JP3621277B2

JP3621277B2 - Protein Synamon

Info

Publication number: JP3621277B2
Application number: JP32565798A
Authority: JP
Inventors: 義美高井; 裕畑; 育子矢尾; 和世水口
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1998-11-16
Publication date: 2005-02-16
Anticipated expiration: 2018-11-16
Also published as: JP2000184884A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、神経シナプス結合後部の構成分子ＳＡＰＡＰに特異的に結合する蛋白質ｐ３１０３に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用な新規の蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序ある細胞接着とそれに引き続く細胞間の情報交換を支える細胞間結合の成立、さらにその細胞間結合を通じて受け渡しされる情報に基づいて引き起こされる細胞の分化といった一連の生命現象の時系制御が極めて重要である。
【０００３】
多細胞生物に認められる細胞間結合には多くの共通性が存在するが、一方で、細胞の種類による特異性も存在し、とくに神経シナプス結合は他の細胞間結合とは大きく異なる特徴を有している。第一に、神経シナプス結合は極性を有し、その前部と後部では構造が著しく異なる。前シナプス膜は神経伝達物質の放出に関わる構造を有するのに対し、後シナプス膜はｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｄｅｎｓｉｔｙ（ＰＳＤ）と呼ばれる特異な細胞骨格構造を有している（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３，７３２−７３７，１９９３；ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０，２６４−２６８，１９９７）。第二には、神経シナプス結合は一度成立した後にも神経刺激伝達に伴い結合の性状の変化（可塑性）を示すということである。この可塑性は、記憶・学習のメカニズムの基本を成す現象であると考えられており、正に神経シナプス結合を他の細胞間結合から際立たせる特徴である。可塑性のメカニズムの詳細は未だ明らかでないが、神経シナプス結合の前部に依存する前シナプス可塑性と、後部に依存する後シナプス可塑性の存在が知られている。いずれにしても神経シナプス結合の特徴的な構造が深く関与していることが予測され、この構造の解明が可塑性のメカニズム、さらには記憶・学習のメカニズム解明に必須であると考えられている。
【０００４】
効果的な神経伝達のためには、後シナプス膜において神経伝達物質受容体が正確な位置に存在することが必要であり、そのためにＰＳＤｓが重要な役割を果たしている。最近の研究から、ＰＳＤｓにおいて様々な受容体の蓄積とクラスタリングに機能する幾つかの分子が同定されている。例えば、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０とそのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）はＮＭＤＡ受容体およびＳｈａｋｅｒ型Ｋ^＋チャネルに結合し（例えば、Ｎｅｕｒｏｎ９，９２９−９４２，１９９３）、またＧＲＩＰおよびＨｏｍｅｒはＡＭＰＡ受容体と代謝性グルタミン酸受容体にそれぞれ結合する（Ｎａｔｕｒｅ３８６，２７９−２８４，１９９７；Ｎａｔｕｒｅ３８６，２８４−２８８，１９９７）ことが知られている。これら分子の共通の特徴は、それらが、蛋白質−蛋白質相互作用のためのモジュールＰＤＺドメインを有するということである（例えば、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０，１０２−１０３，１９９５；ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０，３５０，１９９５；Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，１３８５−１３８８，１９９６；Ｎｅｕｒｏｎ１７，５７５−５７８，１９９６）。
【０００５】
ＰＤＺドメインは最初、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０の約９０アミノ酸の繰り返しとして見出され、その後、３つの蛋白質［ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ）のｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ腫瘍抑制蛋白質Ｄｌｇ−Ａ、ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎ蛋白質ＺＯ−１）に含まれることからＰＤＺと命名された（Ｎｅｕｒｏｎ９，９２９−９４２，１９９２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，４５８０−４５８３，１９９３；Ｃｅｌｌ６６，４５１−４６４，１９９１；Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２１，４９１−５０２，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，７８３４−７８３８，１９９３）。このＰＤＺドメインは様々な蛋白質のＣ末端配列に結合する。すなわち、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０の第１および第２のＰＤＺドメインはＮＭＤＡ受容体およびＳｈａｋｅｒ型Ｋ^＋チャネルと結合する（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９，１７３７−１７４０，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ３７８，８５−８８，１９９５）。第３のＰＤＺドメインはニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎｓ）と呼ばれる神経細胞接着分子の細胞質ドメインと結合する（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７，１５１１−１５１５，１９９７）。また、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０はＮ末端のディサルフィド結合を介してホモダイマーを形成する（Ｎｅｕｒｏｎ１８，８０３−８１４，１９９７）。
【０００６】
ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０は、ＰＤＺドメインの他に１つのＳＨ３ドメインと１つのグアニル酸キナーゼ（ＧＫ）ドメインを有している。ＳＨ３ドメインはｓｒｃチロシンキナーゼのシグナル伝達モジュールとして規定されていたが、その後他の多くの蛋白質でも同定されている（Ｃｅｌｌ８０，２３７−２４８，１９９５）。ただし、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０におけるＳＨ３ドメインの機能は不明である。ＧＫドメインは酵母グアニル酸キナーゼと相同であり、様々な膜関連蛋白質に存在する。これらの蛋白質は特定の膜構造を維持していると考えられており、膜関連グアニル酸キナーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｕａｎｙｌａｔｅｋｉｎａｓｅ：ＭＡＧＵＫ）と命名されている（Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４４，８５−８９，１９９３；Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，３８２−３８４，１９９６）。
【０００７】
近年、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０のＧＫドメインと相互作用する分子が３つの研究グループによって同定され、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと命名されている（Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３６，６６９−６７８，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１１９４３−１１９５１，１９９７；ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ２，４１５−４２４，１９９７；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，５６８７−５６９６，１９９７）。これらの分子のうち、ＳＡＰＡＰ（１，２）はこの出願の発明者らが見出した分子であり、既に特許出願している（特願平９−１１７１４、９−１１７１５）。またこの出願の発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞においては、このＳＡＰＡＰが細胞膜と強固に結合し、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０を細胞膜に移行させることを見出してもいる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１１９４３−１１９５１，１９９７）。
