JP3606579B2 - Methods and compositions for the treatment of BCR-ABL-related leukemia and other cell proliferative disorders - Google Patents

Abstract

The present invention relates to compositions and methods for the prevention and treatment of cell proliferative disorders wherein a protein tyrosine kinase or protein tyrosine phosphatase capable of complexing with a member of the SH2- and/or SH3-containing family of adaptor proteins is involved. This invention is based, in part, on the surprising discovery that the adaptor protein, GRB-2, binds the intracellular BCR-ABL tyrosine kinase product in vivo and is necessary for the activation of the oncogenic potential of the BCR/ABL product. The present invention further relates to protein tyrosine kinase/adaptor protein complexes and the uses of these complexes for the identification of agents capable of decreasing or inhibiting the interaction between the members of such complexes.

Description

4.図の記載
図1:BCR−ABL〜Rasによる転写活性の刺激は、BCRの第一エキソンにチロシン177が存在することが必要である。NIH 3T3細胞に、１μｇのpB4X−CATリポータープラスミドとともに、0.5μｇの指示したBCR−ABL cDNA ＋／− ５μｇのＨ−Ras（17N）cDNAをトランスフェクションさせた。48時間トランスフェクションを行った後、細胞を採取し、下記の第9.1.1.節で概説するようにCAT活性のアッセイを行った。データを任意の単位で記録した。基底シグナルは、リポーターの活性による。
図2:BCR−ABL〜Rasによる転写活性の刺激は、GRB2 SH3ドメインの存在を必要とする。p210 BCR/ABL細胞を発現するRat1細胞に、１μｇのpB4X−CATリポータープラスミドとともに、GRB2欠失変異株のいずれかをトランスフェクションさせた。48時間トランスフェクションを行った後、細胞を採取し、下記の第9.1.1.節で概説するようにCAT活性のアッセイを行った。レーン1:RAT1;レーン2:RAT1/p210/pCENベクター；レーン3:RAT1/p210/pCEN GRB2 ΔN';レーン4:RAT1/p210/pCEN GRB2 ΔC'。データは、RAT1を１に規格化して、任意の単位で記録した。基底シグナルは、リポーターの活性による。値は、重複＋／−範囲の平均である。
図3:野生型および変異体GRB2タンパク質を発現するK562中のヘモグロビン含量。細胞溶解産物を調製し、記載されたベンジジン染色を使用してヘモグロビン含量を測定した（Feinsteinら、1992,Oncogene 7:1853−1857）。３個のサンプルの各細胞集団を分析した。データは、指示した構成体でトランスフェクションした全細胞タンパク質１μｇに対するヘモグロビンの量を表す。
5.発明の詳細な説明
以下に、タンパク質のアダプターファミリーのSH2−および／またはSH3ドメイン含有メンバーと複合体化し得るプロテインチロシンキナーゼまたはプロテインチロシンホスファターゼが関与している細胞増殖性疾患を予防および治療するための組成物ならびに方法を記載する。さらに、プロテインチロシンホスファターゼ／アダプタータンパク質複合体、プロテインチロシンホスファターゼ／アダプタータンパク質複合体、このような複合体の製造法およびこれらの複合体の使用をここに記載する。そのような使用としては、それらに限定されないが、該複合体の成分間の相互作用を破壊することができる作用物質の同定が挙げられる。
本発明は、一部には、アダプタータンパク質GRB−２がin vivoで細胞内のBCR−ABL産物と結合し、かつBCR−ABL産物の潜在的な発がん能力の活性化にとって必要であること、およびGRB−２シグナル形質導入の破壊が細胞の形質転換された表現型を逆にし、動物での腫瘍増殖を減少させる、という驚くべき発見に基づいている。この発現を表すデータは、下記の第６〜14節の実施例に示す。
5.1.プロテインチロシンキナーゼ／アダプタータンパク 質複合体
本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体は、後術するように、タンパク質のPTKファミリーの少なくとも１つのメンバーおよびタンパク質のアダプターファミリーの少なくとも１つのメンバーを含む。標準的な生理的条件下では、該複合体の成分は、他のPTK/アダプタータンパク質複合体成分の１個以上とともに、安定して非共有的な結合を形成することができる。
本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体のPTK成分は、細胞内細胞質非受容体型PTKs、細胞内核非受容体型PTKsまたは膜貫通受容体型PTKのいずれかであり、それらは各々、１個以上の特徴的なペプチドドメインを含む。そのようなドメインは１個以上の触媒ドメインを含むことができ、それらに限定されないが、チロシンキナーゼドメインが挙げられる。チロシンキナーゼ触媒ドメインの長さは、一般に、約250〜約300アミノ酸の範囲であり、これは約30kDaの分子量に相当する。チロシンキナーゼ触媒ドメインの位置は、固定されていないが、一般に、タンパク質のカルボキシ末端付近である。チロシンキナーゼドメイン内に、短く、保存されたアミノ酸残基の範囲が存在してもよい。それは、高レベルの保存性を示さない、長さが可変のアミノ酸残基の範囲と順次交互に現れる。最も硬度に保存されたチロシンキナーゼ触媒ドメインアミノ酸残基に対応するコンセンサス配列が収集されており、当業者には周知である。例えば、Hanksら、（Hanksら、1991,Science 241:42−52）およびWilks（Wilks,A.F.,1990,Prog.Growth Factor Res.2:97−111）参照（それらの全体を参考文献として本明細書に含める。）。該コンセンサス配列は、PTKに特異的な配列であるＤ−Ｌ−Ｒ−Ａ−Ａ−ＮまたはＤ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｎ、およびＰ−I/V−K/R−Ｗ−T/M−Ａ−Ｐ−Ｅである。さらに、該配列モチーフの別の例として、Wilks,A.F.,1990,Progress in Growth Factor Res.2:97−111参照。
本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体のPTK成分は、さらに、１個以上の非触媒ドメインを含むことができ、例えば、それらに限定されないが、１個以上のSH2および／または１個以上のSH3ドメイン、１個以上のSH2結合および／または１個以上のSH3結合ペプチドドメイン、および／または（受容体型PTKの場合）疏水性膜貫通ドメインが挙げられる。SH2（すなわち、srcホモロジー２）非触媒ドメインは、一般に、長さが約100アミノ酸残基である。そのようなSH2ドメインは、いくつかの、好ましくは５個の十分保存されたアミノ酸配列モチーフ内に、高度に保存された、または不変の多数のアミノ酸残基を含むことができ、それらは、当業者には周知である。例えば、Kochら、（kochら、1991,Science 252:668−674）（その全体を参考文献として本明細書に含める。）参照。例えば、アミノ酸コンセンサス配列としては、それらに限定されないが、Ｆ−Ｌ−Ｉ−Ｒ−Ｅ−ＳおよびＦ−Ｌ−Ｖ−Ｒ−Ｅ−Ｓが挙げられる。これらのコンセンサス配列のＲ残基は、SH2ドメイン間で不変である。そのような十分保存されたアミノ酸配列モチーフは、可変であるけれども、一般には１個以上のＧまたはＰ残基を含む、より可変のアミノ酸配列要素の範囲によって分離される。
SH3（すなわち、srcホモロジー３）非触媒ドメインは、一般に、長さが約50アミノ酸残基である。SH3ドメイン内のアミノ酸配列は可変であってもよいが、そのドメインの三次元構造は十分保存される。そのようなSH3三次元構造は、当業者には周知である。例えば、Koyamaら、（Koyamaら、1993,Cell 72:945−952）（その全体を参考文献として本明細書に含める。）参照。
SH2−結合ペプチドドメインは周知である。例えば、Songyangら、（Songyangら、1993,Cell 72:767−778）、Rotinら、（Rotinら、EMBO J.11:559−567）およびSkolnickら、（Skolnickら、1993,EMBO J.12:1929−1936）（これらは、その全体を参考文献として本明細書に含める。）参照。SH2ドメインは、あるSH2−結合ドメインに対して特異性を示す。例えば、SH2−結合ペプチドドメインとしては、それらに限定されないが、ホスホTyr−疏水性−疏水性−lle/Proアミノ酸配列モチーフ（一般に、該配列モチーフは、例えばsrc、fyn、lck、fgr、abl、crkおよびnckタンパク質に見られる型のSH2ドメインに対して好ましい。）、およびホスホTyr−疏水性−Ｘ−疏水性および／または−ホスホTyr−Met−Ｘ−Met（一般に、該配列モチーフは、例えばp85、ホスホリパーゼＣ−γおよびSHPTP2タンパク質に見られる型のSH2ドメインに対して好ましい。）が挙げられる。さらに、GRB−２タンパク質のSH2ドメインを結合するいくつかのタンパク質のドメインの分析から明らかにされたコンセンサス配列は、Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｙ−V/I−Ｎ−V/Iであると決定された。さらに、SH2−結合ペプチドドメインは、SerおよびThr残基（それらのいくつかまたは全部はリン酸化されている）に富む領域を含むことができる（Pendergastら、1991,Cell 66:161−171）。
SH3−結合ペプチドドメインもまた当業者に周知である。例えば、Renら（Renら,1993,Science 259:1157−1161）およびCicchettiら（Cicchettiら,1992,Science 257:803−806）を参照されたい。これらは、参照としてその全体をここに組み入れてある。そのようなSH3−結合ペプチドドメインは、プロリン以外の他のアミノ酸残基もまたSH3結合にとって重要ではあるが、一般にアミノ酸残基プロリンに富んでいる。SH3−結合ドメインの考えうる１つの共通配列は、Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−疎水性残基−Ｘ−Ｐである。さらに、GRB−２のSH3ドメインは、SOSタンパク質に見いだされるアミノ酸配列モチーフであるＰ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｐ−Ｐ−Ｒ−Ｒであることが確定している（Liら,1993,Nature 363:8588;Schlessinger,1993,TIBS,18:273−275）。
本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体の細胞内の細胞質PTK成分は、例えば、Srcファミリーのメンバー（src,yes,fgr,fyn,lyn,hck,lckおよびblk等の分子）;Fesファミリーのメンバー（fesおよびfer等）;Ablファミリーのメンバー（ablおよびarg等）；およびJakファミリーのメンバー（jak1およびjak2等）を含みうる。本発明の好ましい態様において、PTK/アダプタータンパク質複合体のPTK成分は、BCR−ABL遺伝子の細胞内PTK産物である。本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体の膜貫通の受容体PTK成分は、例えば、増殖因子受容体のFGF受容体、セブンレス（Sevenless）/ROS、インスリン受容体、PDGF受容体、EGF受容体ファミリーのメンバー等の分子、またはheアダプタータンパク質に関連する他の任意の分子を含みうる（例えば、Lowensteinら,1992,Cell 70:431−442参照）。
本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体のアダプタータンパク質成分は、１つ以上のSH2および／または１つ以上のSH3非触媒ドメインを含む。アダプタータンパク質の一部でありうるSH2およびSH3ドメインは、上記のように、PTK成分のためのものである。本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体の成分でありうるアダプタータンパク質は、例えば、p85、ｃ−Crk、SHC、Nck、ISGF3α、グアニントリホスファターゼ活性化タンパク質（GAP）、およびタンパク質のGRBサブファミリーのメンバー（GRB1、GRB−２、GRB−３、GRB−４、GRB−７およびGRB−10等）を含みうる。好ましい態様において、本発明のPTK/アダプタータンパク質複合体はBCR−ABL遺伝子のPTK産物およびGRB−２タンパク質を含む。
本発明の複合体および／または該複合体の個々の成分は、後述の第5.3.1.節に記載の方法を用いて実質的に精製することができる。さらに、本発明の複合体のPTKおよび／またはアダプター成分は、化学的合成または後述の第5.3.2.節に記載の組換えDNA技法を含むが、これらに限定されない種々の方法を用いて作成することができる。
5.2.プロテインチロシンホスファターゼ／アダプタータ ンパク質複合体
本発明のPTP/アダプタータンパク質複合体は、タンパク質のPTPファミリーの少なくとも１つのメンバーおよびタンパク質のアダプターファミリーの少なくとも１つのメンバーを含む。標準的な生理的条件のもとで、このような複合体の諸成分は一以上の他のPTP/アダプタータンパク質複合体成分との安定した、非共有結合を形成することが可能である。
本発明のPTP/アダプタータンパク質複合体のPTP成分は、細胞質、細胞内、非受容体PTP、または膜貫通、受容体型PTPであって、これらはそれぞれ１つ以上の特徴的なペプチドドメインを含む。そのようなドメインは、チロシンホスファターゼドメインを含むが、これらだけに限定されない１つ以上の触媒ドメインを含みうる。一般に、チロシンホスファターゼ触媒ドメインは長さが約230アミノ酸である。触媒ホスファターゼドメインのアミノ酸残基の約40は高度に保存されており、そしてこれらのうちには、共通配列I/V−Ｈ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−S/T−Ｇを有する11アミノ酸残基からなる非常に高度に保存されている分節が一般に存在する。非受容体PTPは一般にそのような触媒ドメインを１個含有し、他方、膜貫通受容体PTPは長さ約58アミノ酸残基のペプチド分節によって分けられているそのような触媒ドメイン２個を一般に含有している。
本発明のPTP/アダプタータンパク質複合体のPTP成分は、さらに、１つ以上のSH2ドメイン、１つ以上のSH3ドメイン、１つ以上のSH2−結合ドメイン、および／または１つ以上のSH3−結合ドメインを含むがこれらだけに限定されない、１つ以上の非触媒ドメインを含みうる。これら非触媒ドメインのそれぞれは、第5.2.節に記載のものでありうる。
本発明のPTP/アダプタータンパク質複合体の膜貫通の受容体PTP成分は、例えば、CD45、LAR、RPTPα、RPTPβ、RPTPχおよびRPTPκを含みうる。本発明のPTP/アダプタータンパク質複合体の細胞内の細胞質PTP成分は、例えばPTP1C、PTP1Dおよびコルクスクリュー（corkscrew）を含みうる。
5.3.PTK/アダプター複合体およびPTP/アダプター複合体 の精製ならびに作製
5.3.1.精製法
本発明のPTK/アダプター複合体およびPTP/アダプター複合体を実質的に精製する、すなわち、それが関連する他のタンパク質、糖タンパク質、および他の巨大分子から少なくとも90％（重量に基づいて）、そして所望であれば少なくとも99％精製することができる。そのような精製は、当業者に周知の種々の手順を用いて達成することが可能である。例えば、PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体を含有する細胞、組織または流体を標準的方法の組合せ（例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、分子ふるいクロマトグラフィー、および／またはイオン交換クロマトグラフィー）に付す、等である。別な方法として、もしくはそれらに加えて、PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体の１つ以上の成分と結合可能な抗体を固定化した免疫吸着カラムを使用したイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体を精製することができる。そのような抗体は、起源がモノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよい。PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体のための他の有用な種類のアフィニティークロマトグラフィーは、例えば、触媒ドメイン（すなわち、PTKのキナーゼドメインまたはPTPのホスファターゼドメイン）に結合する固相基質、または複合体を分断しないような様式で結合する複合体のPTK,PTPおよび／またはアダプター成分の非触媒ドメインの固定化結合部位を利用しうる。
本発明のPTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体は、種々の細胞または組織の供給源より生化学的に精製することができる。天然に存在するPTK/アダプター複合体を精製するためには、細胞の供給源は、例えばバキュロウイルス感染SF9細胞、Ａ−431、CHOおよび／または3T3細胞を含みうる。本発明の好ましい態様において、PTK/アダプター複合体はBCR−ABL PTKおよびGRB2タンパク質を含む。このようなPTK/GRB−２複合体の精製のための供給源は、K562、NMG−01およびALL−１細胞系を含みうるが、これらに限定されない。
5.3.2.合成法
本発明のPTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体の成分として作用しうるポリペプチドまたはその断片の合成法は、当業者に周知である。例えば、参照としてここに全体を組み入れるCreighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman and Co.,NYを参照されたい。別々に合成された、または組換えによって作製されたPTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体の成分を、当業者に周知の標準的生化学技法により再構成して、複合体を形成することができる。例えば、PTK/アダプター複合体の諸成分を含有する複数のサンプルを、約150mM以上のNaClを用いて緩衝化した溶液中で、７の範囲内の生理的pHで、室温で組み合わせることができる。例えば、20mM Tris−HCl、pH7.4、137mM NaCl、10％グリセリン、ｌ％Triton X−100、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸および2mM EDTAを含む緩衝液が使用可能であろう。このような手順は、PTP/アダプター複合体の再構成にも使用できる。
PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質をコードする核酸を発現させることによる、本発明のPTK/アダプター複合体の成分の調製方法は本明細書に記述されている。当業者に周知の方法を用いて、PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組換えDNA技法、合成技法およびin vivo組換え／遺伝子組換えを含む。DNAおよびRNAの合成は、さらに自動合成機を用いて行なうこともできる。例えば、Maniatisら,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.およびAusubelら,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing AssociatesおよびWiley Interscience N.Y.に記載の技法を参照されたい。
本発明のPTK/アダプター、PTP/アダプター複合体の成分のコード配列を発現させるため、種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。これらの系は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、PTK、PTPまたはアダプタータンパク質のコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌（例、大腸菌、枯草菌）等の微生物;PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母〔例、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia）］;PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系;PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV）に感染させた、または、組換えプラスミド発現ベクター（例、Tiプラスミド）によって形質転換させた植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系である。
細菌系においては、PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体発現の意図された使用によって、多数の発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体作製のため、またはペプチドライブラリーのスクリーニングのため、大量のPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体を生産する場合は、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルな発現を引き出すベクターが望ましい。そのようなベクターには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、融合タンパク質が産生されるように、PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質のコード配列がlac Zコード領域の枠に合わせて個々にベクターに連結されうる大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら,1983,EMBO J.2:1791）;pINベクター（Inouyeら,1985,Nucleic Acids Res.13:3101−3109;Van Heekeら,1989,J.Biol.Chem.264:5503−5509）等である。pGEXベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させるために使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解した細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、クローン化PTKおよび／またはアダプタータンパク質がGST部分から解放されうるように、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ開裂部位を含むように設計されている。
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスは、スポドプラテ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の成分のコード配列を、このウイルスの非必須領域〔例えば、ポリヒドリン（polyhedrin）遺伝子〕に個別にクローン化し、そしてAcNPVプロモーター（例えば、ポリヒドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。コード配列の上首尾な挿入は、ポリヒドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖組換えウイルス（すなわち、ポリヒドリン遺伝子によってコードされるタンパク質外被を欠くウイルス）の産生をもたらす。次に、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子が発現されているスポドプテラ・フルジペルダ細胞を感染させる（例えば、Smithら,1983,J.Viol.46:584;Smith,米国特許第4,215,051号参照）。
哺乳動物宿主細胞においては、ウイルスに基づく多数の発現系が使用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の成分のコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分リーダー配列、に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）への挿入は、生存可能で、かつ感染宿主中でPTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質を発現可能な組換えウイルスをもたらす（例えば、Loganら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655−3659参照）。挿入されたPTK、PTPおよび／またはアダプターコード配列の効率的な翻訳のためには、特異的開始シグナルもまた必要とされる。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。自身の開始コドンおよび隣接配列を含む完全なPTK、PTPまたはアダプタータンパク質遺伝子が適切な発現ベクターに挿入される場合は、付加的翻訳制御シグナルは何ら必要ではない。しかし、PTK、PTPまたはアダプターコード配列の一部分のみが挿入される場合は、ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを備えていなければならない。さらに、全挿入配列の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものでありうる。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等を含めることにより、発現の効率を増大させることができる（Bittnerら,1987,Methods in Enzymol.153:516−544参照）。
さらに、所望の特定の様式で挿入配列の発現をモジュレートする、または遺伝子産物を修飾およびプロセスする、宿主細胞株を選択することができる。遺伝子産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の転写後プロセシングおよび修飾のための特徴的で、かつ特異的な作用機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のため、適切な一次転写産物のプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞は、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3 WI38、等を含むが、これらだけに限定されない。組換えタンパク質の長期間の高収量生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、PTKおよびアダプタータンパク質、またはPTPおよびアダプタータンパク質の両方を安定的に同時発現する細胞系を遺伝子工学的に作出することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）によってそれぞれ独立して、または整合的に制御されている、PTKおよびアダプタータンパク質DNA、またはPTPおよびアダプタータンパク質DNAならびに選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、遺伝子工学的に作出した細胞を富化培地で１〜２日間増殖させることができる。そして次にこれらの細胞を選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そして細胞を安定的にプラスミドを染色体中に組み入れ、増殖してフォーカスを形成することを可能とする。次に、これらのフォーカスをクローン化し、細胞系に発展させることが可能である。この方法は、PTKおよびアダプタータンパク質、またはPTPおよびアダプタータンパク質の両方を同時発現する細胞系を遺伝子工学的に作出するのに有利に使用できる。このような遺伝子工学的に作出された細胞系は、本発明の複合体によって媒介されるシグナルに影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用である。
以下のものを含むが、それらだけに限定されない多数の選択系が使用できる。すなわち、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら,1977,Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（Szybalskaら,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.48:2026）およびアデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら,1980,Cell 22:817）遺伝子が、それぞれtk−、hgprt−、またはaprt−細胞に使用できる。また、代謝拮抗物質耐性も、メトトレキセートへの耐性を付与するdhfr遺伝子（Wiglerら,1980,Natl.Acad.Sci.USA 77:3567;O'Hareら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1527）；ミコフェノール酸（mycophenolic acid）への耐性を付与するgpt遺伝子（Mulliganら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:2072）；アミノグリコシドＧ−418への耐性を付与するneo遺伝子（Colberre−Garapinら,1981,J.Mol.Biol.150:1）；およびハイグロマイシンへの耐性を付与するhygro遺伝子（Santerreら,1984,Gene 30:147）の選択の基礎として使用できる。
本発明の複合体を形成することのできる、PTK、PTPおよび／またはアダプタータンパク質ファミリーの新規なメンバーは、当技術分野で周知の分子生物学的技法によって同定および単離することが可能である。例えば、PTK、PTPまたはアダプタータンパク質ファミリーのメンバーに共通なドメイン内にある高度に保存された配列に基づいて設計した２つの縮重したオリゴヌクレオチドプライマープールを用いてポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）を実施することにより、以前には知られていなかったPTK、PTPまたはアダプタータンパク質の遺伝子を単離することができる。PCR反応の鋳型は、PTK/アダプター複合体および／またはPTP/アダプター複合体を発現することが知られている細胞系または組織より調製したmRNAの逆転写によって得たcDNAであってよい。増幅された配列がPTK、PTPまたはアダプターサブファミリーのメンバーの配列を表していることを確実にするため、PCR産物をサブクローン化し、配列決定することができる。次に、PCR断片を使用して、増幅された断片を放射標識し、バクテリオファージcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、全長PTK、PTPまたはアダプタータンパク質cDNAクローンを単離することができる。または、標識化断片を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。使用できるクローニング戦略の総論については、例えば、Maniatisら,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press,N.Y.;およびAusubelら、1989,Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing AssociatesおよびWiley Interscience,N.Y.）を参照されたい。
それまで未知であったアダプタータンパク質をクローン化する一般的な方法は、Skolnick（Skolnick,E.Y.,1991,Cell 65:75）およびSkolnickら（米国特許出願第07/643,237号）によって記述されている。これらは、参照として全体をここに組み入れてある。簡単に述べると、タンパク質のアダプターファミリーの新しいメンバーは、アダプター−タンパク質−結合領域を含むチロシンリン酸化ペプチドの少なくとも一部分に特異的に結合する能力によって同定することができる。そのような領域は、SH2−結合ドメインを含みうるが、これだけに限定されない。
5.4.PTK/アダプター複合体およびPTP/アダプター複合体 の誘導体
本明細書にはまた、PTK/アダプター複合体およびPTP/アダプター複合体の機能性誘導体が提供される。「機能性誘導体」という用語は、PTK/アダプター複合体およびPTP/アダプター複合体の「化学的誘導体」、「断片」、「変異体」、「キメラ」または「ハイブリッド」を意味する。これらの用語は以下に定義される。機能性誘導体は、その誘導体に本発明による有用性を与える、PTK、PTPまたはアダプタータンパク質の機能の少なくとも一部を保持する。この機能とは、例えば、PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体に特異的な抗体との反応性、非触媒ドメインによって媒介されるPTKまたはPTPの酵素活性または結合活性、等である。
PTK/アダプター複合体またはPTP/アダプター複合体の「化学的誘導体」は、通常は該タンパク質の一部ではない付加的化学部分を含有する。上記タンパク質複合体またはペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれる。ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と下記のように反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、そのような修飾を分子に導入することができる。
最も一般的には、システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
ヒスチジル残基は、pH5.5〜7.0でジエチルプロカーボネートとの反応により誘導体化される。なぜなら、この作用物質はヒスチジル側鎖に比較的特異的だからである。パラ−ブロモフェナシルブロマイド（para−bromophenacyl bromide）もまた有用である。その反応は、好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウム中で、pH6.0で実施される。
リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの作用物質を用いた誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ−含有残基を誘導体化するのに適する他の試薬は、メチルピコリニミデート等のイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキシル酸との反応を含む。
アルギニル残基は、１種、または数種の通常の試薬との反応によって修飾される。それらの試薬には、フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体は、グアニジン官能基の高いpK_aのため、反応をアルカリ性状態で実施することが必要である。さらに、これらの試薬はアルギニンのε−アミノ基はもとよりリシンの基とも反応しうる。
チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりスペクトル標識を導入するための修飾の、周知の標的である。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。
カルボキシル側の基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル）カルボジイミド等のカルボジイミド（R'−Ｎ−Ｃ−Ｎ−R'）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は頻繁に脱アミド化されて、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形態も、本発明の範囲内に入る。
二官能作用物質を用いた誘導体化は、例えば、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の成分ペプチドを相互に架橋させるのに、またはPTK/アダプター受容体複合体を水に不溶性の支持マトリックスあるいは他の巨大分子キャリアーに架橋させるのに有用である。一般に用いられる架橋剤は、例えば、1,1−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、3,3'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、ホモ二官能イミドエステル、ならびにビス−Ｎ−マレイミド−１、８−オクタン等の二官能マレイミドを含む。メチル−３−（ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間をもたらす。または、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性で水に不溶性なマトリックス、および米国特許第3,969,287号;3,691,016号;4,195,128号;4,247,642号;4,229,537号；および4,330,440号に記載の反応性基質がタンパク質固定化のために使用される。
上記以外の修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Creighton,T,E.,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,pp.79−86（1983））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および、ある場合にはＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。
そのように誘導体化された部分は、安定性、溶解性、吸収、生物的半減期、等を改善することができる。または、これらの部分はタンパク質複合体等の望ましくない副作用を除去または軽減することができる。そのような効果を媒介可能な部分は、例えば、Remington著のPharmaceutical Sciences,1990,18版,Mack Publishing Co.,Easton,PAに開示されている。
「断片」という用語は、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体のPTK、PTPまたはアダプタータンパク質のアミノ酸配列から得られるポリペプチドであって、それが由来する全長ポリペプチドよりも長さの短いポリペプチドを示すのに使われている。そのような断片は、例えば、全長タンパク質のタンパク質加水分解開裂によって作成することができる。好ましくは、この断片はPTK、PTPまたはアダプタータンパク質をコードするDNA配列を適切に修飾して１個以上のアミノ酸をＣ−末端、Ｎ−末端、および／または天然の配列内で１つ以上の部位において欠失させることにより、組換えによって得られる。天然に存在するPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体に似た複合体中に存在する場合、PTK、PTPまたはアダプタータンパク質の断片は、下記のようにシグナル伝達をモジュレートするように作用する化合物をスクリーニングするのに有用である。そのような断片は、複合体中に存在する場合、天然のPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の特徴的部分を１つ以上保持することができると理解される。このように保持される特徴の例は、触媒活性；基質特異性；完全な細胞内におけるたの分子との相互作用；調節機能；または天然のPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体に特異的な抗体、またはその抗原決定基との結合を含む。
本発明の範囲内に含まれる別の機能性誘導体は、天然のポリペプチドに関して１またはそれ以上のアミノ酸が欠けているか、付加されているか、または置換されている、少なくとも１つの「変異型」ポリペプチド（例えば、PTK、PTP、またはアダプター）を含むPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体である。変異型は、Ｃ末端、Ｎ末端、および／または天然の配列の内部の１以上の部位で、１以上のアミノ酸のコドンを付加、除去、および／または修飾するために、PTK、PTP、および／またはアダプタータンパク質DNAコード配列を適当に修飾することによって、天然に存在しているPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体成分に由来するものであってもよい。付加されたアミノ酸、置換されたアミノ酸および／または追加のアミノ酸を有するこのような変異型は、上記の天然のPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の１以上の特徴をあらわしている部分を保持していると理解される。
アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有するPTK、PTP、および／またはアダプタータンパク質を含むPTK/アダプターまたはPTP/アダプターの複合体の機能性誘導体は、当業者に公知の標準的な技術を用いて調製することができる。例えば、機能性誘導体の修飾された成分は、部位特異的突然変異技術を用いて産生してもよく（Adelman et al.,1983,DNA 2:183で例示されているように）、DNAコーディング配列中のヌクレオチドは修飾されたコーディング配列が修飾されるように修飾され、その後この組換えDNAを、上述のような技術を用いて、宿主である原核細胞または真核細胞中で発現させる。代替として、欠失、挿入および／または置換を有するPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の機能性誘導体の成分は、当業者に公知の方法を用いて、直接的に化学合成することによって、簡便に調製してもよい。PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の機能性誘導体は、典型的には、天然の複合体と同質の生物学的活性を示す。
5.5 PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体に対 する抗体
本発明は、さらに、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体またはそれらのエピトープを特異的に認識する抗体、またはPTK、PTP、またはアダプター成分がPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体と離れて個別に存在しているときは抗体によって認識されないはずである複合体のPTK、PTP、またはアダプター成分のいずれかのエピトープを特異的に認識する抗体に関する。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、Ｆ（ab'）_２断片、FAb発現ライブラリーで産生される断片、抗イディオタイプ（抗−Id）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合性断片を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、生体試料中のPTK/アダプター複合体の検出に使用してもよく、または、代替として、PTK/アダプター複合体形成の阻害のための方法として使用してもよく、こうして細胞増殖障害の進行を阻害する。
ポリクローナル抗体は、PTK/アダプター複合体、またはそれらの抗原性のある機能性誘導体などの抗原で免疫された動物の血清に由来する抗体分子の均一でない集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、種々の宿主動物がPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の注射によって免疫され、これらの動物は、ウサギ、マウス、ラット等が含まれるが、これらに限定されるものではない。宿主の種に応じて、免疫応答を増強するために、種々のアジュバントが使用され、フロイントのアジュバント（完全、不完全）、リゾレシチンなどの鉱物ゲル、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（bacille Calmette−Guerin）などの潜在的に有用なヒトアジュバントおよびコリネバクテリウムパルバム（Corynebacterium parvum）等が含むが、これらに限定されるものではない。
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であり、細胞株の連続的培養によって抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができる。これらは、Kohlerらのハイブリドーマ技術（Kohler et al.,Nature 256:495−497（1975）および米国特許番号4,376,110）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosber et al.,1983,Immunology Today 4:72;Cole et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026−2030）、およびEBV−ハイブリドーマ技術（Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Alan,R.Liss.,Inc.pp 77−96）を含むが、これらに限定されるものではない。こうした抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスをも含んでもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitro、in vivoのいずれで培養してもよい。in vivoでの高力価のmAbsの産生は、これを目下好適な産生方法にする。
加えて、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と適当な生物学的活性を有するヒト抗体からの遺伝子とをいっしょにスプライスすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された方法（Morrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature 312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature 314:452−454）を用いることができる。キメラ抗体は、例えばマウスのmAbsに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するような、異なる動物種に由来する異なる部分を含む分子である。
代替として、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（米国特許4,946,778;Bird,1988,Science 242:423−426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;およびWard et al.,1989,Nature334:544−546）をPTK/アダプター複合体特異的一本鎖抗体またはPTP/アダプター複合体特異的一本鎖抗体の産生に適用することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸結合を介するFv領域の重鎖および軽鎖断片をつなぐことによって形成され、一本鎖ポリペプチドを生じる。
PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の特異的結合部位を含む抗体断片を、既知の方法で形成させてもよい。例えば、下記の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない：抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ab'）_２断片、Ｆ（ab'）_２断片のジスルフィド結合を還元することによって生じ得るFab断片。代替として、Fab発現ライブラリーは、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の速やかで簡便な同定を可能にするために構築してもよい（Huse et al.,1989,Science 246:1275−1281）。
5.6 PTK/アダプタータンパク質およびPTP/アダプター タンパク質関連細胞増殖障害
本発明は、最初に、アダプタータンパク質のSH2−および／またはSH3−ドメインを含むファミリーのメンバーの結合が発がんおよびトランスフォーメーションの過程において必須のステップであることを証明する。より詳細には、以下の６〜12節における実施例で示されたデータは、アダプタータンパク質のGRBサブファミリーのGRB2のメンバーのヒトBCR−ABL遺伝子の細胞内PTK産物への結合を詳述する。
この節においては、このようなPTKおよびアダプタータンパク質および／またはPTPおよびアダプタータンパク質の結合がこのような複合体を包含する細胞の増殖障害の治療のために使用され得る様々な使用のいくつかが記載されている。ここで記載された使用は、こうした複合体を破壊する（すなわち、複合体におけるPTKまたはPTPの成分とアダプターメンバーとの間の相互作用を減少させるか、または阻害する）ことができる薬剤、およびアダプタータンパク質のSH2−および／またはSH3−を含むファミリーのメンバーと複合体を形成することができるPTKおよびPTPを含む細胞増殖障害の治療のためのこうした化合物の利用に焦点が絞られているが、これらに限定されるものではない。ここで使用されている「破壊する」という用語は、こうした複合体が、物理的に形成可能のままで残存するか否かにかかわらず、タンパク質複合体成分の物理的な解離のみならず、複合体の活性の撹乱をも意味する。ここで使用されている「活性」は、このような複合体が形成される細胞中のシグナル伝達カスケードにおけるタンパク質複合体の機能を意味し、すなわち、細胞中への細胞外のシグナルの伝達を効率的にするか阻害することにおける複合体の機能を意味する。このような細胞増殖障害の例は、例えば、乾せんやアテローム硬化のみならず、慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病などのガン性障害を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の複合体はまた、こうした細胞の活性化、分化、および生存といった細胞過程においても含まれる。
個々のPTK/アダプタータンパク質複合体またはPTP/アダプタータンパク質複合体に依存しつつ、このような複合体の成分メンバー間の相互作用を破壊することは、包含されるシグナルの伝達イベント上における異なるモジュレート効果を有するかもしれず、すなわち、複合体破壊の該効果により、細胞内に正常に伝達されるシグナルを活性化するか、減少させるか、ブロックするかもしれない。細胞増殖障害に依存するのと同様に、細胞へ正常に導入されるシグナルの活性化、還元、またはブロックは、障害の治療のために望ましい。例えば、BCR−ABL PTKとGRB−２アダプタータンパク質の複合体形成の１つの効果は、Rasシグナリング経路の活性化をひき起こすことである（下記８節の実施例を参照せよ）。こうして、BCR−ABL PTK/GRB−２アダプタータンパク質複合体の破壊は、異常なシグナルの伝達を阻害し、Ras経路の活性化を妨げる。代替として、例えば、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体を含む細胞増殖障害は、こうした複合体が正常なシグナル伝達イベントの異常型の阻害を引き起こすために、進行するかもしれない。こうした場合、複合体の破壊は、通常のシグナル伝達イベントを回復させるはずである。さらに、異常型の複合体は、変更されたサブ細胞アダプタータンパク質の局在化を引き起こす可能性があり、このことは、アダプタータンパク質の6RBサブファミリーのGRB−２メンバーの場合にあったように、例えば、細胞骨格の再構成といった機能不全性細胞イベントを生じさせる可能性がある。この場合にPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の阻害は、正常な細胞の構造を回復させるはずである。さらにまた、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の破壊の原因となる１つまたは複数の薬剤は、このような複合体の他の強力な成分の間の相互作用の破壊を引き起こすかもしれない。こうした成分は、SOSタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。
複合体のPTKまたはPTP成分が膜貫通であって、受容体型PTKまたはPTP分子であるPTK/アダプタータンパク質複合体およびPTP/アダプタータンパク質複合体を考える場合、該受容体またはそれらのリガンドを、細胞の増殖障害の進行を導くシグナル伝達イベントをモジュレートするために、直接使用してもよい。例えば、PTK、可溶性PTK、細胞外PTKドメインを示すペプチド、またはリガンドに結合することが知られている細胞外PTKドメインの部分を示すペプチドは、有用なリガンドに対して内因性膜貫通PTK受容体分子と競合的に作用することのできる目的のPTK発現細胞に暴露されるとき、当業者に公知の方法を用いて投与してもよく、こうして、内因性PTKへのリガンドの結合を低下させるか、阻害する。このような操作の結果、PTK分子のためのアダプタータンパク質の親和性を順番に低下させることができるPTKの自己リン酸化をできる限り阻害することによって、PTKとアダプタータンパク質との間の相互作用の低下または阻害を生じさせることができるはずである。同様な状況は、PTPの場合でも保持される。
加えて、受容体型PTKを考えるときは、そのようなPTKに結合することができる細胞外分子であって、PTKへの結合により活性化しない該分子を当業者に公知の方法を用いて投与してもよい。この型の細胞外分子は、例えば、受容体結合は未だ生じていてもよいが、キナーゼの活性化が生じていないといった、目的のPTKのための天然のリガンドの修飾された形態を含んでもよい。このような設計の分子は、可溶性PTKの投与と同様に作用するはずであり、これらの手順はPTK/アダプタータンパク質複合体形成の低下または阻害という最終的効果を有するはずである。再び、同様の状況はPTPの場合においても生じる。
さらにまた、本発明のPTK/アダプター複合体の受容体PTKまたはPTP/アダプター複合体の受容体PTPの天然リガンドに結合できる分子を、当業者の公知の方法を用いて投与してもよい。このクラスの分子は、リガンドの対応する受容体への結合能を阻害するために作用するはずであり、こうしてPTK/アダプターまたはPTP/アダプタータンパク質複合体の形成を低下させるか阻害する最終効果を有するはずである。
治療される特別の条件に応じて、このような薬剤は製剤化され、全身的にまたは局在的に投与される。製剤化および投与の方法は、"Remington's Pharmaceutical Science",1990,18版、Mack Publishing Co.,Easton,PAに中に見出される。好適な経路は、経口、直腸内、口内粘膜、または小腸内投与を含む；非経口的投与は、２、３の例を挙げれば、硬膜下、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射と同様に、筋肉内、皮下、骨髄内注射を含む。投与のためには、薬剤を水溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液等の生理学的に交換可能な緩衝液中で製剤化する。口内粘膜投与のためには、透過すべきバリヤに適合した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は、一般的に当業者に公知である。
本発明のPTK/アダプター複合体および／またはPTP/アダプター複合体の形成を直接的に妨害するように細胞内で働く薬剤を、細胞の増殖障害の治療のために使用してもよい。このような薬剤は、SH2及び／又は、SH3ドメイン、又はSH2に結合するドメインおよび／またはSH3に結合するドメイン、小さな有機分子、または複合体成分と競合的に作用して結合し、複合体形成を減少させるか阻害するように作用するはずである天然物の抽出物を含むがこれらに限定されるものではなく、これらもまた、目的の細胞増殖障害の進行を低下させるか阻害するはずである。SH2ペプチドドメインおよびSH3ペプチドドメイン、およびSH2に結合するペプチドドメインおよびSH3に結合するペプチドドメインは、上述したように、第5.1節に記載されている。このような薬剤はまた、複合体形成の代わりにまたは複合体形成に加えて下流のシグナリング能を妨害することによって複合体を破壊する。
