアルロン酸の減少は皮膚の張り減少、しわ形成にも関連し、従ってヒアルロン酸の低分子化を予防・防止するヒアルロン酸の分解阻害剤及び化粧料が望まれている。
【０００５】
実際、結合組織中のヒアルロン酸を低分子化するヒアルロニダーゼが想定され、その阻害剤が薬理効果があることが期待された（炎症、４巻、４３７頁、１９８４年）。しかし、ヒト結合組織を形成する線維芽細胞からヒアルロニダーゼが単離された報告はいまだなく、そのためヒト線維芽細胞の酵素が牛精巣由来のヒアルロニダーゼと同様な性質を持っていると仮定し、牛精巣由来のヒアルロニダーゼを用いた種々の阻害剤が報告されている（特公平６─２９２７１号公報、特公平６─４５８４号公報、特開平５─１７８８７６号公報、特開平６─８０５５３号公報、特開平６─８０５７６号公報、特開平６─９４１５号公報、特開平６─９４１６号公報、特開平３─６８５１５号公報）のが現状である。
【０００６】
しかし、近年、関節に存在するヒト滑膜細胞（結合組織、２５巻、２４３頁、１９９４年），ヒト子宮けい管細胞（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３４７巻，９５頁、１９９４年），ヒト皮膚線維芽細胞（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１７２巻，７０頁、１９９０年），ヒト肺線維芽細胞（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０巻、１４９２頁、１９９２年）において、ヒアルロン酸を４糖、６糖にまで分解する牛精巣由来のヒアルロニダーゼとは明らかに異なるエンド型のヒアルロン酸分解機構の存在が報告されている。これらのことから精巣由来のヒアルロニダーゼの阻害剤ではヒトのヒアルロン酸分解を効果的に阻害することは困難である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的とするところは、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している乾皮症，乾せん，あれ肌，乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかもヒトの線維芽細胞に直接作用し、優れた効果を発揮するヒアルロン酸分解阻害剤及び治療剤、並びにあれ肌又は乾燥肌防止剤を提供するにある。また、しわ防止や張り、柔軟性の改善等に効果のある化粧料を提供するにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、クロカワ抽出物を含有又は有効成分とすることを特徴とする化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤、並びにヒアルロン酸異常分解疾患治療剤によって達成される。また、下記一般式（Ａ）で示されるテルフェニル誘導体を含有又は有効成分とすることを特徴とする化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤によって達成される。即ち、本発明はクロカワ抽出物又は下記一般式（Ａ）で示されるテルフェニル誘導体を含有又は有効成分とする化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤、並びにヒアルロン酸異常分解疾患治療剤にある。
【０００９】
【化６】

