【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、チロシナーゼの検知や構造解析に有用な、抗チロシナーゼ抗体、特に抗チロシナーゼモノクローナル抗体のＦａｂフラグメント及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チロシナーゼは生体内でメラニン色素を生合成する上で最も重要な酵素であり、粗面小胞体のリボソームで生成され、次いでゴルジ器官関連小胞体で濃縮、活性化され、ゴルジ器官より生成されるプレメラノソームへ選択的に転送されると考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
生体内でチロシナーゼの生合成が阻害されると、重大な皮膚障害が起こることが知られており、例えば、色素異常症はチロシナーゼ自身の構造の変異やその生合成過程での異常が原因であるといわれている。また、色素異常症にはチロシナーゼのプレメラノソームへの選択的転送の異常が関与している可能性もある。
【０００４】
このような疾病の診断あるいは原因の究明には、チロシナーゼの構造や生体或は細胞に於ける挙動を知ることがたいへん有益であると考えられ、かかる観点から、従来よりチロシナーゼの挙動を知るための努力がなされてきた。特に抗原・抗体反応を用いた方法は、感度も高いことから種々の検討がなされてきており、チロシナーゼに対する抗体の作製が古くからなされてきた。しかしながら、チロシナーゼは抗原として抗体に認識されにくく、且つ、チロシナーゼに物性的に極めて近似したチロシナーゼ関連蛋白が存在するが故に、幾度とない失敗を克服して抗チロシナーゼモノクロナール抗体が作られたのはつい最近のことである。従って、抗チロシナーゼモノクロナール抗体が認識する抗原部位等の詳細な研究は為されておらず、それらの解明のために抗体側の認識部位の構造解析が望まれていた。
【０００５】
更に、代表的な抗体分子であるイムノグロブリンγ（ＩｇＧ）は、抗原を認識するＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２の部分とマクロファージなどと結合するＦｃ部分より構成されていることが知られているが、このうちＦａｂ部分の構造によっては非特異的反応を招くことがあり、得られた抗チロシナーゼ抗体の特異性を証明するためにもＦａｂフラグメントの解析が求められていた。
【０００６】
又、Ｆｃ部分はマクロファージと結合するため、マクロファージが多く存在する環境では抗チロシナーゼ抗体そのものを使用することは不合理であり、Ｆｃ部分を含まない部分、すなわちＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２の部分が求められていた。
【０００７】
一方、チロシナーゼを特異的に認識する抗チロシナーゼ抗体のＦａｂフラグメントはまだ得られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記のような観点からなされたものであり、抗チロシナーゼ抗体の特性把握のため、チロシナーゼの少なくとも一部を抗原として認識する抗チロシナーゼ抗体のＦａｂフラグメント、即ち、抗ヒトチロシナーゼ抗体よりマクロファージ等と結合するＦｃ部分を除いたフラグメントを提供すること及びその製造法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、チロシナーゼのアミノ酸配列のうちチロシナーゼに非常に類似した蛋白であるチロシナーゼ関連蛋白（ＴＲＰ）には認められない配列を有するペプチドを抗原に用いることにより、チロシナーゼを認識するモノクローナル抗体が得られることを見出し、これを蛋白分解酵素により部分消化することによりこのＦａｂフラグメントを得ることに成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、チロシナーゼの少なくとも一部を抗原として認識する抗チロシナーゼ抗体のＦａｂフラグメントである。前記抗体のチロシナーゼに対する認識部位としては、配列番号１に示すアミノ配列の少なくとも一部が挙げられる。また、本発明のＦａｂフラグメントの具体的態様して、前記抗チロシナーゼ抗体が抗チロシナーゼモノクローナル抗体である上記Ｆａｂフラグメント、前記モノクローナル抗体がＩｇＧであり、サブクラスがＩｇＧ１である上記Ｆａｂフラグメント、分子量が４００００〜６００００である上記Ｆａｂフラグメント、さらにチロシナーゼがヒトチロシナーゼである上記Ｆａｂフラグメントが挙げられる。
【００１１】
また本願発明は、下記工程を含む上記のＦａｂフラグメントの製造法を提供する。
（ａ）チロシナーゼのアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結合物を用いて哺乳動物を免疫した後、その動物の脾細胞を取り出し、培養細胞と融合してハイブリドーマを作製し、
（ｂ）チロシナーゼに結合し、かつ、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
（ｃ）前記ハイブリドーマを適当な培地で培養した培養上清、あるいは前記ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して得られる腹水から抗体蛋白を採取し、
（ｄ）前記抗体蛋白を蛋白分解酵素により部分消化してＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントとに切断し、Ｆａｂフラグメントを分離する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
チロシナーゼの中でもヒトチロシナーゼのｃＤＮＡ配列は既に知られており（Ｈｉｒｏａｋｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ， ６４， １２１−１３５（１９８９））、また、ＴＲＰのｃＤＮＡ配列も既に知られている（Ｓｉｇｅｋｉ Ｓｈｉｂａｈａｒａ ｅｔ． ａｌ．， Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ． ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １５６， ４０３−４１４（１９８８））。本発明者らはこれらのｃＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳した結果、チロシナーゼのアミノ酸配列のうち、配列番号１に示したアミノ酸配列を有する部分が、ＴＲＰと相同性が低いことを見いだした。この配列はヒトチロシナーゼに特有であるが、マウス等の実験動物のチロシナーゼともＴＲＰよりははるかに高い相同性を有している。
【００１３】