細胞内に投与しようとする薬剤は、当業者に公知の方法で投与してもよい。例えば、このような薬剤は、リポソーム中に封入されてもよく、その後上述のように投与されてもよい。リポソームは、内部に水溶液を有する球状の脂質二重層である。リポソームが形成されたときに水溶液中に存在するすべての分子は、内部の水溶液中に取り込まれる。リポソームに含まれるものは外部の小環境から保護され、そしてリポソームが細胞膜と融合するために効率的に細胞の細胞質内に輸送される。加えて、小さな有機分子は疎水性であるため、それらは直接に細胞内に投与してもよい。
細胞内で利用されるペプチド物質をコードするヌクレオチド配列は、当業者に公知の方法を用いて、対象の細胞中で発現されてもよい。例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭種ウイルス等のウイルスに由来する発現ベクターを標的とする細胞集団に輸送し、これらの細胞中でこのようなヌクレオチド配列を発現させるために使用してもよい。このようなベクターの構築法は公知である。例えば、Maniatis et al.,1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.およびAusubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wily Interscience,N.Y.を参照せよ。
あるいは、PTK/アダプターおよび／またはPTP/アダプター複合体形成を妨害し得る抗体を、アダプタータンパク質との複合体を形成し得るPTKまたはPTPを包含する細胞増殖障害の治療のために投与してもよい。例えば、リガンドの受容体型PTKsまたはPTPsへの結合を妨害することができる中和抗体を、上述したような技術を用いて投与してもよい。このような投与の効果は、可溶性PTKsまたはPTPsの投与にとっては、上述した効果と同様である。加えて、細胞内のエピトープに結合してPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体形成を破壊する効果を有する中和抗体を投与してもよい。このような抗体は、例えば、細胞内で作用する薬剤の投与のために上記の技術を利用して、投与してもよい。あるいは、一本鎖抗体をコーディングするヌクレオチド配列は、標的となる細胞集団の中で、例えば、Marascoらに記載された方法を用いて発現させてもよい（Marasco et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889−7893）。
本発明のPTK/アダプター複合体および／またはPTP/アダプター複合体は、こうした複合体の構成メンバーの活性を破壊するように作用し得る付加的な分子をスクリーニングするために使用してもよく、かくしてこのような複合体の効果などの該シグナル伝達イベントをモジュレートすることができるかもしれない。このような化合物は、Ｄ−および／またはＬ−配置のアミノ酸からなるペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリの形態で;Lam,et al.,1991,Nature 354:82−84を参照せよ）、ホスホペプチド（phosphopeptide,例えば、ランダムまたは一部縮重、ホスホペプチド指向性ライブラリ形態で、Songyang et al.,1993,Cell 767−778を参照せよ）、抗体、および小さな有機分子を含むが、これらに限定されるものではない。
例えば、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体の個々の成分、または個々の成分の官能基部分に結合する（そしてさらに複合体形成を破壊することができるかもしれない）化合物を同定してもよい。複合体の個別の官能性部分は、ここで、複合体の別のメンバーと尚も安定な複合体を形成できる個別の複合体成分のペプチド部分として定義されてもよい。例えば、PTKのSH2に結合するドメインのペプチド部分は尚もアダプタータンパク質のSH2ドメインに安定して結合することができ、こうしてアダプタータンパク質のSH2ドメインと複合体を尚も形成する。さらに、本発明のPTKまたはPTP成分が触媒ドメインである場合には、触媒ドメインの官能性部分は、未だに基質分子に安定して結合できるペプチドとしてもよい。
このようなPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体成分に結合する分子の単離に実行されるこのアプローチを有用する１つの方法は、成分分子またはそれらの官能基部分の、アガロース、プラスチックビーズ、マイクロタイターウェル、シャーレ、または、例えば、ナイロンやニトロセルロースからなる膜などの固相支持体への接着、ついで１種類の強力な成分に結合する化合物または複数の化合物の存在下における、接着した成分分子のインキュベーションを含むはずである。インキュベーションの後、未結合の化合物を洗い流し、成分に結合した化合物を回収する。この手順を使用することにより、多数の型の分子をPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体成分に結合する活性のために同時にスクリーニングしてもよい。
上記のスクリーニング方法で利用されてもよいPTK/アダプター複合体成分は、PTK分子又はそれらの官能基部分、例えばPTK触媒ドメイン、リン酸化ドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2に結合するドメイン、又はSH3に結合するドメイン、およびアダプタータンパク質、またはそれらの官能基部分、例えばSH2ドメインおよびSH3ドメインを含んでもよく、特に限定されない。使用されるペプチドは、リン酸化されていてもいなくてもよく、リン酸化されている場合には、少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくはリン酸化されたTyrを含む。リン酸ドメインは、あるアミノ酸残基が特異的にリン酸化されたペプチド領域として定義してもよい。このようなリン酸ドメインの官能性部分は、特異的PTKによってあるアミノ酸が特異的にリン酸化されたペプチドとして定義してもよい。SH2ドメインの官能性部分は、SH2に結合するドメインに特異的に結合することができるSH2ドメインの少なくとも１つの部分を含むペプチドとして定義してもよい。同様に、SH3ドメインの官能性部分は、SH3に結合するドメインに特異的に結合することができるSH3ドメインの少なくとも１つの部分を含むペプチドとして定義してもよい。SH2に結合するドメインの官能性部分は、SH2に結合することができるペプチドとして定義してもよく、少なくとも４アミノ酸残基長を有していてもよい。SH3に結合するドメインの官能性部分は、SH3に結合することができるペプチドとして定義してもよく、少なくとも４アミノ酸残基長、好ましくは10アミノ酸残基長を有する。
上記のスクリーニング方法で利用されてもよいPTP/アダプター複合体は、PTP/分子またはそれらの官能基部分、例えば、PTP触媒ドメイン、リン酸化ドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2に結合するドメイン、SH3に結合するドメイン、およびアダプタータンパク質、またはそれらのSH2ドメインおよびSH3ドメインといった官能基部分を含んでもよく、特に限定されない。使用されるペプチドは、リン酸化されていてもされていなくてもよく、リン酸化されている場合には、少なくとも１つのリン酸されたアミノ酸残基を含み、リン酸化されたTyrアミノ酸残基を含むことが好ましい。リン酸ドメインは、あるアミノ酸残基を特異的にリン酸化したペプチドとして定義してもよい。このようなリン酸ドメインの官能性部分は、特異的PTKによってアミノ酸を特異的にリン酸化され得るペプチドとして定義してもよい。SH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2に結合するドメイン、およびSH3に結合するドメインの官能性部分は上記のものであってもよい。
結合活性を示す分子を、さらにPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体を破壊する能力を調べるためにスクリーニングしてもよい。二者択一的に、分子を、PTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体を破壊能のために直接スクリーニングしてもよい。例えば、in vitro複合体形成を、最初に、固相支持体に固定化された目的の複合体のうちの１つの成分、またはそれらの官能性部分によってアッセイする。第二に、固定化された複合体成分を、上記のように同定した化合物、および目的の複合体の第二の成分、またはそれらの官能性成分に接触させる。第三に、化合物の存在下で、第二の成分が固定化された成分と安定した複合体を未だに形成できるか否かを測定する。
加えて、in vivoでの複合体形成を、当業者に公知の免疫共沈法を利用してアッセイしてもよい。簡単にいえば、目的のPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体を形成できる細胞株を上記のように同定した化合物に接触させ、細胞ライセートをこのよう接触させた細胞株から調製する。目的の複合体の成分の１つに対して上昇した抗体を細胞ライセートに添加し、標準的な免疫沈降法に供する。複合体が破壊された場合に複合体の成分だけに対して上昇した抗体が沈降するのに対して、複合体がまだ形成される場合には免疫沈降では複合体が沈降する。
目的のPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体のトランスフォーメーション能に対する薬剤の効果を直接にアッセイしてもよい。このような薬剤は、必ずしも必要ではないが、上述のスクリーニング法を利用して同定された薬剤を含んでもよい。例えば、１またはそれ以上の薬剤は、阻害剤がなければ、細胞のトランスフォーメーションを生じるPTK/アダプター複合体を形成できる繊維芽細胞または造血幹細胞に投与してもよい（Muller et al.,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792;McLaughlin et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6558−6562）。細胞のトランスフォーメーション状態は、その後、例えば、in vitroで軟寒天でのコロニー形成能をモニターすることにより測定してもよい（Lugo et al.,1989,Mol.Cell.Biol.9:1263−1270;Gishizky et al.,1992,Science 256:836−839）。二者択一的に、細胞のトランスフォーメーション状態を、in vivoで、重篤な複合免疫不全状態（SCID）の免疫不全ヌードマウスでの腫瘍の形成能を測定することにより、モニターしてもよい（Sawyers et al.,1992,Blood 79:2089−2098）。さらに、BCR−ABLの場合には、１つまたはそれ以上の薬剤を、当業者に公知のALLおよび／またはCMLの動物モデルに投与してもよく（Gishizky et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3755−3759）および／またはガン性障害の進行を逆転するかもしれない。
PTK/アダプターおよび／またはPTP/アダプター複合体形成を破壊することができ、そしてこうした複合体形成から生じる細胞増殖障害を低下させるか阻害することのできる薬剤を、こうした障害を示している患者またはこのような障害を示すおそれのある患者の治療に使用してもよい。上記の１つまたはそれ以上の薬剤を有効な濃度で患者に投与すると、PTK/アダプターまたはPTP/アダプタータンパク質複合体を含むはずの細胞増殖能は、このような薬剤の存在下で、低下するかまたは消失する。
また、白血病のような造血細胞増殖性疾患の場合には、患者への直接投与よりもむしろ、作用物質または薬剤は当技術分野で公知の自己骨髄移植および化学放射線療法とともに使用することができる。簡単に述べれば、一般に骨盤から採取される骨髄細胞のアリコートを患者から取り出す。次に、細胞をPTK/アダプターまたはPTP/アダプター複合体を効率よく破壊し得る濃度の作用物質または薬剤の存在下で培養する。かかる複合体を形成する能力がある骨髄細胞のシグナル伝達経路をブロックすることにより、これら細胞のクローン子孫の存在に対して選択し、治療対象の造血細胞増殖性疾患に関与しているこれら細胞の培養物を効果的に排除する。骨髄細胞を培養して、発がん性の高い細胞を取り除いている間、当技術分野で公知の技法および線量を用いて、その疾患に適した化学放射線療法で患者を治療する。こうした化学放射線療法による治療の終了時に、患者は発がん性細胞を一掃しておいた骨髄細胞培養物の自己由来の注入液を受け取る。
本発明の好ましい態様において、PTK/アダプター複合体は破壊または妨害されており、そして該複合体はそのPTK成分がヒトBCR−ABL遺伝子の細胞内PTK産物で、アダプタータンパク質成分がアダプタータンパク質のGRBサブファミリーのGRB−２メンバーであるものである。さらに、このような薬剤の投与により治療される細胞増殖性疾患としては、この好ましい態様では慢性骨髄性白血病と急性リンパ性白血病が挙げられるが、これらに限らない。
5.7 結合相手間の相互作用を破壊する能力がある化合 物の同定
活性化チロシンキナーゼ分子とアダプタータンパク質分子（ここでは、「結合相手」と呼ぶことにする）との相互作用を妨げる（すなわち、破壊または阻止する）能力について化合物を試験するにあたって、多くのアッセイ系のどれを使用してもよい。活性化チロシンキナーゼ分子のほかに、アダプタータンパク質と結合して複合体を形成する他の分子が結合相手のこの定義に含まれることを認識するべきである。それゆえ、別の結合相手としては、例えばGRB−２アダプタータンパク質と結合することが知られているSH2ドメイン含有タンパク質のSHCがある（Tauchi,T.ら,1994、J.Exp.Med.179:167−175;Rozakis−Adcock,M.ら,1992,Nature 360:689−692;Pelicci,G.ら,1992,Cell 70:93−104）。しかし、リガンド（天然または合成）、ペプチドまたは小さな有機分子を含むがこれらに限らない多数の化合物をスクリーニングできる迅速で高処理量のアッセイが好ましいものである。こうして結合相手の相互作用を妨げることが確認された化合物はここに記載される阻害活性についてさらに評価され得る。
結合相手間の相互作用を妨げる化合物の同定に用いられるアッセイ系の基礎的な原理は、２種のタンパク質を相互作用させ、結合させ、複合体を形成させるのに十分な条件下および時間において結合相手を含有する反応混合物を調製することを包含する。阻害活性について化合物を試験するためには、反応を試験化合物の存在下または不在下で実施する。すなわち、試験化合物は反応混合物中に最初に添加しておいてもよいし、結合相手の添加後のある時点で添加してもよい。対照は試験化合物の不在下でまたはプラシーボとともにインキュベートされる。その後、結合相手タンパク質の複合体の形成を検出する。対照反応混合物中に複合体が形成されるが、試験化合物を含む反応混合物中では複合体が形成されないこと、または対照反応と比較して反応混合物中での複合体形成のレベルが低下していることは、該化合物が結合相手間の相互作用を妨げることを示している。利用しうるアッセイ成分および各種フォーマットを以下に述べる。
アッセイの成分として用いられる結合相手は、天然源から得られるものであってよく、例えば当技術分野で公知のタンパク質分離法を用いて細胞から精製したり、当技術分野で公知の技法を用いて組換えDNA法により作製したり（例えば、Sambrookら,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories Press,Cold Spring Harbor,N.Y.参照）、かつ／または当技術分野で公知の技法を用いて全部または一部を化学合成したりすることができる。例えば、ペプチドを固相法で合成し、樹脂から切り離し、分離用の高性能液体クロマトグラフィーで精製する（例えば、Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman ＆ Co.,N.Y.pp.50−60参照）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができ、例えばエドマン分解法が用いられる（例えば、Creighton,1983,前掲を参照）。
ペプチド断片はそれぞれのタンパク質の結合ドメインに対応するように作製しうる。例えば、このような断片にはSH2ドメイン、SH3ドメイン、SH2ドメインに結合するペプチド断片および／またはSH3ドメインに結合するペプチド断片が含まれるが、これらに限らない。タンパク質の結合部位を同定および単離するには、当技術分野で常用されている多くの方法を採用することができる。こうした方法として、タンパク質をコードする遺伝子の１つの突然変異誘発および同時免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングがあるが、これらに限らない。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析により、相互作用結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が明らかになるだろう。
また、あるタンパク質を固体表面に固定し、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理しておいたその標識結合相手と相互作用させて、それに結合させることもできる。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識ペプチドは固体材料に結合されたままで残り、それを単離した後アミノ酸配列決定により同定する。また、ひとたびタンパク質の遺伝子が得られたら、短い遺伝子セグメントを遺伝子工学的に作製してそのタンパク質のペプチド断片を発現させ、その後ペプチド断片をその結合活性について試験し、精製し、または合成することができる。
本発明のアッセイにおいて使用しうる結合相手のアミノ酸配列は、分子クローニング法で作製されようと、化学合成法で合成されようと、それらをコードする遺伝子の既知配列に同一である必要はない。結合相手はアミノ酸残基が欠出、付加または置換されているが機能的に等しい産物をもたらす変更配列を含んでいてもよい。
例えば、配列内の残基の代わりに機能的に等しいアミノ酸残基を用いて配列を変えることができる。こうした置換残基はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができ、例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
アッセイ系で用いられる結合相手の１つは、結合相手間で形成される複合体の検出を容易にするために、直接または間接的に標識されるべきである。適当な標識系のどれを使用してもよく、¹²⁵Iのような放射性同位元素、基質にさらしたとき検出可能な比色分析シグナルまたは光を発生する酵素標識系、それに蛍光標識が含まれるが、これらに限らない。
アッセイの結合相手を作製するために組換えDNA法を用いる場合は、標識づけ、固定化および／または検出を容易にする融合タンパク質を遺伝子工学的に作製することが有利である。例えば、チロシンキナーゼまたはアダプタータンパク質のコード配列を、酵素活性を有するかまたは酵素基質として作用する異種タンパク質のコード配列に融合させることにより、標識づけおよび検出が簡単になる。融合構築物は、融合産物の異種成分が結合相手の結合を妨げないように設計すべきである。
間接標識は、結合相手のひとつに特異的に結合する、標識抗体のような第３のタンパク質の使用を伴う。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーにより生産されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されることはない。
アッセイは、不均一または均一な形態で行うことができる。不均一アッセイは、結合相手のひとつを固相に固定し、固相に固定された複合体を反応の最後に検出することを伴う。均一アッセイにおいては、全反応は液相中で行われる。どちらの方法においても、反応物の添加の順序を変えて、試験される化合物に関する異なる情報を得ることができる。例えば、試験物質の存在下で反応を行う、すなわち、結合相手の前または結合相手と同時に反応混合物に試験物質を添加することにより、例えば、競合により結合相手間の相互作用を妨害する試験化合物を同定することができる。一方、複合体が形成した後に試験化合物を反応混合物に添加することにより、前形成された複合体を分断する試験化合物、例えば、複合体から結合相手のひとつにとって代わるより高い結合定数を有する化合物を試験することができる。
不均一アッセイ系においては、一方の結合相手が固体表面に固定され、その結合相手（固定されていない）が直接あるいは間接的に標識される。実際には、マイクロタイタープレートが好都合に利用される。固定種は、非共有または共有結合により固定化されうる。非共有結合は、固体表面をタンパク質の溶液でコーティングして乾燥することにより、簡単に達成されうる。あるいはまた、タンパク質に特異的な固定化抗体を使用して、タンパク質を固体表面に固定してもよい。この表面を前もって調製し、保存しておいてもよい。
上記のようなアッセイを行うために、試験化合物とともに、あるいは試験化合物なしに、固定化種の結合相手はコーティングされた表面に添加される。反応が完了した後に、（例えば、洗浄により）未反応の成分を除去すると、形成した複合体は固体表面に固定化されたままでいる。固体表面に固定された複合体の検出はいくつかの方法でなされる。結合相手が予備標識されている場合には、表面に固定化された標識の検出により、複合体の形成が示される。結合相手が予備標識されていない場合には、間接標識を使用して、例えば、結合相手に特異的な標識抗体（この抗体は、今度は、標識抗Ig抗体により直接的にあるいは間接的に標識されうる。）を用いて、表面に固定された複合体を検出することができる。反応成分の添加の順序に依存して、複合体の形成を抑制するか、あるいは、前形成された複合体を分断する試験化合物を検出することができる。
あるいはまた、試験化合物の存在下または不存在下で、液相中で反応を行い、反応生成物を未反応成分と分離し、そして、例えば、溶液中に形成した複合体を固定するための一方の結合相手に特異的な固定化抗体および固定された複合体を検出するための他の結合相手に特異的な標識抗体を用いて、複合体を検出することができる。ここでも、反応物の液相への添加の順序に依存して、複合体を抑制するか、あるいは、前形成された複合体を分断する試験化合物を同定することができる。
本発明の他の態様において、均一アッセイを使用することができる。この方法においては、結合相手の前形成された複合体が調製され、ここでは、結合相手のひとつが標識されるが、この標識により生じるシグナルは複合体の形成により消失する（例えば、イムノアッセイのためのこの方法を利用するRubensteinの米国特許第4,109,496号を参照のこと）。結合相手のひとつと競合し、前形成された複合体からこれにとって代わる試験物質の添加により、バックグラウンドより高いシグナルが発生する。このようにして、ウイルスタンパク質−宿主細胞タンパク質相互作用を壊す試験物質を同定することができる。
6.実施例:BCR−ABLはGRB−２とin vitroでもin vivoで も会合する
この節で提示する実施例において、アダプタータンパク質のGRBサブファミリーのGRB−２メンバーがBCR−ABL細胞内PTKにin vitroでもin vivoでも結合することが実証される。
6.1.材料および方法
6.1.1 細胞およびウイルス
Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞を完全Grace培地（Smith,G.E.,1983,Mol.Cell.Biol.3:2156−2165）中で増殖させた。Ph¹陽性白血病細胞系K562およびNMG−01を慢性骨髄性白血病患者から誘導し、P210 BCR−ABLを発現させた。PH¹陽性細胞系ALL−１を急性リンパ性白血病患者から誘導し、P185 BCR−ABLを発現させた。これらのPH¹陽性細胞系を10％牛胎児血清含有RPMI 1640培地中で培養した。COSアフリカミドリザル細胞（COS African green monkey cells）およびRat1繊維芽細胞を５％牛胎児血清含有DMEM培地中で増殖させた。
Pendergastら,1991,Cell 66:161−171;Pendergastら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5927−5931に記載のように、野生型バキュロウイルスDNAの存在下で、pAcCI2バキュロウイルスベクター中にクローニングされた対応するcDNAを同時トランスフェクションすることにより、cBCR、cABLおよびBCR−ABLの発現用の組換えバキュロウイルスを作製した。
先に記載した方法（Mullerrら,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792）に従い、COS細胞での一過性の高発現（hyperexpression）により、無ヘルパー（Helper−free）レトロウイルスのストックを調製した。免疫組織化学的方法（Mullerら,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792）を用いて、野生型および変異型のBCR−ABL遺伝子産物をRat1繊維芽細胞へ移入する能力に従い、レトロウイルスのストックの特性付けを行った。これらの染色法において、内在性レベルのrat c−ablタンパク質は検出されなかった。BCR−ABLタンパク質発現のレベルを測定する（ウエスタンブロット）ことにより、遺伝子移入のレベルをさらに評価した。比較できるレベルの遺伝子移入を示すレトロウイルスのストックのみをこれらの検討に使用した。ウイルスストックの限界希釈へさらした後のG418耐性Rat1コロニーの頻度により測定したところ、力価はml当たり105感染粒子の範囲であった。
6.1.2 抗体
cBCRのアミノ末端、cABLのアミノおよびカルボキシ末端配列に対するウサギポリクローナル抗体については先に記載した（Pendergastら,1991,Cell 66:161−171;Konopkaら,1984,Cell 37:1035−1042）。マウスモノクローナル抗−ABL（21−63）抗体を免疫ブロット法（Pendergastら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5927−5931）に採用した。GRB−２（Ab50）のＣ末端SH3ドメインに対するウサギポリクローナル抗体およびGRB−２（Ab86）のＮ末端SH3ドメインから誘導された合成ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を、それぞれ、免疫沈降法および免疫ブロット法（Lowensteinら,1992,Cell 70:431−442）に使用した。
6.1.3 プラスミドの構築
650塩基対のヒトGRB−2 CDNA（Lowensteinら,1992,Cell 70:431−442:Matuokaら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9015−9019）を、ヒト胎盤cDNAライブラリーから、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、（5'）SH3−SH2および（3'）SH3フラグメントとしてクローニングした。完全長のGRB−2 cDNAを生成するために、GRB−２のコドン154のユニークなKpn I部位を採用した。GRB−２の全コーディング配列およびGRB−２の（3'）SH3ドメインをpGEX−2Tベクター（Pharmacia）のBam H I部位にフレーム内でサブクローニングした。Skolnikら,1993,EMBO J.12:1929−1936に記載のように、GRB−２の単離された（5'）SH3およびSH2ドメインを調製した。
野生型P185 BCR−ABL（McLaughlinら,1989,Mol.Cell.Biol.9:1866−1874）およびP185（Δ176−426）（Mullerら,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792）についてのcDNAの調製ならびに対応するcDNAのpSRα（Pendergastら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5927−5931）およびpSRαMSVtKneo（Mullerら,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792）ベクターへのクローニングは、先に記載したように行った。Muta−Gene Phagemid in vitro mutagenesisi system（Bio Rad）を用いるオリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発により、P185 BCR−ABL（Y177F）変異体を創製した。pGEM4/cBCR由来のcBCRの1.6KbのEcoR I−Sac IフラグメントをpBlueScript SK＋ベクター（Stratagene）のEcoR IおよびSac I部位にサブクローニングし、XL−1 BlueバクテリアをヘルパーファージR408（Stratagene）で同時感染させて一本鎖DNAを守ることにより、鋳型を作成した。この突然変異オリゴヌクレオチド5'−AAG CCC TTC TTC GTT AAC GTC GAG−3'を採用して、ヌクレオチド530をＡからＴに変更することにより、チロシンの代わりにフェニルアラニンコドンを生成した。さらに、ヌクレオチド534にサイレントな塩基の変更を導入し、ユニークなHpa I部位を作成した。このユニークなHpa I部位の存在のために突然変異誘発されたプラスミドが選択された。突然変異は、両方向でのジデオキシ読み終わり配列分析により証明された。突然変異したBCR配列を野生型P185 BCR−ABL cDNAに導入した。P185BCR−ABL（Y177F）をpSRαおよびpSRαMSVtK neo哺乳類発現ベクターならびにバキュロウイルス発現用のAcC12ベクターにサブクローニングした。野生型cABLのためのcDNAのpSRαベクターへのクローニングは、先に記載した（Pendergastら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5927−5931）。BCR（Δ872−1271）も、Pendergastら,1991,Cell 66:161−171に記載されているように、pSRαにクローニングした。
6.1.4.GST融合タンパク質の発現と精製
既に記載されたように（Pendergast et al.,1991,Cel l 66:161−171）、GST融合タンパク質を発現させて、グルタチオン−セルファロース4Bビーズ（Pharmacia）を用いて精製した。融合タンパク質は樹脂上に残したままで４℃で保存した。
6.1.5.代謝による標識化と免疫沈降
示された組換えバキュロウイルスにSf9細胞を感染させた。感染の３日後、細胞をメチオニンを含まない培地中で0.1mCi/ml［³⁵S］メチオニン（ICN）とともに４〜６時間、27℃でインキュベートした。5mM EDTA,1mM PMSF,50μg/mlロイペプチン、25μg/mlアプロチニン、25mM NaF,1mM Na₃VO₄および0.1mM Na₂MoO₄を補ったKLB（10mMリン酸ナトリウムpH7.0,150mM NaCl,1％Triton X−100）またはPCLB（50mM HEPES,pH7.0,150mM NaCl,1mM MgCl₂,1％Triton X−100,10％グリセロール）のいずれかで、標識細胞を溶解した。溶解物を100,000×ｇで１時間遠心することにより清澄とした。溶解物を示された抗体ととともに直接またはインキュベーション緩衝液（20mM HEPES,pH7.0,150mM NaCl,0.1％Triton X−100,10％グリセロール,0.5mM Na₃VO₄,0.1mM Na₂MoO₄,25mM NaF,1mM PMSF,25μg/mlロイペプチン）で３倍希釈後、示されたようにインキュベートした。プロテインＡ−セファロースビーズ（Pharmacia）とともに120分間、４℃でインキュベーションすることにより免疫複合体を集めた。ビーズをインキュベーション緩衝液で十分に洗浄し、結合していない物質を除去した。結合したタンパク質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、フルオログラフィーで肉眼で確認した。未標識の溶解物を用いるときはいつでも示された抗体によるイムノブロットによりそのタンパク質を検出した。
6.1.6.バインディングアッセイ
タンパク質溶解物をインキュベーション緩衝液で３倍に希釈し、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたGSTまたはGST融合タンパク質とともにインキュベートした。４℃での90分間のインキュベーション後、ビーズをインキュベーション緩衝液またはRIPA緩衝液（20mM Tris−HCl,pH7.4,137mM NaCl,10％グリセロール,1％Triton X−100,0.1％SDS,0.5％デオキシコール酸塩および2mM EDTA）で、示されたように十分に洗浄した。結合タンパク質はSDSポリアクリルアミド後の放射能標識化タンパク質のフルオログラフィーにより分析した。
6.1.7.イムノブロット、IN VITRO自己リン酸化および脱 リン酸化反応
イムノブロットおよび［γ³²P］ATPによるin vitro標識化の方法は基本的には以前に記載されたように行なった（Pendergast et al.,1991,Cell66:161−171;Pendergast et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5927−5931）。ジャガイモ酸性ホスファターゼによる脱リン酸化は記載されたように行なった（Pendergast et al.,1991,Cell66:161−171;Pendergast et al.,1991,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA88:5927−5931）。
6.2.結果
6.2.1.BCR−ABLはGRB−２とIN VIVOで会合する
BCR−ABLチロシンキナーゼがGRB−２アダプタータンパク質とそのままの細胞中で物理的複合体を形成するかどうかを決定するために、これらの２種類のタンパク質が共免疫沈降するかどうかを調べた。細胞溶解物をPh¹陽性白血病細胞系、K562、MEG−01、およびALL−1 Ph¹造血細胞系それにRat1繊維芽細胞から調製し、抗ABL pEx4、抗GRB−２または対照抗体との免疫沈降に供した。十分な洗浄の後、免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースビーズ上に集め、［γ³²P］ATPとMnCl₂存在下でin vitroリン酸化に供した。そのような条件はBCR−ABLキナーゼの自己リン酸化を促進する。反応は30分後に30℃で停止させ、洗浄し、SDS/8％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。³²P標識タンパク質はオートラジオグラフィーにより検出した。匹敵する量のBCR−ABLタンパク質を抗GRB−２または抗ABL抗体のいずれかを用いて沈降させた。さらに両形態のBCR−ABL（P210とP185）は対応するBCR−ABLタンパク質を発現するRat1繊維芽細胞のGRB−２と会合した。
同様に、GRB−２タンパク質との免疫沈降は、BCR−ABLを発現している細胞系の抗ABL抗体により沈降させることができる。具体的には、細胞溶解物をMEG−01細胞から調製し、対照（前免疫血清）、抗ABL pEX4抗体および抗GRB−２抗体との免疫沈降に供した。免疫沈降タンパク質をSDS/12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、抗GRB−２抗体を用いてイムノブロットした。結合した抗体は［¹²⁵I］プロテインＡを用いて肉眼で確認し、抗GRB−２と抗ABL免疫沈降物質を含有する両レーンで検出することができた。
BCR−ABLを発現する細胞を³⁵S−メチオニンで代謝的に標識した後、抗ABL抗体か抗GRB−２抗体による免疫沈降により、細胞中で利用できるBCR−ABLキナーゼの50％〜90％が上記の結果と一致してGRB−２と複合体を形成する。興味あることに、GRB−２と発がん性ｖ−ablキナーゼとの会合は観察されなかった。これらの実験から、GRB−２アダプタータンパク質は両形態のBCR−ABLチロシンキナーゼと安定な複合体を形成するが、ｖ−ablキナーゼとは複合体を形成しないこと、およびBCR−ABL/GRB−２複合体はBCR−ABLのin vitroリン酸化後そのままの状態にあることが分かった。
6.2.2.BCR−ABLはIN VITROでGRB−２と結合する
BCR−ABLとGRB−２との会合の分子的基礎を調べるために、全長GRB−2 cDNA配列をpGEX−2Tにクローン化して細菌中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質として発現させた。GST−GRB−２タンパク質を精製して、in vitroでBCR−ABLと結合する能力について調べた。具体的には、P185 BCR−ABL組換えバキュロウイルスで感染させたSf9昆虫細胞の分解物からの³⁵Sメチオニン標識タンパク質を、プロテインＡ−セファロースビーズに結合させた等量の固定化GSTのみ、GST−GRB−２全長、GSTアミノ末端、GRB−2 SH3ドメイン、GST−GRB−2 SH2ドメインGSTカルボキシ末端、GRB−2 SH3ドメインおよび抗ABL抗体とともにインキュベートした。90分間、４℃でのインキュベーション後、ビーズをインキュベーション緩衝液で４回、RIPA緩衝液で２回洗浄して、結合していない物質を除去した。結合したタンパク質はSDS/7％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、フルオログラフィーで検出した。バキュロウイルス感染の昆虫細胞中に発現されたP185 BCR−ABLは、グルタチオンセファロースビーズ上に固定化された全長GRB−２に結合することが分かった。GSTのみへの結合は検出されなかった。BCR−ABLとGST−GRB−２との複合体は、SDSとデオキコール酸塩洗浄剤を含有する緩衝液での洗浄後も、もとのままの状態であった。
どのGRB−２ドメインがBCR−ABLと結合するのかを同定するために、単離されたGRB−2 SH3ドメインとSH2ドメインを有するGST融合タンパク質を調製した。BCR−ABL結合はGST−GRB−2 SH2融合タンパク質と結合した。GRB−２のアミノ末端とカルボキシ末端のSH3ドメインを有するGST融合タンパク質もバキュロウイルス産生BCR−ABLタンパク質とin vitroで結合した。GRB−２のSH2とSH3のドメインとBCR−ABLとの相互作用はSDSとデオキシコール酸塩を含有する緩衝液での洗浄に抗するものであった。BCR−ABLをジャガイモ酸性ホスファターゼで処理することにより、GRB−2 SH2ドメインと会合するその能力は完全に取り除かれたが、GRB−2 SH3ドメインへのその結合が影響されることはなかった。
7.実施例:SH2を仲介とするGRB−２のBCR−ABLへの結合 に必要なBCR−ABL配列
本節に紹介する実施例において、GRB−2 SH2ドメインを経るBCR−ABL/GRB−２結合に必要なアミノ酸配列を調べる。具体的には、結合はTyr−リン酸化アミノ酸残基の存在を必要とすることが示され、さらにBCRの第一エキソン変異はSH2を仲介とするBCR/GRB−２結合を消滅させることができることが示される。
7.1.材料と方法
本実施例で紹介する実験に用いられた材料と技術は上記の第6.1節に記載した通りである。
7.2.結果
7.2.1.SH2を仲介とするGRB−２のBCR−ABLへの結合はBC R配列のチロシンリン酸化を必要とする
BCR−ABLのどの領域がGRB−２結合に関与しているかを同定するために、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞でBCRとABL配列を別々に発現させ、全長GRB−２ならびに単離されたGRB−2 SH2及びSH3ドメインに結合するそれらの能力について調べた。バキュロウイルスの産生したcABLは全長GRB−２にin vitroで結合したが、GRB−2 SH2ドメインだけでは結合しなかった。具体的には、Sf9昆虫細胞を単独でcABL組換えバキュロウイルスに感染させた。感染の３日後に細胞を³⁵S−メチオニンで標識した。標識細胞を溶解させ、溶解タンパク質を、プロテインＡ−セファロースビーズの存在下で、GSTのみ、GST−GRB−２全長、GST−GRB−２アミノSH3、GST−GRB−2 SH2、GST−GRB−２カルボキシSH3、および対応する抗ABL抗体とインキュベートした。90分間４℃でのインキュベーション後、ビーズをインキュベーション緩衝液で４回、RIPA緩衝液で２回洗浄した。結合したタンパク質をSDS/10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、フルオログラフィーで検出した。昆虫細胞中で過剰発現したcABLはチロシン残基上でリン酸化されている（Pendergast et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 8:5927−5931）。よって、バキュロウイルス産生cABLタンパク質に対してGRB−2 SH2ドメインが結合不能なのはチロシンリン酸化の欠如によるものではなかった。
in vitroでのcABLのGRB−２への結合は、GRB−２のアミノ末端とカルボキシ末端のSH3ドメインのみを経て仲介されているようである。SH3ドメインはプロリンに富む特定の部分に結合する（Cicchetti et al.,1992,Scie nce 257:803−806;Ren et al.,1993,Science 259:1157−1161）。最近、Sos1のカルボキシ末端領域に存在するプロリンに富む配列（PPPVPPR）とGRB−2 SH3ドメインとの直接の相互作用により、GRB−２はSos1グアニンヌクレオチド交換体に結合することが示されている（Li et al.,1993,Nature 363:85−87;Rozakis−Adcock et al.,1993,Nature 363:83−85）。cABLのカルボキシ末端はプロリンに富むいくつかの伸長部分を含有する。しかし、PPPVPPR配列はcABLタンパク質に見られない。in vitroでのGRB−2 SH3ドメインのcABLへの結合は、cABLカルボキシ末端ドメインの大部分を欠くcABL欠失変異タンパク質において著しく減少しているが、完全にはなくなってはいない。後記する通り、タンパク質溶解物からの免疫沈降後の通常のcABLとGRB−２との検出可能な会合の欠如とともに、これらのデータから、in vitroで観察されるcABL/GRB−２相互作用は特異的なものではなく、in vivoで起こらないことが示唆される。しかし、cABL中のプロリンに富むドメインは他のSH3ドメインの結合部位として働くことが可能である。
in vitroでのGRB−２の全長または単離されたドメインへのcBCRの結合の同様な分析から、全長GRB−２のみが、およびそれよりも少ない程度でGRB−２のＮ末端SH3ドメインが、in vitroでcBCRに結合することが明らかとなった。具体的には、Sf9昆虫細胞を単独でcBCR組換えバキュロウイルスに感染させ、次にcABL組換えバキュロウイルスで既に記載のように処理した。興味深いことに、GRB−２のSH2ドメインへのcBCRの結合は検出されなかった。
in vitroでGRB−2 SH2ドメインがcABLとcBCRにまったく結合しないことは、このドメインのキメラBCR−ABLチロシンキナーゼへの強い結合とは対照的である。cBCR配列のリン酸化状態は、BCR−ABLキメラとは全長cBCRタンパク質の点において異なる。cBCRタンパク質は、昆虫細胞での過剰発現後でさえ調べられたすべての種類の細胞のセリン／スレオニン残基においてのみリン酸化されているだけである（Timmons et al.,1989,Oncogene 4:559−567;Pendergast et al.,1991,Cell 66:161−171）。対照的に、BCR−ABLキメラにおいて、活性化ABLキナーゼはBCRの第一エキソン配列をチロシン上でリン酸化する（Liu et al.,1993,Oncogne 8:101−109）。BCR配列のチロシンリン酸化が、単離されたGRB−2 SH2ドメインへの結合の原因となっているかどうかを評価するために、全長cBCRとcABLのタンパク質をコードするバキュロウイルスを昆虫細胞に共感染させた。具体的には、Sf9昆虫細胞にcABLとcBCRの組換えバキュロウイルスを共感染させ、cABL組換えバキュロウイルスについて既に記載したように処理した。cABLチロシンキナーゼによるcBCRのトランス−リン酸化の結果、GRB−2 SH2ドメインはcBCRに結合した。抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットにより、cABLバキュロウイルスとcBCRバキュロウイルスを共感染させたSf9細胞中でcBCRはチロシンのリン酸化を受けた。GRB−２の単離されたアミノ末端またはカルボキシ末端のSH3ドメインへのcBCRの低いレベルのin vitro結合も検出された。これらの結果から、BCR配列へのGRB−2 SH2ドメインの結合はチロシンリン酸化が必要であることが示された。
7.2.2.GRB−２はIN VIVOでBCR−ABL配列と相互作用を行 なうが、CABLとCBCR配列とは相互作用を行なわない
GRB−２のcABLとcBCRへのin vitro結合がin vivoでも起こっているのかどうかを調べるために、対応するcDNAの発現構築物をCOS細胞に移入した。これらのcDNAのトランスフェクションの結果、cABLとcBCRの発現は対応する内因性タンパク質レベルを超えて約50〜200倍に増加する（Pendergast et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.US A 88:5927−5931）。これらの条件下で、cABLは認知できる量でGRB−２と共免疫沈降することはなかった。同様に、GRB−２とBCR配列との相互作用は、COS細胞でのP210 BCR−ABLキメラに保持されたBCR配列の過剰発現後に検出することはできなかった。対照的に、顕著な量のP185 BCR−ABLが同じ実験で抗GRB−２抗体により沈降した。
具体的には、pSRαベクター中にクローン化したcABL cDNAおよびP185野生型をCOS細胞に移入した。このトランスフェクションの３日後に細胞を溶解させ、溶解物を２時間、４℃で通常のウサギ血清、抗ABL 2/3抗体および抗GRB−２抗体とともにインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡビーズ上に集め、インキュベーション緩衝液で６回洗浄した。結合したタンパク質をSDS/8％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、フィルターを抗ABLマウスモノクローナル抗体とともにインキュベートした。免疫反応性バンドは増強化学発光（ECL）検出システム（Amersham）を用いて肉眼で確認した。さらに、pSRγベクター中にクローン化したBCR（△872−1271）cDNAをCOS細胞に移入した。この感染の３日後に細胞を溶解させ、溶解物を対照血清、抗BCR抗体または抗GRB−２抗体とともに２時間４℃でインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースビーズで集め、インキュベーション緩衝液で４回洗浄し、50mM Tris−HCl、pH7.0で２回洗浄し、次にγ−³²P ATPとMnCl₂存在下でin vitroリン酸化に供した。タンパク質はSDS/8％ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーにより分析した。
これらのデータは、通常の細胞からの抗GRB−２免疫沈降物中の検出可能な内因性cABLとcBCRタンパク質の欠如とともに、cABL/GRB−２とcBCR/GRB−２複合体はin vivoでは観察されないとの主張を支持するものである。これらの知見から、BCR−ABLキメラはそのBCRおよびABLタンパク質配列成分から識別できる新規なタンパク質結合性を示すことが実証された。
7.2.3.BCRの第一エキソンの点変異はGRB SH2ドメインの BCRへの結合を消滅させる
特定のチロシンリン酸化タンパク質へのSH2ドメインの結合は、リン酸化チロシンに対する一次配列Ｃ末端に依存する（Fanti et al.,1992,Cell 69:413−423;Kashishian et al.,1992,EMBO J．11:1373−1382;Sonyang et al.,1993,Cell 72:767−778）。BCRの第一エクソン内の11の潜在的チロシンリン酸化部位のまわりの配列を調べることにより、チロシン177がCRB−2 SH2ドメインの最適結合部位に対応する配列YVNV内に見られることが明らかとなった（Sonyang et al.,1993,Cell 72:767−778;Skolnik et al.,1993,ENBO J.12:1929−1936）。BCRの第一エクソン中の他の10個のチロシンのまわりの配列は、GRB−2 SH2ドメインまたは調べられた他のSH2ドメインの最適結合部位と一致しない（Sonyang et al.,1993,Cell 72:767−778）。BCR−ABLをGRB−2 SH2ドメインに結合させるためにチロシン177が必要であるかどうかを決定するために、部位特異的変異によりBCR−ABL中のチロシン177をフェニルアラニンに置換し、この変異タンパク質を昆虫細胞で発現させ、GRB−２に対する結合について調べた。in vitro自己リン酸化後のP185（Y177F）変異タンパク質とP185野生型タンパク質とのホスホペプチドマップのパターンの比較から、P185（Y177F）では少なくとも一つの主要なホスホペプチドの欠如が明らかとなった。具体的には、pSRαMSVtkneoベクターにクローン化したP185野生型とP185（Y177F）をCOS細胞に移入した。このトランスフェクションの３日後に、細胞を溶解させ、溶解物を抗ABL抗体とともにインキュベートした。免疫沈降物をγ−³²P ATPとMnCl₂存在下でin vitro自己リン酸化に供した。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロースに移し、ホスホペプチドマップ作製に供した。
結合の研究により、野生型P185 BCR−ABLとは対照的に、BCRの第一エクソン中のチロシン177をフェニルアラニンで置換したP185 BCR−ABL（Y177F）変異タンパク質は、in vitroでGRB−2 SH2ドメインと相互作用しないことが示された。具体的には、Sf9昆虫細胞に、pAcC12ベクターを用いてクローン化した野生型P185 BCR−ABL cDNAと野生型バキュロウイルスDNAを共に移入するか、またはpAcC12ベクター中にクローン化したP185 BCR−ABL（Y177F）cDNAと野生型バキュロウイルスDNAを共に移入した。このトランスフェクションの６日後、細胞を、³⁵S−メチオニンで代謝を通して標識した。細胞を溶解し、溶解物をGST−GRB−2 SH2または抗ABL pEX4抗体とともにプロテインＡ−セファロースビーズの存在下でインキュベートした。結合したタンパク質はSDS/7％ポリアクリルアミドゲル電気泳動とフルオログラフィーにより分析した。
次に、in vivoでGRB−２と相互作用するP185 BCR−ABL（Y117F）変異体の能力を評価した。P185（Y117F）は、変異タンパク質を安定に発現するCOS細胞またはRat1繊維芽細胞で過剰発現されたときに内因性GRB−２と相互作用を行なわなかった。同様に、チロシン177を欠くBCR−ABL欠失変異体はGRB−２に結合しなかった。具体的には、pSRαMSVtkneoベクター中にクローン化したP185野生型とP185（Y177F）のcDNAをCOS細胞に移入した。このトランスフェクションの３日後、細胞を溶解させ、溶解物を通常のウサギ血清（NRS）、抗ABL 2/3抗体、または抗GRB−２抗体とともに２時間、４℃でインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースビーズ上に集め、［γ³²P］ATPとMnCl₂存在下でのin vitroリン酸化に供した。タンパク質をSDS 10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーにより分析した。さらに、P185野生型とP185（Y177F）を発現するG418選択Rat1細胞の溶解物を、抗GRB−２抗体、抗ABL 2/3抗体または通常のウサギ血清とともに２時間、４℃でインキュベートした。免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースビーズ上に集めた。結合したタンパク質をSDS 10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびその後の抗ABLマウスモノクローナル抗体によるイムノブロットにより分析した。免疫反応性バンドはECL検出システム（Amersham）で肉眼で確認した。
これらのデータから、BCR−ABLとGRB−２とのin vivoでの相互作用は、BCR−ABL中のリン酸化チロシン177へのGRB−2 SH2ドメインの結合により仲介されていることが示された。GRB−2 SH3ドメインは、全長GRB−２とBCR−ABLとの間のin vivo結合に明らかに寄与していない。
8.実施例:GRB−２結合を欠損しているBCR−ABLタンパク質はトランスフォーメーション能力の減少を呈する
この実施例に示すデータにより、BCR−ABL細胞内PTKのトランスフォーメーションポテンシャルは、タンパク質のアダプターファミリーのGRBサブファミリーのGRB−２へのこのPTKの結合に依存していることが示される。この結果により、このようなPTKへのアダプタータンパク質の結合がトランスフォーメーション／発がん過程における１つのステップとして関与していることを表している。
8.1.材料および方法
8.1.1 トランスフォーメーションアッセイ
Rat1繊維芽細胞の感染を前記のように実施した（Lugoら,1989,Mol.Cell.Biol．９:1263−1270）。力価は、繊維芽細胞への遺伝子転移の頻度により測定した場合、ml当たりの感染粒子が＞10⁵の範囲である。半固体培地でRat1コロニー形成を、15％子牛胎児血清および0.4％ノーブル（Noble）寒天を補給した、Iscove 5ml中の６−cm²皿当たり５×10⁴個の細胞を塗布して測定した（Lugoら,1989,Mol.Cell.Biol.9:1263−1270）。G418−耐性集団を感染細胞をG518（0.5mg/ml）で12〜15日間培養して樹立した。選択した後、G418−耐性培養物の細胞をml当たり10⁴個の細胞の濃度で寒天に塗布した。寒天に形成したコロニーの数を細胞塗布の２週間後に記録した。
新たに単離したマウス骨髄からの造血細胞培養物の感染および樹立を前記のように実施した（McLaughlinら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6558−6562）。簡単には、４〜６週令雌BALB/cマウスからの骨髄成分を、ml当たりPolybrene 4μｇを補給した適切なレトロウイルス原液にml当たり２×10⁶個の細胞で再懸濁した。細胞を37℃で４時間インキュベートした。感染後、細胞を洗浄しそして５％子牛胎児血清および50μＭβ−メルカプトエタノールを補給したRPMI 1640培地に再懸濁した。ml当たり10⁶個の細胞の濃度で細胞懸濁液5mlを各6cm²皿に塗布した。培養物を８週間まで維持し、新鮮な培地を１週間に１度添加した。非粘着性造血細胞の濃度がml当たり10⁶個を越える場合に、培養物が形質転換したと考えた。
8.1.2.種々の方法
セクション8.1.1に記載したトランスフォーメーションアッセイとは別の技術は上記のセクション6.1に記載されているものである。
8.2.結 果
BCR−ABL−誘導発がん誘発に対するGRB−２結合の生物学的関連性を測定するために、BCR−ABLが繊維芽細胞および造血細胞をトランスフォームする能力に対する、GRB−２と会合するのに必要な突然変異チロシン−177の影響を調べた。ヘルパーフリーの野生型のレトロウイルス原液および突然変異BCR−ABL型を使用してRat1繊維芽細胞および新たに単離したマウス骨髄細胞に感染させた。GRB2およびhSos−１の両者ともこれらの細胞型で発現することが示された（Lowensteinら,1992,Cell.70:431−442;Bowtellら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:6511−6515;Chardinら,1993,Science 260:1338−1343）。Rat1繊維芽細胞のトランスフォーメーションを軟寒天でのコロニー形成により検定した（Lugoら,1989,Mol.Cel l.Biol.9:1263−1270）。造血細胞トランスフォーメーションをpre−Ｂ−リンパ球の成長を支持する条件下で感染マウス骨髄細胞を培養することにより検定した（McLaughlinら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:6558−6562）。野生型BCR−ABLと対照的に、P185（Y177F）タンパク質は造血細胞を形質転換せず、Rat1細胞を形質転換する能力の減少を示した（下の表１を参照されたい）。これらの結果は、Y177を欠失しているP185（Δ176−426）突然変異体がRat1繊維芽細胞および造血細胞の両者でトランスフォーミング活性の減少を呈するという以前の観察と一致する（Mullerら,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792;表１）。P185（Δ176−426）はP185（Y177F）より、特にG418選択の後でRat1繊維芽細胞のトランスフォーメーションにおいてさらに顕著な欠失を示す。BCR第一エクソンのY177の下流にある配列はホスホセリン／ホスホトレオニン依存形式でSH2−ドメインに結合していることが示された（Peudergastら,1991,Cell66:161−171;Mullerら,1991,Mol.Cell.Biol.11:1785−1792）。２種のSH2−結合部位がこの領域内で同定され（ＡおよびＢと名付けられた）、そしてこれらの部位の除去により繊維芽細胞のBCR−ABL−媒介トランスフォーメーションにとって重要な特異的タンパク質相互作用を停止できるであろう。P185（Y177F）およびP185（Δ176−426）の両者とも造血細胞でトランスフォーミング活性を示さなかった。BCR−ABLタンパク質の形質転換活性における差異はタンパク質発現のレベル差によるものではなかった。