【０００８】
そしてさらにこの出願の発明者等は、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与するＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する分子を見出している。このＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰ結合分子はＭＡＧＵＫの構造を有し、Ｎ末端のＧＫドメインと２つのＷＷドメインおよび５つのＰＤＺドメインを有し、ＧＫドメインを介してＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに結合し、ＰＤＺドメインを介してＮＭＤＡ受容体およびニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎｅ）に結合する。そして、この蛋白質はシナプス結合の受容体および細胞接着蛋白質を統合させることから、Ｓ−ＳＣＡＭ（ｓｙｎａｐｔｉｃｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ）と命名され、既に特許出願されている（特願平１０−３０２２３９号）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者らおよびその他の研究グループから提出された様々な知見により、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰはＰＳＤがＰＳＤ形成における中核的な蛋白質であることが明らかにされている。そして、このＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰはＰＳＤ−９５およびＳ−ＳＣＡＭという２つのｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎをＰＳＤに固定していることも示されている。しかしながら、ＰＳＤ形成の全貌を解明するためには、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと結合するさらに別の新規分子を特定することが不可欠である。
【００１０】
また、このような分子の同定とその機能の解明は、ヒトの記憶・学習といった高次脳機能の理解に大きな前進をもたらすばかりか、この分子あるいはこの分子の活性、作用に影響する様々な物質、化合物等は、中枢神経系の機能的または構造的障害を原因とする様々な神経疾患の原因解明、並びにそれら疾患の診断、予防および治療法等の開発に大きく寄与するものと期待される。
【００１１】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与する重要な役割を果たしているＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する未知分子を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決する発明として、配列番号１のアミノ酸配列を有するラット蛋白質ｐ３１０３を提供する。
この出願はまた、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するラット蛋白質ｐ３１０３を提供する。
【００１３】
この出願はさらに、前記のラット蛋白質ｐ３１０３をコードするラット遺伝子と、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの一部配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
またこの出願は、前記のｃＤＮＡまたはＤＮＡ断片を保有する組換えベクターと、前記のラット蛋白質ｐ３１０３に対する抗体を提供する。
【００１４】
さらにまた、この出願は、配列番号１と相同のアミノ酸配列を有し、前記のラット蛋白質ｐ３１０３と同一の機能を有する動物性蛋白質、この動物性蛋白質をコードする動物遺伝子、およびこの動物遺伝子のｃＤＮＡを提供する。
この発明によって提供される蛋白質ｐ３１０３は、ｙｅａｓｔｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法を用いてＳＡＰＡＰ１との相互作用分子を探索した結果単離された新規分子であり、ＳＨ３ドメインおよびＰＤＺドメインを有する神経特異的なおよび蛋白質分子である。
【００１５】
なお、コンピューターによるホモロジー検索の結果、これらの蛋白質は新規蛋白質であることが確認されている。
以下、この発明の蛋白質ｐ３１０３について実施の形態を詳しく説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明のラット蛋白質ｐ３１０３は、配列番号２に塩基配列を示したｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号１のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、ＳＨ３ドメイン（アミノ酸番号５５４−６１３）およびＰＤＺドメイン（アミノ酸番号６５４−７４９）が含まれている。
【００１７】
また、ノザン解析の結果、図１に示したように、この蛋白質はラットの脳でのみ発現していることが確認されている。
この蛋白質ｐ３１０３は公知の方法、すなわちラットの脳から単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってｐ３１０３を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、ｃＤＮＡがコードするｐ３１０３を大量に発現させることができる。
【００１８】
この発明の蛋白質ｐ３１０３を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を挿入結合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ｃＤＮＡがコードしているｐ３１０３を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードするタンパク質部分のみを取得することもできる。
【００１９】
この発明のラット蛋白質ｐ３１０３を動物細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入すれば、この発明のＨ３７タンパク質を動物細胞内で発現できる。
以上のとおり方法によって得られるラット蛋白質ｐ３１０３は、例えば、この蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。
【００２０】
この発明の遺伝子は、上記の蛋白質ｐ３１０３をコードするラットの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーをスクリーニングから単離することができる。
【００２１】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有することを特徴とするものであり、この発明の前記蛋白質ｐ３１０３をコードしている。この発明の蛋白質ｐ３１０３は少なくともラットの脳組織で発現しているので、配列番号２の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００２２】
一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれる。
同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされているタンパク質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明に含まれる。
【００２３】
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）、あるいはそれらのアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
この発明の蛋白質ｐ３１０３に対する抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２４】