（但し、式中Ｒ_１〜Ｒ_４は水酸基又はアセチル基である）
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳説する。
【００１１】
本発明に係るクロカワ抽出エキスを製造する方法としては、イボタケ科由来きのこであるクロカワ（ＢｏｌｅｔｏｐｓｉｓＬｅｕｃｏｍｅｌａｓ）子実体を適当な抽出溶媒に一定期間浸漬すればよく、必要により減圧下還流抽出や加圧抽出等の通常の抽出手段を利用できる。例えば、クロカワ子実体凍結乾燥粉砕物に対し重量比で５〜３０倍の抽出溶媒を加え、通常１５〜５０℃で２４時間〜１週間浸漬して抽出エキスを得る方法等が挙げられる。
また、抽出エキスをろ過又は遠心分離等により不溶物を除去したり、通常の濃縮手段、例えば減圧濃縮等して濃縮抽出エキスとして得ることもできる。また通常の粉末化方法により乾燥エキス末として用いることもできる。
【００１２】
クロカワの乾燥エキス末を製造する方法としては、前記抽出エキスを通常の乾燥手段、例えば減圧乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥等により乾燥エキス末として得る方法等が挙げられる。
【００１３】
クロカワ抽出エキスを製造する際に用いる抽出溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール、１，３ブチレングリコール等の水溶性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。更に酢酸エチル等の極性有機溶媒によって再抽出してもよい。または、クロロフォルム等の非極性溶媒処理によって疎水性物質を除いたあと上述した方法で濃縮、粉末化することもできる。
【００１４】
本発明に係るテルフェニル誘導体は、例えば、上記のクロカワ抽出エキス又はその乾燥エキス末から得ることができる。
【００１５】
本発明に係るテルフェニル誘導体を単離する方法としては、前記クロカワ抽出エキス又は乾燥エキス末を酢酸エチル等の有機溶媒で再抽出し、シリカゲルカラム等の分離手段で精製してテルフェニル誘導体画分として得る、又は更にシリカゲルカラム等の分離手段を繰り返したり、ＨＰＬＣを用いて単離する方法等が挙げられる。
【００１６】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤は、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している疾患に対して、優れた治療剤として用いることができ、また乾燥肌又はあれ肌防止剤としても用いられる。また、老化による皮膚の張り低下やしわの形成を予防する効果が期待できる。更には、通常の化粧品等の有効成分としての他、培養細胞系に添加して研究・試験用試薬等として用いることもできる。化粧料として用いる場合は、特に（頭皮を含む）皮膚に適用する皮膚化粧料が望ましい。尚、本発明において化粧料とは歯磨き、入浴剤をも包含するものである。歯磨きに用いた場合、歯肉炎の予防効果が期待できる。
【００１７】
本発明において疾患とは、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している症状を示し、ヒアルロン酸分解の結果として患部で水分保持能力が低下している乾皮症，乾燥肌，あれ肌，その他光加齢や老化にともなう張り、柔軟性の低下やしわの形成した症状を含む。
【００１８】
本発明におけるヒアルロン酸異常分解疾患治療剤とは、ヒアルロン酸の分解が亢進した疾患に適用する薬剤を言い、改善効果を奏するものも含む。
【００１９】
ヒスタミンは線維芽細胞のヒアルロン酸分解を促進することが知られていることから（特開平８─２２５４４７号公報）、前記ヒアルロン酸の分解亢進が伴う疾患の内、特にマスト細胞の浸潤によりヒスタミン量が増大していると考えられる光加齢に対しても効果が期待できる。
【００２０】
本発明における防止剤とは、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者に適用するもの、及び予防として正常人が適用するものをいい、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者が適用するのが特に好ましい。
【００２１】
本発明の化粧料の形態としては、適当な賦形剤，担体，希釈剤を用いて、ゲル，クリーム，スプレー剤，貼付剤，ローション，パック類，乳液，パウダー，入浴剤（顆粒剤、液剤、粉末等）等、化粧品に一般に用いられている種々の剤形に調製することができる。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及び防止剤の形態としては、適当な賦形剤，担体，希釈剤を用いて、錠剤，液剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，軟膏剤，貼付剤，注射剤，坐剤，入浴剤等の剤形とすることができ、またゲル，クリーム，スプレー剤，貼付剤，ローション，パック類，乳液，パウダー等の剤形を挙げることができる。
【００２３】
上記化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及び防止剤の調製は、常法によって行われ、例えば、固形製剤については用途によって通常の医薬部外品添加物，食品添加物，化粧品添加物等適宜選択でき、例えば、乳糖，でんぷん，結晶セルロース，タルク等を用いて製剤化することができる。カプセル剤はそのようにして調製された細粒剤，散剤等を適当なカプセルに充填して得ることができる。液剤は白糖，カルボキシメチルセルロース等を含む水溶液に本発明の薬剤を溶解、又は懸濁することにより調製することができる。
【００２４】
また本発明の化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及び防止剤に使用される賦形剤又は補助剤としては、本発明の効果を損なわない範囲において、通常化粧品，医薬品，医薬部外品，食品等に使用されるものが使用可能であり、用途、剤形に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばワセリン，スクワラン等の炭化水素類、ステアリルアルコール等の高級アルコール類、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル類、ラノリン酸等の動物性油脂類、グリセリン，プロピレングリコール等の多価アルコール類、グリセリン脂肪酸エステル，モノステアリン酸ポリエチレングリコール，ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸等の各種有機酸や無機酸及びそれらの塩、水、及びエタノール等が挙げられる。
【００２５】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤を培養細胞系において研究・試験用試薬として用いる場合、配合量としては、培養細胞により高分子ヒアルロン酸を産生させるときは、クロカワ抽出エキス乾燥重量又はテルフェニル誘導体として培養液中に０．１μＭ以上含有されるのが好ましく、更に好ましくは１μＭ〜１ｍＭが望ましい。
【００２６】
また、本発明の化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤におけるクロカワ抽出エキス、テルフェニル誘導体の配合量としては、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等種々の要因により異なり一概には規定できないが、適用する組成物の総量を１００ｇ基準として、０．０００１ｇ〜１．５ｇが好ましく、特に０．００１ｇ〜１ｇが好ましい。０．０００１ｇ未満では本発明の効果が得られない場合があり、１．５ｇを超えて配合しても配合量に見合った効果が得られない場合がある。尚、該抽出エキスにおいては上記数値は乾燥エキス末としての換算値を適用する。
【００２７】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及びあれ肌又は乾燥肌防止剤の投与方法としては、経口又は非経口投与が可能である。
【００２８】
通常１日当たり投与量としては、経口投与では、テルフェニル誘導体の量として１μｇ〜１ｇが好ましく、特に５μｇ〜０．１ｇが好ましい。非経口投与では、５０μｇ〜０．１ｇが好ましい。しかしながら、投与量は、目的、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等により適宜変更されうるものであり、一概には規定できない。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例、比較例により本発明を更に詳しく説明する。
尚、実施例に先立ちヒアルロン酸分解阻害剤の効果を調べるための評価系について説明する。以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥと略記する。
【００３０】
（１）ＭＥＭ培地の調製法
ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（大日本製薬社製、１０−１０１）１０．６ｇにそれぞれ終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）ＮｏｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００３１】
（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００３２】
（３）細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０^５個／ｍｌに調整し、２２５ｃｍ^２のフラスコに５０ｍｌ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後、ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ．社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍｌ）、さらに３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をＵｎｄｅｒｈｉｌｌらの方法（Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、さらにゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００３３】
（４）高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０^５個／ｍｌに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍｌずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４０００ＤＰＭ／ｍｌ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。尚、培地交換時にヒスタミン（１０μＭとなるように）と各種評価を行う薬剤（試料）を添加した。
【００３４】
（５）細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍｌをセファロースＣＬ─２Ｂカラム（内径１ｃｍ，長さ６０ｃｍ）にアプライし、以下の条件でゲルろ過を行った。
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
分画：４ｍｌ／画分
分画総数：２５
更に分子量１０万以下のヒアルロン酸が溶出する画分１０〜２５の１６本を集め、［^３Ｈ］放射活性を測定し，分解したヒアルロン酸の量を求めた。さらに、ヒアルロン酸分解率および分解阻害率は以下の数１および数２によって求めた。
【００３５】
【数１】
ヒアルロン酸分解率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
Ａ＝ヒスタミン添加によるヒアルロン酸分解量
Ｂ＝ヒスタミン＋薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００３６】
【数２】
ヒアルロン酸分解阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ＝ヒスタミン添加によるヒアルロン酸分解量
Ｂ＝ヒスタミン＋薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００３７】
実施例１（クロカワ抽出エキスの調製）
クロカワの子実体４ｋｇ９０％エタノールで抽出後、減圧乾燥し、アセトンで抽出後、減圧下アセトンを留去した。クロロフォルムで疎水性画分を除いたあと、さらに酢酸エチルにて可溶化し、酢酸エチル可溶性画分（２４ｇ）を得た。
【００３８】
実施例２
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２，０／１０）で展開し、１０画分を得、第９画分を減圧濃縮し４．８ｇを得た。
【００３９】
実施例３
上記実施例２（４．８ｇ）をシリカゲルカラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／メタノール（８／２，０／１０）で展開し、１４画分を得、第６画分を減圧濃縮し７１０．５ｍｇのテルフェニル誘導体含有画分を得た。
【００４０】
実施例４
上記テルフェニル誘導体含有画分７１０．５ｍｇをＭＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、７０％メタノールで分画し、５画分を得、第３画分（１７．２ｍｇ）を減圧濃縮し、さらにＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、９０％メタノールで５分画し、第３分画より５ｍｇのテルフェニル誘導体を得、以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりジアセテートテルフェニル誘導体化７であることを確認した。
【００４１】
【化７】

（但し、式中Ａｃはアセチル基である）
【００４２】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ；１．９７，２．４２，６．８６（ｄ，８．６），７．０７（ｓ），７．１２（ｓ），７．１８（ｄ，８．６）
【００４３】
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ；２０．１，２０．３，１７０．３，１７０．６，９９．３，１０７．３，１１４．９，１１５．９，１１９．２，１２２．０，１２５．１，１２９．５，１３２．８，１３７．２，１３８．８，１４３．６，１４４．２，１４７．９，１５２．３，１５７．８
【００４４】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ４２５
【００４５】
実施例５
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２，０／１０）で展開し、１３画分を得、第４画分を減圧濃縮し１．３ｇを得た。その内１０１．１ｍｇをＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、７０％メタノールで溶出し、９画分を得、第２画分を減圧濃縮し１７．８ｍｇのテルフェニル誘導体を得た。以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりテトラアセテートテルフェニル誘導体化８であることを確認した。
【００４６】
【化８】