種々のBCR−ABL型を発現する細胞の溶解物質のウェスタンブロット分析により、相当するレトロウイルスでRat1繊維芽細胞を感染後の、比較できる定常的なタンパク質の値が示された。ウェスタンブロット分析では、RAT1細胞を、P185BCR−ABCの野生型および突然変異体（Y177F）型またはコントロールベクターをコードするレトロウイルスで感染させた。感染３日後に、細胞を溶解し、そして抗−ABLマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法を実施した。免疫反応帯をECL検出系（Amersham）を用いて可視化した。
9.実施例：ras反応性エレメントプロモーターからのras 依存的なBCR−ABL活性の転写
本節に記した実施例においてBCR−ABL細胞内PTK/GRB−２結合はrasシグナル伝達経路を活性化することが示されている。
9.1.材料と方法
9.1.1.転写活性化アッセイ
ras反応性エレメント（ets/AP−１）プロモーターからの発現の転写活性化は本質的には既述の方法に従った（Clarkら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4887−4891;Hauserら,1993,Methods in Enzymology,印刷中）。簡単に記せば、NIH 3T3細胞を１μｇのpB4X−CATクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポータープラスミド（Wasylykら,1989,Mol.Cell.Biol. ９:2247−2250）及び５μｇのpZIP H−ras（17N）（Feigら,1988,Mol.Cell.Biol. 8:3235−3243）の存在または不在下で明示したBCR−ABL変異体を含有する0.5μｇのpSRαMSVTkneoを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションは60mmの皿を用いて２通りずつ行い、細胞は48時間後に採取した。250mMトリス塩酸（pH7.8）100μｌ中で凍結融解して細胞を溶解した後、遠心して細胞の破片を取り除き、上清を62℃で加熱して内在性のアシルトランスフェラーゼを変性させた。さらに遠心した後、上清を50μｌずつ取り、0.1μCiの¹⁴Cクロラムフェニコール（NEN）及び250mMトリス塩酸中に0.34mMアセチルCoAを含む液で最終反応容量を140μｌとして45分間インキュベートし、CAT活性を測定した。反応は500μｌの酢酸エチル抽出によって終わらせ、真空下で蒸発させ、残存したペレットを再溶解し、シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーをおこなった。溶剤としては、５％メタノール/95％クロロホルム（v/v）を用いた。AMBISベータスキャナーで定量した。
9.1.2.その他の技法
第8.1.1節に記載したトランスフォーメーションアッセイ以外の技法については、上記の第6.1節に記載したとおりである。
9.2.結 果
GRB−２のBCR−ABLとの結合が発癌性の形質転換を可能とする作用機作は、Sos−１グアニンヌクレオチド交換因子を経由してrasを直接的に刺激することによるものである。BCR−ABLとGRB−２との相互作用が、ras経路に直接的に作用するか否かを調べるため、転写活性化アッセイを行った。発癌性のrasはras反応性エレメント（例えば、ets−１及びAP−1 DNAモチーフ;Hauserら,19993,Methods in Enzymology，印刷中）からの転写率を増加させる。さらに、プロテインチロシンキナーゼおよびセリン／トレオニンキナーゼを含む広範な機能を有するガン遺伝子は、ras反応性エレメント、例えばets/AP−１モチーフを有するプロモーターからの転写を活性化しうる（Schweighofferら,1992,Science.256:825−827）。各種のガン遺伝子のets/AP−１含有プロモーターからの転写活性化能と細胞形質転換能との間には相関関係がある（Wasylykら,1988,ENBO.J. 7:2475−2483）。上述のとおり、トランス活性化アッセイは、ガン遺伝子機能の分析のための細胞増殖及び腫瘍原性研究を補完するものである。
BCR−ABLの野生型と変異型について、ets/AP−１からの転写活性化能を比較した。CATレポーターはβ−グロビンプロモーターの制御下にあり、４個の縦列のras反応性エレメントを有している（pB4X−CAT）。発癌性のrasはこのエレメントからの転写率を15倍増加させることが示されている（Schweighoffer,Science,256:825−827）。図１に示すとおり、野生型BCR−ABLで誘導した活性化は、ras（17N）、これは最も強力な阻害性の変異体で、ras機能を中和することが示されているものであるが（Feigら,1988,Mol.Cell.Biol.，８:3235−3243;Thomasら,1992,Cell，68:1031−1040;Woodら,1992,Cell，6 8:1041−1050）このras（17N）のコトランスフェクションによって消失する。このことは、BCR−ABLによって誘導された転写活性がrasによって媒介されることを示している。BCR−ABL変異体のP185（Y177F）及びP185（Δ176−425）はGRB−２結合を欠いているが、それらの変異体はこのプロモーターからの転写トランス活性化にほとんど影響を及ぼさないことは意義深いことである。これらのBCR−ABL変異体で示された低いレベルのトランス活性化は、これらの変異体が野生型P185 BCR−ABLに比し低い形質転換能を有することと相関している（上記の表１参照）。
さらに、野生型BCR−ABL含有レトロウイルスをRat1の繊維芽細胞に感染させるとras−GTP画分が増加する。すなわち、Rat1細胞にP185 BCR−ABL野生型のヘルパーフリーレトロウイルス又はベクター（対照）を感染させた。感染の２日後に、リン酸塩不含の培地で³²P−オルトリン酸（0.5mCi/ml）で16時間、細胞をラベルした。細胞を溶解させ、抗rasモノクローナル抗体でras−免疫沈降させた。rasに結合したグアニンヌクレオチドは、解離させた後、0.75M KH₂PO₄（pH3.5）中のPEI−セルロースプレートで薄層クロマトグラフィーにより分離した。rasに結合したGDP及びGTP量のAMBISベータスキャナーによる定量では中程度だが再現性のある増加を示した。
10.実施例：シグナル伝達能のないGRB2は形質転換され た細胞の表現型を復帰させる
次の例は、BCR/ABLとGRB2が関与するシグナル伝達経路が分断されると、形質転換によって生じた表現型が復帰され得ることを示している。シグナル伝達能のないGRB2変異体の発現が増大すると、Rat1細胞のBCR/ABLで誘導された増殖が復帰する。また、シグナル伝達経路の分断によって、慢性骨髄性白血病患者から得られたBCR/ABLを発現する細胞（K562細胞）及びPDGFレセプター依存性の形質転換細胞の増殖も阻害される。
10.1.材料と方法
GRB2遺伝子の変異体は、Ｎ、末端又はＣ末端のどちらかからSH3ドメインを欠失することによって構築された。GRB2の完全長型及び末端切断型は、改変pCGNプラスミドベクター（Tanakaら，Cell，60:375−386,1990）のBamH I部にPendergastら、Cell，75:175−183,1993記載の方法で挿入した。このベクターにはヒグロマイシン抵抗性遺伝子をSV40複製起点の上流に挿入してある。トランスフェクトされら構築物からの内在性のGRB2タンパク質を区別するため、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンエピトープをコードする配列（Pati,U.K.,Gene，114:285−288,1992）を変異体タンパク質のＮ末端に同じ読み枠で融合させてある。これと同じ抗原性標識を野生型GRB2遺伝子にも融合させた。
BCR/ABLで形質転換されたRat1繊維芽細胞は上記実施例8.1.1に記載の方法で確立した。GRB2構築物はRat1−BCR/ABL細胞系及びラットグリオーム細胞系C6（ATCC CCL 107）に標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法（Molecular Cloning Techniques,Laboratory Manual,2nd Ed.,Sambrookら編,Cold Spring Harbor Laboratory Press,及びMuller）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクト後、Rat1細胞を24時間培養し、G418薬剤＋ヒグロマイシン（Sigma）に７−９日間さらした。２種の薬剤によって選択された細胞群を軟寒天にまき、内在性BCR/ABL,GRB2,トランスフェクトされたGRB2のレベルをウエスタンブロットで測定した。相異なるGRB2構築物を発現している個々のクローン由来の細胞系も確立した。トランスフェクトされたC6細胞の場合には、Muller（上述参照）の方法に従ってヒゴロマイシン含有培地で10日間培養することにより、細胞を選択した。薬剤による選択の後、細胞を0.5％FCSとPDGF（1ng/ml）を含有する軟寒天培地にまいた。10日目に0.4mmより大きいコロニー数を数えた。
GRB2構築物の発現は、Pendergastら，Cell．75:175−185,1993の方法に従って免疫沈降反応で調べた。簡単に記せば、BCR/ABL−GRB2を発現しているRat1細胞を溶解させ、抗ABL pEx4抗体で免疫沈降反応させ、免疫沈降物をin vitroオートキナーゼアッセイにかけた（Pendergastら，上述参照）。サンプルは、SDS−PAGEゲルで分析し、オートラジオグラフィーで目視可能なものとした。２つの目の実験においては、細胞を10mMトリス塩酸（pH7.4）、１％SDS、1mM PMSF中で溶解し、各サンプルからの15μｇのタンパク質をSDS−PAGE（15％）を用いて分離した。得られたタンパク質は、電気泳動でニトロセルロースフィルターに移し、抗GRB2マウスモノクローナル抗体（Trandsduction Laboratories）で免疫ブロットした後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスモノクローナル抗体（Bio Rad）とインキュベートした。タンパク質はEnhanced Chemiluminescence検出システム（Amersham）で目視可能とした。
軟寒天アッセイは既述の方法（Lugoら，Mol.Cell.Bi o.,９:1263−1270）に従って行った。薬剤によって選択された細胞群は、それぞれの細胞型のクローニング効率によって10³〜５×10⁴個/6cm²皿の範囲の密度でプレートした。サンプルは20％ウシ胎児血清を含有する培地に２通りずつまいた。肉眼で見えるコロニー（0.4mmより大）を14日後に数えた。データはトランスフェクトされ、薬剤で選択された細胞群について行った３ないし５回の独立した実験でのコロニー数の平均を示している。Rat1−BCR/ABLの増殖に関するデータは、適当な構築物でトランスフェクトした３つの独立したRat1−BCR/ABLのクローンからの細胞系についてそれぞれ２〜３回の別の実験を繰り返して得たものである。上記のとおり、このデータは７つの独立した実験で観察されたコロニー数の平均を示している。
K562（ATCC CRL 243）細胞は標準的なエレクトロポレーション法を用いて、GRB2構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトした後、18〜24時間培養し、ヒグロマイシン（500μg/ml）に２日間さらした。薬剤による選択後、生細胞数はトリパンブルー染色されない細胞数を数えることによって決定した。軟寒天に同数の生細胞をまいた。
10.2.結 果
10.2.1.Rat1細胞におけるGRB2の発現
Rat1−BCR/ABL細胞でのGRB2 N末端変異タンパク質の発現は、正常な表現型への復帰をひきおこす。GRB2 N末端変異体を発現する細胞群は液体培養で単層をなし、集密状態に達すると接触阻害を示した。GRB2 N末端変異体を発現するRat1−BCR/ABL細胞は、空のベクターを発現している細胞と比較すると、軟寒天中にコロニーを形成する能力がはるかに低いことは重要である（表２参照）。GRB2C末端変異体を発現する細胞は液体培養で単層をなすが、集密状態になっても休止しなかった。GRB2 C末端変異体を発現するRat1−BCR/ABL繊維芽細胞の軟寒天中での増殖は、GRB2 N末端変異体で見られた程ではないが抑制された。Ｎ末端変異体及びＣ末端変異体を発現する細胞群には変異型タンパク質と野生型GRB2タンパク質の類似した比が示されているので、Ｎ末端変異体がBCR/ABLによって誘導される形質転換をより強く抑制することは単に２種の変異体のレベルの差によるものではないであろう。詳細には、p210 BCR−ABLのみ、あるいはさらに野生型GRB2又は末端切断型GRB2を共に発現しているRat1細胞を溶解し、抗ABL抗体と免疫沈降反応をさせた。沈降反応生成物をin vitroオートキナーゼアッセイし、サンプルはSDS−PAGE（８％ゲル）で分析した。対照に比しGRB−２発現の増大している細胞においてもABLキナーゼ活性に変化は認められなかった。さらにp210 BCR−ABLのみ、あるいはさらに野生型GRB2又は末端切断型GRB−２を共に発現しているRat1細胞を溶解させ、１つのクローンの細胞溶解物から得たタンパク質を電気泳動でニトロセルロースフィルターに移し、抗GRB−２モノクローナル抗体を用いて免疫ブロットした。GTB−２形質転換体はすべてほぼ同程度のGRB2タンパク質を発現した。これらの相異はむしろ２つのSH3ドメインがSOSと異なる親和性で結合するか、あるいは異なる基質と結合することを示しているのかもしれない。このようにGRB−２のSH3欠失変異タンパク質は、細胞中で内在性の野生型GRB2と等モル量又はより多量に存在する場合、BCR/ABLによって誘導される形質転換の主たる負の阻害剤となる。
N'末端又はC'末端GRB2変異体と対照的に、Rat1−BCR/ABL繊維芽細胞中で野生型GRB2の発現が増大した場合は、形質転換された表現型をより目立たせると考えられる。トランスフェクトされた野生型GRB2構築物を発現している、薬剤によって選択された細胞群は、空のベクターでトランスフェクトされた細胞と比較すると軟寒天中のコロニー数が常に25〜30％多かった（表２）。これらのデータは、Rat1繊維芽細胞のBCR/ABLによって誘導される形質転換においてGRB2タンパク質が制限エフェクターである可能性を示唆している。