本発明者らは、この点に注目し、上記配列を有するペプチド（以下、「チロシナーゼに特異的なペプチド」ともいう）の合成を（株）ペプチド研究所に委託した。入手したペプチドを用いて哺乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培養細胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマにチロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を生産させることに成功した。この抗体はヒトチロシナーゼを強く認識し、更には、弱いながらマウスのチロシナーゼも認識した。さらに、その抗体に対し酵素処理を施すことにより特異性および反応性の高い抗チロシナーゼ抗体Ｆａｂフラグメントを得た。以下に、モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの製造法の一例を、製造手順に沿って説明する。
【００１４】
＜１＞抗原
哺乳動物を免疫する際に用いる抗原としては、ヒトチロシナーゼに特異的なアミノ酸配列を有するペプチドが好適である。そのようなアミノ酸配列として、配列番号１に示す配列が挙げられる。このアミノ酸配列を有するペプチドは常法により化学合成することができる。例えば、市販されているペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入力すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプチドの受託合成サービスを行っている会社に依託して入手してもよい。
【００１５】
かくして得られるペプチド（以下、「合成ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いることができるし、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ：Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ：Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）等の担体と結合させて用いることもできる。このような担体を用いると、ペプチドのみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合でも抗原性を上げることができる。尚、この場合は担体に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマを選択する段階で取り除くことができる。
【００１６】
＜２＞哺乳動物の免疫
上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いられている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペプチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、フロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントとともに１〜２週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２週間以上後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法が挙げられる。
【００１７】
このときの合成ペプチドあるいは担体に結合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度が適当である。投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ未満では抗体を十分に生成しないことがある。また、５０ｍｇ／ｋｇを越えても更なる免疫効果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目的とする抗体が得られない恐れがある。
【００１８】
＜３＞ハイブリドーマの作製
上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細胞−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。
【００１９】
融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが好ましい。
【００２０】
例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられる。このような細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別できる。具体的には、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３株、Ｐ３／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１株、ＦＯ株、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株等のミエローマ細胞の市販株が挙げられるが、これらには限定されない。
【００２１】
細胞融合は通常ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤とともに混合することにより行われる。融合促進剤としては、細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示できる。また電気パルスによって融合させてもよい。
【００２２】
細胞融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいはＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育させる。
【００２３】
＜４＞ハイブリドーマの選別
上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノクローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを株の混合体であるので、これらの中から前記合成ペプチド、すまわちヒトチロシナーゼに特異的なペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。
【００２４】
この選別の方法としては、抗原に用いた合成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレート等に固相化しておきこれにハイブリドーマ培養上清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質で標識した第２抗体を加え、結合した標識量から合成ペプチドに結合する抗体量を知ることができる。或は、ハイブリドーマが産生する抗体を固相化し、これに合成ペプチド、標識第２抗体を順次加えてインキュベートしてもよい。
【００２５】
このようにして得られたハイブリドーマの１株は、平成６年５月２７日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＰＭ Ｐ−１４３４０として寄託されており、平成６年９月１４日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８０１として寄託されている。
【００２６】