（但し、式中Ａｃはアセチル基である）
【００４７】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ；２．０６，２．２１，２．３２，２．４３，６．５７（ｓ），６．６５（ｓ），７．１６（ｄ，８．９），７．２９（ｄ，８．９）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ；１．９９，２．１２，２．２９，２．４７，７．０２（ｓ），７．１６（ｓ），７．１８（ｄ，８．３），７．２９（ｄ，８．３）
【００４８】
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ；２０．３，２０．５，２０．６，２１．３，１６７．８，１６９．３，１７０．３，１７１．１，９８．０，１０６．１，１１２．７，１２０．５，１２１．７，１２５．７，１２９．２，１３０．３，１３０．９，１３３．８，１３５．８，１４１．７，１４５．６，１４５．９，１５０．９，１５１．８
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ；２０．０，２０．０，２０．３，２０．９，１６９．４，１６９．８，１７０．０，１７１．０，９９．４，１０７．４，１１４．１，１２１．１，１２２．７，１２７．２，１３０．９，１３１．９，１３２．２，１３５．１，１３７．１，１４４．４，１４７．３，１４９．０，１５２．２，１５２．８
【００４９】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ５０９
【００５０】
実施例６
上記実施例２（４．８ｇ）をシリカゲルカラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／メタノール（８／２，０／１０）で展開し、１４画分を得、第１４画分を減圧濃縮し４５４．５ｍｇのテルフェニル誘導体含有画分を得た。その画分の１５１．１ｍｇをＨＰＬＣ（ｆｌｕｏｆｉｘカラム）に供与し、４５％メタノールで分画し、１１画分を得、第６画分より１０．４ｍｇテルフェニル誘導体を得、以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりテルフェニル誘導体化９であることを確認した。
【００５１】
【化９】

【００５２】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；６．６７（ｄ，８．３），７．１４（ｓ），７．２７（ｓ），７．３３（ｄ，８．３）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ；６．７４（ｄ，６．５）７．０４（ｓ），７．２５（ｄ，６．５），７．３０（ｓ）
【００５３】
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；９８．９，１０５．２，１１２．６，１１３．３，１１４．１，１１５．２，１２７．７，１３２．０，１４３．７，１４４．７，１４５．８，１５３．７，１５８．２，
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ；９９．４，１０６．５，１１５．３，１１５．６，１１６．８，１２６．０，１３３．６，１４６．６，１４８．５，１５２．１，１５６．７
【００５４】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ３４１
【００５５】
実施例７
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２，０／１０）で展開し、１３画分を得、第７画分を減圧濃縮し２８４．９ｍｇを得た。それを分取用ＴＬＣに供与しクロロフォルム／メタノール（８／２）で展開分取し、６画分を得、第２画分を減圧濃縮し１２０．５ｍｇを得て、それをＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、７０％メタノールで分画し、６画分を得、第３画分より４０．２ｍｇのテルフェニル誘導体を得た。以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりトリアセテートテルフェニル誘導体化１０であることを確認した。
【００５６】
【化１０】

（但し、式中Ａｃはアセチル基である）
【００５７】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ；１．９９，２．１１，２．４４，６．８６（ｄ，８．６），７．０３（ｓ），７．１０（ｄ，８．６），７．１４（ｓ）
【００５８】
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ；２０．０，２０．１，２０．３，１６９．７，１７０．２，１７０．４，９９．４，１０７．４，１１４．１，１１６．１，１２０．３，１２４．０，１２８．０，１３１．８，１３２．１，１３４．９，１３７．０，１４４．１，１４７．１，１４８．５，１５２．６，１５８．３
【００５９】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ４６７
【００６０】
実施例８
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２，０／１０）で展開し、１３画分を得、第１０画分を減圧濃縮し２．６ｇを得た。これをシリカゲルカラムに供与しクロロフォルム／メタノール（８／２，０／１０）で溶出し、９画分を得、第５画分を減圧濃縮し７８５．８ｍｇを得た。その画分の１９９．１ｍｇをそれをＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、５０％メタノールで分画し、９画分を得、第５画分より４７．９ｍｇのテルフェニル誘導体を得た。以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりテトラアセテートテルフェニル誘導体化１１であることを確認した。
【００６１】
【化１１】

（但し、式中Ｒ_５、Ｒ_６はいずれかがアセチル基で、他方は水酸基である）
【００６２】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ；２．０４，６．８５（ｄ，８．３），６．９１（ｓ），７．１６（ｄ，８．３），７．４９（ｓ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；２．１３，６．８７（ｄ，８．３），７．０３（ｓ），７．１４（ｄ，８．３），７．５１（ｓ）
【００６３】
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ；２０．２，１７１．２，９９．０，１０８．７，１１５．０，１１６．０，１１６．３，１２３．３，１２５．４，１２６．２，１３２．７，１３７．８，１３９．４，１４２．９，１４３．８，１４６．３，１５１．８，１５７．８
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；２０．２，１６８．７，９８．３，１０７．５，１１３．７，１１４．２，１１４．７，１１４．５，１１４．７，１２２．２，１２３．８，１２４．６，１３１．３，１３２．１，１４１．７，１４５．６，１４９．５，１５６．５
【００６４】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ３８３
【００６５】
実施例１〜６、比較例３
実施例１〜６をそれぞれ５０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶解し、それぞれのＤＭＳＯ溶液を調整した。また、比較例３として従来知られている牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチン（炎症、４巻、ＮＯ４、４３７（１９８４））０．１８ｇを水１０ｇに溶解し、水溶液（２００μＭ）を調整した。
【００６６】
試験例
実施例１〜６、比較例１（水溶液）、比較例２（ＤＭＳＯのみ）並びに上記比較例３を用いて、前述した（５）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解を調べ、ヒアルロン酸分解率およびヒアルロン酸分解阻害率を前記数１、数２より算出した。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】