10.2.2.K562細胞でのBRB2変異体の発現
GRB2のSH3部分の変異体はヒト白血病細胞の増殖も阻害する。GRB2構築物をK562細胞に導入した。K562細胞は、p210 BCR/ABLを発現している細胞で芽球発症の慢性骨髄性白血病患者から確立した系である。トランスフェクション及び48時間薬剤選択を行った後、内在性のBCR/ABL,GRB2及びトランスフェクトされたGRB2のレベルをウエスタンブロット法で求めた。同時に生細胞を軟寒天にまいた。GRB2 N末端変異体タンパク質を発現しているK562細胞の培養では、空のものをトランスフェクトした対照に比べ、軟寒天中のコロニー数が1/10であった（表２）。Rat1−BCR/ABL繊維芽細胞で認められたと同様に、GRB2 C末端変異体もK562のコロニー形成を阻害したが、その程度はＮ末端変異体より低かった。これらのデータは、GRB2によって媒介されるシグナル伝達が、BCR/ABLによって引き起こされるヒトの悪性腫瘍発生において重要不可欠な要素であることを示唆している。
10.2.3.C6グリオーム細胞でのGRB2の発現
GRB2構築物をラットC6グリオーム細胞にも導入した。C6グリオーム細胞の形質転換された増殖性の表現型はPDGF受容体活性依存性である（Zhangら，Neurol.Res. 14 （５）：397−401,1992）。PDGF受容体がGRB2と相互作用することは知られている（Lowensteinら,1992,Cell 70:431−442）。表２に示すとおり、シグナル伝達能のないGRB2変異体の発現はコロニー形成を顕著に阻害する。このデータは、GRB2シグナル伝達の阻害は、受容体チロシンキナーゼ活性化に依存する形質転換細胞の増殖を阻害するために使用しうることを示している。
11.実施例：シグナル伝達能のないGRB2はモデル動物で の腫瘍増殖を妨げる
本実施例は、シグナル伝達能のないGRB2を発現している細胞は、もはや動物に腫瘍を形成しえないことを示しており、BCR/ABLシグナル伝達経路の分断によって動物のがんを治療しうることを示唆している。
11.1.材料と方法
GRB2（野生型及び変異体）及びBCR/ABLを発現しているRat1細胞は上記第10.1節に記載の方法で調製した。ヌードマウス（１群４匹）の左側腹部の皮下に、野生型GRB2、Ｎ末端切断GRB2、Ｃ末端切断GRB2のいずれかとp210 BCR/ABLを共に発現しているRat1細胞を注射した。p210 BCR/ABLのみを発現している細胞（100μｌ中２×10⁶細胞）は各マウスの右後肢に皮下注射し、その個体における対照とした。マウスは移植３週間後に屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。
11.2.結 果
表３に示した結果は、シグナル伝達能のないGRB2タンパク質の発現によってin vivoの腫瘍細胞の増殖が減少することを明瞭に示している。

12.実施例：ras活性化に及ぼすシグナル伝達能のないGR B2の影響
本実施例は、ここに記載したシグナル伝達能のないGRB2分子はその形質転換阻害活性に比例してBCR/ABLによって誘導されるras活性化を阻害することを示しており、GRB2と下流のシグナル伝達要素（ras活性化へ導く）との相互作用が分断されることを示唆している。
12.1.材料と方法
ras反応性エレメント（ets/AP−１）プロモーターからの発現の転写活性化は上記第9.1節記載の方法で行った。Rat1細胞の形質転換、軟寒天アッセイ、免疫ブロッティング実験は上記第10.1節記載の方法で行った。
12.2.結 果
GRB2変異体の増殖阻害効果が、ras活性化を阻害するためであるか否かを調べるため、野生型又は変異型GRB2を過剰に発現しているRat1−BCR/ABL細胞の溶解物を調製し、ras活性化能を調べた。ras依存性転写活性化アッセイを用いることにより、Ｎ末端変異GRB2を発現しているRat1−BCR/ABL細胞の溶解物は、空のベクターをトランスフェクトをした対照と比較して1/10〜1/15の低いras活性化能を示した（図２）。Ｃ末端変異GRB2を発現している細胞の溶解物もＮ末端変異体で見られた程ではないがras活性化能の低下を示した。このＮ末端変異体とＣ末端変異体の阻害効果の差はそれぞれの持つBCR/ABL形質転換表現型を復帰させる能力と整合するものであった。
もしGRB2変異体タンパク質がシグナル伝達経路のrasより前の中間段階をブロックするのであれば、ras活性化を回避する遺伝子による形質転換は影響を受けないはずである。この仮説を検証するために、GRB2構築物を、活性型rafで形質転換したRat1細胞にトランスフェクトさせた。rafはセリンキナーゼであり、同じシグナル伝達経路でrasの下流で、マイトジェン作用を示す（Kolchら，Nature．349:426,1991）。ヒグロマイシンで選択した後、細胞群を寒天にまいた。Ｎ末端又はＣ末端GRB2変異体を発現しているRat1/v−raf細胞は軟寒天中で空のベクターでトランスフェクトした対照の細胞と同数のコロニーを形成した（表４）。さらに、SH3変異体を野生型GRB2の２倍以上発現している細胞系は、軟寒天中でのそれ自体の増殖能を阻害しなかった。これらのデータは、GRB2変異タンパク質が、BCR/ABLのマイトジェンシグナルをrafの上流のシグナル伝達経路を切断することにより阻害することを示唆している。

13.実施例：GRB2変異体はヒトPh ¹ 陽性白血病細胞系K562 の増殖を阻害し、分化を誘導する
下記の実施例において、GRB2のSH3変異体タンパク質は、BCR/ABLで誘導される造血系細胞の発がん性表現型を復帰させる能力があるのみならず、K562細胞の赤血球系への分化をひきおこす能力があることを示している。
13.1.材料と方法
形質転換アッセイ：軟寒天アッセイは上記の第8.1.1節記載の方法で行った。各細胞型のクローニング効率によって10³〜５×10⁴個/6cm²皿の範囲の密度で同数の生細胞を軟寒天中にまいた。サンプルは20％ウシ胎児血清を含有する培地に２通りずつプレートした。14日後に肉眼で見えるコロニー（＞0.4mm）の数を数えた。コロニー数は細胞数が計10⁴となるように調整した。
転写活性化アッセイ:ras反応性エレメント（ets/AP−１）プロモーターからの発現の転写活性化は既述の方法（Pendergastら,1993）に従って行った。簡単に記せば、正常Rat1細胞及びGRB2タンパク質を発現している形質転換Rat1/BCR−ABL細胞とを１μｇのpB4x−CATレポータープラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後に細胞を採取し、CAT活性を第9.1.1節記載の方法で測定した。
結合アッセイ、in vitro自己リン酸化と免疫ブロッティ ング：
in vitroの結合アッセイ、in vitroの〔γ³²P〕ATPラベル及び免疫ブロッティングの方法は本質的には上記の第6.1.6節及び第6.1.7節記載のとおりに行った。
ヘモグロビンタンパク質の定量：トランスフェクトされたK562細胞群に存在するヘモグロビン量は本質的にはFeinsteinら,1992,Oncogene 7:1853−1857に記載の方法で定量した。簡単に記せば、各細胞群から溶解物を調製し、総タンパク量をBradfordアッセイ法で求めた。各サンプルについて、20μｇの総細胞性タンパク質を90％酢酸中に１％ベンジジンを含む溶液及び新たに調製した過酸化水素と混合した。室温で20分間インキュベートした後、10％酢酸溶液を加え、515nmの吸光度を測定した。比較対照としてヒトのヘモグロビンを用いた。
腫瘍増殖アッセイ:Rat1/BCR−ABL繊維芽細胞の腫瘍形成性について本質的には、既述の方法（Lugoら,1989,Mo l.Cell.Biol. 9:1263−1270）に従って評価した。簡単に記せば、野生型又は変異GRB2構築物でトランスフェクトしたRat1/BCR−ABL繊維芽細胞群から２×10⁶個の細胞を取り、ヌードマウスの左後側腹部に接種した。その個体での対照として空のベクターでトランスフェクトしたRat1/BCR−ABL細胞を各マウスの右後側腹部に接種した。各Rat1/BCY−ABL細胞群あたり４匹のマウスを用いた。接種３週間後、マウスを屠殺し、左右の側腹部の腫瘍の大きさを比較し、湿重量（グラム）で記録した。
13.2.結 果
下記の実験で、GRB2のSH3変異体タンパク質が造血系細胞においてBCR/ABLによって誘導される発癌性表現型を復帰しうるか否かを評価した。GRB2構築物をPh¹陽性のK562細胞に導入した。トランスフェクション及びヒグロマイシン存在下で48時間培養後、免疫ブロット法で内在性及びトランスフェクトされたGRB2タンパク質を定量した。同時に細胞を液体培地から採取し、生細胞を同数ずつ軟寒天中にまいた。各実験においてトランスフェクトされたGRB2変異体のレベルは内在性のGRB2より少なくとも５倍は多かった。GRB2 N末端切断変異体を発現しているK562細胞をまいた培養では空のベクターでトランスフェクトした対照に比べ1/10のコロニー数を示した（上記表２）。Rat1/BCR−ABL繊維芽細胞で見られたのと同様に、GRB2 C末端切断変異体も、Ｎ末端変異体より程度は低いもののK562のコロニー形成を阻害した（上記表２）。これらのデータは、GRB2によって媒介されるBCR−ABL誘導ras活性化はBCR−ABLが誘導するヒトの悪性腫瘍発生に重要不可欠な要素であることを強く示唆する。
K562細胞系は高レベルの野生型GRB2タンパク質を安定に発現しており、培地中で維持されうるとはいえ、Ｎ末端切断又はＣ末端切断GRB2タンパク質を発現する１つのクローンから由来する細胞系を確立することは不可能であった。K562細胞は分化能とヘモグロビン合成能を保持している（Anderson,L.Cら,1979,Int.J.Cancer 23:143−147;Rowley,P.T.ら,1981,Exp.Hematol．9:32−37;Feinstein,E.ら,1992,Oncogene 7:1853−1857）。以前の研究によれば、チロシンキナーゼ活性阻害剤はK562細胞を赤血球系へ分化させうることを示していた（Fukazawa,H.ら,1991,Biochem.Pharm.,42:1661−1671;Anafi,M.ら,1993,Blood 82:3524−3529）。
GRB2変異体の発現が同様の分化過程をおこすか否かを調べるため、軟寒天アッセイに用いたトランスフェクトされたK562細胞の一部を取って溶解させ、ヘモグロビンタンパク量を各細胞群毎に定量した。Ｎ末端切断又はＣ末端切断変異体を発現している細胞ではヘモグロビンタンパク量の劇的な増加が認められた。これに対し、野生型GRB2タンパク質を高レベルで発現しているK562細胞では、空のベクターでトランスフェクトした対照と比較してヘモグロビンの増加は認められなかった。このように、ここで用いられたGRB2変異体はBCR/ABL形質転換表現型を復帰させるのみならず、K562細胞を赤血球系へ分化させる能力も持っている。これらのデータは、BCR−ABLが、部分的に通常の分化をras依存的にブロックすることにより、造血系細胞を形質転換しうることを示唆している。
13.実施例：タンパク質／チロシンキナーゼの相互作用 を妨害する化合物を特定するスクリーニングアッセイ
ここに提示する実施例では、試験物質が、結合相手である複合体との相互作用を阻害するポテンシャルを検定する手段を記載する。こうした結合相手は、たとえば、アダプタータンパク質と、こうしたアダプタータンパク質に結合する分子、たとえば、活性化されたチロシンキナーゼ分子、ならびに他のタンパク質、たとえばSHCタンパク質を含むものとすることができる。この実施例で特定する化合物は、細胞の成長制御をモジュレートしうる可能性があり、腫瘍形成ならびに細胞増殖性疾患を調節しうる可能性がある。
ここに記載する特定のアッセイでは、リン酸化したチロシンキナーゼタンパク質と結合しうるアダプター−GST融合タンパク質を、リン酸化したチロシンキナーゼタンパク質を固相に固定化しておいたものとともに、試験物質の存在下でインキュベートする。試験物質が、アダプタータンパク質−GST融合タンパク質と、チロシンキナーゼ分子との相互作用を阻害しうる場合には、固定化したチロシンキナーゼ分子に結合するアダプター−GST融合タンパク質の量が、試験物質が存在しない場合にチロシンキナーゼ分子に結合するアダプター−GST融合タンパク質の量と比べて、検出が可能な程度に減少する。
こうした例を、GRB−２とEGF−Ｒとの相互作用を阻害する物質のスクリーニングに関して詳しく例示する。しかし、これと同一の原理を、任意のチロシンキナーゼタンパク質あるいはチロシンキナーゼのチロシンリン酸化基質（たとえば、SHC、ホスファターゼ1D）と、このものと相互作用しうるアダプタータンパク質との相互作用を阻害する物質を検出する際にも適用することができる。
アダプター−GST融合タンパク質：
ここで使用するアダプター−GST（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質は、GRB−2/pGEX構築物で形質転換した大腸菌での発現によって産生したGRB−２−GST融合タンパク質とした。こうした融合タンパク質のGRB−２部分は、GRB−２タンパク質のSH2ドメインのみから構成されるものとした。形質転換細胞は、アンピシリンを加えたルリアブロス（LB）中で生育させる。600nmでのOD（光学濃度）が0.3に達した後、細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）で６時間にわたって誘導して、誘導タンパク質を発現させる。
６時間の発言期間の後、細胞を沈殿させ、４℃にて10分間にわたって10,000×ｇでペレット化し、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に再度懸濁させた。次に、細胞を、超音波処理（６ストローク、５秒／ストローク）によって破壊した。不溶性の物質を、４℃にて10分間にわたって10,000×ｇで遠心分離することによって取り除き、得られた上清を、グルタチオン−セファロースカラムに通した。結合したGRB−２−GST融合タンパク質を、5mMの還元グルタチオンでカラムから溶出させ、PBSに対して透析した。
固定化したチロシンキナーゼ分子：
ここで使用するチロシンキナーゼ分子は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ（EGF−Ｒ）である。EGF−Ｒは、EGF−Ｒを過度に発現している細胞、たとえばA431（ATCC CRL 1551）細胞系から単離する。細胞を、HNTG緩衝液（20mMヘペス/HCl、pH7.4;150mMNaCl;1.0％トリトンＸ−100;5％グリセロール;1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、1mg/Lアプロトニン、1mg/Lロイペプチン;10mg/Lベンズアミジン）中で溶解する。
EGF−Ｒタンパク質を、以下に説明するようにしてマイクロタイタープレートに固定することによって、細胞溶解産物から単離する。その後、EGF−Ｒを以下に説明するようにしてin vitroでリン酸化する。
EGF−Ｒ分子のマイクロタイタープレートへの固定化を行う。マイクロタイタープレートの調製にあたっては、まず、プレートのウェルを、４℃にて一晩、EGFRの細胞外ドメインに対して誘導された抗EGF−Ｒモノクローナル抗体（UBI、＃05−101）（PBS中の濃度：最終容量150μl/ウェルで、0.5μg/ウェル）でコーティングする。
一晩のコーティングの後、マイクロタイタープレートのウェルからコーティング用溶液を取り除き、かわりに、ブロッキング用緩衝液（ドライミルク５％のPBS溶液）を加えて室温で30分間おき、その後ブロッキング用緩衝液を取り除き、ウェルをTBST緩衝液（150mMNaCl;50mMトリス−HCl、pH7.2;0.1％トリトンＸ−100）で４回洗浄する。
EGF−Ｒ発現細胞の細胞溶解産物を、各ウェルに、150μｌのPBSへの溶液として加え、室温で振とうしながら30分間インキュベートする。結合しなかったEGF−Ｒを、ウェルをTBST緩衝液で５回洗浄することによって取り除く。ウェル１つあたり、約50−100ngのEGF−Ｒタンパク質が結合する。
内在性ホスファターゼ活性が高い、EGF−Ｒを過度に発現する細胞系、たとえばA431株化細胞を使用することが重要である。これは、細胞溶解及び固定化抗体とのインキュベーションの間に、ホスファターゼによってリン酸基がEGF−Ｒ分子から除去され、内在性のアダプタータンパク質、たとえばGRBタンパク質がEGFRと結合し、場合によって人為的な結果が生じることが防止されるからである。また、使用する細胞系が容易に飢餓化しうるものである場合には、細胞溶解を行う前に、細胞を飢餓化しておくこともできる。
自己リン酸化EGF−Ｒの作成：
以下に記載するin vitroのキナーゼ反応によって、自己リン酸化されたEGF−Ｒが得られた。キナーゼ反応は、15μｌのATP/Mn²⁺ミックス（50mMのMnCl₂、最終濃度10μM ATP、総容量150μｌ）を加えることによって開始した。プレートは、室温にて５分間、振盪しつつインキュベートし、上清を吸引し、次に、プレートをTBSTで５回洗浄した。
アッセイの手順：
30ngのGRB−２−GST融合タンパク質（すなわち、EGF−R:GRB−２タンパク質の比で1:1）、あるいは5ngのGRB−２−GST融合タンパク質（すなわち、EGF−R:GRB−２タンパク質の比で4:1）を、リン酸化したEGF−Ｒでコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに、インキュベーション用緩衝液（0.1Mのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5）中で、室温にて30分にわたって、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した試験物質の存在下で加える。対照のウェルは、試験物質を用いずに、GRB−２−GST融合タンパク質とともにインキュベートする。
インキュベーションの後、ウェルをTBSTで十分に洗浄する。次に、固定化EGF−Ｒと結合したGRB−２−GST融合タンパク質の量を、好ましくは融合タンパク質のGST部分に対する精製ウサギ抗血清（AMRAD,オーストラリア、ニュービクトリア、カタログ番号00001605）を用いて測定する。インキュベーションは、室温にて30分間行う。インキュベーションの後、抗体を除去し、ウェルをTBSTで十分に洗浄する。次に、結果が目に見えるようにするために、ウェルを、TAGOヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ抗体とともに、室温にて30分間インキュベートする。インキュベーションの後、抗体を除去し、ウェルを水道水、次にTBSTで洗浄する。基質溶液であるABTS（2,2'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸））/H₂O₂（10mlのABSTに対して1.2μｌのH₂O₂）をウェルに加え、室温にて20分間インキュベートする。5NH₂SO₄を加えることによって反応を停止する。410nmでのODを各ウェルについて測定する。この方法を用いると、GRB−２−GSTがバックグラウンドに対して2ngという少量であっても、検出を行うことが可能である。
また、試験物質とGRB−２−GST融合タンパク質をEGF−Ｒのウェルでインキュベートしてから、ビオチニル化したモノクローナル抗体、たとえばEL−６あるいはEL−12を使用して、融合タンパク質の結合を検定することもできる。こうした抗体によって認識されるエピトープは、GRB−２のSH2ドメインに位置しているものの、GRB−２のリン酸化EGFRとの結合を妨害しない。次に、これらの抗体の結合を、ストレプトアビジン−ビオチニル化したホースラディッシュペルオキシダーゼ反応物質を使用して測定する。
さらにまた、試験物質とGRB−２−GST融合タンパク質のEGF−Ｒのウェルでインキュベートしてから、融合タンパク質の固定化EGFRとの結合についての検定を、インキュベーション用緩衝液中で1mM 1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン（CDNB）及び1.54mg/mlの還元グルタチオンとともにインキュベートすることによって行うこともできる。次に、ODを340nmで測定する。この反応は、ODが1.0となるまで線形であり、競合性のGST阻害物質を用いて、マナービックおよびダニエルソン（Mannervik,B.and Danielson,U.H.,1988,CRC Critical Reviews in Biochemistry 23:238）に記載されたようににして停止することができる。
本明細書に記載した本発明に、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく数多くの改変や変更を加えうることは、明らかである。以上で説明した特定の実施態様は、例として挙げただけであって、本発明は、添付した請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。This invention is a continuation-in-part of US application No. 08 / 246,441 filed May 20, 1994, the entirety of which is hereby incorporated by reference. US application No. 08 / 246,441 is a continuation-in-part of US application No. 08 / 127,922 filed on September 28, 1993.
1.Introduction
The present invention relates to compositions and methods for preventing and treating cell proliferative diseases involving protein tyrosine kinases or protein tyrosine phosphatases that can be complexed with members of the SH2- and / or SH3 domain containing family of adapter proteins. About. The present invention is that, in part, the adapter protein GRB-2 binds to intracellular BCR-ABL tyrosine kinase products in vivo and is necessary for activation of the potential carcinogenic potential of BCR-ABL products , And the disruption of the signaling ability of GRB-2 reverses the transformed phenotype of cells and reduces tumor growth in animals. The present invention further relates to the use of the complex to identify protein tyrosine kinase / adapter protein complexes and agents capable of disrupting the interaction between members of the complex.
2.background
2.1.Protein phosphorylation and signal transduction
Cells rely heavily on extracellular molecules as a means of receiving stimuli from the environment in which they come into direct contact. These extracellular signals are essential for the correct regulation of various cellular processes such as differentiation, contractility, secretion, cell division, contact inhibition and metabolism. For example, extracellular molecules such as hormones, growth factors, lymphokines or neurotransmitters act as ligands that bind to specific cell surface receptors. When these ligands bind to their receptors, they trigger a cascade reaction that results in both the growth of the initial stimulus and the coordination of the individual cellular processes described above. In addition to normal cellular processes, receptors and their extracellular ligands are also present in abnormal or potentially harmful processes such as virus-receptor interactions, inflammation, and transformation of cells to a cancerous state. May be involved.
Of this process called signal transduction (recent review, Posada et al., 1992, Mol. Biol. Cell 3: 583-592; Hardie, DG, 1990, Symp. Soc. Exp. Biol. 44: 241-255) A central feature is the reversible phosphorylation of certain proteins.
Phosphorylation or dephosphorylation of amino acid residues induces steric changes in the protein that alter the biological properties of the protein being regulated. Proteins are phosphorylated by protein kinases and dephosphorylated by protein phosphatases. Protein kinases and phosphatases are classified according to the amino acid residue on which they act. One class is serine-threonine kinase and phosphatase (Scott et al., 1992, 2: 289-295), which acts on serine and threonine residues. Other types are tyrosine kinases and phosphatases (Fischer et al., 1991, Science 253: 401-406; Schlessinger et al., 1992, Neuron 9: 383-391; Ullrich et al., 1990, Cell 61: 203-212), tyrosine Acts on residues. Phosphorylation is a dynamic process involving competing phosphorylation and dephosphorylation reactions, where the instantaneous phosphorylation level represents the relative activity of protein kinases and phosphatases that catalyze these reactions at that instant. .
Most of the phosphorylation of proteins occurs at serine and threonine amino acid residues, but also occurs at tyrosine residues, which many oncogene products and growth factor receptors have intrinsic protein tyrosine kinase activity. Since the discovery of having, it has begun to attract considerable interest. The importance of protein tyrosine phosphorylation in growth factor signal transduction, cell cycle progression and malignant transformation is now well established (Cantley et al., 1991, Cell 64: 281-302; Hunter T., 1991). Cell 64: 249-270; Nurse, 1990, Nature 344: 503-308; Schlessinger et al., 1992, Neuron 9: 383-391; Ullrich et al., 1990, Cell 61: 203-212). Disruption of normal growth control pathways leading to carcinogenesis has been shown to be caused by activation or overexpression of protein tyrosine kinases that constitute a large population of dominant oncogenic proteins (Hunter, T., 1991, Cell 64 : 249-270).
2.2.Protein tyrosine kinase
Protein tyrosine kinases comprise a large family of proteins that contain many growth factor receptors and potential oncogenes, which share a common origin with serine / threonine-specific protein kinases (Hanks et al., 1998). Science 241: 42-52). The protein kinase can be further defined as a receptor type or a non-receptor type.
Receptor-type protein tyrosine kinases have a transmembrane topology and have been extensively studied. Binding of a specific ligand to the extracellular domain of a receptor protein tyrosine kinase is thought to induce receptor dimerization and phosphorylation of its own tyrosine residue. Individual phosphotyrosine residues in the cytoplasmic domain of the receptor are thought to act as specific binding sites that interact with the host of cytoplasmic signaling molecules, thereby activating various signal transduction pathways (Ullrich et al., 1990, Cell 61: 203-212).
Intracellular cytoplasmic non-receptor protein tyrosine kinases can be broadly defined as protein tyrosine kinases that do not contain a hydrophobic transmembrane domain. In this broad classification, known cytoplasmic protein tyrosine kinases can be divided into four different forms. That is, the SRC family (Martinez et al., 1987, Science 237: 411-414; Sukegawa et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 41-47; Yamanishi et al., 1987, 7: 237-243; Marth et al., 1985, Cell 43: 393-404; Dymecki et al., 1990, Science 247: 332-336), FES family (Ruebroek et al., 1985, EMBO J. 4: 2897-2903; Hao et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1587-1593), ABL family (Shtivelman et al., 1986, Cell 47: 277-284; Kruh et al., 1986, Science 234: 1545-1548) and the JAK family. They differ in overall molecular structure, but each member of these morphological families of cytoplasmic protein tyrosine kinases share a catalytic kinase domain as well as a non-catalytic domain. Such non-catalytic domains are the SH2 (SRC homology domain 2; Sadowski et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4396-4408; Koch et al., 1991, Science 252: 668-674) domain and the SH3 domain (Mayer et al., 1998, Nature 332: 269-272). Non-catalytic domains are thought to be important in the regulation of protein-protein interactions during signal transduction (Pawson et al., 1992, Cell 71: 359-362).
The metabolic role of cytoplasmic protein tyrosine kinases is not well understood compared to receptor protein tyrosine kinases, but considerable progress has been made in explaining some processes involving this type of molecule. For example, the src family members lck and fyn have been shown to interact with CD4 / CD8 and the T cell receptor complex and are therefore implicated in T cell activation (Veillette Et al., 1992, TIG 8: 61-66). Certain cytoplasmic protein tyrosine kinases are associated with certain stages of the cell cycle (Morgan et al., 1989, Cell 57: 775-786; Kipreos et al., 1990, Science 248: 217-220; Weaver et al., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 4415-4422). Cytoplasmic protein tyrosine kinases have been implicated in neuronal development (Maness, P., 1992, Dev. Neurosci. 14: 257-270). Deregulation of kinase activity by mutation or overexpression is a well-established mechanism underlying cell transformation (Hunter et al., 1985, supra; Ullrich et al., Supra).
2.3.G-protein and signal transduction
Guanine-nucleotide-binding proteins such as Ras (Lowy et al., 1993, Ann Rev. Biochem. 62: 851-891) (G-protein; Simon et al., 1991, Science 252: 802-808; Kaziro et al., 1991, Ann Rev. Biochem. 60: 349-400) plays an important role in the transmission of mitogenic signals from receptor tyrosine kinases. As an example, activation of receptor tyrosine kinases by ligand binding results in the accumulation of an active GTP-bound form of the Ras molecule (Gibbs et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 20437-2044; Satoh et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5993-5997; Li et al., 1992, Science 256: 1456-1459; Buday et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 1903-1910; Medema et al., 1993 Mol. Cell. Biol. 13: 155-162). Ras activation is also required for transformation by viral oncogenic tyrosine kinases (Smith et al., 1986, Nature 320: 540-43).
Ras activity is regulated by the opposing actions of GTPase-activating proteins (GAPs) and guanine nucleotide exchange factors, which stimulate the slow intrinsic rate of GTP hydrolysis on Ras, which exchange factors on Ras Stimulates the basal rate of GDP exchange for GTP. That is, GAPs act as a negative regulator of Ras function, and exchange factors act as Ras activators.
Recently, a direct link between activated receptor tyrosine kinase and Ras has been established and mammalian GRB-2, a 26 kilodalton protein consisting of one SH2 domain and two SH3 domains. A protein (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442) was found to bind receptor tyrosine kinases directly to the Ras exchange factor Sos in mammals and Drosophila (Buday et al., 1993, Cell 73: 611- 620; Egan et al., 1993, Nature 363: 45-51; Li et al., 1993, Nature 363: 85-87; Gale et al., 1993, Nature 363: 88-92; Rozakis-Adcock et al., 1993, Nature 363: 83- 85; Chardin et al., 1993, Science 260: 1338-1343; Oliver et al., Cell 73: 179-191; Simon et al., 1993, Cell 73: 169-177). The GRB-2 SH2 domain binds to a specific tyrosine phosphorylation sequence of the receptor tyrosine kinase, and the GRB-2 SH3 domain binds to a proline-rich sequence present in the Sos exchange factor. Thus, binding of GRB-2 to the receptor kinase prepares Sos for recruitment to the plasma membrane where Ras is located (Schlessinger, J., 1993, TIBS 18: 273-275).
2.4.BCR-ABL in the development of leukemia
Activation of the oncogenic potential of normal cellular proteins, such as protein tyrosine kinases, is caused by alterations in the corresponding enzyme activity of the protein, inappropriate binding to other cellular components as mentioned in Section 2.3 above, or both. It is thought to occur.
For example, BCR-ABL protein tyrosine kinase oncoproteins are thought to transform cells by altered enzyme activity and / or non-covalent protein-protein interactions. The gene encoding the BCR-ABL oncoprotein is a chimeric oncogene generated by moving the sequence from the cABL protein tyrosine kinase on chromosome 9 to the BCR sequence on chromosome 22 (Kurzock et al., 1988, N. Engl J. Med. 319: 990-998 and Rosenberg et al., 1988, Adv. In Virus Res. 35: 39-81). The BCR-ABL oncogene is a Philadelphia chromosome (Ph¹) It is believed to be related to the pathogenesis of positive human leukocytes. That is, Ph¹Chromosomes are found in at least 90-95% of patients with chronic myelogenous leukemia (CML), a clonal cancer resulting from malignant transformation of hematopoietic stem cells (Fialkow et al., 1977, Am. J. Med. 63,: 125-130. ) And about 20% of adult acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients, 5% of pediatric ALL patients and 2% of adult acute myeloid leukemia (AML) patients (Whang-Peng et al., 1970). , Blood 36: 448-457; Look, AT, 1985, Semin. Oncol. 12: 92-104). The BCR-ABL gene produces two separate chimeric proteins, P210 BCR-ABL and P185 BCR-ABL, which are characteristic of CML and ALL, respectively. Furthermore, it has recently been shown directly that the BCR-ABL gene product is the causative agent of CML (Skorski et al., 1993, J. Clin Invest. 92: 194-202; Snyder et al., 1993, Blood 82: 600-605 ).
CML is clinically characterized by a two-stage process. The disease begins in a chronic phase characterized by a substantial increase in the pool of immature bone marrow progenitor cells. As terminal differentiation is retained, this results in a significant increase in the pool of circulating mature granulocytes. Several weeks to years later, a state of accelerated bone marrow proliferation occurs, and the bone marrow cells gradually lose their terminal differentiation potential. During this time, thrombocytosis, basophilia and clonal cytogenetic abnormalities often appear. These abnormalities are signals of the final blast phase, during which immature blasts grow rapidly and patient death is unavoidable.
Previously, the BCR-ABL protein was found to exhibit increased tyrosine kinase and transformation capacity compared to normal c-ABL protein (Konopka et al., 1984, Cell 37: 1035-1042). The first exon sequence of BCR specifically activates tyrosine kinase ability and transformation ability of BCR-ABL (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792; McWhirter et al., 1991, Mol Cell Biol. 11: 1553-1565). The first exon of BCR can bind to the ABL SH2 domain in a manner independent of phosphotyrosine (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171), and deletion of the BCR sequence essential for ABL SH2-binding is BCR-ABL is untransformed (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171). Furthermore, BCR has been shown to bind in vitro to several other SH2 domains encoded by other proteins (Muller et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5087-5093). These results infer that some aspects of SH2 domain binding to BCR are involved in the carcinogenicity of BCR-ABL oncoproteins, but the mechanism by which such BCR-ABL carcinogenesis occurs is still clear. Absent. For example, the existence of numerous SH2 domain-containing proteins is known, and the identification of BCR-ABL effectors requires further considerable research.
3.Summary of the Invention
The present invention relates to compositions and methods for preventing and treating cell proliferative diseases involving protein tyrosine kinases or protein tyrosine phosphatases that can be complexed with members of the SH2- and / or SH3 domain containing family of adapter proteins. About. The invention further uses the protein tyrosine kinase / adapter protein complex, protein tyrosine phosphatase / adapter protein complex and use of the complex to identify agents capable of disrupting interactions between components of the complex. About.
“Protein tyrosine kinase” is abbreviated herein as “PTK” and “protein tyrosine phosphatase” is abbreviated herein as “PTP”. As will be appreciated, “PTK” means transmembrane receptor protein tyrosine kinase or cytoplasmic protein tyrosine kinase unless otherwise specified, and similarly, “PTP” means transmembrane receptor unless otherwise specified. By somatic protein tyrosine phosphatase or cytoplasmic protein tyrosine phosphatase.
The present invention states that, in part, the adapter protein GRB-2 binds to intracellular BCR-ABL PTK products in vivo and is necessary for activation of the potential carcinogenic potential of BCR-ABL products. Based on amazing discoveries. The inventors firstly reversed the physiological relevance of interactions between members of the signal transduction pathway, in part by disrupting the transformed phenotype of the cell due to disruption of this signal transduction. This will be explained by showing that the growth of cancer in animals is suppressed. Data representing this discovery is shown in the examples in Sections 6-14 below. Thus, the present invention shows, in the first example, that the SH2- and / or SH3 domain-containing adapter family of proteins, particularly the GRB-2 member of the GRB subfamily of proteins, is involved in the development and maintenance of cell proliferation / activation. Represented and described herein for abnormal cell growth involved in carcinogenesis, transformation processes and human cancer development. Further, with respect to BCR-ABL transformation, the present invention discloses a first effector (ie, GRB-2) for the BCR-ABL product.
3.1.Abbreviation
The table below shows the one-letter and three-letter abbreviations commonly used by protein chemists and used herein.