＜５＞チロシナーゼに特異的に結合する抗チロシナーゼ抗体Ｆａｂフラグメントの調製及びその利用法
上記のようにして得られたハイブリドーマからチロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を得るには、例えば、抗体産生ハイブリドーマを常法に従って硫安分画、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等で精製すればよい。後記実施例で得られたモノクローナル抗体は、ヒトチロシナーゼには特異的に強く結合し、マウスチロシナーゼとは特異的に弱く結合する。これは、チロシナーゼのアミノ酸配列に於いて、配列番号１の配列はヒトに特異的なものであり、マウスのチロシナーゼではこれに相当する部分ではアミノ酸１個分異なっている。これらのことより、チロシナーゼのこの領域は動物種により若干異なるものの、割合相同性の高い部分であり、上記モノクローナル抗体はどの動物種に於いてもある程度チロシナーゼを認識することが期待できる。更に、この配列を少し変えるだけでそれぞれの動物に特有のチロシナーゼを認識させることが出来る。本発明のＦａｂフラグメントは、これらの抗チロシナーゼモノクロナール抗体のＦａｂフラグメントを包含するものである。
【００２７】
かくして、抗チロシナーゼモノクロナール抗体が得られるわけであるが、これをさらに蛋白分解酵素にて部分消化し、プロテインＡカラム等を用いてＦｃフラグメントを除けばＦａｂフラグメントが得られる。かかる酵素としては、ｐＨ等の条件を適切に設定することによりＦａｂフラグメントを切断できるものであれば特段の限定はなく、例えば、不溶化パパインやフィシン等が例示できる。
【００２８】
また、前記と同様にして合成ペプチドで哺乳動物を免疫し、その血液から通常の抗体の精製と同様にしてイムノグロブリン画分を調製すれば、抗チロシナーゼポリクローナル抗体が得られる。こうして得られた抗チロシナーゼポリクローナル抗体もチロシナーゼに特異的に結合するものであり、この抗チロシナーゼポリクローナル抗体前記蛋白分解酵素で消化しても、本発明のＦａｂフラグメントが得られる。
【００２９】
本発明のチロシナーゼに特異的に結合する抗チロシナーゼ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトチロシナーゼと特異的に反応するので、ヒト由来の培養細胞、皮膚組織等の免疫染色における染色体用抗体、さらにはウェスタンブロットあるいはミクロオートラジオグラフィーにおける染色用抗体として使用可能であり、ヒトチロシナーゼの定性あるいは定量のための検知用試薬として利用することができる。更にＦｃ部分を含まないため、マクロファージの影響を受けにくい。又、動物のチロシナーゼともＴＲＰよりははるかに特異的に結合するので、上記と同様の実験を、動物を用いても行うことが出来る。
【００３０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明について詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
＜１＞ハイブリドーマの作製
ペプチドの合成および担体（ＫＬＨ）への結合は、株式会社ペプチド研究所に依頼した。
【００３２】
上記の担体結合合成ペプチド１００μｇを生理食塩水１００μｌに溶かし、完全フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ製）１００μｌと混合乳化したものを、８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）の腹腔内に投与した。その後１週間目と２週間目に、上記担体結合合成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混合乳化液２００μｌを腹腔内投与した。更に、３回目の投与から２週間後に、５０μｇの合成ペプチドを溶解した生理食塩水１００μｌを静脈注射した。
【００３３】
３日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。一方、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（大日本製薬より購入）を、細胞融合に合わせて対数増殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。
【００３４】
１０８個の脾細胞に対し、２×１０７個のミエローマを上記培地中で混合し、遠心分離により細胞をペレットにした。上清を除いた後、３７℃に保温した５０％ＰＥＧ４０００（ＳＩＧＭＡ製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、１分間穏やかに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６４０培地２ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌しながら滴下した。
【００３５】
滴下終了後、遠心分離により上清を除いた後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌに懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベークライト製）に、１ウェルにつき１００μｌずつ分注した。翌日２５μｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後２５μｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、培養上清を半分除き、１００μｌのＧＩＴ培地を添加した。
【００３６】
細胞融合から約２週間後、ミエローマと脾細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成したが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製）を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により検定した。このうち、抗体価の高かったウェル中のハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。さらに、合成ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、ヒトチロシナーゼ及びマウスチロシナーゼに結合し、チロシナーゼ関連蛋白に実質的に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４８０１として寄託されている。
【００３７】
＜２＞チロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの調製
上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、チロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の採取を行った。
【００３８】