【００６８】
その結果、ヒスタミン添加によって無添加時よりヒアルロン酸の分解は促進された状態において、実施例１〜６のテルフェニル誘導体を含むクロカワ抽出エキス、テルフェニル誘導体画分、テルフェニル誘導体、いずれの薬剤においてもヒアルロン酸分解の阻害効果が認められた。また比較例３に示した牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチンの添加は、ヒトの細胞培養系である本評価系において全く効果がないことがわかった。
【００６９】
この結果からテルフェニル誘導体は、ヒトのヒアルロン酸分解阻害剤として有効であることは明らかである。また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤はヒアルロン酸分解が異常に亢進している疾患に有効であると考えられる。
【００７０】
実施例９〜１１（錠剤）
以下実施例中の表中の値は、特段の断りなければ全て重量％である。
【００７１】
【表２】

【００７２】
上記表２の各成分を均一に混合し、常法に従って、１錠１７０ｍｇとなるように打錠し、錠剤を調製した。
【００７３】
実施例１２〜１４（カプセル剤）
【００７４】
【表３】

【００７５】
上記表３中の各成分を均一に混合し、常法に従って、混合物の１５０ｍｇを３号硬カプセルに充填した。
【００７６】
実施例１５〜１７（液剤）
【００７７】
【表４】

【００７８】
精製水に上記表４中のの各成分を溶解し、攪拌均一化してシロップ剤とした。
【００７９】
実施例１８〜２１（クリーム）
【００８０】
【表５】

【００８１】
上記表５中において、成分（Ａ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｂ）を混合溶解した（混合液Ｉ）。これとは別に、成分（Ｄ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｃ）を混合溶解した（混合液ＩＩ）。つぎに、混合液Ｉに、徐々に混合液ＩＩを加えて、充分攪拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００８２】
実施例２２〜２５（ローション）
【００８３】
【表６】

【００８４】
上記表６中の各成分を常法により混合溶解して、ローションを調製した。
【００８５】
実施例２６〜２７（入浴剤）
【００８６】
【表７】

【００８７】
上記表７中の各成分を混合し、常法により入浴剤を調製した。なお、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈されて使用される。
【００８８】
実施例２８〜３０（薬用練歯磨）
【００８９】
【表８】

【００９０】
常法に従い、水、グリセリン，カラギナン，サッカリン，パラオキシ安息香酸ブチル，クロルヘキシジンジグリコネート，香料及びテルフェニル誘導体を計量し、混合して粘結剤を膨潤させたのち、第２リン酸カルシウム，ラウリル硫酸ナトリウムを加え、更によく混合し脱泡したのち、チューブに充填して練歯磨を得た。
【００９１】
実施例３１〜３３（洗口剤）
【００９２】
【表９】

【００９３】
常法に従い、上記表９の組成からなる洗口剤を調製した。
【００９４】
【発明の効果】
以上の様に、本発明により、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を阻害するヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している乾皮症，乾せん，あれ肌，乾燥肌等の疾患に対し優れた効果を発揮するヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及びあれ肌又は乾燥肌防止剤、あれ肌又は乾燥肌防止剤及びしわ防止や張り、柔軟性の改善等に効果のある化粧料を提供できることは明らかである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cosmetic, a hyaluronic acid decomposition inhibitor and a therapeutic agent which can be expected to have a preventive / therapeutic effect on xerosis, psoriasis, irritated skin, dry skin, etc., in which hyaluronic acid degradation is physiologically increased from normal. And an agent for preventing rough or dry skin.
[0002]
[Prior art]
Hyaluronic acid retains water in the intercellular space, retains cells based on the formation of a jelly-like matrix in tissues, retains lubricity and flexibility of organ tissues, resists external forces such as mechanical obstacles, And many functions such as prevention of bacterial infection (BIOINDUSTRY, 8, 346, 1991).
[0003]
Furthermore, it has recently been found that hyaluronic acid has various physiological actions depending on its molecular weight. For example, high-molecular-weight hyaluronic acid (molecular weight of 1,000,000 or more), which is considered to be synthesized in vivo, suppresses proteoglycan release, suppresses bradykinin joint pain, repairs damaged cartilage, and suppresses inflammation. It has an effect (BIO INDUSTRY, Vol. 11, p. 632, 1991), and its degraded (low molecular weight) product, low molecular weight hyaluronic acid, has an angiogenesis promoting action (Science, 228, 1324, 1985). It has a leukocyte chemotaxis-promoting action (Japanese Patent Publication No. 6-8323) and is considered to have an inflammation-promoting action. It is considered that the decrease in hyaluronic acid in the skin due to aging is greatly involved in the moisture environment and flexibility of the skin, and the formation of tension and wrinkles (Int J Dermatol (1994), 33, 119-122) (Int). J Dermatol (1996) 35, 539-544).
[0004]
From the above, the low molecular weight of hyaluronic acid is considered to be due to hepatitis, gingivitis (inflammation, vol. 4, p. 437, 1984), rheumatoid arthritis, osteoarthritis (connective tissue, vol. 25, p. 243, 1994), malignancy It is thought to be closely related to the worsening of the symptoms of tumors (J. Cellar Physiology, 160, 275, 1994), and further, the decrease in hyaluronic acid due to aging is also associated with decreased skin tension and wrinkling, and thus hyaluronic acid. There is a need for hyaluronic acid degradation inhibitors and cosmetics that prevent and prevent the formation of low molecular weight compounds.
[0005]
In fact, hyaluronidase which reduces the molecular weight of hyaluronic acid in connective tissue was assumed, and it was expected that the inhibitor would have a pharmacological effect (Inflammation, Vol. 4, 437, 1984). However, there have been no reports of the isolation of hyaluronidase from fibroblasts that form human connective tissue.Therefore, it was assumed that the enzyme of human fibroblasts had properties similar to those of bovine testis-derived hyaluronidase. Various inhibitors using hyaluronidases derived from the same have been reported (JP-B-6-29271, JP-B-6-4584, JP-A-5-178876, JP-A-6-80553, JP-A-6-80553). At present, Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 6-80576, 6-9415, 6-9416, and 3-65515.
[0006]
However, in recent years, human synovial cells present in joints (connective tissue, Vol. 25, p. 243, 1994), human cervical duct cells (FEBS Letters, 347, p. 95, 1994), human dermal fibroblasts (BBA, 172, 70, 1990) and human lung fibroblasts (J. Clin. Invest. 90, 1492, 1992) convert hyaluronic acid to tetrasaccharide and hexasaccharide. It has been reported that there is an endo-type hyaluronan-degrading mechanism that is clearly different from bovine testis-derived hyaluronidase, which degrades to the maximum. For these reasons, it is difficult for an inhibitor of testicular hyaluronidase to effectively inhibit the degradation of human hyaluronic acid.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a preventive / therapeutic effect for xerosis, psoriasis, rough skin, dry skin, etc., in which hyaluronic acid degradation is physiologically higher than normal, and furthermore, human fiber It is an object of the present invention to provide a hyaluronic acid degradation inhibitor and a therapeutic agent which directly act on blast cells and exhibit excellent effects, and an agent for preventing rough or dry skin. Another object of the present invention is to provide a cosmetic that is effective in preventing wrinkles, improving tension, improving flexibility, and the like.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The above object is achieved by a cosmetic containing an extract of Kurokawa or as an active ingredient, a hyaluronic acid decomposition inhibitor, a rough skin or dry skin inhibitor, and a therapeutic agent for an abnormal hyaluronic acid degradation disease. . Further, the present invention is achieved by a cosmetic, a hyaluronic acid decomposition inhibitor, and a rough skin or dry skin inhibitor characterized by containing a terphenyl derivative represented by the following general formula (A) or as an active ingredient. That is, the present invention provides a cosmetic, a hyaluronic acid degradation inhibitor, a rough skin or dry skin inhibitor, and an abnormal hyaluronic acid, comprising or as an active ingredient a Kurokawa extract or a terphenyl derivative represented by the following general formula (A). Degraded disease therapeutic agents.
[0009]
Embedded image