Four.Figure description
Figure 1: Stimulation of transcriptional activity by BCR-ABL-Ras requires the presence of tyrosine 177 in the first exon of BCR. NIH 3T3 cells were transfected with 0.5 μg of the indicated BCR-ABL cDNA +/− 5 μg of H-Ras (17N) cDNA along with 1 μg of pB4X-CAT reporter plasmid. After 48 hours of transfection, cells were harvested and assayed for CAT activity as outlined in Section 9.1.1. Below. Data was recorded in arbitrary units. Basal signal is due to reporter activity.
Figure 2: Stimulation of transcriptional activity by BCR-ABL-Ras requires the presence of the GRB2 SH3 domain. Rat1 cells expressing p210 BCR / ABL cells were transfected with 1 μg of pB4X-CAT reporter plasmid along with one of the GRB2 deletion mutants. After 48 hours of transfection, cells were harvested and assayed for CAT activity as outlined in Section 9.1.1. Below. Lane 1: RAT1; Lane 2: RAT1 / p210 / pCEN vector; Lane 3: RAT1 / p210 / pCEN GRB2 ΔN ′; Lane 4: RAT1 / p210 / pCEN GRB2 ΔC ′. Data was recorded in arbitrary units with RAT1 normalized to 1. Basal signal is due to reporter activity. Values are the average of overlap +/- ranges.
Figure 3: Hemoglobin content in K562 expressing wild type and mutant GRB2 proteins. Cell lysates were prepared and the hemoglobin content was determined using the described benzidine staining (Feinstein et al., 1992, Oncogene 7: 1853-1857). Each cell population of the three samples was analyzed. Data represent the amount of hemoglobin per 1 μg of total cellular protein transfected with the indicated construct.
Five.Detailed Description of the Invention
Below are compositions and methods for preventing and treating cell proliferative disorders involving protein tyrosine kinases or protein tyrosine phosphatases that can be complexed with SH2- and / or SH3 domain-containing members of the adapter family of proteins. Describe. In addition, protein tyrosine phosphatase / adapter protein complexes, protein tyrosine phosphatase / adapter protein complexes, methods of making such complexes, and the use of these complexes are described herein. Such uses include, but are not limited to, the identification of agents that can disrupt the interaction between the components of the complex.
The present invention provides, in part, that the adapter protein GRB-2 binds to intracellular BCR-ABL products in vivo and is necessary for activation of the potential carcinogenic potential of BCR-ABL products, and It is based on the surprising discovery that disruption of GRB-2 signal transduction reverses the transformed phenotype of cells and reduces tumor growth in animals. Data representing this expression is shown in the Examples in Sections 6-14 below.
5.1.Protein tyrosine kinase / adapter protein Quality complex
The PTK / adapter protein complex of the present invention comprises at least one member of the PTK family of proteins and at least one member of the adapter family of proteins, as will be described later. Under standard physiological conditions, the components of the complex can stably form non-covalent bonds with one or more of the other PTK / adapter protein complex components.
The PTK component of the PTK / adapter protein complex of the present invention is one of intracellular cytoplasmic non-receptor type PTKs, intracellular nuclear non-receptor type PTKs, or transmembrane receptor type PTK, each of which has one or more characteristic features. Containing the peptide domain. Such domains can include one or more catalytic domains, including but not limited to tyrosine kinase domains. The length of the tyrosine kinase catalytic domain generally ranges from about 250 to about 300 amino acids, corresponding to a molecular weight of about 30 kDa. The position of the tyrosine kinase catalytic domain is not fixed, but is generally near the carboxy terminus of the protein. There may be a range of short and conserved amino acid residues within the tyrosine kinase domain. It alternates with a range of amino acid residues of variable length that do not show a high level of conservation. Consensus sequences corresponding to the most conserved tyrosine kinase catalytic domain amino acid residues have been collected and are well known to those skilled in the art. See, for example, Hanks et al. (Hanks et al., 1991, Science 241: 42-52) and Wilks (Wilks, AF, 1990, Prog. Growth Factor Res. 2: 97-111), which are incorporated herein by reference in their entirety. Include in the book.) The consensus sequence includes PDL-specific sequences D-L-R-A-A-N or D-L-A-A-R-N, and P-I / V-K / R-W- T / M-A-P-E. Furthermore, see Wilks, A.F., 1990, Progress in Growth Factor Res. 2: 97-111 as another example of the sequence motif.
The PTK component of the PTK / adapter protein complex of the present invention can further comprise one or more non-catalytic domains, such as, but not limited to, one or more SH2 and / or one or more SH3. Domains, one or more SH2 binding and / or one or more SH3 binding peptide domains, and / or a hydrophobic transmembrane domain (for receptor-type PTKs). SH2 (ie, src homology 2) non-catalytic domains are generally about 100 amino acid residues in length. Such SH2 domains can contain a number of highly conserved or invariant amino acid residues within some, preferably 5 well-conserved amino acid sequence motifs, It is well known to the traders. See, for example, Koch et al. (Koch et al., 1991, Science 252: 668-674), which is hereby incorporated by reference in its entirety. For example, amino acid consensus sequences include, but are not limited to, F-I-R-E-S and F-L-V-R-E-S. The R residue of these consensus sequences is invariant between SH2 domains. Such well-conserved amino acid sequence motifs are variable, but are generally separated by a range of more variable amino acid sequence elements, including one or more G or P residues.
SH3 (ie, src homology 3) non-catalytic domains are generally about 50 amino acid residues in length. The amino acid sequence within the SH3 domain may be variable, but the three-dimensional structure of the domain is well conserved. Such SH3 three-dimensional structures are well known to those skilled in the art. See, for example, Koyama et al. (Koyama et al., 1993, Cell 72: 945-952), which is hereby incorporated by reference in its entirety.
SH2-binding peptide domains are well known. For example, Songyang et al. (Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778), Rotin et al. (Rotin et al., EMBO J. 11: 559-567) and Skolnick et al. (Skolnick et al., 1993, EMBO J. 12: 1929-1936), which are hereby incorporated by reference in their entirety. SH2 domains exhibit specificity for certain SH2-binding domains. For example, SH2-binding peptide domains include, but are not limited to, phospho Tyr-hydrophobic-hydrophobic-lle / Pro amino acid sequence motifs (generally the sequence motifs are for example src, fyn, lck, fgr, abl, preferred for the type of SH2 domain found in crk and nck proteins), and phospho-Tyr-hydrophobic-X-hydrophobic and / or-phospho-Tyr-Met-X-Met (generally the sequence motif is eg preferred for the type of SH2 domain found in p85, phospholipase C-γ and SHPTP2 proteins. Furthermore, the consensus sequence revealed from the analysis of several protein domains that bind the SH2 domain of the GRB-2 protein was determined to be XP—X—Y—V / I—N—V / I. It was done. In addition, SH2-binding peptide domains can include regions rich in Ser and Thr residues, some or all of which are phosphorylated (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171).
SH3-binding peptide domains are also well known to those skilled in the art. See, for example, Ren et al. (Ren et al., 1993, Science 259: 1157-1161) and Cicchetti et al. (Cicchetti et al., 1992, Science 257: 803-806). These are incorporated herein by reference in their entirety. Such SH3-binding peptide domains are generally rich in amino acid residues proline, although other amino acid residues other than proline are also important for SH3 binding. One possible consensus sequence for the SH3-binding domain is XP—X—X—X—P—P—P—hydrophobic residue —X—P. Furthermore, the SH3 domain of GRB-2 has been determined to be PPPPPVPPRRR, an amino acid sequence motif found in the SOS protein (Li et al., 1993, Nature 363: 8588; Schlessinger, 1993, TIBS, 18: 273-275).
Intracellular cytoplasmic PTK components of the PTK / adapter protein complex of the present invention include, for example, members of the Src family (molecules such as src, yes, fgr, fyn, lyn, hck, lck, and blk); members of the Fes family ( fes and fer, etc.); Abl family members (such as abl and arg); and Jak family members (such as jak1 and jak2). In a preferred embodiment of the invention, the PTK component of the PTK / adapter protein complex is an intracellular PTK product of the BCR-ABL gene. The transmembrane receptor PTK component of the PTK / adapter protein complex of the present invention includes, for example, the growth factor receptor FGF receptor, Sevenless / ROS, insulin receptor, PDGF receptor, EGF receptor family Or any other molecule related to the he adapter protein (see, eg, Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442).
The adapter protein component of the PTK / adapter protein complex of the present invention comprises one or more SH2 and / or one or more SH3 non-catalytic domains. The SH2 and SH3 domains that can be part of the adapter protein are for the PTK component, as described above. Adapter proteins that can be components of the PTK / adapter protein complexes of the invention include, for example, p85, c-Crk, SHC, Nck, ISGF3α, guanine triphosphatase activating protein (GAP), and members of the GRB subfamily of proteins (GRB1, GRB-2, GRB-3, GRB-4, GRB-7, GRB-10, etc.). In a preferred embodiment, the PTK / adapter protein complex of the present invention comprises the PTK product of the BCR-ABL gene and the GRB-2 protein.
The complex of the invention and / or the individual components of the complex can be substantially purified using the methods described in Section 5.3.1. In addition, the PTK and / or adapter component of the complex of the present invention may be made using a variety of methods including, but not limited to, chemical synthesis or the recombinant DNA techniques described in Section 5.3.2, below. can do.
5.2.Protein tyrosine phosphatase / adapter Protein complex
The PTP / adapter protein complex of the present invention comprises at least one member of the PTP family of proteins and at least one member of the adapter family of proteins. Under standard physiological conditions, components of such a complex can form stable, non-covalent bonds with one or more other PTP / adapter protein complex components.
The PTP component of the PTP / adapter protein complex of the present invention is cytoplasmic, intracellular, non-receptor PTP, or transmembrane, receptor-type PTP, each containing one or more characteristic peptide domains. Such domains can include one or more catalytic domains, including but not limited to tyrosine phosphatase domains. Generally, the tyrosine phosphatase catalytic domain is about 230 amino acids in length. About 40 of the amino acid residues of the catalytic phosphatase domain are highly conserved, and of these, the consensus sequence I / V—H—C—X—A—G—X—X—R—S / T There is generally a very highly conserved segment consisting of 11 amino acid residues with -G. Non-receptor PTPs generally contain one such catalytic domain, whereas transmembrane receptor PTPs generally contain two such catalytic domains separated by a peptide segment of approximately 58 amino acid residues in length. doing.
The PTP component of the PTP / adapter protein complex of the present invention may further comprise one or more SH2 domains, one or more SH3 domains, one or more SH2-binding domains, and / or one or more SH3-binding domains. Can include one or more non-catalytic domains, including but not limited to: Each of these non-catalytic domains can be those described in Section 5.2.
The transmembrane receptor PTP component of the PTP / adapter protein complex of the present invention can include, for example, CD45, LAR, RPTPα, RPTPβ, RPTPχ and RPTPκ. The intracellular cytoplasmic PTP component of the PTP / adapter protein complex of the present invention can include, for example, PTP1C, PTP1D and a corkscrew.
5.3.PTK / adapter complex and PTP / adapter complex Purification and production
5.3.1.Purification method
Substantially purify the PTK / adapter complex and PTP / adapter complex of the invention, ie, at least 90% (by weight) from other proteins, glycoproteins, and other macromolecules with which it is associated, And if desired, at least 99% can be purified. Such purification can be accomplished using various procedures well known to those skilled in the art. For example, cells, tissues or fluids containing PTK / adapter complexes or PTP / adapter complexes are subjected to a combination of standard methods (eg, ammonium sulfate precipitation, molecular sieve chromatography, and / or ion exchange chromatography). Etc. Alternatively, or in addition thereto, PTK / adapter complex or by immunoaffinity chromatography using an immunosorbent column immobilized with an antibody capable of binding to one or more components of the PTP / adapter complex, by PTK / Adapter complexes or PTP / adapter complexes can be purified. Such antibodies may be monoclonal or polyclonal in origin. Other useful types of affinity chromatography for PTK / adapter complexes or PTP / adapter complexes are, for example, solid phase substrates that bind to the catalytic domain (ie, the kinase domain of PTK or the phosphatase domain of PTP), or An immobilized binding site in the non-catalytic domain of the PTK, PTP and / or adapter component of the complex that binds in a manner that does not disrupt the complex may be utilized.
The PTK / adapter complex or PTP / adapter complex of the present invention can be biochemically purified from various cell or tissue sources. To purify the naturally occurring PTK / adaptor complex, the cell source may include, for example, baculovirus infected SF9 cells, A-431, CHO and / or 3T3 cells. In a preferred embodiment of the invention, the PTK / adapter complex comprises BCR-ABL PTK and GRB2 proteins. Sources for purification of such PTK / GRB-2 complexes can include, but are not limited to, K562, NMG-01 and ALL-1 cell lines.
5.3.2.Synthesis method
Methods for synthesizing polypeptides or fragments thereof that can act as components of the PTK / adapter complex or PTP / adapter complex of the present invention are well known to those skilled in the art. See, for example, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, which is hereby incorporated by reference in its entirety. Reconstructing separately synthesized or recombinantly produced components of a PTK / adapter complex or PTP / adapter complex by standard biochemical techniques well known to those skilled in the art to form the complex Can do. For example, multiple samples containing components of a PTK / adaptor complex can be combined at room temperature at physiological pH in the range of 7 in a solution buffered with about 150 mM or more NaCl. For example, a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% glycerin, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid and 2 mM EDTA could be used. Such a procedure can also be used to reconstitute the PTP / adapter complex.
Described herein are methods for preparing components of the PTK / adapter complexes of the present invention by expressing nucleic acids encoding PTK, PTP and / or adapter proteins. Methods which are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing PTK, PTP and / or adapter protein coding sequences and appropriate transcriptional / translational control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques and in vivo recombination / genetic recombination. The synthesis of DNA and RNA can also be performed using an automatic synthesizer. See, for example, the techniques described in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, and Wiley Interscience N.Y.
Various host-expression vector systems can be used to express the coding sequences of the components of the PTK / adaptor and PTP / adaptor complex of the present invention. These systems include, but are not limited to: That is, microorganisms such as bacteria (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vector containing coding sequence of PTK, PTP or adapter protein; PTK, PTP and / or Or yeast transformed with a recombinant yeast expression vector containing the coding sequence for the adapter protein [eg, Saccharomyces, Pichia]; recombination containing the coding sequence for PTK, PTP and / or adapter protein Insect cell lines infected with viral expression vectors (eg, baculovirus); recombinant viral expression vectors containing coding sequences for PTK, PTP and / or adapter proteins (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV ) Infected or pair Plant cell lines transformed with a plasmid expression vector (eg, Ti plasmid); or a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, an adenovirus late promoter; A mammalian cell line with a recombinant expression construct containing the vaccinia virus 7.5K promoter).
In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the intended use of PTK / adapter complex or PTP / adapter complex expression. For example, when producing large amounts of PTK / adapter or PTP / adapter complex for antibody production or peptide library screening, vectors that elicit high-level expression of fusion protein products that can be easily purified are desirable. . Such vectors include, but are not limited to: That is, the E. coli expression vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO), in which the coding sequences of PTK, PTP and / or adapter protein can be individually ligated into the vector in the frame of the lac Z coding region so that a fusion protein is produced. J.2: 1791); pIN vector (Inouye et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509). pGEX vectors can also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). In general, such fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption onto glutathione-agarose beads and subsequent elution in the presence of free glutathione. pGEX vectors are designed to contain thrombin or factor Xa protease cleavage sites so that the cloned PTK and / or adapter protein can be released from the GST moiety.
In insect systems, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector to express foreign genes. The virus grows in Spodoptera frugiperda cells. Coding sequences of components of the PTK / adapter or PTP / adapter complex are individually cloned into a nonessential region of the virus (eg, polyhedrin gene) and controlled for the AcNPV promoter (eg, polyhydrin promoter) Can be put down. Successful insertion of the coding sequence results in inactivation of the polyhydrin gene and production of a non-closed recombinant virus (ie, a virus that lacks the protein coat encoded by the polyhydrin gene). These recombinant viruses are then used to infect Spodoptera frugiperda cells in which the inserted gene is expressed (see, eg, Smith et al., 1983, J. Viol. 46: 584; Smith, US Pat. No. 4,215,051). ).
In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems can be used. When adenovirus is used as an expression vector, the coding sequence of a component of the PTK / adapter or PTP / adapter complex can be ligated to an adenovirus transcription / translation regulatory complex, eg, the late promoter and tripartite leader sequence. it can. This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region (eg, region E1 or E3) of the viral genome results in a recombinant virus that is viable and capable of expressing PTK, PTP and / or adapter proteins in an infected host (eg, Logan et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659). Specific initiation signals are also required for efficient translation of inserted PTK, PTP and / or adapter coding sequences. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. If the complete PTK, PTP or adapter protein gene, including its own initiation codon and adjacent sequences, is inserted into the appropriate expression vector, no additional translation control signals are required. However, if only a portion of the PTK, PTP or adapter coding sequence is inserted, it must have an exogenous translational control signal including the ATG start codon. In addition, the start codon must be consistent with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert sequence. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of a variety of natural and synthetic origins. Inclusion of appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. can increase the efficiency of expression (see Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).
In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of gene products can be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms of action for post-transcriptional processing and modification of proteins. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. For this purpose, eukaryotic host cells with cellular mechanisms for proper primary transcript processing, glycosylation and phosphorylation of gene products can be used. Such mammalian host cells include, but are not limited to, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 WI38, and the like. Stable expression is preferred for long-term, high-yield production of recombinant proteins. For example, cell lines that stably co-express both PTK and adapter protein, or both PTP and adapter protein can be engineered. Rather than using an expression vector containing a viral origin of replication, each is independently or consistently controlled by appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancer sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) PTK and adapter protein DNA, or PTP and adapter protein DNA and a selectable marker can be used to transform host cells. After the introduction of the foreign DNA, the genetically engineered cells can be grown in a rich medium for 1-2 days. These cells are then transferred to a selective medium. The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows cells to stably integrate the plasmid into the chromosome and grow to form a focus. These foci can then be cloned and developed into cell lines. This method can be advantageously used to engineer cell lines that co-express both PTK and adapter protein, or both PTP and adapter protein. Such genetically engineered cell lines are particularly useful for screening and evaluation of compounds that affect signals mediated by the complexes of the invention.
A number of selection systems can be used, including but not limited to: That is, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska et al., 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) and adenine phosphor The ribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) gene can be used for tk-, hgprt-, or aprt-cells, respectively. In addition, antimetabolite resistance is also dhfr gene conferring resistance to methotrexate (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 1527); gpt gene conferring resistance to mycophenolic acid (Mulligan et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); conferring resistance to aminoglycoside G-418 Can be used as a basis for selection of the neo gene (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); and the hygro gene conferring resistance to hygromycin (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147) .
New members of the PTK, PTP and / or adapter protein families that can form the complexes of the present invention can be identified and isolated by molecular biological techniques well known in the art. For example, polymerase chain reaction (PCR) is performed using two degenerate oligonucleotide primer pools designed based on highly conserved sequences within a domain common to members of the PTK, PTP or adapter protein family This makes it possible to isolate previously unknown genes for PTK, PTP or adapter proteins. The template for the PCR reaction may be cDNA obtained by reverse transcription of mRNA prepared from cell lines or tissues known to express PTK / adapter complexes and / or PTP / adaptor complexes. To ensure that the amplified sequence represents that of a member of the PTK, PTP or adapter subfamily, the PCR product can be subcloned and sequenced. The PCR fragments can then be used to isolate full length PTK, PTP or adapter protein cDNA clones by radiolabeling the amplified fragments and screening a bacteriophage cDNA library. Alternatively, genomic libraries can be screened using labeled fragments. For a review of available cloning strategies, see, for example, Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, NY; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY Refer to).
General methods for cloning adapter proteins that were previously unknown are described by Skolnick (Skolnick, E.Y., 1991, Cell 65:75) and Skolnick et al. (US Patent Application No. 07 / 643,237). These are incorporated herein by reference in their entirety. Briefly, new members of the adapter family of proteins can be identified by their ability to specifically bind to at least a portion of a tyrosine phosphorylated peptide that includes an adapter-protein-binding region. Such a region can include, but is not limited to, an SH2-binding domain.
5.4.PTK / adapter complex and PTP / adapter complex Derivatives of
Also provided herein are functional derivatives of PTK / adapter complexes and PTP / adapter complexes. The term “functional derivative” means “chemical derivative”, “fragment”, “variant”, “chimera” or “hybrid” of PTK / adapter complex and PTP / adapter complex. These terms are defined below. A functional derivative retains at least part of the function of the PTK, PTP or adapter protein, conferring utility on the derivative according to the invention. This function includes, for example, reactivity with an antibody specific for PTK / adapter complex or PTP / adapter complex, enzymatic activity or binding activity of PTK or PTP mediated by a non-catalytic domain, and the like.
A “chemical derivative” of a PTK / adapter complex or PTP / adapter complex contains additional chemical moieties not normally part of the protein. Covalent modifications of the protein complex or peptide are within the scope of the present invention. Such modifications can be introduced into the molecule by reacting the target amino acid residue of the peptide with an organic derivatizing agent that can react with a selected side chain or terminal residue as described below.
Most commonly, cysteinyl residues are reacted with α-haloacetates (and corresponding amines) such as chloroacetic acid or chloroacetamide to give carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues also include bromotrifluoroacetone, α-bromo-β (5-imidazolyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimide, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl 2-pyridyl disulfide, p- Derivatized by reaction with chloromercuribenzoate, 2-chloromercurl-4-nitrophenol, or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.
Histidyl residues are derivatized by reaction with diethyl procarbonate at pH 5.5-7.0. This is because this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Para-bromophenacyl bromide is also useful. The reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0.
Ricinyl and amino terminal residues are reacted with succinic acid or other carboxylic anhydrides. Derivatization with these agents has the effect of reversing the charge of the ricinyl residue. Other reagents suitable for derivatizing α-amino-containing residues include imide esters such as methyl picolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzene sulfonic acid; O-methylisourea; -Pentanedione; and reaction with glyoxylic acid catalyzed by transaminase.
Arginyl residues are modified by reaction with one or several conventional reagents. These reagents include phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. Derivatives of arginine residues have a high pK with guanidine functionality_aTherefore, it is necessary to carry out the reaction in an alkaline state. In addition, these reagents can react with the lysine group as well as the arginine ε-amino group.
Tyrosyl residues are well-known targets for modification to introduce spectral labels by reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane. Most commonly, N-acetylimidazole and tetranitromethane are used to form O-acetyl tyrosyl species and 3-nitro derivatives, respectively.
The carboxyl side group (aspartyl or glutamyl) is a carbodiimide such as 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl (4-ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide. It is selectively modified by reaction with (R′—N—C—N—R ′) Furthermore, aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.
Glutaminyl and asparaginyl residues are frequently deamidated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues. Alternatively, these residues are deamidated under mildly acidic conditions. Either form of these residues falls within the scope of the present invention.
Derivatization with bifunctional agents may be used, for example, to crosslink PTK / adapter or PTP / adapter complex component peptides to each other, or to support a PTK / adapter receptor complex in a water insoluble support matrix or other. It is useful for crosslinking to a macromolecular carrier. Commonly used crosslinking agents include, for example, disuccinimidyl esters such as 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, 3,3′-dithiobis (succinimidylpropionate), etc. N-hydroxysuccinamide esters such as esters with 4-azidosalicylic acid, homobifunctional imide esters, and bifunctional maleimides such as bis-N-maleimide-1,8-octane. Derivatizing agents such as methyl-3- (p-azidophenyl) dithiolpropioimidate provide a photoactivatable intermediate that can form crosslinks in the presence of light. Alternatively, a reactive, water-insoluble matrix such as cyanogen bromide activated carbohydrate and a reactive substrate as described in US Pat. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; and 4,330,440 are protein immobilized. Used for crystallization.
Modifications other than those described above include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, methylation of α-amino groups of lysine, arginine, and histidine side chains (Creighton, T, E., Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetylation of N-terminal amines, and in some cases amidation of C-terminal carboxyl groups.
Such derivatized moieties can improve stability, solubility, absorption, biological half-life, and the like. Alternatively, these moieties can remove or reduce undesirable side effects such as protein complexes. Portions that can mediate such effects are disclosed, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA.
The term “fragment” refers to a polypeptide obtained from the amino acid sequence of PTK, PTP or adapter protein of a PTK / adapter or PTP / adapter complex, and having a shorter length than the full-length polypeptide from which it is derived. Used to indicate Such fragments can be made, for example, by proteolytic cleavage of the full-length protein. Preferably, this fragment is suitably modified in the DNA sequence encoding PTK, PTP or adapter protein to make one or more amino acids C-terminal, N-terminal and / or one or more sites within the native sequence. Can be obtained by recombination. When present in a complex that resembles a naturally occurring PTK / adapter or PTP / adapter complex, a fragment of PTK, PTP, or an adapter protein can contain compounds that act to modulate signal transduction as described below. Useful for screening. It is understood that such fragments can retain one or more characteristic parts of a native PTK / adapter or PTP / adapter complex when present in the complex. Examples of features retained in this way are catalytic activity; substrate specificity; interaction with other molecules in the whole cell; regulatory function; or specific for native PTK / adapter or PTP / adapter complex Containing the antibody or its antigenic determinant.
Another functional derivative included within the scope of the present invention is at least one “variant” poly which is missing, added or substituted with respect to the native polypeptide in one or more amino acids. A PTK / adapter or PTP / adapter complex comprising a peptide (eg, PTK, PTP, or adapter). Variants can be PTK, PTP, and / or modified to add, remove, and / or modify one or more amino acid codons at one or more sites within the C-terminus, N-terminus, and / or native sequence. Alternatively, it may be derived from a naturally occurring PTK / adapter or PTP / adapter complex component by appropriate modification of the adapter protein DNA coding sequence. Such variants with added amino acids, substituted amino acids, and / or additional amino acids retain portions that represent one or more features of the natural PTK / adapter or PTP / adapter complex described above. It is understood that.
Functional derivatives of PTK / adapter or PTP / adapter complexes, including PTKs, PTPs, and / or adapter proteins with amino acid residue deletions, insertions, and / or substitutions, are standard Can be prepared using techniques. For example, a modified component of a functional derivative may be produced using site-directed mutagenesis techniques (as exemplified by Adelman et al., 1983, DNA 2: 183) and the DNA coding sequence The nucleotides therein are modified such that the modified coding sequence is modified, and then this recombinant DNA is expressed in the host prokaryotic or eukaryotic cell using techniques such as those described above. Alternatively, components of functional derivatives of PTK / adapter or PTP / adapter complex with deletions, insertions and / or substitutions can be conveniently synthesized directly by chemical synthesis using methods known to those skilled in the art. May be prepared. A functional derivative of a PTK / adapter or PTP / adapter complex typically exhibits a biological activity that is homogeneous with the natural complex.
5.5For PTK / adapter or PTP / adapter complex Antibody
The invention further provides antibodies that specifically recognize PTK / adapter or PTP / adapter complexes or epitopes thereof, or PTK, PTP, or adapter components separately from the PTK / adapter or PTP / adapter complex. It relates to an antibody that specifically recognizes any epitope of the PTK, PTP, or adapter component of the complex that should not be recognized by the antibody when present. Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs), humanized or chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ′)₂Including, but not limited to, fragments produced in FAb expression libraries, anti-idiotype (anti-Id) antibodies, and any of the epitope-binding fragments described above. Such antibodies may be used, for example, for the detection of PTK / adapter complexes in a biological sample, or alternatively, as a method for inhibition of PTK / adapter complex formation, This inhibits the progression of cell proliferation disorders.
Polyclonal antibodies are heterogeneous populations of antibody molecules derived from the sera of animals immunized with an antigen, such as PTK / adapter complexes, or antigenic functional derivatives thereof. For the production of polyclonal antibodies, various host animals are immunized by injection of PTK / adapter or PTP / adapter complex, including but not limited to rabbits, mice, rats, etc. is not. Depending on the host species, various adjuvants are used to enhance the immune response, including Freund's adjuvants (complete and incomplete), mineral gels such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyholes Potentially useful human adjuvants such as limpet hemocyanin, dinitrophenol, and BCG (bacille Calmette-Guerin) and, but not limited to, Corynebacterium parvum.
A monoclonal antibody is a substantially homogeneous population of antibodies to a particular antigen and can be obtained by any method that produces antibody molecules by continuous culture of cell lines. These include Kohler et al. Hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 495-497 (1975) and US Pat. No. 4,376,110), human B cell hybridoma technology (Kosber et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), and EBV-hybridoma technology (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan, R. Liss., Inc. pp 77-96), but is not limited thereto. Such antibodies may also include IgG, IgM, IgE, IgA, IgD and their subclasses. The hybridoma producing the mAb of the present invention may be cultured either in vitro or in vivo. The production of high titers of mAbs in vivo makes this a currently preferred production method.
In addition, it was developed for the production of “chimeric antibodies” by splicing together genes from mouse antibody molecules with appropriate antigen specificity and human antibodies with appropriate biological activity. Method (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452- 454) can be used. A chimeric antibody is a molecule that contains different portions derived from different animal species, such as those having a variable region derived from a murine mAbs and a human immunoglobulin constant region.
Alternatively, methods described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546) can be applied to the production of PTK / adapter complex specific single chain antibodies or PTP / adapter complex specific single chain antibodies. . Single chain antibodies are formed by linking the heavy and light chain fragments of the Fv region via an amino acid bond, resulting in a single chain polypeptide.
Antibody fragments containing specific binding sites for PTK / adapter or PTP / adaptor complex may be formed by known methods. Examples include, but are not limited to, the following fragments: F (ab ′) that can be produced by pepsin digestion of antibody molecules₂Fragment, F (ab ')₂Fab fragments that can be generated by reducing the disulfide bonds of the fragments. Alternatively, Fab expression libraries may be constructed to allow rapid and convenient identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity for PTK / adapter or PTP / adapter complex (Huse et al. al., 1989, Science 246: 1275-1281).
5.6PTK / Adapter protein and PTP / Adapter Protein-related cell proliferation disorders
The present invention first demonstrates that the binding of family members containing the SH2- and / or SH3-domains of the adapter protein is an essential step in the process of carcinogenesis and transformation. More specifically, the data presented in the Examples in Sections 6-12 below detail the binding of the GRB2 member of the adapter protein GRB subfamily to the intracellular PTK product of the human BCR-ABL gene.
This section describes some of the various uses in which the binding of such PTKs and adapter proteins and / or PTPs and adapter proteins can be used for the treatment of cellular proliferative disorders involving such complexes. ing. Agents and adapters that can break down such complexes (ie, reduce or inhibit the interaction between components of PTK or PTP in the complex and adapter members) and adapters described herein Although the focus has been on the use of such compounds for the treatment of cell proliferative disorders, including PTK and PTP, which can form complexes with members of the family containing the proteins SH2- and / or SH3- It is not limited to. As used herein, the term “break” refers not only to the physical dissociation of protein complex components, but to the complex, whether such complexes remain physically formable or not. It also means disruption of body activity. “Activity” as used herein refers to the function of the protein complex in the signaling cascade in the cell in which such a complex is formed, ie, efficient transmission of extracellular signals into the cell. Means the function of the complex in enabling or inhibiting. Examples of such cell proliferation disorders include, but are not limited to, cancer disorders such as chronic myelogenous leukemia and acute lymphoblastic leukemia as well as psoriasis and atherosclerosis. The complexes of the invention are also involved in cellular processes such as cell activation, differentiation and survival.
Disrupting the interaction between the component members of such a complex, depending on the individual PTK / adapter protein complex or PTP / adapter protein complex, modulates differently on the signal transduction events involved It may have an effect, i.e., the effect of complex disruption may activate, decrease or block the signal normally transmitted into the cell. Similar to relying on cell proliferation disorders, activation, reduction, or blocking of signals that are normally introduced into cells is desirable for the treatment of disorders. For example, one effect of complex formation between BCR-ABL PTK and GRB-2 adapter protein is to cause activation of the Ras signaling pathway (see examples in Section 8 below). Thus, disruption of the BCR-ABL PTK / GRB-2 adapter protein complex inhibits abnormal signal transduction and prevents activation of the Ras pathway. Alternatively, cell proliferative disorders involving, for example, PTK / adapter or PTP / adaptor complex may progress because such a complex causes an abnormal inhibition of normal signaling events. In such cases, disruption of the complex should restore normal signaling events. In addition, aberrant complexes can cause altered subcellular adapter protein localization, as was the case with GRB-2 members of the 6RB subfamily of adapter proteins, For example, it may cause dysfunctional cellular events such as cytoskeleton reorganization. In this case, inhibition of the PTK / adapter or PTP / adapter complex should restore normal cell structure. Furthermore, the agent or agents responsible for the destruction of the PTK / adapter or PTP / adapter complex may cause a disruption of the interaction between other strong components of such a complex. Such components include, but are not limited to, SOS proteins.
When considering PTK / adapter protein complexes and PTP / adapter protein complexes that are PTK or PTP components of the complex and are receptor-type PTK or PTP molecules, the receptor or their ligands are It may be used directly to modulate signaling events that lead to the progression of proliferative disorders. For example, PTKs, soluble PTKs, peptides that show extracellular PTK domains, or peptides that show parts of the extracellular PTK domain that are known to bind to ligands are endogenous transmembrane PTK receptors for useful ligands When exposed to a target PTK-expressing cell capable of acting competitively with the molecule, it may be administered using methods known to those of skill in the art, thus reducing the binding of the ligand to endogenous PTK. , Inhibit. As a result of these manipulations, the interaction between PTK and the adapter protein is reduced by inhibiting as much as possible autophosphorylation of PTK, which in turn can reduce the affinity of the adapter protein for the PTK molecule Or it should be possible to cause inhibition. A similar situation is maintained for PTP.
In addition, when considering receptor-type PTK, an extracellular molecule that can bind to such PTK and is not activated by binding to PTK is administered using methods known to those skilled in the art. May be. This type of extracellular molecule may include a modified form of the natural ligand for the PTK of interest, eg, receptor binding may not yet occur, but kinase activation has not occurred. . Molecules of such design should act similarly to the administration of soluble PTK and these procedures should have the net effect of reducing or inhibiting PTK / adapter protein complex formation. Again, a similar situation occurs in the case of PTP.
Furthermore, a molecule capable of binding to the receptor PTK of the PTK / adaptor complex of the present invention or the natural ligand of the receptor PTP of the PTP / adapter complex may be administered using methods known to those skilled in the art. This class of molecules should act to inhibit the ability of the ligand to bind to the corresponding receptor, thus having the ultimate effect of reducing or inhibiting the formation of PTK / adapter or PTP / adapter protein complex It should be.
Depending on the specific conditions being treated, such agents are formulated and administered systemically or locally. Methods of formulation and administration are found in “Remington's Pharmaceutical Science”, 1990, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA. Suitable routes include oral, rectal, buccal mucosa, or small intestine administration; parenteral administration includes subdural, direct intraventricular, intravenous, intraperitoneal, nasal cavity to name a few examples Intramuscular, subcutaneous, and intramedullary injections are included as well as internal or intraocular injections. For administration, the agents are formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically exchangeable buffers such as Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. For buccal mucosal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are generally known to those skilled in the art.
Agents that act intracellularly to directly interfere with the formation of the PTK / adapter complex and / or PTP / adaptor complex of the present invention may be used for the treatment of cellular proliferation disorders. Such agents bind competitively with SH2 and / or SH3 domains, or domains that bind to SH2 and / or domains that bind to SH3, small organic molecules, or complex components to form complexes. Including, but not limited to, extracts of natural products that should act to reduce or inhibit, which should also reduce or inhibit the progression of the desired cell proliferation disorder . The SH2 peptide domain and SH3 peptide domain, and the peptide domain that binds to SH2 and the peptide domain that binds to SH3 are described in Section 5.1, as described above. Such agents also destroy the complex by interfering with downstream signaling ability instead of or in addition to complex formation.
The drug to be administered intracellularly may be administered by methods known to those skilled in the art. For example, such agents may be encapsulated in liposomes and then administered as described above. Liposomes are spherical lipid bilayers with aqueous solutions inside. All molecules present in the aqueous solution when the liposome is formed are taken up in the internal aqueous solution. What is contained in the liposome is protected from the external small environment and is efficiently transported into the cytoplasm of the cell for the liposome to fuse with the cell membrane. In addition, since small organic molecules are hydrophobic, they may be administered directly into cells.
Nucleotide sequences encoding peptide substances utilized within cells may be expressed in the cells of interest using methods known to those skilled in the art. For example, transporting an expression vector derived from a virus such as a retrovirus, vaccinia virus, adeno-associated virus, herpes virus, or bovine papillary virus to a targeted cell population and expressing such nucleotide sequences in these cells May be used to Such vector construction methods are known. See, for example, Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wily Interscience, N.Y.
Alternatively, antibodies that can interfere with PTK / adapter and / or PTP / adapter complex formation may be administered for the treatment of cell proliferative disorders, including PTK or PTP, that can form complexes with adapter proteins. . For example, neutralizing antibodies that can interfere with the binding of ligands to receptor type PTKs or PTPs may be administered using techniques such as those described above. The effects of such administration are similar to those described above for the administration of soluble PTKs or PTPs. In addition, neutralizing antibodies that bind to intracellular epitopes and have the effect of disrupting PTK / adapter or PTP / adapter complex formation may be administered. Such antibodies may be administered, for example, using the techniques described above for the administration of drugs that act intracellularly. Alternatively, a nucleotide sequence encoding a single chain antibody may be expressed in a target cell population using, for example, the method described in Marasco et al. (Marasco et al., 1993, Proc. Natl). Acad. Sci. USA 90: 7889-7893).
The PTK / adapter complexes and / or PTP / adapter complexes of the present invention may be used to screen for additional molecules that can act to disrupt the activity of the members of such complexes, thus It may be possible to modulate the signaling event such as the effect of such a complex. Such compounds include peptides consisting of amino acids in the D- and / or L-configuration (eg in the form of a random peptide library; see Lam, et al., 1991, Nature 354: 82-84), phosphopeptides (Including, but not limited to, phosphopeptides, eg, random or partially degenerate, phosphopeptide-directed library forms, see Songyang et al., 1993, Cell 767-778), antibodies, and small organic molecules. It is not something.
For example, compounds that bind to individual components of a PTK / adapter or PTP / adapter complex, or a functional group portion of an individual component (and may further be able to disrupt complex formation) may be identified. . An individual functional part of a complex may be defined herein as a peptide part of an individual complex component that can still form a stable complex with another member of the complex. For example, the peptide portion of the domain that binds to SH2 of PTK can still bind stably to the SH2 domain of the adapter protein, thus still forming a complex with the SH2 domain of the adapter protein. Furthermore, when the PTK or PTP component of the present invention is a catalytic domain, the functional part of the catalytic domain may still be a peptide that can be stably bound to a substrate molecule.
One method that makes use of this approach carried out to isolate molecules that bind to such PTK / adapter or PTP / adapter complex components is to agarose, plastic beads, microbe of component molecules or their functional moieties. Adhesive component molecules in a titer well, petri dish, or solid support such as a membrane made of nylon or nitrocellulose, and then in the presence of a compound or compounds that bind to one strong component Should be included. After incubation, unbound compound is washed away and the compound bound to the component is recovered. By using this procedure, multiple types of molecules may be screened simultaneously for activity to bind to PTK / adapter or PTP / adapter complex components.
The PTK / adapter complex component that may be utilized in the above screening methods is a PTK molecule or a functional moiety thereof, such as a PTK catalytic domain, phosphorylated domain, SH2 domain, SH3 domain, SH2 binding domain, or SH3 And may include an adapter protein, or a functional group portion thereof, such as an SH2 domain and an SH3 domain, without particular limitation. The peptide used may or may not be phosphorylated and, if phosphorylated, contains at least one amino acid residue, preferably phosphorylated Tyr. A phosphate domain may be defined as a peptide region in which certain amino acid residues are specifically phosphorylated. Such a functional part of a phosphate domain may be defined as a peptide in which an amino acid is specifically phosphorylated by a specific PTK. The functional portion of the SH2 domain may be defined as a peptide comprising at least one portion of the SH2 domain that can specifically bind to a domain that binds SH2. Similarly, a functional portion of an SH3 domain may be defined as a peptide comprising at least one portion of an SH3 domain that can specifically bind to a domain that binds to SH3. The functional portion of the domain that binds to SH2 may be defined as a peptide that can bind to SH2, and may have a length of at least 4 amino acid residues. The functional part of the domain that binds to SH3 may be defined as a peptide capable of binding to SH3 and has a length of at least 4 amino acid residues, preferably 10 amino acid residues.
The PTP / adapter complex that may be used in the above screening method is a PTP / molecule or functional part thereof, such as PTP catalytic domain, phosphorylated domain, SH2 domain, SH3 domain, SH2 binding domain, SH3 Domains that bind to and adapter proteins, or functional moieties such as their SH2 and SH3 domains may be included and are not particularly limited. The peptide used may or may not be phosphorylated, and if phosphorylated, it contains at least one phosphorylated amino acid residue and contains a phosphorylated Tyr amino acid residue. It is preferable to include. A phosphate domain may be defined as a peptide that is specifically phosphorylated on an amino acid residue. Such a functional part of a phosphate domain may be defined as a peptide capable of specifically phosphorylating an amino acid by a specific PTK. The functional portion of the SH2 domain, SH3 domain, domain that binds to SH2, and domain that binds to SH3 may be as described above.
Molecules that show binding activity may be further screened to determine their ability to disrupt PTK / adapter or PTP / adapter complex. Alternatively, the molecules may be screened directly for the ability to destroy the PTK / adapter or PTP / adaptor complex. For example, in vitro complex formation is first assayed by one component of the complex of interest immobilized on a solid support, or a functional portion thereof. Second, the immobilized complex component is contacted with the compound identified as described above and the second component of the complex of interest, or a functional component thereof. Third, it is determined whether or not the second component can still form a stable complex with the immobilized component in the presence of the compound.
In addition, in vivo complex formation may be assayed utilizing co-immunoprecipitation methods known to those skilled in the art. Briefly, a cell line capable of forming the desired PTK / adapter or PTP / adapter complex is contacted with the compound identified as described above, and a cell lysate is prepared from the contacted cell line. Antibody raised against one of the components of the complex of interest is added to the cell lysate and subjected to standard immunoprecipitation. When the complex is destroyed, the antibody raised against only the components of the complex is precipitated, whereas when the complex is still formed, the complex is precipitated by immunoprecipitation.
The effect of the agent on the transformation ability of the PTK / adapter or PTP / adaptor complex of interest may be assayed directly. Such agents are not necessarily required, but may include agents identified using the screening methods described above. For example, one or more agents may be administered to fibroblasts or hematopoietic stem cells capable of forming PTK / adapter complexes that produce cell transformation in the absence of inhibitors (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792; McLaughlin et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6558-6562). The transformation state of the cells may then be measured, for example, by monitoring the ability of colonization in soft agar in vitro (Lugo et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1263-1270). Gishizky et al., 1992, Science 256: 836-839). Alternatively, cell transformation status may be monitored in vivo by measuring the ability to form tumors in severe combined immunodeficiency (SCID) immunodeficient nude mice. (Sawyers et al., 1992, Blood 79: 2089-2098). In addition, in the case of BCR-ABL, one or more agents may be administered to animal models of ALL and / or CML known to those skilled in the art (Gishizky et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3755-3759) and / or may reverse the progression of cancerous disorders.
Agents that can disrupt PTK / adapter and / or PTP / adapter complex formation and reduce or inhibit cell proliferation disorders resulting from such complex formation should It may be used to treat patients who may exhibit such disorders. When one or more of the above drugs is administered to a patient at an effective concentration, does the cell proliferative capacity that should contain PTK / adapter or PTP / adapter protein complex decrease in the presence of such drug? Or disappear.
Also, in the case of hematopoietic cell proliferative diseases such as leukemia, rather than direct administration to the patient, the agent or drug can be used with autologous bone marrow transplantation and chemoradiotherapy known in the art. Briefly, an aliquot of bone marrow cells, generally taken from the pelvis, is removed from the patient. The cells are then cultured in the presence of a concentration of an agent or drug that can efficiently disrupt the PTK / adapter or PTP / adapter complex. By blocking the signaling pathways of bone marrow cells capable of forming such complexes, the cells are selected for the presence of clonal progeny of these cells, and the cells involved in the hematopoietic cell proliferative disorder to be treated Eliminate cultures effectively. While culturing bone marrow cells and removing highly carcinogenic cells, the patient is treated with chemoradiotherapy appropriate to the disease using techniques and doses known in the art. At the end of such chemoradiotherapy treatment, the patient receives an autologous infusion of bone marrow cell culture that has been cleared of carcinogenic cells.
In a preferred embodiment of the invention, the PTK / adapter complex is disrupted or disrupted and the complex is an intracellular PTK product of the human BCR-ABL gene and the adapter protein component is the GRB sub-part of the adapter protein. A member of the GRB-2 family. Further, cell proliferative diseases that are treated by administration of such agents include, but are not limited to, chronic myeloid leukemia and acute lymphocytic leukemia in this preferred embodiment.
5.7A compound capable of breaking the interaction between binding partners Identification
In testing compounds for their ability to prevent (ie, destroy or block) the interaction between an activated tyrosine kinase molecule and an adapter protein molecule (referred to herein as a “binding partner”), many assay systems Any may be used. In addition to the activated tyrosine kinase molecule, it should be recognized that other molecules that bind to the adapter protein to form a complex are included in this definition of binding partner. Thus, another binding partner is, for example, the SH2 domain-containing protein SHC known to bind to the GRB-2 adapter protein (Tauchi, T. et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 167-175; Rozakis-Adcock, M. et al., 1992, Nature 360: 689-692; Pelicci, G. et al., 1992, Cell 70: 93-104). However, rapid, high-throughput assays that can screen a large number of compounds, including but not limited to ligands (natural or synthetic), peptides or small organic molecules are preferred. Compounds that have been confirmed to interfere with binding partner interactions can thus be further evaluated for inhibitory activity as described herein.
The basic principle of the assay system used to identify compounds that interfere with the interaction between the binding partners is the binding under conditions and time sufficient to allow the two proteins to interact, bind and form a complex. Including preparing a reaction mixture containing the partner. In order to test a compound for inhibitory activity, the reaction is carried out in the presence or absence of the test compound. That is, the test compound may be added first to the reaction mixture or at some point after the addition of the binding partner. Controls are incubated in the absence of test compound or with placebo. Thereafter, the formation of a complex of the binding partner protein is detected. Complexes are formed in the control reaction mixture, but no complex is formed in the reaction mixture containing the test compound, or the level of complex formation in the reaction mixture is reduced compared to the control reaction This indicates that the compound prevents the interaction between the binding partners. Available assay components and various formats are described below.
Binding partners used as components of the assay may be obtained from natural sources, eg, purified from cells using protein separation methods known in the art, or using techniques known in the art. (E.g., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY) and / or using techniques known in the art The whole or a part can be chemically synthesized. For example, peptides are synthesized by solid phase methods, cleaved from the resin, and purified by high performance liquid chromatography for separation (eg, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, WHFreeman & Co., NYpp. 50 See -60). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing, for example using the Edman degradation method (see, for example, Creighton, 1983, supra).
Peptide fragments can be made to correspond to the binding domains of the respective proteins. For example, such fragments include, but are not limited to, SH2 domains, SH3 domains, peptide fragments that bind to SH2 domains and / or peptide fragments that bind to SH3 domains. Many methods commonly used in the art can be employed to identify and isolate protein binding sites. Such methods include, but are not limited to, screening for single mutagenesis and co-immunoprecipitation assays of one of the genes encoding the protein. Sequence analysis of the genes encoding the respective proteins will reveal mutations corresponding to the regions of the protein involved in interaction binding.
Alternatively, a certain protein can be immobilized on a solid surface, interacted with the labeled binding partner treated with a proteolytic enzyme such as trypsin, and bound thereto. After washing, the short labeled peptide containing the binding domain remains bound to the solid material and is identified by amino acid sequencing after it is isolated. Once a protein gene is obtained, a short gene segment can be engineered to express a peptide fragment of the protein, which can then be tested for its binding activity, purified, or synthesized. it can.
The binding partner amino acid sequences that can be used in the assays of the present invention need not be identical to the known sequences of the genes that encode them, whether produced by molecular cloning methods or synthesized by chemical synthesis methods. The binding partner may include altered sequences that result in a product that is missing, added or substituted, but functionally equivalent to amino acid residues.
For example, functionally equivalent amino acid residues can be used in place of residues in the sequence to alter the sequence. These substituted residues can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs, for example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. ; Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine; positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine; negatively charged (acidic) ) Amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
One of the binding partners used in the assay system should be labeled directly or indirectly to facilitate detection of complexes formed between the binding partners. Any suitable labeling system may be used,¹²⁵Radioisotopes such as I, colorimetric signals detectable when exposed to substrates or enzyme labeling systems that generate light, including but not limited to fluorescent labels.
When using recombinant DNA methods to create assay binding partners, it is advantageous to engineer fusion proteins that facilitate labeling, immobilization and / or detection. For example, fusing a tyrosine kinase or adapter protein coding sequence to a coding sequence of a heterologous protein having enzymatic activity or acting as an enzyme substrate simplifies labeling and detection. The fusion construct should be designed so that the heterologous components of the fusion product do not interfere with the binding of the binding partner.
Indirect labeling involves the use of a third protein, such as a labeled antibody, that specifically binds to one of the binding partners. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments and fragments produced by a Fab expression library.
The assay can be performed in a heterogeneous or homogeneous form. A heterogeneous assay involves immobilizing one of the binding partners to a solid phase and detecting the complex immobilized on the solid phase at the end of the reaction. In a homogeneous assay, the entire reaction is performed in the liquid phase. In either method, the order of addition of the reactants can be varied to obtain different information about the compound being tested. For example, by reacting in the presence of a test substance, i.e. by adding the test substance to the reaction mixture before or simultaneously with the binding partner, for example, a test compound that interferes with the interaction between the binding partners due to competition. Can be identified. On the other hand, by adding a test compound to the reaction mixture after the complex has formed, a test compound that disrupts the preformed complex, for example, a compound having a higher binding constant that replaces one of the binding partners from the complex. Can be tested.
In a heterogeneous assay system, one binding partner is immobilized on a solid surface and the binding partner (unimmobilized) is labeled directly or indirectly. In practice, microtiter plates are advantageously used. Fixed species can be immobilized non-covalently or covalently. Non-covalent binding can be achieved simply by coating the solid surface with a protein solution and drying. Alternatively, the protein may be immobilized on a solid surface using an immobilized antibody specific for the protein. This surface may be prepared in advance and stored.
To perform the assay as described above, the binding partner of the immobilized species is added to the coated surface with or without the test compound. After the reaction is complete, removal of unreacted components (eg, by washing) leaves the formed complex immobilized on the solid surface. Detection of the complex immobilized on the solid surface can be done in several ways. When the binding partner is pre-labeled, detection of the label immobilized on the surface indicates the formation of a complex. If the binding partner is not pre-labeled, indirect labeling can be used, for example, a labeled antibody specific for the binding partner (this antibody is now labeled directly or indirectly with a labeled anti-Ig antibody). Can be used to detect complexes immobilized on the surface. Depending on the order of addition of reaction components, test compounds that inhibit complex formation or disrupt the preformed complex can be detected.
Alternatively, the reaction is carried out in the liquid phase in the presence or absence of the test compound, the reaction product is separated from the unreacted components and, for example, one for fixing the complex formed in solution. The complex can be detected using an immobilized antibody specific for the other binding partner and a labeled antibody specific for another binding partner to detect the immobilized complex. Again, depending on the order of addition of the reactants to the liquid phase, test compounds that inhibit the complex or disrupt the preformed complex can be identified.
In other embodiments of the invention, a homogeneous assay can be used. In this method, a pre-formed complex of the binding partner is prepared, where one of the binding partners is labeled, but the signal generated by this label disappears upon formation of the complex (eg, for immunoassays). (See Rubenstein, U.S. Pat. No. 4,109,496, which utilizes this method). The addition of a test substance that competes with one of the binding partners and replaces it from the preformed complex produces a signal above background. In this way, test substances that disrupt viral protein-host cell protein interactions can be identified.
6.Example: BCR-ABL is combined with GRB-2 in vitro and in vivo Also meet
The examples presented in this section demonstrate that GRB-2 members of the GRB subfamily of adapter proteins bind to BCR-ABL intracellular PTK both in vitro and in vivo.
6.1.Materials and methods
6.1.1Cells and viruses
Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells were grown in complete Grace medium (Smith, G.E., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165). Ph¹Positive leukemia cell lines K562 and NMG-01 were derived from patients with chronic myeloid leukemia and expressed P210 BCR-ABL. PH¹Positive cell line ALL-1 was induced from patients with acute lymphocytic leukemia and expressed P185 BCR-ABL. These PH¹Positive cell lines were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum. COS African green monkey cells and Rat1 fibroblasts were grown in DMEM medium containing 5% fetal calf serum.
PAcCI2 baculovirus in the presence of wild type baculovirus DNA as described in Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931. Recombinant baculoviruses for expression of cBCR, cABL and BCR-ABL were generated by co-transfecting the corresponding cDNA cloned in the vector.
In accordance with the method described previously (Mullerr et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792), transient hyperexpression in COS cells resulted in helper-free retroviral Stocks were prepared. Using an immunohistochemical method (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792), retrofitting the wild-type and mutant BCR-ABL gene products into Rat1 fibroblasts according to their ability to transfer Virus stocks were characterized. In these staining methods, endogenous levels of rat c-abl protein were not detected. The level of gene transfer was further assessed by measuring the level of BCR-ABL protein expression (Western blot). Only retroviral stocks that exhibited comparable levels of gene transfer were used for these studies. The titer ranged from 105 infectious particles per ml as determined by the frequency of G418 resistant Rat1 colonies after exposure to limiting dilution of the virus stock.
6.1.2antibody
Rabbit polyclonal antibodies against the amino terminus of cBCR and the amino and carboxy terminus sequences of cABL have been described previously (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171; Konopka et al., 1984, Cell 37: 1035-1042). Mouse monoclonal anti-ABL (21-63) antibody was employed for immunoblotting (Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). A rabbit polyclonal antibody against the C-terminal SH3 domain of GRB-2 (Ab50) and a rabbit polyclonal antibody against a synthetic peptide derived from the N-terminal SH3 domain of GRB-2 (Ab86) were respectively isolated by immunoprecipitation and immunoblotting (Lowenstein Et al., 1992, Cell 70: 431-442).
6.1.3Plasmid construction
A 650 base pair human GRB-2 cDNA (Lowenstein et al., 1992, Cell 70: 431-442: Matuoka et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9015-9019) was obtained from a human placenta cDNA library. These were cloned as (5 ′) SH3-SH2 and (3 ′) SH3 fragments by polymerase chain reaction (PCR). In order to generate full length GRB-2 cDNA, a unique Kpn I site at codon 154 of GRB-2 was employed. The entire coding sequence of GRB-2 and the GRB-2 (3 ′) SH3 domain were subcloned in frame into the Bam HI site of the pGEX-2T vector (Pharmacia). Isolated (5 ′) SH3 and SH2 domains of GRB-2 were prepared as described in Skolnik et al., 1993, EMBO J. 12: 1929-1936.
About wild type P185 BCR-ABL (McLaughlin et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1866-1874) and P185 (Δ176-426) (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792) PSRα (Pendergast et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931) and pSRαMSVtKneo (Muller et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1785-1792) ) Cloning into the vector was performed as described above. P185 BCR-ABL (Y177F) mutant was created by mutagenesis of oligonucleotide specific site using Muta-Gene Phagemid in vitro mutagenesisi system (Bio Rad). A 1.6 Kb EcoR I-Sac I fragment of cBCR from pGEM4 / cBCR was subcloned into the EcoR I and Sac I sites of the pBlueScript SK + vector (Stratagene) and co-infected with XL-1 Blue bacteria with helper phage R408 (Stratagene) A template was created by protecting the single-stranded DNA. This mutant oligonucleotide 5′-AAG CCC TTC TTC GTT AAC GTC GAG-3 ′ was employed to change the nucleotide 530 from A to T to generate a phenylalanine codon instead of tyrosine. In addition, a silent base change was introduced at nucleotide 534 to create a unique Hpa I site. The mutated plasmid was selected because of the presence of this unique Hpa I site. Mutations were verified by dideoxy reading end sequence analysis in both directions. The mutated BCR sequence was introduced into the wild type P185 BCR-ABL cDNA. P185BCR-ABL (Y177F) was subcloned into the pSRα and pSRαMSVtK neo mammalian expression vectors and the AcC12 vector for baculovirus expression. Cloning of cDNA for wild-type cABL into the pSRα vector was described previously (Pendergast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5927-5931). BCR (Δ872-1271) was also cloned into pSRα as described in Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161-171.
6.1.4.Expression and purification of GST fusion protein
As already described (Pendergast et al., 1991,Cel l 66: 161-171), GST fusion protein was expressed and purified using glutathione-sepharose 4B beads (Pharmacia). The fusion protein was stored at 4 ° C. while remaining on the resin.
6.1.5.Metabolic labeling and immunoprecipitation
Sf9 cells were infected with the indicated recombinant baculovirus. Three days after infection, cells were cultured in medium without methionine at 0.1 mCi / ml [³⁵S] was incubated with methionine (ICN) for 4-6 hours at 27 ° C. 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 50 μg / ml leupeptin, 25 μg / ml aprotinin, 25 mM NaF, 1 mM Na_ThreeVO_FourAnd 0.1 mM Na₂MoO_FourSupplemented with KLB (10 mM sodium phosphate pH 7.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100) or PCLB (50 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1% Triton X-100, 10% glycerol). The lysate was clarified by centrifugation at 100,000 xg for 1 hour. Lysates with the indicated antibodies directly or in incubation buffer (20 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10% glycerol, 0.5 mM Na_ThreeVO_Four, 0.1mM Na₂MoO_Four, 25 mM NaF, 1 mM PMSF, 25 μg / ml leupeptin) and then incubated as indicated. Immune complexes were collected by incubation with Protein A-Sepharose beads (Pharmacia) for 120 minutes at 4 ° C. The beads were washed thoroughly with incubation buffer to remove unbound material. The bound protein was analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and visually confirmed by fluorography. Whenever unlabeled lysate was used, the protein was detected by immunoblotting with the indicated antibodies.
6.1.6.Binding assay
The protein lysate was diluted 3-fold with incubation buffer and incubated with GST or GST fusion protein bound to glutathione-Sepharose beads. After 90 minutes incubation at 4 ° C., the beads were incubated with incubation buffer or RIPA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxychol). Acid salt and 2 mM EDTA) and washed thoroughly as indicated. The bound protein was analyzed by fluorography of radiolabeled protein after SDS polyacrylamide.
6.1.7.Immunoblot, IN VITRO autophosphorylation and dephosphorylation Phosphorylation
Immunoblot and [γ³²The method of in vitro labeling with [P] ATP was basically as described previously (Pendergast et al., 1991,Cell66: 161-171; Pendergast et al., 1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88: 5927-5931). Dephosphorylation with potato acid phosphatase was performed as described (Pendergast et al., 1991,Cell66: 161-171; Pendergast et al., 1991,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA88: 5927-5931).
6.2.result
6.2.1.BCR-ABL meets with GRB-2 at IN VIVO
To determine whether BCR-ABL tyrosine kinase forms a physical complex with intact GRB-2 adapter protein in cells, it was examined whether these two proteins co-immunoprecipitated. Cell lysate to Ph¹Positive leukemia cell lines, K562, MEG-01, and ALL-1 Ph¹Hematopoietic cell lines and Rat1 fibroblasts were prepared and subjected to immunoprecipitation with anti-ABL pEx4, anti-GRB-2 or control antibody. After extensive washing, the immunoprecipitate is collected on protein A-Sepharose beads and [γ³²P] ATP and MnCl₂It was subjected to in vitro phosphorylation in the presence. Such conditions promote autophosphorylation of BCR-ABL kinase. The reaction was stopped after 30 minutes at 30 ° C., washed and analyzed by SDS / 8% polyacrylamide gel electrophoresis.³²P-labeled protein was detected by autoradiography. Comparable amounts of BCR-ABL protein were precipitated using either anti-GRB-2 or anti-ABL antibodies. Furthermore, both forms of BCR-ABL (P210 and P185) were associated with GRB-2 of Rat1 fibroblasts expressing the corresponding BCR-ABL protein.
Similarly, immunoprecipitation with GRB-2 protein can be precipitated by anti-ABL antibodies from cell lines expressing BCR-ABL. Specifically, cell lysates were prepared from MEG-01 cells and subjected to immunoprecipitation with controls (preimmune serum), anti-ABL pEX4 antibody and anti-GRB-2 antibody. Immunoprecipitated proteins were separated by SDS / 12% polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose and immunoblotted with anti-GRB-2 antibody. The bound antibody is [¹²⁵I] Protein A was confirmed with the naked eye and could be detected in both lanes containing anti-GRB-2 and anti-ABL immunoprecipitate.
Cells expressing BCR-ABL³⁵After metabolic labeling with S-methionine, 50% to 90% of the BCR-ABL kinase available in the cells is consistent with the above results by immunoprecipitation with anti-ABL or anti-GRB-2 antibodies. 2 to form a complex. Interestingly, no association of GRB-2 with carcinogenic v-abl kinase was observed. From these experiments, the GRB-2 adapter protein forms a stable complex with both forms of BCR-ABL tyrosine kinase, but does not form a complex with v-abl kinase, and BCR-ABL / GRB-2 The complex was found to be intact after in vitro phosphorylation of BCR-ABL.
6.2.2.BCR-ABL binds to GRB-2 with IN VITRO
To investigate the molecular basis of the association between BCR-ABL and GRB-2, the full-length GRB-2 cDNA sequence was cloned into pGEX-2T and expressed in bacteria as a glutathione S-transferase (GST) fusion protein. GST-GRB-2 protein was purified and examined for its ability to bind BCR-ABL in vitro. Specifically, from the degradation product of Sf9 insect cells infected with P185 BCR-ABL recombinant baculovirus³⁵Equal amount of immobilized GST bound S-methionine labeled protein to protein A-sepharose beads, GST-GRB-2 full length, GST amino terminus, GRB-2 SH3 domain, GST-GRB-2 SH2 domain GST carboxy terminus Incubated with GRB-2 SH3 domain and anti-ABL antibody. After 90 minutes incubation at 4 ° C., the beads were washed 4 times with incubation buffer and 2 times with RIPA buffer to remove unbound material. The bound protein was analyzed by SDS / 7% polyacrylamide gel electrophoresis and detected by fluorography. P185 BCR-ABL expressed in baculovirus-infected insect cells was found to bind to full-length GRB-2 immobilized on glutathione sepharose beads. No binding to GST alone was detected. The complex of BCR-ABL and GST-GRB-2 remained intact after washing with a buffer containing SDS and deoxycholate detergent.
In order to identify which GRB-2 domain binds to BCR-ABL, an isolated GST fusion protein with GRB-2 SH3 and SH2 domains was prepared. BCR-ABL binding was associated with GST-GRB-2 SH2 fusion protein. A GST fusion protein with the amino-terminal and carboxy-terminal SH3 domains of GRB-2 was also bound in vitro with baculovirus-produced BCR-ABL protein. The interaction between the SH2 and SH3 domains of GRB-2 and BCR-ABL was resistant to washing with a buffer containing SDS and deoxycholate. Treatment of BCR-ABL with potato acid phosphatase completely removed its ability to associate with the GRB-2 SH2 domain, but its binding to the GRB-2 SH3 domain was not affected.
7.Example: SH2 mediated binding of GRB-2 to BCR-ABL BCR-ABL sequence required for
In the examples introduced in this section, the amino acid sequence necessary for BCR-ABL / GRB-2 binding via the GRB-2 SH2 domain is examined. Specifically, binding has been shown to require the presence of a Tyr-phosphorylated amino acid residue, and further, the first exon mutation of BCR can abolish SH2-mediated BCR / GRB-2 binding Is shown.
7.1.Materials and methods
The materials and techniques used in the experiments introduced in this example are as described in Section 6.1 above.
7.2 Results
7.2.1.SH2 mediated binding of GRB-2 to BCR-ABL is BC Requires tyrosine phosphorylation of the R sequence
To identify which regions of BCR-ABL are involved in GRB-2 binding, BCR and ABL sequences were expressed separately in insect cells infected with baculovirus, and full-length GRB-2 as well as isolated We investigated their ability to bind to the GRB-2 SH2 and SH3 domains. CABL produced by baculovirus bound to full-length GRB-2 in vitro, but not to the GRB-2 SH2 domain alone. Specifically, Sf9 insect cells were infected with cABL recombinant baculovirus alone. Cells 3 days after infection³⁵Labeled with S-methionine. The labeled cells are lysed, and the lysed protein is dissolved in the presence of Protein A-Sepharose beads in the presence of GST only, GST-GRB-2 full length, GST-GRB-2 amino SH3, GST-GRB-2 SH2, GST-GRB-2. Incubated with carboxy SH3 and the corresponding anti-ABL antibody. After 90 minutes incubation at 4 ° C., the beads were washed 4 times with incubation buffer and 2 times with RIPA buffer. Bound protein was analyzed by SDS / 10% polyacrylamide gel electrophoresis and detected by fluorography. CABL overexpressed in insect cells is phosphorylated on tyrosine residues (Pendergast et al., 1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 8: 5927-5931). Therefore, the inability of the GRB-2 SH2 domain to bind to the baculovirus-produced cABL protein was not due to the lack of tyrosine phosphorylation.
In vitro binding of cABL to GRB-2 appears to be mediated only through the amino-terminal and carboxy-terminal SH3 domains of GRB-2. The SH3 domain binds to a specific part rich in proline (Cicchetti et al., 1992,Scie nce 257: 803-806; Ren et al., 1993,Science 259: 1157-1161). Recently, direct interaction between the proline-rich sequence (PPPVPPR) present in the carboxy-terminal region of Sos1 and the GRB-2 SH3 domain has shown that GRB-2 binds to the Sos1 guanine nucleotide exchanger ( Li et al., 1993,Nature 363: 85-87; Rozakis-Adcock et al., 1993,Nature 363: 83-85). The carboxy terminus of cABL contains several proline-rich extensions. However, the PPPVPPR sequence is not found in the cABL protein. In vitro binding of the GRB-2 SH3 domain to cABL is markedly reduced in cABL deletion mutant proteins lacking most of the cABL carboxy-terminal domain, but not completely eliminated. As described below, these data, together with the lack of detectable association between normal cABL and GRB-2 after immunoprecipitation from protein lysates, indicate that the cABL / GRB-2 interaction observed in vitro is unique. Suggests that it does not occur in vivo. However, the proline-rich domain in cABL can serve as a binding site for other SH3 domains.
From a similar analysis of cBCR binding to GRB-2 full length or isolated domain in vitro, only full length GRB-2 and, to a lesser extent, the N-terminal SH3 domain of GRB-2, It was shown to bind to cBCR in vitro. Specifically, Sf9 insect cells alone were infected with cBCR recombinant baculovirus and then treated with cABL recombinant baculovirus as previously described. Interestingly, no binding of cBCR to the SH2 domain of GRB-2 was detected.
In contrast to the strong binding of this domain to the chimeric BCR-ABL tyrosine kinase, the GRB-2 SH2 domain does not bind to cABL and cBCR at all in vitro. The phosphorylation state of the cBCR sequence differs from the BCR-ABL chimera in terms of the full length cBCR protein. The cBCR protein is only phosphorylated at serine / threonine residues in all cell types examined even after overexpression in insect cells (Timmons et al., 1989,Oncogene 4: 559-567; Pendergast et al., 1991,Cell 66: 161-171). In contrast, in BCR-ABL chimeras, activated ABL kinase phosphorylates the first exon sequence of BCR on tyrosine (Liu et al., 1993,Oncogne 8: 101-109). To assess whether tyrosine phosphorylation of the BCR sequence is responsible for binding to the isolated GRB-2 SH2 domain, co-infection of insect cells with baculoviruses encoding full-length cBCR and cABL proteins I let you. Specifically, Sf9 insect cells were co-infected with cABL and cBCR recombinant baculovirus and treated as previously described for cABL recombinant baculovirus. As a result of trans-phosphorylation of cBCR by cABL tyrosine kinase, the GRB-2 SH2 domain bound to cBCR. CBCR was tyrosine phosphorylated in Sf9 cells co-infected with cABL baculovirus and cBCR baculovirus by Western blot using an anti-phosphotyrosine antibody. A low level of in vitro binding of cBCR to the isolated amino- or carboxy-terminal SH3 domain of GRB-2 was also detected. These results indicated that binding of the GRB-2 SH2 domain to the BCR sequence requires tyrosine phosphorylation.
7.2.2.GRB-2 interacts with BCR-ABL sequence at IN VIVO However, CABL and CBCR sequences do not interact
To examine whether in vitro binding of GRB-2 to cABL and cBCR occurred in vivo, the corresponding cDNA expression construct was transferred into COS cells. As a result of transfection of these cDNAs, cABL and cBCR expression increases approximately 50-200 fold over the corresponding endogenous protein levels (Pendergast et al., 1991,Proc.Natl.Acad.Sci.US A 88: 5927-5931). Under these conditions, cABL did not co-immunoprecipitate with GRB-2 in appreciable amounts. Similarly, the interaction between GRB-2 and BCR sequences could not be detected after overexpression of the BCR sequence retained in the P210 BCR-ABL chimera in COS cells. In contrast, a significant amount of P185 BCR-ABL was precipitated by anti-GRB-2 antibody in the same experiment.
Specifically, cABL cDNA and P185 wild type cloned into the pSRα vector were transferred to COS cells. Cells were lysed 3 days after this transfection and the lysates were incubated for 2 hours at 4 ° C. with normal rabbit serum, anti-ABL 2/3 antibody and anti-GRB-2 antibody. The immunoprecipitate was collected on protein A beads and washed 6 times with incubation buffer. Bound proteins were separated by SDS / 8% polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose, and the filters were incubated with anti-ABL mouse monoclonal antibodies. Immunoreactive bands were confirmed with the naked eye using an enhanced chemiluminescence (ECL) detection system (Amersham). Furthermore, BCR (Δ872-1271) cDNA cloned in the pSRγ vector was transferred to COS cells. Cells were lysed 3 days after infection and lysates were incubated with control serum, anti-BCR antibody or anti-GRB-2 antibody for 2 hours at 4 ° C. The immunoprecipitate is collected with protein A-Sepharose beads, washed 4 times with incubation buffer, washed 2 times with 50 mM Tris-HCl, pH 7.0, and then γ-³²P ATP and MnCl₂It was subjected to in vitro phosphorylation in the presence. Proteins were analyzed by SDS / 8% polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography.
These data indicate that the cABL / GRB-2 and cBCR / GRB-2 complexes were observed in vivo, with the absence of detectable endogenous cABL and cBCR proteins in anti-GRB-2 immunoprecipitates from normal cells It supports the claim that it will not be done. These findings demonstrated that the BCR-ABL chimera exhibits novel protein binding that can be distinguished from its BCR and ABL protein sequence components.
7.2.3.The BCR first exon point mutation of the GRB SH2 domain Defeat binding to BCR
SH2 domain binding to specific tyrosine phosphorylated proteins depends on the primary sequence C-terminus for phosphorylated tyrosine (Fanti et al., 1992,Cell 69: 413-423; Kashishian et al., 1992,EMBO J.11: 1373-1382; Sonyang et al., 1993,Cell 72: 767-778). Examination of the sequence around 11 potential tyrosine phosphorylation sites within the first exon of BCR reveals that tyrosine 177 is found in the sequence YVNV corresponding to the optimal binding site of the CRB-2 SH2 domain. (Sonyang et al., 1993,Cell 72: 767-778; Skolnik et al., 1993,ENBO J.12: 1929-1936). Sequences around the other 10 tyrosines in the first exon of BCR do not match the optimal binding sites of the GRB-2 SH2 domain or other SH2 domains examined (Sonyang et al., 1993,Cell 72: 767-778). To determine if tyrosine 177 is required to bind BCR-ABL to the GRB-2 SH2 domain, site-directed mutagenesis replaced tyrosine 177 in BCR-ABL with phenylalanine, It was expressed in insect cells and examined for binding to GRB-2. Comparison of phosphopeptide map patterns of P185 (Y177F) mutant protein and P185 wild-type protein after in vitro autophosphorylation revealed the absence of at least one major phosphopeptide in P185 (Y177F). Specifically, P185 wild type and P185 (Y177F) cloned into the pSRαMSVtkneo vector were transferred to COS cells. Three days after the transfection, the cells were lysed and the lysate was incubated with anti-ABL antibody. The immunoprecipitate is γ-³²P ATP and MnCl₂It was subjected to in vitro autophosphorylation in the presence. The protein was analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose and subjected to phosphopeptide map generation.
By binding studies, in contrast to wild-type P185 BCR-ABL, the P185 BCR-ABL (Y177F) mutant protein in which tyrosine 177 in the first exon of BCR was replaced with phenylalanine was found to be in vitro in the GRB-2 SH2 domain. It was shown not to interact with. Specifically, Sf9 insect cells were transfected with wild-type P185 BCR-ABL cDNA and wild-type baculovirus DNA cloned using the pAcC12 vector, or P185 BCR-ABL cloned into the pAcC12 vector ( Y177F) cDNA and wild type baculovirus DNA were both transferred. Six days after this transfection, the cells were³⁵Labeled through metabolism with S-methionine. Cells were lysed and lysates were incubated with GST-GRB-2 SH2 or anti-ABL pEX4 antibody in the presence of protein A-Sepharose beads. Bound proteins were analyzed by SDS / 7% polyacrylamide gel electrophoresis and fluorography.
Next, the ability of the P185 BCR-ABL (Y117F) mutant to interact with GRB-2 in vivo was evaluated. P185 (Y117F) did not interact with endogenous GRB-2 when overexpressed in COS cells or Rat1 fibroblasts stably expressing the mutant protein. Similarly, the BCR-ABL deletion mutant lacking tyrosine 177 did not bind to GRB-2. Specifically, cDNAs of P185 wild type and P185 (Y177F) cloned into the pSRαMSVtkneo vector were transferred to COS cells. Three days after this transfection, the cells were lysed and the lysate was incubated with normal rabbit serum (NRS), anti-ABL 2/3 antibody, or anti-GRB-2 antibody for 2 hours at 4 ° C. Immunoprecipitates are collected on protein A-Sepharose beads and [γ³²P] ATP and MnCl₂It was subjected to in vitro phosphorylation in the presence. Proteins were analyzed by SDS 10% polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography. In addition, lysates of G418-selected Rat1 cells expressing P185 wild type and P185 (Y177F) were incubated with anti-GRB-2 antibody, anti-ABL 2/3 antibody or normal rabbit serum for 2 hours at 4 ° C. Immunoprecipitates were collected on protein A-Sepharose beads. Bound protein was analyzed by SDS 10% polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with anti-ABL mouse monoclonal antibody. Immunoreactive bands were confirmed visually with the ECL detection system (Amersham).
These data indicate that the in vivo interaction between BCR-ABL and GRB-2 is mediated by binding of the GRB-2 SH2 domain to phosphorylated tyrosine 177 in BCR-ABL. . The GRB-2 SH3 domain clearly does not contribute to the in vivo binding between full length GRB-2 and BCR-ABL.
8. Example: BCR-ABL protein lacking GRB-2 bindingExhibits reduced transformation ability
The data presented in this example show that the transformation potential of BCR-ABL intracellular PTK is dependent on the binding of this PTK to GRB-2 of the GRB subfamily of protein adapter families. This result indicates that such adapter protein binding to PTK is involved as one step in the transformation / carcinogenesis process.
8.1.Materials and methods
8.1.1Transformation assay
Rat1 fibroblast infection was performed as previously described (Lugo et al., 1989,Mol.Cell.Biol.9: 1263–1270). The titer is> 10 infectious particles per ml when measured by frequency of gene transfer to fibroblasts.^FiveRange. Rat1 colony formation in semi-solid medium, 6-cm in Iscove 5ml supplemented with 15% calf fetal serum and 0.4% Noble agar²5 × 10 per dish^FourCells were applied and measured (Lugo et al., 1989,Mol.Cell.Biol.9: 1263–1270). G418-resistant populations were established by culturing infected cells with G518 (0.5 mg / ml) for 12-15 days. After selection, 10 cells / ml of G418-resistant culture are used.^FourIt was applied to agar at a concentration of individual cells. The number of colonies formed on the agar was recorded 2 weeks after cell application.
Infection and establishment of hematopoietic cell cultures from freshly isolated mouse bone marrow was performed as previously described (McLaughlin et al., 1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 6558-6562). Briefly, bone marrow components from 4-6 week old female BALB / c mice were added 2 × 10 6 per ml in an appropriate retroviral stock solution supplemented with 4 μg Polybrene per ml.⁶Resuspended in individual cells. Cells were incubated for 4 hours at 37 ° C. Following infection, the cells were washed and resuspended in RPMI 1640 medium supplemented with 5% fetal calf serum and 50 μM β-mercaptoethanol. 10 per ml⁶5 ml of cell suspension at a concentration of 6 cells each 6 cm²Applied to a dish. The culture was maintained for up to 8 weeks and fresh medium was added once a week. Non-adherent hematopoietic cell concentration of 10 per ml⁶The culture was considered transformed when more than one was reached.
8.1.2.Various methods
An alternative technique to the transformation assay described in Section 8.1.1 is that described in Section 6.1 above.
8.2.Result
Necessary for BCR-ABL to associate with GRB-2 for its ability to transform fibroblasts and hematopoietic cells to measure the biological relevance of GRB-2 binding to BCR-ABL-induced carcinogenesis The effect of a novel mutant tyrosine-177 was investigated. Rat1 fibroblasts and freshly isolated mouse bone marrow cells were infected using helper-free wild-type retroviral stock solution and mutant BCR-ABL type. Both GRB2 and hSos-1 have been shown to be expressed in these cell types (Lowenstein et al., 1992,Cell.70: 431-442; Bowtell et al., 1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89: 6511-6515; Chardin et al., 1993,Science 260: 1338-1343). Rat1 fibroblast transformation was assayed by colonization in soft agar (Lugo et al., 1989,Mol.Cel l.Biol.9: 1263–1270). Hematopoietic cell transformation was assayed by culturing infected mouse bone marrow cells under conditions that support pre-B-lymphocyte growth (McLaughlin et al., 1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84: 6558-6562). In contrast to wild-type BCR-ABL, the P185 (Y177F) protein did not transform hematopoietic cells and showed a reduced ability to transform Rat1 cells (see Table 1 below). These results are consistent with previous observations that the P185 (Δ176-426) mutant lacking Y177 exhibits reduced transforming activity in both Rat1 fibroblasts and hematopoietic cells (Muller et al., 1991,Mol.Cell.Biol.11: 1785-1792; Table 1). P185 (Δ176-426) shows a more pronounced deletion in Rat1 fibroblast transformation than P185 (Y177F), especially after G418 selection. The sequence downstream of Y177 in the BCR first exon was shown to bind to the SH2-domain in a phosphoserine / phosphothreonine-dependent manner (Peudergast et al., 1991,Cell66: 161-171; Muller et al., 1991,Mol.Cell.Biol.11:1785-1792). Two SH2-binding sites have been identified within this region (named A and B), and removal of these sites causes specific protein interactions that are important for BCR-ABL-mediated transformation of fibroblasts Would be able to stop. Neither P185 (Y177F) nor P185 (Δ176-426) showed transforming activity in hematopoietic cells. Differences in the transformation activity of BCR-ABL protein were not due to differences in protein expression levels.