上記ハイブリドーマをＧＩＴ培地で培養し、細胞濃度が約５×１０６個／ｍｌになったところで培養上清を遠心分離により回収し、これをポアーサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテインＡカラムキット（アマシャム・ジャパン製）により精製し抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を得た。
【００３９】
得られたモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスをアイソタイピングキット（アマシャム・ジャパン製）により調べたところ、クラスはＩｇＧであり、サブクラスはＩｇＧ１であることが判明した。
【００４０】
得られた抗体をＩｇＧ１Ｆａｂ調製キット（ピアス社製）を用いて部分消化し、消化物からＦｃフラグメントをプロテインＡカラムに吸着させて除去し、Ｆａｂフラグメントを得た。このものの分子量は、電気泳動により測定したところ約５００００であり、この数値より、得られたフラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントではなく、Ｆａｂフラグメントであることが判った。
【００４１】
＜３＞抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの評価
（１）抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントのヒトチロシナーゼに対する特異性
上記で得られたモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントについて、ＭｅＷｏ細胞（ヒト悪性黒色腫由来培養細胞）およびＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚ガン由来培養細胞）の抽出物を用いて、特異性の評価をウエスタンブロット法（エンザイムイムノブロット法）により行った。
【００４２】
培養フラスコで培養したＭｅＷｏおよびＨｅＬａ細胞の培養上清を除き、ダルベッコＰＢＳバッファー（以下、単に「ＰＢＳ」という）で数回洗浄した後、細胞をラバーポリスマンを使用して回収した。回収した細胞を、再びＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．９）に懸濁した。
【００４３】
この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタンパク濃度を測定し、試料蛋白とした。これを、５〜２０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（パジェル：ＡＴＴＯ製）を用いた電気泳動に供した。アプライ量は、１レーン当りタンパク量として１０μｇ／レーンである。なお、電気泳動は常法に従って行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出し１レーンを切り取り、チロシナーゼの活性染色（ＤＯＰＡ染色）を行いゲル上のチロシナーゼの位置を検出した。
【００４４】
一方、ゲルの残りのレーンをトランスファーバッファー（１００ｍＭ，Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ，ｇｌｙｃｉｎ）に浸漬した後、ブロッティング装置（セミドライブロッティング装置：ＡＴＴＯ製）を用い、泳動物をゲルから、予めトランスファーバッファーに浸漬したメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；ミリポア社製）へ転写した。
【００４５】
泳動物を転写したメンブレンを、ＰＢＳバッファーに１５分間浸漬した後、ブロッキングバッファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー）に浸し、２５℃で１時間緩やかに振とうした。
【００４６】
その後、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー（ＴＰＢＳバッファー）を用いて洗浄（１５分１回，５分２回）し、前記＜２＞で得られたＦａｂフラグメント溶液（５μｇ／ｍｌ溶液を約２ｍｌ）に浸漬し、約１時間２５℃で緩やかに振盪した。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製、１０，０００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬し、２５℃で約１時間緩やかに振盪した。
【００４７】
メンブレンをＴＰＢＳバッファーにより洗浄（１５分１回，５分４回）した後、市販のＨＲＰ検出キット（アマシャム社製ＥＣＬキット）を使用して、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントが結合した泳動物のバンドを検出した。尚、ＨＲＰが結合したバンドは、４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用しても検出する事ができる。
【００４８】
上記のようにして行ったイムノブロッティングの結果、前記活性染色の結果からチロシナーゼと考えられるＤＯＰＡ染色バンドと同じ位置に、バンドが認められ、上記で得られたモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトチロシナーゼ活性を有する蛋白のバンド、すなわちヒトチロシナーゼに結合することが判明した。さらにこのＦａｂフラグメントは、ＨｅＬａ細胞の抽出物には結合しなかった。
【００４９】
（２）抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの反応性
上記で得られたモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントについて、酵素標識抗体測定法（ＥＬＩＳＡ）により、非特異的染色性を蛋白分解酵素処理してないＩｇＧと比較した。
【００５０】
培養フラスコで培養したＭｅＷｏ細胞の培養上清を除き、ダルベッコＰＢＳバッファー（ＰＢＳ）で数回洗浄した後、細胞をラバーポリスマンを使用して回収した。回収した細胞を、再びＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．９）に懸濁した。
【００５１】
この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタンパク濃度を測定し、細胞抽出液とした。これを、抗原蛋白とした。
【００５２】