この発明の動物遺伝子は、ラット以外の哺乳動物の遺伝子であって、前記のラット蛋白質ｐ３１０３と同一の機能を有する動物性蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子は、例えば、この発明のｃＤＮＡをプローブとして様々な動物種のｃＤＮＡライブラリーから相同のｃＤＮＡを単離し、さらにこのｃＤＮＡをプローブとしてゲノムライブラリーから単離することができる。また、このｃＤＮＡを微生物、動物細胞または植物細胞等で発現させることにより、ｐ３１０３と同一の機能を有する動物性蛋白質を得ることができる。
【００２５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の蛋白質ｐ３１０３は神経シナプス結合後部におけるＰＳＤ形成に重要な役割を果たしている蛋白質ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する新規な蛋白質であり、この蛋白質はヒトをはじめとする動物の神経系の発生や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用である。
【００２６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ３１０３の組織分布を調べたノーザンブロット分析の結果である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein p3103 that specifically binds to a constituent molecule SAPAP at the back of the neural synapse connection. More specifically, the present invention relates to the elucidation of mechanisms such as the formation and development of human nervous system, memory, learning, etc., as well as the diagnosis, prevention, and prevention of various neurological diseases caused by functional or structural disorders of the nervous system The present invention relates to a novel protein useful for technological development for treatment.
[0002]
[Prior art]
The maintenance of normal functions of humans and other multicellular organisms is caused by the formation of cell-cell connections that support ordered cell adhesion and the subsequent exchange of information between cells, as well as the information passed through the cell-cell connections. Time series control of a series of life phenomena such as cell differentiation is extremely important.
[0003]
There are many commonities among the cell-to-cell connections found in multicellular organisms, but there are also specificities depending on the cell type, and in particular, neural synaptic connections have characteristics that are very different from other cell-to-cell connections. doing. First, neural synaptic connections are polar, and their structures are significantly different at the front and back. The presynaptic membrane has a structure related to neurotransmitter release, whereas the postsynaptic membrane has a specific cytoskeletal structure called postsynthetic density (PSD) (Curr. Opin. Neurobiol. 3, 732-). 737, 1993; Trends Neurosci. 20, 264-268, 1997). The second is that neural synaptic connections, once established, show a change in the properties of the connection (plasticity) with nerve stimulation transmission. This plasticity is considered to be a phenomenon that forms the basis of the memory / learning mechanism, and is a feature that makes neural synaptic connections stand out from other intercellular connections. Although details of the mechanism of plasticity are not yet clear, it is known that presynaptic plasticity depends on the anterior part of neural synaptic connections and posterior synaptic plasticity depends on the posterior part. In any case, it is predicted that the characteristic structure of neural synaptic connection is deeply involved, and it is considered that the elucidation of this structure is essential for the elucidation of the plasticity mechanism and the memory / learning mechanism.
[0004]
Effective neurotransmission requires the presence of neurotransmitter receptors at the correct location in the post-synaptic membrane, and PSDs play an important role. Recent studies have identified several molecules that function in the accumulation and clustering of various receptors in PSDs. For example, PSD-95 / SAP90 and its isoforms bind to NMDA receptors and Shaker-type K ⁺ channels (eg, Neuron 9, 929-942, 1993), and GRIP and Homer metabolize with AMPA receptors. It is known to bind to sex glutamate receptors (Nature 386, 279-284, 1997; Nature 386, 284-288, 1997). A common feature of these molecules is that they have a modular PDZ domain for protein-protein interactions (eg, Trends Biochem. Sci. 20, 102-103, 1995; Trends Biochem. Sci. 20). , 350, 1995; Curr. Biol. 6, 1385-1388, 1996; Neuron 17, 575-578, 1996).
[0005]