Western blot analysis of lysates of cells expressing various BCR-ABL types showed comparable steady-state protein values after infection of Rat1 fibroblasts with the corresponding retrovirus. For Western blot analysis, RAT1 cells were infected with retrovirus encoding P185BCR-ABC wild-type and mutant (Y177F) type or control vector. Three days after infection, the cells were lysed and Western blotting using anti-ABL mouse monoclonal antibody was performed. The immune reaction zone was visualized using the ECL detection system (Amersham).
9. Example:ras from ras responsive element promoter -Dependent transcription of BCR-ABL activity
In the examples described in this section, BCR-ABL intracellular PTK / GRB-2 binding has been shown to activate the ras signaling pathway.
9.1.Materials and methods
9.1.1.Transcription activation assay
Transcriptional activation of expression from the ras responsive element (ets / AP-1) promoter essentially followed the previously described method (Clark et al., 1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90: 4887-4891; Hauser et al., 1993, Methods in Enzymology, printing). Briefly, NIH 3T3 cells were transformed into 1 μg of pB4X-CAT chloramphenicol acetyltransferase reporter plasmid (Wasylyk et al., 1989,Mol.Cell.Biol.  9: 2247-2250) and 5 μg of pZIP H-ras (17N) (Feig et al., 1988,Mol.Cell.Biol.  8:Transfected with 0.5 μg of pSRαMSVTkneo containing the BCR-ABL variant manifested in the presence or absence of 3235-3243). Transfection was performed in duplicate using 60 mm dishes, and cells were harvested 48 hours later. The cells were lysed by freezing and thawing in 100 μl of 250 mM Tris-HCl (pH 7.8), centrifuged to remove cell debris, and the supernatant was heated at 62 ° C. to denature endogenous acyltransferase. After further centrifugation, remove 50 μl of each supernatant and add 0.1 μCi.¹⁴CAT activity was measured by incubating with a solution containing 0.34 mM acetyl-CoA in C chloramphenicol (NEN) and 250 mM Tris-HCl for a final reaction volume of 140 μl for 45 minutes. The reaction was terminated by extraction with 500 μl of ethyl acetate, evaporated under vacuum, the remaining pellet was redissolved, and thin layer chromatography was performed on a silica gel plate. As the solvent, 5% methanol / 95% chloroform (v / v) was used. Quantified with AMBIS beta scanner.
9.1.2.Other techniques
Techniques other than the transformation assay described in Section 8.1.1 are as described in Section 6.1 above.
9.2.Result
The mechanism of action by which GRB-2 binding to BCR-ABL allows oncogenic transformation is by directly stimulating ras via the Sos-1 guanine nucleotide exchange factor. To examine whether the interaction between BCR-ABL and GRB-2 directly affects the ras pathway, a transcription activation assay was performed. Oncogenic ras are ras-responsive elements (eg, ets-1 and AP-1 DNA motifs; Hauser et al., 19993,Methods in Enzymology, During printing). In addition, a wide range of oncogenes, including protein tyrosine kinases and serine / threonine kinases, can activate transcription from promoters with ras-responsive elements, such as the ets / AP-1 motif (Schweighoffer et al., 1992,Science.256: 825-827). There is a correlation between the ability of various oncogenes to activate transcription from ets / AP-1-containing promoters and the ability to transform cells (Wasylyk et al., 1988,ENBO.J.  7:2475-2483). As mentioned above, transactivation assays complement cell proliferation and tumorigenicity studies for the analysis of oncogene function.
The transcriptional activation ability from ets / AP-1 was compared between the wild type and mutant type of BCR-ABL. The CAT reporter is under the control of the β-globin promoter and has 4 tandem ras-responsive elements (pB4X-CAT). Carcinogenic ras has been shown to increase transcription rates from this element by a factor of 15 (Schweighoffer,Science, 256: 825-827). As shown in FIG. 1, the activation induced by wild-type BCR-ABL is ras (17N), the most potent inhibitory mutant that has been shown to neutralize ras function. (Feig et al., 1988,Mol.Cell.Biol.,8: 3235-3243; Thomas et al., 1992,Cell,68: 1031-1040; Wood et al., 1992,Cell,6 8: 1041-1050) disappeared by co-transfection of this ras (17N). This indicates that the transcriptional activity induced by BCR-ABL is mediated by ras. The BCR-ABL mutants P185 (Y177F) and P185 (Δ176-425) lack GRB-2 binding, but it is significant that these mutants have little effect on transcriptional transactivation from this promoter It is deep. The low level of transactivation exhibited by these BCR-ABL mutants correlates with the low transformation ability of these mutants compared to wild type P185 BCR-ABL (Table 1 above). reference).
Furthermore, when a rat type 1 fibroblast is infected with a wild-type BCR-ABL-containing retrovirus, the ras-GTP fraction increases. That is, Rat1 cells were infected with P185 BCR-ABL wild-type helper-free retrovirus or vector (control). Two days after infection, in phosphate-free medium³²Cells were labeled with P-orthophosphoric acid (0.5 mCi / ml) for 16 hours. Cells were lysed and ras-immunoprecipitated with anti-ras monoclonal antibody. The guanine nucleotide bound to ras is 0.75 M KH after dissociation₂PO_FourSeparation by thin layer chromatography on PEI-cellulose plates in pH 3.5. Quantification of GDP and GTP bound to ras by AMBIS beta scanner showed a moderate but reproducible increase.
10. Example:GRB2 without signaling ability is transformed Revert phenotype of damaged cells
The following example shows that when the signaling pathway involving BCR / ABL and GRB2 is disrupted, the phenotype produced by transformation can be restored. Increased expression of GRB2 mutants with no signal transduction capacity restores BCR / ABL-induced proliferation of Rat1 cells. In addition, disruption of the signal transduction pathway also inhibits the growth of BCR / ABL-expressing cells (K562 cells) and PDGF receptor-dependent transformed cells obtained from patients with chronic myeloid leukemia.
10.1.Materials and methods
A mutant of the GRB2 gene was constructed by deleting the SH3 domain from either the N-terminal or C-terminal. The full-length and truncated forms of GRB2 are modified pCGN plasmid vectors (Tanaka et al.,Cell,60: 375-386, 1990), Pendergast et al.Cell,75: 175-183,1993. This vector has a hygromycin resistance gene inserted upstream of the SV40 origin of replication. In order to distinguish endogenous GRB2 protein from the transfected construct, the sequence encoding the influenza virus hemagglutinin epitope (Pati, U.K.,Gene,114: 285-288,1992) fused to the N-terminus of the mutant protein in the same reading frame. This same antigenic tag was also fused to the wild type GRB2 gene.
Rat1 fibroblasts transformed with BCR / ABL were established by the method described in Example 8.1.1 above. The GRB2 construct is a standard calcium phosphate transfection method for Rat1-BCR / ABL cell line and rat glioma cell line C6 (ATCC CCL 107) (Molecular Cloning Techniques, Laboratory Manual, 2nd Ed., Edited by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory). Press, and Muller). After transfection, Rat1 cells were cultured for 24 hours and exposed to G418 drug + hygromycin (Sigma) for 7-9 days. Cells selected by the two drugs were seeded on soft agar and the levels of endogenous BCR / ABL, GRB2, transfected GRB2 were measured by Western blot. Cell lines from individual clones expressing different GRB2 constructs were also established. In the case of transfected C6 cells, cells were selected by culturing for 10 days in medium containing hygromycin according to the method of Muller (see above). After drug selection, cells were seeded on soft agar medium containing 0.5% FCS and PDGF (1 ng / ml). On day 10, the number of colonies larger than 0.4 mm was counted.
The expression of the GRB2 construct is described in Pendergast et al.Cell.75: The immunoprecipitation reaction was examined according to the method of 175-185,1993. Briefly, Rat1 cells expressing BCR / ABL-GRB2 were lysed, immunoprecipitated with anti-ABL pEx4 antibody, and the immunoprecipitate was subjected to an in vitro autokinase assay (see Pendergast et al., Supra). Samples were analyzed on SDS-PAGE gels and made visible by autoradiography. In the second experiment, cells were lysed in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% SDS, 1 mM PMSF, and 15 μg of protein from each sample was separated using SDS-PAGE (15%). . The obtained protein was transferred to a nitrocellulose filter by electrophoresis, immunoblotted with an anti-GRB2 mouse monoclonal antibody (Trandsduction Laboratories), and then incubated with a goat anti-mouse monoclonal antibody (Bio Rad) conjugated to horseradish peroxidase. The protein was made visible by an enhanced chemiluminescence detection system (Amersham).
The soft agar assay was performed as previously described (Lugo et al.,Mol.Cell.Bi o.,9: 1263-1270). The cell group selected by the drug is selected according to the cloning efficiency of each cell type.^Three~ 5 × 10^Four6cm²Plated at a density in the range of dishes. Samples were spread in duplicate in medium containing 20% fetal calf serum. Visible colonies (greater than 0.4 mm) were counted after 14 days. Data represent the average number of colonies from 3 to 5 independent experiments performed on transfected and drug-selected cell populations. Data on the growth of Rat1-BCR / ABL were obtained by repeating two to three separate experiments on cell lines from three independent Rat1-BCR / ABL clones transfected with the appropriate construct. is there. As indicated above, this data represents the average number of colonies observed in 7 independent experiments.
K562 (ATCC CRL 243) cells were transfected with the GRB2 construct using standard electroporation methods. After transfection, they were cultured for 18-24 hours and exposed to hygromycin (500 μg / ml) for 2 days. After selection with drugs, the number of viable cells was determined by counting the number of cells not stained with trypan blue. The same number of living cells were spread on soft agar.
10.2.Result
10.2.1.Expression of GRB2 in Rat1 cells
Expression of the GRB2 N-terminal mutant protein in Rat1-BCR / ABL cells causes a return to the normal phenotype. The cell group expressing the GRB2 N-terminal mutant formed a monolayer in liquid culture and showed contact inhibition when it reached confluence. It is important that Rat1-BCR / ABL cells expressing the GRB2 N-terminal mutant have a much lower ability to form colonies in soft agar compared to cells expressing empty vectors (Table 2). reference). Cells expressing the GRB2C terminal mutant formed a monolayer in liquid culture, but did not rest even when confluent. Growth of Rat1-BCR / ABL fibroblasts expressing the GRB2 C-terminal mutant in soft agar was suppressed, although not as much as that seen with the GRB2 N-terminal mutant. The cell groups expressing the N-terminal mutant and C-terminal mutant show similar ratios of mutant protein to wild-type GRB2 protein, so that the N-terminal mutant can be transformed by BCR / ABL. More intense suppression would not simply be due to differences in the levels of the two variants. Specifically, Rat 210 cells expressing only p210 BCR-ABL or wild-type GRB2 or truncated GRB2 together were lysed and immunoprecipitated with an anti-ABL antibody. The precipitation reaction product was subjected to in vitro autokinase assay, and the sample was analyzed by SDS-PAGE (8% gel). There was no change in ABL kinase activity even in cells with increased GRB-2 expression compared to controls. Furthermore, Rat 210 cells expressing only p210 BCR-ABL or both wild type GRB2 or truncated GRB-2 were lysed, and the protein obtained from the cell lysate of one clone was electrophoresed into a nitrocellulose filter. Transfer and immunoblot using anti-GRB-2 monoclonal antibody. All GTB-2 transformants expressed approximately the same level of GRB2 protein. These differences may rather indicate that the two SH3 domains bind to SOS with different affinities or to different substrates. Thus, the SH3 deletion mutant protein of GRB-2 is a major negative inhibitor of transformation induced by BCR / ABL when it is present in cells in equimolar or greater amounts than endogenous wild type GRB2. It becomes.
In contrast to N′-terminal or C′-terminal GRB2 mutants, increased expression of wild-type GRB2 in Rat1-BCR / ABL fibroblasts would make the transformed phenotype more prominent. The drug-selected cell population expressing the transfected wild type GRB2 construct always had 25-30% more colonies in soft agar compared to cells transfected with the empty vector ( Table 2). These data suggest that GRB2 protein may be a restriction effector in BCR / ABL-induced transformation of Rat1 fibroblasts.