次にこの抗原蛋白をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（スミロンｔｙｐｅＨ（住友ベークライト製））の各ウェルに抗原蛋白（１０μｇ／ｍｌ）５０μｌずつを入れ３７℃で１時間放置後、１％ウシ血清由来アルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、２５℃で１時間ブロッキングを行った。ＰＢＳにて２回洗浄しチロシナーゼを含む抗原固相ウェルを作製した。このプレートに精製チロシナーゼモノクローナル抗体ＩｇＧ（５００ｎｇ／ｍｌ）およびＦａｂフラグメント（５００ｎｇ／ｍｌ）を各々５０μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。上記と同様に洗浄後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体（ＴＡＧＯ社製）５０μｌを加え３７℃で１時間インキュベートした。同様に洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンハイドロクロライドを含む発色液を７５μｌ加え３７℃で３０分インキュベートした。２５μｌの１Ｍ硫酸で反応を停止し、４２０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
表１に示すようにチロシナーゼに対する反応性はＩｇＧに比較してＦａｂのほうが高く、実使用においてはさらに低い濃度で使用する事ができ、非特異的反応を防止することができる。
【００５４】
【表１】
【００５５】
本発明のＦａｂフラグメントは弱いながら、同様の操作で、マウスメラノーマ細胞であるメラノーマＢ−１６にも特異的に反応することが判った。
【００５６】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントは、チロシナーゼに対する反応性が高く非特異的結合を防止することが可能である。又、Ｆｃ部分を含まないためマクロファージの影響を受けにくい。このモノクローナル抗体は、本発明抗チロシナーゼモノクロナール抗体の蛋白分解酵素による部分消化により得られる。
【００５７】
【配列表】
[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an anti-tyrosinase antibody, particularly an anti-tyrosinase monoclonal antibody Fab fragment useful for detection and structural analysis of tyrosinase and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Tyrosinase is the most important enzyme for biosynthesis of melanin pigments in vivo, and is produced in the ribosomes of the rough endoplasmic reticulum, then concentrated and activated in the Golgi organ-related endoplasmic reticulum, and pre-produced from the Golgi organ. It is thought to be selectively transferred to melanosomes.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Inhibition of tyrosinase biosynthesis in vivo is known to cause serious skin damage. For example, dysplasia is caused by mutations in the structure of tyrosinase itself or abnormalities in the biosynthesis process. It is said that. It is also possible that dysplasia is associated with abnormal selective transfer of tyrosinase to premelanosomes.
[0004]
For the diagnosis or investigation of the cause of such diseases, it is considered to be very useful to know the structure of tyrosinase and the behavior in the living body or cells. From this point of view, it is necessary to know the behavior of tyrosinase. Efforts have been made. In particular, methods using an antigen / antibody reaction have been studied variously because of their high sensitivity, and the production of antibodies against tyrosinase has long been made. However, tyrosinase is not easily recognized by antibodies as an antigen, and tyrosinase-related proteins that are very close to physical properties of tyrosinase are present, so that overcoming failures have been overcome and anti-tyrosinase monoclonal antibodies were produced. Just recently. Therefore, detailed studies on the antigen site recognized by the anti-tyrosinase monoclonal antibody have not been made, and in order to elucidate them, structural analysis of the recognition site on the antibody side has been desired.
[0005]
Furthermore, immunoglobulin γ (IgG), which is a typical antibody molecule, is Fab or F (ab ′) that recognizes an antigen. 2 It is known that it is composed of an Fc part that binds to a macrophage and the like, and depending on the structure of the Fab part, a non-specific reaction may be caused. Specificity of the obtained anti-tyrosinase antibody In order to prove this, the analysis of the Fab fragment has been required.