The PDZ domain was first found as a repeat of about 90 amino acids of PSD-95 / SAP90, after which the three proteins [PSD-95 / SAP90, Drosophila discs-large tumor suppressor protein Dlg-A, height junction (Neuron 9, 929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268, 4580-4583, 1993; Cell 66, 451-464, 1991; J. Biol. Chem. Cell Biol.121, 491-502, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90, 7834-7838, 1993). This PDZ domain binds to the C-terminal sequence of various proteins. That is, the first and second PDZ domains of PSD-95 / SAP90 bind to NMDA receptors and Shaker-type K ⁺ channels (Science 269, 1737-1740, 1995; Nature 378, 85-88, 1995). The third PDZ domain binds to the cytoplasmic domain of a neural cell adhesion molecule called neuroligins (Science 277, 1511-1515, 1997). PSD-95 / SAP90 forms a homodimer via an N-terminal disulfide bond (Neuron 18, 803-814, 1997).
[0006]
PSD-95 / SAP90 has one SH3 domain and one guanylate kinase (GK) domain in addition to the PDZ domain. The SH3 domain has been defined as the signal transduction module of the src tyrosine kinase, but has since been identified in many other proteins (Cell 80, 237-248, 1995). However, the function of the SH3 domain in PSD-95 / SAP90 is unknown. The GK domain is homologous to yeast guanylate kinase and is present in various membrane-related proteins. These proteins are thought to maintain a specific membrane structure and are named membrane-associated guanylate kinase (MAGUK) (Mech. Dev. 44, 85-89, 1993). Curr. Biol. 6, 382-384, 1996).
[0007]
Recently, molecules that interact with the GK domain of PSD-95 / SAP90 have been identified by three research groups and named GKAP / SAPAP / DAP (J. Cell Biol. 136, 669-678, 1997; Biol.Chem.272, 11943-1951, 1997; Genes Cells 2, 415-424, 1997; J. Neurosci. 17, 5687-5696, 1997). Among these molecules, SAPAP (1, 2) is a molecule found by the inventors of this application, and has already been applied for a patent (Japanese Patent Application Nos. 9-11714 and 9-111715). The inventors of this application have also found that in HEK293 cells, this SAPAP binds tightly to the cell membrane and transfers PSD-95 / SAP90 to the cell membrane (J. Biol. Chem. 272, 11943). -11951, 1997).
[0008]
Furthermore, the inventors of this application have found a molecule that specifically binds to GKAP / SAPAP / DAP that is involved in PSD formation at the back of neural synaptic connections. This GKAP / SAPAP / DAP binding molecule has a MAGUK structure, has an N-terminal GK domain, two WW domains, and five PDZ domains, and binds to GKAP / SAPAP / DAP via the GK domain. It binds to NMDA receptors and neuroligines through the domain. Since this protein integrates a receptor for synaptic binding and a cell adhesion protein, it has been named S-SCAM (synthetic scaffolding molecule) and has already been filed for a patent (Japanese Patent Application No. 10-302239).
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
Various findings submitted by the inventors of this application and other research groups have revealed that GKAP / SAPAP / DAP is a core protein in PSD formation. This GKAP / SAPAP / DAP also shows that two scaffolding proteins, PSD-95 and S-SCAM, are fixed to the PSD. However, to elucidate the full picture of PSD formation, it is essential to identify additional new molecules that bind to GKAP / SAPAP / DAP.
[0010]
In addition, the identification of such molecules and the elucidation of their functions not only make great progress in understanding higher brain functions such as human memory and learning, but also various substances that affect the activity and action of this molecule or this molecule. Compounds and the like are expected to greatly contribute to elucidation of the causes of various neurological diseases caused by functional or structural disorders of the central nervous system, and development of diagnosis, prevention and treatment methods for these diseases.
[0011]
The present invention has been made in view of the circumstances as described above, and provides an unknown molecule that specifically binds to GKAP / SAPAP / DAP that plays an important role in the formation of PSD at the back of neural synaptic connections. The purpose is that.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