(Where R ₁ ~ R ₄ Is a hydroxyl group or an acetyl group)
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
[0011]
As a method for producing the extract of Kurokawa according to the present invention, the fruiting body of Kurokawa (Boleoptis Leucomelas), which is a mushroom derived from Ibotaceae, may be immersed in an appropriate extraction solvent for a certain period of time. Ordinary extraction means such as can be used. For example, a method of adding an extraction solvent in a weight ratio of 5 to 30 times with respect to the freeze-dried and crushed Kurokawa fruit body, and immersing it at 15 to 50 ° C. for 24 hours to 1 week to obtain an extract can be mentioned.
In addition, the extract can be removed as a concentrated extract by removing insolubles by filtration or centrifugation, or by a conventional concentration means such as concentration under reduced pressure. It can also be used as a dry extract powder by a usual powdering method.
[0012]
Examples of the method for producing the dried extract powder of Kurokawa include a method of obtaining the extract extract as a dry extract powder by usual drying means, for example, drying under reduced pressure, spray drying or freeze drying.
[0013]
Examples of the extraction solvent used for producing the Kurokawa extract include water, water-soluble organic solvents such as methanol, ethanol, and 1,3-butylene glycol, and a mixed solvent thereof. Further, it may be re-extracted with a polar organic solvent such as ethyl acetate. Alternatively, the hydrophobic substance may be removed by treatment with a non-polar solvent such as chloroform, and then concentrated and powdered by the above-described method.
[0014]
The terphenyl derivative according to the present invention can be obtained, for example, from the aforementioned Kurokawa extract or its dried extract powder.
[0015]
As a method for isolating the terphenyl derivative according to the present invention, the Kurokawa extract or dried extract powder is re-extracted with an organic solvent such as ethyl acetate, and purified by a separation means such as a silica gel column to obtain a terphenyl derivative fraction. Or a method in which a separation means such as a silica gel column or the like is repeated, or isolation is performed using HPLC.
[0016]
The hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention can be used as an excellent therapeutic agent for diseases in which hyaluronic acid degradation is physiologically enhanced from normal, and also used as an agent for preventing dry or rough skin. Can be In addition, the effect of preventing a decrease in skin tension and the formation of wrinkles due to aging can be expected. Further, it can be used as a research / test reagent or the like by being added to a cultured cell system in addition to an active ingredient of ordinary cosmetics. When used as a cosmetic, a skin cosmetic applied to the skin (including the scalp) is particularly desirable. In the present invention, the cosmetics include toothpastes and bath additives. When used for brushing the teeth, the effect of preventing gingivitis can be expected.
[0017]
In the present invention, a disease refers to a symptom in which hyaluronic acid degradation is physiologically increased from normal, and xeroderma, dry skin, and rough skin in which water retention ability is reduced in an affected part as a result of hyaluronic acid degradation. Includes symptoms of light aging, aging, loss of flexibility and wrinkles.
[0018]
The therapeutic agent for an abnormally degraded hyaluronic acid disease in the present invention refers to a drug applied to a disease in which the degradation of hyaluronic acid is enhanced, and includes a drug that has an improving effect.
[0019]
Since histamine is known to promote the degradation of hyaluronic acid in fibroblasts (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-225247), histamine levels are increased by infiltration of mast cells, particularly in the diseases accompanied by the enhanced degradation of hyaluronic acid. The effect can also be expected against light aging, which is considered to be increasing.
[0020]
The inhibitor in the present invention refers to those which are applied to a symptomatic person in which the degradation of hyaluronic acid is physiologically enhanced from normal, and those applied to normal persons as prevention, and the degradation of hyaluronic acid is physiological. It is particularly preferable to apply it to a symptomatic person whose level is higher than normal.
[0021]
As the form of the cosmetic of the present invention, gels, creams, sprays, patches, lotions, packs, emulsions, powders, baths (granules, liquids) using appropriate excipients, carriers and diluents , Powder, etc.) can be prepared into various dosage forms generally used in cosmetics.
[0022]
The form of the hyaluronic acid degradation inhibitor, the therapeutic agent for abnormally degraded hyaluronic acid disease and the preventive agent of the present invention may be any of tablets, liquids, capsules, granules, powders, It can be in the form of ointments, patches, injections, suppositories, baths, etc., and include gels, creams, sprays, patches, lotions, packs, emulsions, powders, etc. Can be.
[0023]
Preparation of the above-mentioned cosmetics, hyaluronic acid decomposition inhibitor, therapeutic agent for abnormal hyaluronic acid degradation disease and inhibitor is carried out by a conventional method. For example, for solid preparations, ordinary quasi-drug additives and food additives are used depending on the use. , Cosmetic additives and the like can be appropriately selected, and for example, can be formulated using lactose, starch, crystalline cellulose, talc and the like. Capsules can be obtained by filling fine granules, powders and the like thus prepared in suitable capsules. Liquid preparations can be prepared by dissolving or suspending the agent of the present invention in an aqueous solution containing sucrose, carboxymethyl cellulose, and the like.
[0024]
As the excipients or auxiliaries used in the cosmetics, hyaluronic acid degradation inhibitors, therapeutic agents for abnormal hyaluronic acid degradation diseases and inhibitors of the present invention, as long as the effects of the present invention are not impaired, ordinary cosmetics and pharmaceuticals , Quasi-drugs, foods, etc. can be used, and are appropriately selected according to the use and dosage form, and are not particularly limited. For example, hydrocarbons such as petrolatum and squalane, higher alcohols such as stearyl alcohol, lower alkyl esters of higher fatty acids such as isopropyl myristate, animal fats and oils such as lanolinic acid, polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol, Surfactants such as glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol monostearate, polyethylene alkyl ether phosphate, preservatives such as methyl paraoxybenzoate and butyl paraoxybenzoate, waxes, resins, various flavors, various pigments, sodium citrate, and carbonic acid Examples include various organic and inorganic acids such as sodium and lactic acid, and salts thereof, water, and ethanol.
[0025]