[0006]
In addition, since the Fc part binds to macrophages, it is unreasonable to use the anti-tyrosinase antibody itself in an environment where many macrophages are present, and the part not containing the Fc part, that is, Fab or F (ab ′) 2 The part of was demanded.
[0007]
On the other hand, an Fab fragment of an anti-tyrosinase antibody that specifically recognizes tyrosinase has not been obtained yet.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and in order to understand the characteristics of anti-tyrosinase antibody, Fab fragment of anti-tyrosinase antibody that recognizes at least a part of tyrosinase as an antigen, that is, macrophages and the like from anti-human tyrosinase antibody. It is an object of the present invention to provide a fragment from which an Fc part that binds to the protein is removed and a method for producing the same.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found a peptide having a sequence that is not found in tyrosinase-related protein (TRP), which is a protein very similar to tyrosinase, among the amino acid sequences of tyrosinase. It was found that a monoclonal antibody recognizing tyrosinase was obtained by using it as an antigen, and this Fab fragment was successfully obtained by partial digestion with a protease, thereby completing the present invention.
[0010]
That is, the present invention is a Fab fragment of an anti-tyrosinase antibody that recognizes at least a part of tyrosinase as an antigen. Examples of the recognition site for the tyrosinase of the antibody include at least a part of the amino sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, as a specific embodiment of the Fab fragment of the present invention, the Fab fragment in which the anti-tyrosinase antibody is an anti-tyrosinase monoclonal antibody, the monoclonal antibody is IgG, and the subclass is IgG 1 And the Fab fragment having a molecular weight of 40,000 to 60,000, and the Fab fragment in which tyrosinase is human tyrosinase.
[0011]
Moreover, this invention provides the manufacturing method of said Fab fragment including the following processes.
(A) After immunizing a mammal with a conjugate of a peptide having at least part of the amino acid sequence of a region having low homology with the amino acid sequence of a tyrosinase-related protein in the amino acid sequence of tyrosinase, the animal Spleen cells are taken out and fused with cultured cells to produce hybridomas,
(B) selecting a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to tyrosinase and does not bind to a tyrosinase-related protein;
(C) collecting antibody protein from a culture supernatant obtained by culturing the hybridoma in an appropriate medium, or ascites obtained by culturing the hybridoma in the peritoneal cavity of a mouse;
(D) The antibody protein is partially digested with a protease and cleaved into a Fab fragment and an Fc fragment to separate the Fab fragment.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Among tyrosinases, the cDNA sequence of human tyrosinase is already known (Hiroaki Yamamoto et. Al., Jpn. J. Genet, 64, 121-135 (1989)), and the cDNA sequence of TRP is already known. (Sigeki Shibahara et. Al., Tohoku J. exp. Med., 156, 403-414 (1988)). As a result of translating these cDNA sequences into amino acid sequences, the present inventors have found that the portion having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of tyrosinase has low homology with TRP. This sequence is unique to human tyrosinase, but has much higher homology with tyrosinase from experimental animals such as mice than TRP.
[0013]
The present inventors paid attention to this point, and outsourced the synthesis of a peptide having the above sequence (hereinafter also referred to as “a peptide specific for tyrosinase”) to Peptide Institute. After immunizing a mammal with the obtained peptide, spleen cells were taken out and fused with cultured cells to produce a hybridoma. The hybridoma was successfully produced with a monoclonal antibody specific for tyrosinase. This antibody strongly recognized human tyrosinase, and also weakly recognized mouse tyrosinase. Further, the antibody treatment was performed with an enzyme to obtain an anti-tyrosinase antibody Fab fragment having high specificity and reactivity. Below, an example of the manufacturing method of a monoclonal antibody Fab fragment is demonstrated along a manufacturing procedure.
[0014]
<1> Antigen
As an antigen used when immunizing a mammal, a peptide having an amino acid sequence specific for human tyrosinase is suitable. An example of such an amino acid sequence is the sequence shown in SEQ ID NO: 1. A peptide having this amino acid sequence can be chemically synthesized by a conventional method. For example, the peptide can be obtained by inputting the sequence using a commercially available peptide synthesizer. Alternatively, it may be obtained by contracting with a company that provides a peptide synthesis service.