This invention provides a rat protein p3103 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an invention for solving the above problems.
This application also provides rat protein p3103 having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added.
[0013]
This application further provides a rat gene encoding the aforementioned rat protein p3103, a cDNA of this gene, a cDNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2, and a DNA fragment comprising a partial sequence of this cDNA.
This application also provides a recombinant vector carrying the cDNA or DNA fragment and an antibody against the rat protein p3103.
[0014]
Furthermore, this application includes an animal protein having an amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 1 and having the same function as the rat protein p3103, an animal gene encoding the animal protein, and a cDNA of the animal gene I will provide a.
The protein p3103 provided by the present invention is a novel molecule isolated as a result of searching for molecules interacting with SAPAP1 using the yeast two-hybrid method, and is a nerve-specific and protein having an SH3 domain and a PDZ domain Is a molecule.
[0015]
As a result of computer-based homology search, it has been confirmed that these proteins are novel proteins.
Hereinafter, embodiments of the protein p3103 of the present invention will be described in detail.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The rat protein p3103 of the present invention is a protein encoded by the cDNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. This amino acid sequence includes an SH3 domain (amino acid numbers 554-613) and a PDZ domain (amino acid numbers 654-749).
[0017]
As a result of Northern analysis, as shown in FIG. 1, it was confirmed that this protein is expressed only in the rat brain.
This protein p3103 is assembled using a known method, that is, a method of isolating from rat brain, a method of preparing a peptide by chemical synthesis based on the amino acid sequence provided by the present invention, or a cDNA fragment provided by the present invention. It can be obtained by a method of production using a replacement DNA technique. For example, when p3103 is obtained by recombinant DNA technology, it can be expressed in vitro by preparing RNA by in vitro transcription from a vector having the cDNA fragment of the present invention and performing in vitro translation using this as a template. In addition, if the translation region is recombined into an appropriate expression vector by a known method, a large amount of p3103 encoded by the cDNA can be expressed in Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells and the like.
[0018]
When the protein p3103 of the present invention is expressed in a microorganism such as Escherichia coli, the translation region of the cDNA of the present invention is added to an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a cDNA cloning site, a terminator and the like that can replicate in the microorganism. A recombinant expression vector is prepared by inserting and binding a host cell. After transformation of a host cell with this expression vector, the resulting transformant is cultured to produce a large amount of p3103 encoded by the cDNA in a microorganism. can do. Alternatively, it can be expressed as a fusion protein with another protein. Only the protein portion encoded by the cDNA can be obtained by cleaving the obtained fusion protein with an appropriate protease.
[0019]
When the rat protein p3103 of the present invention is expressed in animal cells, the cDNA translation region of the present invention is recombined into an animal cell expression vector having a promoter for animal cells, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like. When introduced into animal cells, the H37 protein of the present invention can be expressed in animal cells.
The rat protein p3103 obtained by the method as described above can be used, for example, as an antigen for preparing an antibody that specifically recognizes this protein.
[0020]