10.2.2.Expression of BRB2 mutant in K562 cells
A variant of the SH3 portion of GRB2 also inhibits the growth of human leukemia cells. The GRB2 construct was introduced into K562 cells. K562 cells are p210 BCR / ABL-expressing cells established from blast-onset chronic myeloid leukemia patients. After transfection and drug selection for 48 hours, the levels of endogenous BCR / ABL, GRB2 and transfected GRB2 were determined by Western blot. At the same time, living cells were spread on soft agar. In cultures of K562 cells expressing the GRB2 N-terminal mutant protein, the number of colonies in soft agar was 1/10 compared to controls transfected with empty (Table 2). Similar to that observed in Rat1-BCR / ABL fibroblasts, the GRB2 C-terminal mutant also inhibited K562 colony formation, but to a lesser extent than the N-terminal mutant. These data suggest that signaling mediated by GRB2 is an essential component in the development of human malignancies caused by BCR / ABL.
10.2.3.Expression of GRB2 in C6 glioma cells
The GRB2 construct was also introduced into rat C6 glioma cells. The transformed proliferative phenotype of C6 glioma cells is dependent on PDGF receptor activity (Zhang et al.,Neurol.Res.  14 (5):397-401, 1992). The PDGF receptor is known to interact with GRB2 (Lowenstein et al., 1992,Cell  70: 431-442). As shown in Table 2, the expression of GRB2 mutant without signal transduction ability significantly inhibits colony formation. This data indicates that inhibition of GRB2 signaling can be used to inhibit the growth of transformed cells that depend on receptor tyrosine kinase activation.
11. Example:GRB2 without signal transduction is a model animal Prevent tumor growth
This example shows that cells expressing GRB2 without signal transduction ability can no longer form tumors in animals, treating cancer in animals by disruption of the BCR / ABL signaling pathway. It suggests that
11.1.Materials and methods
Rat1 cells expressing GRB2 (wild type and mutant) and BCR / ABL were prepared by the method described in Section 10.1 above. Rat1 cells expressing both wild-type GRB2, N-terminal truncated GRB2, and C-terminal truncated GRB2 and p210 BCR / ABL were injected subcutaneously into the left flank of nude mice (4 mice per group). p210 Cells expressing only BCR / ABL (2 × 10 in 100 μl⁶Cells) were injected subcutaneously into the right hind limb of each mouse and served as a control in that individual. Mice were sacrificed 3 weeks after transplantation and tumor size was measured.
11.2.Result
The results shown in Table 3 clearly show that expression of GRB2 protein with no signaling ability reduces tumor cell growth in vivo.