When the hyaluronic acid decomposition inhibitor of the present invention is used as a reagent for research and testing in a cultured cell system, when the blended amount is to produce high molecular hyaluronic acid by cultured cells, the dry weight of Kurokawa extract extract or terphenyl derivative is used. It is preferably contained in the culture solution at 0.1 μM or more, more preferably 1 μM to 1 mM.
[0026]
In addition, the amount of the Kurokawa extract and the terphenyl derivative in the cosmetic, the inhibitor of hyaluronic acid degradation, the therapeutic agent for abnormally degraded hyaluronic acid disease, and the agent for preventing rough or dry skin according to the present invention may vary depending on the type of the target disease Although it depends on various factors such as the degree, degree, age, weight, and sex of the patient and cannot be specified unconditionally, 0.0001 g to 1.01 g based on 100 g of the total amount of the composition to be applied. 5 g is preferable, and 0.001 g to 1 g is particularly preferable. If the amount is less than 0.0001 g, the effect of the present invention may not be obtained, and if the amount exceeds 1.5 g, the effect corresponding to the amount may not be obtained. In addition, in the said extract, the said numerical value applies the conversion value as a dry extract powder.
[0027]
The method of administering the hyaluronic acid degradation inhibitor, the therapeutic agent for abnormally degraded hyaluronic acid disease, and the agent for preventing rough or dry skin of the present invention may be oral or parenteral.
[0028]
Usually, the daily dose is preferably 1 μg to 1 g, more preferably 5 μg to 0.1 g, as the amount of the terphenyl derivative for oral administration. For parenteral administration, 50 g to 0.1 g is preferred. However, the dose can be appropriately changed depending on the purpose, the type and degree of the target disease, the age, weight, sex, etc. of the patient, and cannot be unconditionally defined.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples.
Prior to Examples, an evaluation system for examining the effect of a hyaluronic acid degradation inhibitor will be described. Hereinafter, polyoxyethylene is abbreviated as POE.
[0030]
(1) Preparation method of MEM medium
Minimum Essential Medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 10-101) 10.6 (V / V) 1% (V / V) Non Essential Amino Acid (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 16-810), 1 mM sodium pyruvate in each 10.6 g Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 16-820), 1.2% (W / V) sodium bicarbonate and distilled water were added to make 1 liter, and then the pH was adjusted to about 7 by blowing carbon dioxide gas (hereinafter referred to as MEM medium). Abbreviated).
[0031]
(2) Inactivation of fetal bovine serum (FBS)
FBS (Irvine Scientific) was heated at 56 ° C. for 30 minutes.
[0032]
(3) Method for preparing polymer tritium hyaluronic acid for cell addition
The number of cells of a normal human fibroblast cell line [Detroit 551 (ATCC CCL 110)] was increased to 2 × 10 4 in a MEM medium containing 10% (V / V) of inactivated FBS. ⁵ Adjust to pcs / ml, 225cm ² Was placed in a flask, and cultured for 3 days to obtain a confluent state. Thereafter, tritium glucosamine (manufactured by American Radioactive Chemicals Inc.), which is a precursor of hyaluronic acid, was added to the culture system (10 μCi / ml). After further culturing for 3 days, tritium-labeled hyaluronic acid was removed from the culture solution to Underhill. Purification was performed by the method of J. Cell Biology, Vol. 82, p. 475, 1979, and a high molecular weight tritium hyaluronic acid (specific radioactivity 0.1 μCi / μg) having a molecular weight of 1,000,000 or more was prepared by a gel filtration column. . This was used as a polymer tritium hyaluronic acid for addition to a cell culture system.
[0033]
(4) Addition culture of polymer tritium hyaluronic acid
The number of cells of a normal human fibroblast cell line [Detroit 551 (ATCC CCL 110)] was increased to 1.5 × 10 5 in a MEM medium containing 10% (V / V) of inactivated FBS. ⁵ 0.8 ml each was inoculated on a 12-well plate (manufactured by Falcon), and 3 days at 37 ° C. in an atmosphere of 95% (V / V) air-5% (V / V) carbon dioxide gas. The culture was allowed to stand, and the medium was changed to MEM medium only, followed by culturing for one day. Thereafter, a MEM medium containing high molecular tritium hyaluronic acid (14000 DPM / ml) was prepared, the medium was replaced, and the cells were cultured for 3 days. In addition, histamine (to be 10 μM) and a drug (sample) for various evaluations were added at the time of medium exchange.
[0034]
(5) Evaluation of degradation of polymer tritium hyaluronic acid by cells
After completion of the culture, the culture solution was collected, and subjected to a heat treatment at 100 ° C. for 5 minutes. Then, 1 ml of the medium was applied to a Sepharose CL # 2B column (1 cm in inner diameter, 60 cm in length), and subjected to gel filtration under the following conditions. Was.
Flow rate: 0.6 ml / min
Fractionation: 4 ml / fraction
Total number of fractions: 25
Further, 16 of fractions 10 to 25 in which hyaluronic acid having a molecular weight of 100,000 or less eluted were collected, and [ ³ H] The radioactivity was measured to determine the amount of decomposed hyaluronic acid. Further, the hyaluronic acid decomposition rate and the decomposition inhibition rate were determined by the following equations (1) and (2).
[0035]
(Equation 1)
Hyaluronic acid decomposition rate (%) = B / A × 100
A = Amount of hyaluronic acid decomposed by histamine addition
B = Decomposition amount of hyaluronic acid by addition of histamine + drug
[0036]
(Equation 2)
Hyaluronic acid degradation inhibition rate (%) = (1-B / A) × 100
A = Amount of hyaluronic acid decomposed by histamine addition
B = Decomposition amount of hyaluronic acid by addition of histamine + drug
[0037]
Example 1 (Preparation of Kurokawa Extract)
4 kg of Kurokawa fruiting bodies were extracted with 90% ethanol, dried under reduced pressure, extracted with acetone, and acetone was distilled off under reduced pressure. After removing the hydrophobic fraction with chloroform, the mixture was further solubilized with ethyl acetate to obtain an ethyl acetate-soluble fraction (24 g).
[0038]
Example 2
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 above was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10/0, 8/2) and chloroform / methanol (9/1, 8/2) were used as developing solvents. , 0/10) to obtain 10 fractions, and the ninth fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 4.8 g.
[0039]
Example 3
The above Example 2 (4.8 g) was donated to a silica gel column and developed with chloroform / methanol (8/2, 0/10) as a developing solvent to obtain 14 fractions. A 0.5 mg terphenyl derivative-containing fraction was obtained.
[0040]
Example 4
The above terphenyl derivative-containing fraction (710.5 mg) was donated to MPLC (ODS column) and fractionated with 70% methanol to obtain 5 fractions. The third fraction (17.2 mg) was concentrated under reduced pressure, and further subjected to HPLC. (ODS column), and fractionated with 90% methanol for 5 minutes to obtain 5 mg of a terphenyl derivative from the third fraction. The following NMR signal (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (Japan) It was confirmed to be diacetate terphenyl derivative 7 by JEOL-DX303HF (manufactured by Denshi Co., Ltd.).
[0041]
Embedded image