[0015]
The peptide thus obtained (hereinafter also referred to as “synthetic peptide”) can be used as an antigen as it is, keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA: Bovine Serum Albumin), It can also be used in combination with a carrier such as ovalbumin (OVA: Ovalbumin). When such a carrier is used, antigenicity can be increased even when the peptide alone has low antigenicity or no antigenicity. In this case, antibodies against the carrier can also be produced, but they can be removed at the stage of selecting the hybridoma.
[0016]
<2> Mammal immunity
The mammal immunized with the antigen is not particularly limited as long as it is a mammal usually used in immunization experiments, and examples thereof include mice, rats, rabbits and the like. In addition, the immunization method may be performed in accordance with a normal immunization technique. For example, a synthetic peptide or a synthetic peptide bound to a carrier at a dose of 0.5 mg / kg to 50 mg / kg is Freund's complete adjuvant. Alternatively, there may be mentioned a method in which the administration is repeated several times every 1 to 2 weeks together with incomplete adjuvant, and the final immunization is performed by administering only the synthetic peptide at least 2 weeks after the final administration.
[0017]
The dose of the synthetic peptide or the synthetic peptide bound to the carrier at this time is suitably about 0.5 mg / kg to 50 mg / kg per dose. If the dose is less than 0.5 mg / kg, the antibody may not be produced sufficiently. Further, if the dose exceeds 50 mg / kg, no further immune effect can be expected, and further, immunosuppression occurs in vivo, and the target antibody may not be obtained.
[0018]
<3> Production of hybridoma
Animals immunized as described above are sacrificed 3-4 days after the final immunization, the spleen is removed, and the spleen cells are removed. A spleen cell-cultured cell hybridoma can be obtained by fusing this cell with a cultured cell as a fusion partner in the presence of a fusion promoter and selecting the resulting fused cell.
[0019]
The cultured cell of the fusion partner is not particularly limited as long as it fuses with spleen cells, but generally, myeloma cells (myeloma cells) are suitable. Moreover, in order to be able to distinguish unfused cells and fused cells after cell fusion, those having a specific drug marker for selection are preferred.
[0020]
For example, one deficient in hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase can be mentioned. Such cells cannot grow in a medium (HAT medium) supplemented with hypoxanthine, aminopterin and thymidine, but a fused cell of this cell and a normal cell can grow in a HAT medium. Can be distinguished. Specific examples include commercially available myeloma cells such as P3X63Ag8.653, P3 / NSI / 1-AG4-1, FO, SP2 / 0-Ag14, but are not limited thereto.
[0021]
Cell fusion is usually performed by mixing antibody-producing cells (spleen cells) and myeloma cells with a fusion promoter in a mixing ratio of 10: 1 to 2: 1 in a medium such as RPMI1640 or MEM. The fusion promoter is not particularly limited as long as it is a fusion agent that is usually used in cell fusion experiments. Specific examples include Sendai virus and polyethylene glycol having an average molecular weight of 500 to 7000. Moreover, you may fuse | fuse by an electric pulse.
[0022]
Cells that have undergone cell fusion are diluted with, for example, RPMI 1640 or MEM medium, and the cells washed by centrifugation are suspended in a selective medium such as HAT medium, dispensed onto a multiplate, etc., and cultured, and only hybridomas are obtained. Grow.
[0023]
<4> Hybridoma selection
Since the hybridoma obtained as described above is a mixture of strains, a hybridoma producing a monoclonal antibody against a different antigen-determining site of a peptide used as an antigen or a protein used as a carrier is used. A hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to the synthetic peptide, that is, a peptide specific to human tyrosinase, is selected.
[0024]
As the selection method, an enzyme immunoassay method (ELISA method) using a synthetic peptide used as an antigen is preferable. For example, an antibody that binds to a synthetic peptide from the amount of the bound label by adding a second antibody labeled with a hybridoma culture supernatant and further with an enzyme, a fluorescent substance or a luminescent substance after immobilizing the synthetic peptide on a plastic plate or the like You can know the amount. Alternatively, the antibody produced by the hybridoma may be immobilized on a solid phase, and a synthetic peptide and a labeled second antibody are sequentially added thereto and incubated.
[0025]
One hybridoma strain obtained in this way was transferred to the FEPM from May 27, 1994 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal code 305 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan). It was deposited as P-14340, and on September 14, 1994, this original deposit was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty, and deposited as deposit number FERM BP-4801.