12. Example:GR without signal transduction on ras activation Influence of B2
This example shows that GRB2 molecules without signal transduction described here inhibit ras activation induced by BCR / ABL in proportion to their transformation inhibitory activity. This suggests that the interaction with the transmission element (which leads to ras activation) is disrupted.
12.1.Materials and methods
Transcriptional activation of expression from the ras responsive element (ets / AP-1) promoter was performed by the method described in Section 9.1 above. Rat1 cell transformation, soft agar assay, and immunoblotting experiments were performed as described in Section 10.1 above.
12.2.Result
To examine whether the growth inhibitory effect of the GRB2 mutant is to inhibit ras activation, a lysate of Rat1-BCR / ABL cells overexpressing wild-type or mutant GRB2 was prepared. The ability to activate ras was examined. By using a ras-dependent transcriptional activation assay, lysates of Rat1-BCR / ABL cells expressing the N-terminal mutant GRB2 were 1 / 10-1 compared to controls transfected with empty vector. The low ras activation ability of / 15 was shown (FIG. 2). Lysates of cells expressing the C-terminal mutant GRB2 also showed reduced ras activation ability, although not as much as the N-terminal mutant. This difference in inhibitory effect between the N-terminal mutant and the C-terminal mutant was consistent with their ability to restore the BCR / ABL transformed phenotype.
If the GRB2 mutant protein blocks an intermediate step prior to ras in the signal transduction pathway, transformation with a gene that avoids ras activation should not be affected. To test this hypothesis, the GRB2 construct was transfected into Rat1 cells transformed with active raf. raf is a serine kinase that exhibits mitogenic action downstream of ras in the same signaling pathway (Kolch et al.,Nature.349: 426,1991). After selection with hygromycin, the cells were spread on agar. Rat1 / v-raf cells expressing N-terminal or C-terminal GRB2 mutants formed as many colonies as control cells transfected with empty vector in soft agar (Table 4). In addition, cell lines expressing the SH3 mutant more than twice as much as wild type GRB2 did not inhibit its own ability to grow in soft agar. These data suggest that the GRB2 mutant protein inhibits the BCR / ABL mitogenic signal by cleaving the signal transduction pathway upstream of raf.

13. Example:GRB2 mutant is human Ph ¹ Positive leukemia cell line K562 Inhibits proliferation and induces differentiation
In the Examples below, the SH3 mutant protein of GRB2 not only has the ability to restore the oncogenic phenotype of hematopoietic cells induced by BCR / ABL, but also the ability to cause differentiation of K562 cells to the erythroid system. It shows that there is.
13.1.Materials and methods
Transformation assay: The soft agar assay was performed by the method described in Section 8.1.1 above. 10 depending on the cloning efficiency of each cell type^Three~ 5 × 10^FourPiece / 6cm²The same number of viable cells were spread in soft agar with a density in the range of the dish. Samples were plated in duplicate on medium containing 20% fetal calf serum. The number of colonies (> 0.4 mm) visible with the naked eye after 14 days was counted. The total number of colonies is 10^FourIt adjusted so that it might become.
Transcription activation assayTranscriptional activation of expression from the: ras responsive element (ets / AP-1) promoter was performed according to the method described previously (Pendergast et al., 1993). Briefly, normal Rat1 cells and transformed Rat1 / BCR-ABL cells expressing GRB2 protein were transfected with 1 μg of pB4x-CAT reporter plasmid, and cells were harvested 48 hours after transfection, and CAT Activity was measured by the method described in Section 9.1.1.
Binding assays, in vitro autophosphorylation and immunoblotting Ng:
In vitro binding assay, in vitro [γ³²P] ATP labeling and immunoblotting methods were performed essentially as described in Sections 6.1.6 and 6.1.7 above.
Quantification of hemoglobin protein: The amount of hemoglobin present in the transfected K562 cells is essentially Feinstein et al., 1992,Oncogene  7:The amount was determined by the method described in 1853-1857. Briefly, lysates were prepared from each cell group and total protein was determined by the Bradford assay. For each sample, 20 μg of total cellular protein was mixed with a solution containing 1% benzidine in 90% acetic acid and freshly prepared hydrogen peroxide. After incubating at room temperature for 20 minutes, a 10% acetic acid solution was added, and the absorbance at 515 nm was measured. Human hemoglobin was used as a comparative control.
Tumor growth assay: Rat1 / BCR-ABL fibroblast tumorigenicity essentially consists of the previously described method (Lugo et al., 1989,Mo l Cell Biol.  9:1263-1270). Briefly, 2 × 10 from Rat1 / BCR-ABL fibroblast populations transfected with wild type or mutant GRB2 constructs.⁶Cells were taken and inoculated into the left hind flank of nude mice. As a control in that individual, Rat1 / BCR-ABL cells transfected with an empty vector were inoculated into the right hind flank of each mouse. Four mice were used for each Rat1 / BCY-ABL cell group. Three weeks after inoculation, the mice were sacrificed, the tumor sizes of the left and right flank were compared and recorded in wet weight (grams).
13.2.Result
In the following experiment, it was evaluated whether the SH3 mutant protein of GRB2 can restore the oncogenic phenotype induced by BCR / ABL in hematopoietic cells. GRB2 construct to Ph¹Introduced into positive K562 cells. After transfection and incubation for 48 hours in the presence of hygromycin, endogenous and transfected GRB2 protein was quantified by immunoblotting. At the same time, cells were collected from the liquid medium, and the same number of living cells were spread in soft agar. The level of the GRB2 mutant transfected in each experiment was at least 5 times greater than that of endogenous GRB2. Cultures containing K562 cells expressing the GRB2 N-terminal truncation mutant showed 1/10 the number of colonies compared to controls transfected with the empty vector (Table 2 above). Similar to that seen in Rat1 / BCR-ABL fibroblasts, the GRB2 C-terminal truncation mutant also inhibited K562 colony formation to a lesser extent than the N-terminal mutant (Table 2 above). These data strongly suggest that BCR-ABL-induced ras activation mediated by GRB2 is an essential element in BCR-ABL-induced human malignancies development.
The K562 cell line stably expresses high levels of wild-type GRB2 protein and, although it can be maintained in culture, a cell line derived from one clone that expresses an N-terminally or C-terminally truncated GRB2 protein. It was impossible to establish. K562 cells retain the ability to differentiate and synthesize hemoglobin (Anderson, L.C et al., 1979,Int.J.Cancer  twenty three: 143-147; Rowley, P.T., et al., 1981,Exp.Hematol.9:32-37; Feinstein, E. et al., 1992,Oncogene  7:1853-1857). Previous studies have shown that tyrosine kinase activity inhibitors can differentiate K562 cells into the erythroid system (Fukazawa, H. et al., 1991,Biochem.Pharm.,42: 1661-1671; Anafi, M. et al., 1993,Blood  82: 3524-3529).
To examine whether the expression of the GRB2 mutant causes a similar differentiation process, a portion of the transfected K562 cells used in the soft agar assay were taken and lysed, and the amount of hemoglobin protein was determined for each cell group. did. A dramatic increase in the amount of hemoglobin protein was observed in cells expressing N-terminal truncated or C-terminal truncated mutants. In contrast, K562 cells expressing high levels of wild-type GRB2 protein did not show increased hemoglobin compared to controls transfected with the empty vector. Thus, the GRB2 mutant used here not only reverts the BCR / ABL transformation phenotype but also has the ability to differentiate K562 cells into the erythroid lineage. These data suggest that BCR-ABL can transform hematopoietic cells by partially blocking normal differentiation in a ras-dependent manner.
13.Example: Protein / tyrosine kinase interaction Screening assays to identify compounds that interfere
The examples presented here describe means for assaying the potential of a test substance to inhibit its interaction with a complex that is a binding partner. Such binding partners can include, for example, adapter proteins and molecules that bind to such adapter proteins, such as activated tyrosine kinase molecules, as well as other proteins, such as SHC proteins. The compounds identified in this example may be able to modulate cell growth control and may modulate tumorigenesis as well as cell proliferative diseases.
In the specific assay described here, an adapter-GST fusion protein capable of binding to a phosphorylated tyrosine kinase protein is immobilized in the presence of a test substance together with a phosphorylated tyrosine kinase protein immobilized on a solid phase. Incubate. If the test substance can inhibit the interaction between the adapter protein-GST fusion protein and the tyrosine kinase molecule, the amount of adapter-GST fusion protein bound to the immobilized tyrosine kinase molecule is not present. In some cases, the amount of adapter-GST fusion protein that binds to the tyrosine kinase molecule is reduced to a detectable extent.
Such an example is illustrated in detail regarding screening for substances that inhibit the interaction between GRB-2 and EGF-R. However, the same principle is applied to a substance that inhibits the interaction between any tyrosine kinase protein or tyrosine phosphorylated substrate of tyrosine kinase (eg, SHC, phosphatase 1D) and an adapter protein that can interact with this protein. It can also be applied when detecting.
Adapter-GST fusion protein:
The adapter-GST (glutathione-S-transferase) fusion protein used here was a GRB-2-GST fusion protein produced by expression in E. coli transformed with the GRB-2 / pGEX construct. The GRB-2 portion of such a fusion protein was composed only of the SH2 domain of the GRB-2 protein. Transformed cells are grown in luria broth (LB) supplemented with ampicillin. After the OD (optical density) at 600 nm reaches 0.3, the cells are induced with isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) for 6 hours to express the induced protein.
After a 6 hour speech period, cells were pelleted, pelleted at 10,000 × g for 10 minutes at 4 ° C., washed and resuspended in phosphate buffered saline (PBS). The cells were then disrupted by sonication (6 strokes, 5 seconds / stroke). Insoluble material was removed by centrifugation at 10,000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the resulting supernatant was passed through a glutathione-Sepharose column. The bound GRB-2-GST fusion protein was eluted from the column with 5 mM reduced glutathione and dialyzed against PBS.
Immobilized tyrosine kinase molecule:
The tyrosine kinase molecule used here is epidermal growth factor receptor tyrosine kinase (EGF-R). EGF-R is isolated from cells that overexpress EGF-R, such as the A431 (ATCC CRL 1551) cell line. Cells were washed with HNTG buffer (20 mM Hepes / HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1.0% Triton X-100; 5% glycerol; 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mg / L aprotonin, 1 mg / L leupeptin; 10 mg / L benzamidine).
The EGF-R protein is isolated from the cell lysate by immobilization on a microtiter plate as described below. Thereafter, EGF-R is phosphorylated in vitro as described below.
Immobilization of EGF-R molecules on a microtiter plate. In preparing the microtiter plate, first, the well of the plate was anti-EGF-R monoclonal antibody (UBI, # 05-101) (in PBS) induced against the extracellular domain of EGFR overnight at 4 ° C. Concentration: 0.5 μg / well in a final volume of 150 μl / well).
After overnight coating, remove the coating solution from the wells of the microtiter plate, and instead add blocking buffer (5% dry milk in PBS) and leave at room temperature for 30 minutes, then remove the blocking buffer. Remove and wash wells 4 times with TBST buffer (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7.2; 0.1% Triton X-100).
Cell lysates of EGF-R expressing cells are added to each well as a solution in 150 μl PBS and incubated for 30 minutes with shaking at room temperature. Unbound EGF-R is removed by washing the wells 5 times with TBST buffer. Approximately 50-100 ng of EGF-R protein binds per well.
It is important to use cell lines with high endogenous phosphatase activity that overexpress EGF-R, such as the A431 cell line. This is because, during cell lysis and incubation with the immobilized antibody, the phosphate group is removed from the EGF-R molecule by phosphatase, and an endogenous adapter protein, such as the GRB protein, binds to EGFR and is sometimes artificial. This is because a result is prevented. Also, if the cell line used can be easily starved, the cells can be starved before cell lysis.
Creation of autophosphorylated EGF-R:
Autophosphorylated EGF-R was obtained by the in vitro kinase reaction described below. The kinase reaction is 15 μl of ATP / Mn²⁺Mix (50mM MnCl₂The final concentration was 10 μM ATP, total volume 150 μl). The plate was incubated at room temperature for 5 minutes with shaking, the supernatant was aspirated and the plate was then washed 5 times with TBST.
Assay procedure:
30 ng of GRB-2-GST fusion protein (ie 1: 1 ratio of EGF-R: GRB-2 protein) or 5 ng of GRB-2-GST fusion protein (ie EGF-R: GRB-2 protein 4: 1) in microtiter plate wells coated with phosphorylated EGF-R in incubation buffer (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 6.5) for 30 minutes at room temperature In the presence of a test substance dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO). Control wells are incubated with the GRB-2-GST fusion protein without the test substance.
After incubation, the wells are thoroughly washed with TBST. Next, the amount of GRB-2-GST fusion protein bound to immobilized EGF-R is measured, preferably using purified rabbit antiserum (AMRAD, Australia, New Victoria, catalog number 00001605) against the GST portion of the fusion protein. To do. Incubation is for 30 minutes at room temperature. After incubation, the antibody is removed and the wells are washed thoroughly with TBST. The wells are then incubated with TAGO goat anti-rabbit peroxidase antibody for 30 minutes at room temperature to make the results visible. After incubation, the antibody is removed and the wells are washed with tap water and then with TBST. ABTS (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid)) / H as substrate solution₂O₂(1.2 μl H for 10 ml ABST₂O₂) Is added to the wells and incubated for 20 minutes at room temperature. 5NH₂SO_FourThe reaction is stopped by adding. The OD at 410 nm is measured for each well. When this method is used, detection is possible even when GRB-2-GST is as small as 2 ng with respect to the background.
In addition, the test substance and GRB-2-GST fusion protein are incubated in EGF-R wells, and then the binding of the fusion protein is assayed using a biotinylated monoclonal antibody such as EL-6 or EL-12. You can also. The epitope recognized by such antibodies is located in the SH2 domain of GRB-2 but does not interfere with the binding of GRB-2 to phosphorylated EGFR. The binding of these antibodies is then measured using a streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase reactant.
Furthermore, after incubating the test substance in the EGF-R well of the GRB-2-GST fusion protein, the assay for binding of the fusion protein to immobilized EGFR was performed in 1 mM 1-chloro-incubation buffer. It can also be carried out by incubating with 2,4-dinitrobenzene (CDNB) and 1.54 mg / ml reduced glutathione. Next, OD is measured at 340 nm. The reaction is linear until the OD is 1.0, using competitive GST inhibitors, Mannervik and Danielson, UH, 1988, CRC Critical Reviews in Biochemistry 23: 238 Can be stopped as described in.
Obviously, many modifications and variations may be made to the invention described herein without departing from the spirit and scope of the invention. The particular embodiments described above are provided by way of example only and the present invention is limited only by the terms of the appended claims.

Claims (71)

A method for identifying a compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder involving a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprising:
(A) exposing at least one compound to a peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex for a time sufficient to bind the compound to the functional portion of the member; ,
(B) removing unbound compound and (c) detecting the presence of the compound bound to the functional portion of a member of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex, thereby detecting the protein tyrosine kinase polypeptide / Identifying a compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder in which the adapter polypeptide complex is involved;
A method comprising that. A method for identifying a compound capable of modulating a cell proliferative disorder involving a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprising the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex Exposing to a sufficient time to disrupt the complex and detecting the disruption of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a transmembrane receptor protein tyrosine kinase polypeptide. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is an intracellular cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide. 5. The method of claim 4, wherein the intracellular cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide is a cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide in BCR / ABL cells. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a protein tyrosine kinase polypeptide intracellular nuclear protein tyrosine kinase polypeptide. The method according to claim 1 or 2, wherein the adapter polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a GRB polypeptide. 8. The method of claim 7, wherein the GRB polypeptide is a GRB-2 polypeptide. 8. The method of claim 7, wherein the GRB polypeptide is a GRB-1, GRB-4, GRB-7 or GRB-10 polypeptide. The protein tyrosine kinase polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide in BCR / ABL cells, and the adapter tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is GRB The method according to claim 1 or 2, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a BCR / ABL polypeptide / adapter polypeptide complex. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a peptide having at least one phosphorylated tyrosine amino acid residue. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional portion of a phosphorylated domain. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional portion of an SH2 domain. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the peptide comprising a functional part of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional part of an SH3 domain. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises at least 4 consecutive amino acid residues of the SH2 binding domain. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the peptide comprising a functional part of a member of a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional part of an SH3 binding domain. 17. The method of claim 16, wherein the functional portion of the SH3 binding domain has a chain length of at least 4 amino acid residues. 17. The method of claim 16, wherein the functional portion of the SH3 binding domain has a chain length of at least 10 amino acid residues. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the identified compound further has the ability to disrupt a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex. A compound capable of destroying a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex further has the ability to modulate a cell proliferative disorder in which the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is involved. Item 3. The method according to Item 1 or 2. 21. The method of claim 20, wherein the identified compound further has the ability to disrupt a BCR / ABL polypeptide / GRB-2 polypeptide complex. The ability of a compound having the ability to disrupt a BCR / ABL polypeptide / GRB-2 polypeptide complex to further modulate a cell proliferative disorder in which the BCR / ABL polypeptide / GRB-2 polypeptide complex is involved The method of claim 21, comprising: 23. The method of claim 22, wherein the cell proliferative disorder is chronic myelogenous leukemia. 23. The method of claim 22, wherein the cell proliferative disorder is acute lymphocytic leukemia. 23. The method of claim 22, wherein the cell proliferative disorder is acute myeloid leukemia. A method of identifying a compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder involving a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprising:
(A) exposing at least one compound to a peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex for a time sufficient to bind the compound to the functional portion of the member; ,
(B) removing unbound compound and (c) detecting the presence of the compound bound to the functional portion of a member of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex, thereby producing a protein tyrosine phosphatase polypeptide / Identifying a compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder in which the adapter polypeptide complex is involved;
A method comprising that. A method for identifying a compound capable of modulating a cell proliferative disorder in which a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is involved, comprising the compound tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex Exposing the complex to a time sufficient to disrupt the complex and detecting the disruption of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the protein tyrosine phosphatase polypeptide of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is a transmembrane receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the protein tyrosine phosphatase polypeptide of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is an intracellular cytoplasmic protein tyrosine phosphatase polypeptide. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the adapter polypeptide of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is a GRB polypeptide. 32. The method of claim 30, wherein the GRB polypeptide is a GRB-2 polypeptide. 32. The method of claim 30, wherein the GRB polypeptide is a GRB-1, GRB-4, GRB-7 or GRB-10 polypeptide. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a peptide having at least one phosphorylated amino acid residue. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional portion of an SH2 domain. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional portion of an SH3 domain. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises at least 4 consecutive amino acid residues of the SH2 binding domain. 28. The method of claim 26 or 27, wherein the peptide comprising a functional portion of a member of a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprises a functional portion of an SH3 binding domain. 38. The method of claim 37, wherein the functional portion of the SH3 binding domain has a chain length of at least 4 amino acid residues. 38. The method of claim 37, wherein the functional portion of the SH3 binding domain has a chain length of at least 10 amino acid residues. A method of identifying a compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder involving a transmembrane receptor protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex comprising:
(A) a receptor protein tyrosine kinase polypeptide of a receptor protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex, wherein the compound is capable of forming a receptor tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex; For a period of time sufficient to bind the compound to
(B) detecting the level of receptor protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex present in the cell of step (a);
(C) detecting the level of a receptor protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex present in a cell of the type of step (a) not in contact with the compound, and (d) detecting in step (b) Comparing the level of the receptor protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex determined to the level detected in step (c), wherein the level detected in step (c) ), The compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder in which the receptor protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is involved is identified.
A method comprising that. A method of identifying a compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder involving a transmembrane receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex comprising:
(A) a receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide of the receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex with the compound and cells capable of forming a receptor tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex; For a period of time sufficient to bind the compound to
(B) detecting the level of receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex present in the cells of step (a);
(C) detecting the level of a receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex present in a cell of the type of step (a) not in contact with the compound, and (d) detecting in step (b) Comparing the level of the receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex determined to the level detected in step (c), wherein the level detected in step (c) ), The compound to be tested for the ability to modulate a cell proliferative disorder in which the receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is involved is identified.
A method comprising that. 42. The method of claim 40 or 41, wherein the adapter polypeptide is a GRB polypeptide. 43. The method of claim 42, wherein the GRB polypeptide is a GRB-2 polypeptide. 43. The method of claim 42, wherein the GRB polypeptide is a GRB-1, GRB-4, GRB-7 or GRB-10 polypeptide. A method for modulating a cell proliferative disorder involving a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex in vitro, wherein the cell is capable of forming a protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex Contacting with a sufficient amount of the compound to disrupt the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex of the cell such that a cell proliferative disorder is modulated. The cell proliferative disorder protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is involved in a non-human mammal to a method for modulating, in a non-human mammal, so that the cell proliferative disorder is modulated Administering a sufficient amount of the compound to disrupt the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex. 47. The method of claim 45 or 46, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a transmembrane receptor protein tyrosine kinase polypeptide. 47. The method of claim 45 or 46, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is an intracellular cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide. 49. The method of claim 48, wherein the intracellular cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide is a cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide in BCR / ABL cells. 47. The method of claim 45 or 46, wherein the protein tyrosine kinase of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a nuclear protein tyrosine kinase polypeptide in a polypeptide cell. 47. The method of claim 45 or 46, wherein the adapter polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a GRB polypeptide. 52. The method of claim 51, wherein the GRB polypeptide is a GRB-2 polypeptide. 52. The method of claim 51, wherein the GRB polypeptide is a GRB-1, GRB-4, GRB-7 or GRB-10 polypeptide. The protein tyrosine kinase polypeptide of the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a cytoplasmic protein tyrosine kinase polypeptide in BCR / ABL cells, and the adapter tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is GRB 47. A method according to claim 45 or 46, wherein the protein tyrosine kinase polypeptide / adapter polypeptide complex is a BCR / ABL polypeptide / adapter polypeptide complex. 55. The method of claim 54, wherein the cell proliferative disorder that is modulated is chronic myelogenous leukemia. 55. The method of claim 54, wherein the cell proliferative disorder that is modulated is acute lymphocytic leukemia. 55. The method of claim 54, wherein the cell proliferative disorder that is modulated is acute myeloid leukemia. A method for modulating a cell proliferative disorder involving a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex in vitro, wherein the cell is capable of forming a protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex Contacting with a sufficient amount of the compound to disrupt the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex of the cell such that a cell proliferative disorder is modulated. The cell proliferative disorder protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is involved in a non-human mammal to a method for modulating, in a non-human mammal, so that the cell proliferative disorder is modulated Administering a sufficient amount of the compound to disrupt the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex. 60. The method of claim 58 or 59, wherein the protein tyrosine phosphatase polypeptide of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is a transmembrane receptor protein tyrosine phosphatase polypeptide. 60. The method of claim 58 or 59, wherein the protein tyrosine phosphatase polypeptide of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is an intracellular cytoplasmic protein tyrosine phosphatase polypeptide. 60. The method of claim 58 or 59, wherein the adapter polypeptide of the protein tyrosine phosphatase polypeptide / adapter polypeptide complex is a GRB polypeptide. 64. The method of claim 62, wherein the GRB polypeptide is a GRB-2 polypeptide. 60. The method of claim 58 or 59, wherein the GRB polypeptide is a GRB-1, GRB-4, GRB-7 or GRB-10 polypeptide. Isolated BCR / ABL polypeptide / GRB-2 adapter polypeptide complex. An assay for identifying a substance that blocks a specific interaction between a first binding partner molecule and a second binding partner molecule, comprising:
(A) a protein or peptide comprising an amino acid sequence corresponding to the binding domain of the first binding partner molecule, and a protein or peptide comprising an amino acid sequence corresponding to the binding domain of the second binding partner molecule, Contacting in the presence of a test substance under conditions and for a time sufficient to bind two binding partner molecules to form a binding partner complex, and (b) detecting the formation of the complex, The ability of the test substance to block the interaction between the first binding partner and the second binding partner is due to a decrease in complex formation when compared to the amount of complex formed in the absence of the test substance. Indicated,
An assay comprising: 68. The assay of claim 66, wherein the binding domain of the first binding partner molecule is an SH2 binding domain and the binding domain of the second binding partner molecule is an SH2 domain. 68. The assay of claim 66, wherein the first binding partner molecule is an activated tyrosine kinase molecule and the second binding partner molecule is an adapter protein molecule. 69. The assay of claim 68, wherein the activated tyrosine kinase molecule is an activated BCR-ABL molecule and the adapter protein molecule is a GRB-2 molecule. 68. The assay of claim 66, wherein one binding partner molecule of the complex is immobilized and the other binding partner molecule is labeled with a signal generating compound. 71. The assay of claim 70, wherein one binding partner molecule of the complex is immobilized prior to step (a), and thus contacting in step (a) occurs in the solid-liquid phase.

Images