(Where Ac is an acetyl group)
[0042]
¹ H-NMR (CD ₃ OD) δ; 1.97, 2.42, 6.86 (d, 8.6), 7.07 (s), 7.12 (s), 7.18 (d, 8.6)
[0043]
^Thirteen C-NMR (CD ₃ OD) δ; 20.1, 20.3, 170.3, 170.6, 99.3, 107.3, 114.9, 115.9, 119.2, 122.0, 125.1, 129. 5, 132.8, 137.2, 138.8, 143.6, 144.2, 147.9, 152.3, 157.8
[0044]
FAB-MS (Pos.): M / z 425
[0045]
Example 5
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 above was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10/0, 8/2) and chloroform / methanol (9/1, 8/2) were used as developing solvents. , 0/10) to obtain 13 fractions, and the fourth fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 1.3 g. 101.1 mg thereof was supplied to HPLC (ODS column) and eluted with 70% methanol to obtain 9 fractions, and the second fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 17.8 mg of a terphenyl derivative. The following NMR signal (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-DX303HF) confirmed that the compound was tetraacetate terphenyl derivative 8.
[0046]
Embedded image

(Where Ac is an acetyl group)
[0047]
¹ H-NMR (CDCl ₃ ) Δ; 2.06, 2.21, 2.32, 2.43, 6.57 (s), 6.65 (s), 7.16 (d, 8.9), 7.29 (d, 8.9)
¹ H-NMR (CD ₃ OD) δ; 1.99, 2.12, 2.29, 2.47, 7.02 (s), 7.16 (s), 7.18 (d, 8.3), 7.29 (d , 8.3)
[0048]
^Thirteen C-NMR (CDCl ₃ 2), 20.5, 20.6, 21.3, 167.8, 169.3, 170.3, 171.1, 98.0, 108.0, 112.7, 120.5 , 121.7, 125.7, 129.2, 130.3, 130.9, 133.8, 135.8, 141.7, 145.6, 145.9, 150.9, 151.8.
^Thirteen C-NMR (CD ₃ OD) δ; 20.0, 20.0, 20.3, 20.9, 169.4, 169.8, 170.0, 171.0, 99.4, 107.4, 114.1, 121. 1, 122.7, 127.2, 130.9, 131.9, 132.2, 135.1, 137.1, 144.4, 147.3, 149.0, 152.2, 152.8
[0049]
FAB-MS (Pos.): M / z 509
[0050]
Example 6
The above Example 2 (4.8 g) was donated to a silica gel column and developed with chloroform / methanol (8/2, 0/10) as a developing solvent to obtain 14 fractions. The 14th fraction was concentrated under reduced pressure to 454 g. A 0.5 mg terphenyl derivative-containing fraction was obtained. 151.1 mg of the fraction was donated to HPLC (fluofix column), fractionated with 45% methanol to obtain 11 fractions, 10.4 mg terphenyl derivative was obtained from the 6th fraction, and the NMR signal shown below (JEOL-LAMBDA, manufactured by JEOL Ltd.) and mass spectrum (JEOL-DX303HF, manufactured by JEOL Ltd.) were confirmed to be terphenyl derivative 9.
[0051]
Embedded image

[0052]
¹ H-NMR (d-DMSO) δ; 6.67 (d, 8.3), 7.14 (s), 7.27 (s), 7.33 (d, 8.3)
¹ H-NMR (CD ₃ OD) δ; 6.74 (d, 6.5) 7.04 (s), 7.25 (d, 6.5), 7.30 (s)
[0053]
^Thirteen C-NMR (d-DMSO) δ; 98.9, 105.2, 112.6, 113.3, 114.1, 115.2, 127.7, 132.0, 143.7, 144.7, 145.8, 153.7, 158.2,
^Thirteen C-NMR (CD ₃ OD) [delta]; 99.4, 106.5, 115.3, 115.6, 116.8, 126.0, 133.6, 146.6, 148.5, 158.5, 152.1, 156.7.
[0054]
FAB-MS (Pos.): M / z 341
[0055]
Example 7
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 above was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10/0, 8/2) and chloroform / methanol (9/1, 8/2) were used as developing solvents. , 0/10) to obtain 13 fractions, and the 7th fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 284.9 mg. It was donated to preparative TLC and developed and fractionated with chloroform / methanol (8/2) to obtain 6 fractions, and the second fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 120.5 mg, which was subjected to HPLC (ODS column). ) And fractionated with 70% methanol to obtain 6 fractions, and 40.2 mg of a terphenyl derivative was obtained from the third fraction. The following NMR signal (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-DX303HF) confirmed that the compound was triacetate terphenyl derivative 10.
[0056]
Embedded image