The gene of the present invention is a rat gene encoding the above-mentioned protein p3103. For example, an existing genomic library can be isolated from screening using the cDNA of the present invention or a partial sequence thereof as a probe.
[0021]
The cDNA of the present invention is characterized by having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and codes for the protein p3103 of the present invention. Since the protein p3103 of the present invention is expressed at least in rat brain tissue, by screening a rat brain cDNA library using an oligonucleotide probe synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, A clone identical to cDNA can be easily obtained. Alternatively, the target cDNA can also be synthesized using these oligonucleotides as primers, using the polymerase chain reaction (PCR) method.
[0022]
In general, polymorphisms due to individual differences are frequently observed in mammalian genes. Accordingly, a cDNA in which one or more nucleotides are added, deleted and / or substituted with other nucleotides in SEQ ID NO: 2 is also included in the present invention.
Similarly, a protein in which addition or deletion of one or a plurality of amino acid residues resulting from these changes and / or substitution with other amino acid residues is made is also a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. As long as it has the activity of, it is included in this invention.
[0023]
The DNA fragment of the present invention includes a cDNA fragment (10 bp or more) containing any partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a DNA fragment composed of an antisense strand thereof.
The antibody against the protein p3103 of this invention can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein itself or a partial peptide thereof as an antigen.
[0024]
The animal gene of the present invention is a gene of a mammal other than a rat and encodes an animal protein having the same function as the rat protein p3103. For example, homologous cDNAs can be isolated from cDNA libraries of various animal species using the cDNA of the present invention as a probe, and further isolated from a genomic library using this cDNA as a probe. In addition, by expressing this cDNA in a microorganism, animal cell, plant cell or the like, an animal protein having the same function as p3103 can be obtained.
[0025]
【The invention's effect】
As described above in detail, the protein p3103 of the present invention is a novel protein that specifically binds to the proteins GKAP / SAPAP / DAP that play an important role in PSD formation at the back of the neural synapse connection. Elucidation of the development and development of the nervous system of animals, memory, learning, and other mechanisms, as well as the development of technologies for diagnosis, prevention, and treatment of various neurological diseases caused by functional or structural disorders of the nervous system Etc. are useful.
[0026]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the result of Northern blot analysis examining the tissue distribution of p3103.

Claims

Rat protein p3103, which consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and specifically binds to SAPAP, a constituent molecule behind the neuronal synapse.

A rat gene encoding the rat protein p3103 of claim 1.

Rat protein p3103, which consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and which specifically binds to the constituent molecule SAPAP behind the neuronal synapse.

The cDNA of the rat gene according to claim 2, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

A recombinant vector carrying the cDNA of claim 4.

An antibody against rat protein p3103 of claim 1 or claim 3.

A non-rat mammalian protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2 and specifically binds to a constituent molecule SAPAP at the rear part of the neuronal synapse binding of the non-rat mammal A non-rat mammalian cDNA encoding.

A non-rat mammalian protein that specifically binds to SAPAP, a constituent molecule of the non-rat mammal's neural synaptic junction, which is an expression product of the non-rat mammal cDNA of claim 7 .