(Where Ac is an acetyl group)
[0057]
¹ H-NMR (CD ₃ OD) δ; 1.99, 2.11, 2.44, 6.86 (d, 8.6), 7.03 (s), 7.10 (d, 8.6), 7.14 (s) )
[0058]
^Thirteen C-NMR (CD ₃ OD) δ; 20.0, 20.1, 20.3, 169.7, 170.2, 170.4, 99.4, 107.4, 114.1, 116.1, 120.3, 124. 0, 128.0, 131.8, 132.1, 134.9, 137.0, 144.1, 147.1, 148.5, 152.6, 158.3
[0059]
FAB-MS (Pos.): M / z 467
[0060]
Example 8
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 above was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10/0, 8/2) and chloroform / methanol (9/1, 8/2) were used as developing solvents. , 0/10) to obtain 13 fractions, and the 10th fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 2.6 g. This was donated to a silica gel column and eluted with chloroform / methanol (8/2, 0/10) to obtain 9 fractions, and the fifth fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 785.8 mg. 199.1 mg of the fraction was donated to HPLC (ODS column) and fractionated with 50% methanol to obtain 9 fractions. From the fifth fraction, 47.9 mg of a terphenyl derivative was obtained. The following NMR signal (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (manufactured by JEOL Ltd., JEOL-DX303HF) confirmed that it was tetraacetate terphenyl derivative 11.
[0061]
Embedded image

(Where R ₅ , R ₆ Is either an acetyl group and the other is a hydroxyl group)
[0062]
¹ H-NMR (CD ₃ OD) δ; 2.04, 6.85 (d, 8.3), 6.91 (s), 7.16 (d, 8.3), 7.49 (s)
¹ H-NMR (d-DMSO) δ; 2.13, 6.87 (d, 8.3), 7.03 (s), 7.14 (d, 8.3), 7.51 (s)
[0063]
^Thirteen C-NMR (CD ₃ OD) δ; 20.2, 171.2, 99.0, 108.7, 115.0, 116.0, 116.3, 123.3, 125.4, 126.2, 132.7, 137. 8, 139.4, 142.9, 143.8, 146.3, 151.8, 157.8
^Thirteen C-NMR (d-DMSO) δ; 20.2, 168.7, 98.3, 107.5, 113.7, 114.2, 114.7, 114.5, 114.7, 122.2, 123.8, 124.6, 131.3, 132.1, 141.7, 145.6, 149.5, 156.5
[0064]
FAB-MS (Pos.): M / z 383
[0065]
Examples 1 to 6, Comparative Example 3
50 mg of each of Examples 1 to 6 was dissolved in 1 ml of DMSO to prepare each DMSO solution. Further, 0.18 g of glycyrrhizin (inflammation, 4 volumes, NO4, 437 (1984)), which is an inhibitor of bovine testis-derived hyaluronidase conventionally known as Comparative Example 3, was dissolved in 10 g of water to prepare an aqueous solution (200 μM). did.
[0066]
Test example
Using Examples 1 to 6, Comparative Example 1 (aqueous solution), Comparative Example 2 (DMSO only), and Comparative Example 3 described above, the decomposition of polymeric tritium hyaluronic acid was examined by the method of (5) described above, and hyaluronic acid was determined. The decomposition rate and the hyaluronic acid decomposition inhibition rate were calculated from the above equations (1) and (2). Table 1 shows the results.
[0067]
[Table 1]

[0068]
As a result, in a state in which the degradation of hyaluronic acid is promoted by the addition of histamine from the time of no addition, the extract of Kurokawa containing the terphenyl derivative of Examples 1 to 6, the terphenyl derivative fraction, the terphenyl derivative, Also showed an effect of inhibiting the degradation of hyaluronic acid. It was also found that the addition of glycyrrhizin, which is an inhibitor of bovine testis-derived hyaluronidase shown in Comparative Example 3, had no effect in this evaluation system, which is a human cell culture system.
[0069]
From this result, it is clear that the terphenyl derivative is effective as a human hyaluronic acid degradation inhibitor. The hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention is considered to be effective for diseases in which hyaluronic acid degradation is abnormally enhanced.
[0070]
Examples 9 to 11 (tablets)
Hereinafter, all values in the tables in the examples are% by weight unless otherwise specified.
[0071]
[Table 2]

[0072]
The components shown in Table 2 were uniformly mixed, and the mixture was tableted to give a tablet of 170 mg according to a conventional method to prepare a tablet.
[0073]
Examples 12 to 14 (capsules)
[0074]
[Table 3]

[0075]
The components in Table 3 above were uniformly mixed, and 150 mg of the mixture was filled into No. 3 hard capsules according to a conventional method.
[0076]
Examples 15 to 17 (liquid preparations)
[0077]
[Table 4]

[0078]
Each component in Table 4 was dissolved in purified water, and the mixture was stirred and homogenized to obtain a syrup.
[0079]
Examples 18 to 21 (cream)
[0080]
[Table 5]

[0081]
In Table 5, after the component (A) was uniformly mixed and dissolved at 80 ° C., the component (B) was mixed and dissolved therein (mixture I). Separately, the component (D) was uniformly mixed and dissolved at 80 ° C., and then the component (C) was mixed and dissolved therein (mixture liquid II). Next, the mixture II was gradually added to the mixture I, and the mixture was cooled to 30 ° C. with sufficient stirring to obtain a cream.
[0082]
Examples 22 to 25 (lotion)
[0083]
[Table 6]

[0084]
A lotion was prepared by mixing and dissolving each of the components in Table 6 in a conventional manner.
[0085]
Examples 26 to 27 (bath additives)
[0086]
[Table 7]

[0087]
Each component in Table 7 was mixed to prepare a bath agent by a conventional method. It should be noted that this bath agent is used after being diluted about 3000 times at the time of use.
[0088]
Examples 28 to 30 (Medicated toothpaste)
[0089]
[Table 8]

[0090]
Water, glycerin, carrageenan, saccharin, butyl parahydroxybenzoate, chlorhexidine diglyconate, fragrance, and terphenyl derivative are weighed and mixed according to a conventional method, and mixed to swell the binder, and then dibasic calcium phosphate and sodium lauryl sulfate. After further mixing and defoaming, the mixture was filled in a tube to obtain a toothpaste.
[0091]
Examples 31 to 33 (mouthwash)
[0092]
[Table 9]

[0093]
According to a conventional method, a mouthwash having the composition shown in Table 9 was prepared.
[0094]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a hyaluronic acid degradation inhibitor that acts on cells present in human connective tissue and inhibits hyaluronic acid degradation, xeroderma in which hyaluronic acid degradation is physiologically enhanced from normal, Therapeutic agent for abnormal degradation of hyaluronic acid, which exerts excellent effects on diseases such as psoriasis, rough skin, and dry skin, and a rough or dry skin inhibitor, a rough or dry skin inhibitor, and a wrinkle-preventing and toughening agent. It is clear that cosmetics effective for improvement and the like can be provided.

Claims

A cosmetic comprising a Kurokawa extract.

An agent for preventing rough or dry skin containing Kurokawa extract as an active ingredient.