[0026]
<5> Preparation of anti-tyrosinase antibody Fab fragment that specifically binds to tyrosinase and its use
In order to obtain a monoclonal antibody that specifically binds to tyrosinase from the hybridoma obtained as described above, for example, the antibody-producing hybridoma may be purified by ammonium sulfate fractionation, gel filtration, affinity chromatography or the like according to a conventional method. The monoclonal antibodies obtained in the examples described later bind specifically and strongly to human tyrosinase, and specifically and weakly bind to mouse tyrosinase. This is because in the amino acid sequence of tyrosinase, the sequence of SEQ ID NO: 1 is human-specific, and in mouse tyrosinase, the corresponding portion differs by one amino acid. From these facts, although this region of tyrosinase is slightly different depending on the animal species, it is a highly homologous portion, and the monoclonal antibody can be expected to recognize tyrosinase to some extent in any animal species. Furthermore, tyrosinase peculiar to each animal can be recognized only by slightly changing this sequence. The Fab fragment of the present invention encompasses the Fab fragment of these anti-tyrosinase monoclonal antibodies.
[0027]
Thus, an anti-tyrosinase monoclonal antibody can be obtained. A Fab fragment can be obtained by further digesting the antibody with a protease and removing the Fc fragment using a protein A column or the like. The enzyme is not particularly limited as long as it can cleave the Fab fragment by appropriately setting conditions such as pH, and examples thereof include insolubilized papain and ficin.
[0028]
Further, an anti-tyrosinase polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal with a synthetic peptide in the same manner as described above and preparing an immunoglobulin fraction from the blood in the same manner as the purification of a normal antibody. The anti-tyrosinase polyclonal antibody thus obtained also specifically binds to tyrosinase, and the Fab fragment of the present invention can be obtained by digestion with this anti-tyrosinase polyclonal antibody with the above-mentioned proteolytic enzyme.
[0029]
The anti-tyrosinase antibody Fab fragment that specifically binds to tyrosinase of the present invention specifically reacts with human tyrosinase. Therefore, antibodies for chromosomes in immunostaining of human-derived cultured cells, skin tissues, etc. It can be used as an antibody for staining in autoradiography and can be used as a detection reagent for qualitative or quantitative determination of human tyrosinase. Furthermore, since it does not contain the Fc part, it is less susceptible to macrophages. In addition, since it also binds to animal tyrosinase more specifically than TRP, the same experiment as described above can be performed using animals.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples of the present invention. However, the present invention is not limited to these examples.
[0031]
<1> Production of hybridoma
Peptide laboratories were requested for peptide synthesis and binding to the carrier (KLH).
[0032]
100 μg of the above carrier-bound synthetic peptide dissolved in 100 μl of physiological saline and mixed and emulsified with 100 μl of complete Freund's adjuvant (manufactured by SIGMA) were administered intraperitoneally to 8-week-old BALB / c mice (Claire Japan). Thereafter, 200 μl of the above-mentioned carrier-bound synthetic peptide-incomplete Freund's equivalent mixed emulsion was intraperitoneally administered in the first and second weeks. Further, 2 weeks after the third administration, 100 μl of physiological saline in which 50 μg of the synthetic peptide was dissolved was intravenously injected.
[0033]
Three days later, the spleen was removed from the mouse, and the splenocytes were suspended in RPMI 1640 medium and washed. On the other hand, mouse myeloma cell line P3X63Ag8.653 (purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was cultured in a logarithmic growth phase according to cell fusion and collected by centrifugation.
[0034]
10 8 2x10 per individual splenocyte 7 The myeloma was mixed in the above medium and the cells were pelleted by centrifugation. After removing the supernatant, 1 ml of RPMI 1640 medium containing 50% PEG 4000 (manufactured by SIGMA) kept at 37 ° C. was gradually added dropwise over 1 minute and gently stirred for 1 minute. Furthermore, 2 ml of RPMI 1640 medium at 37 ° C. was added dropwise for 2 minutes, and further 8 ml was added dropwise with stirring for 3 minutes.
[0035]
After completion of dropping, the supernatant was removed by centrifugation, and the cell pellet was suspended in 40 ml of GIT medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Dispensed. The next day, 25 μl of HAT medium was added, and after 4 days, 25 μl of HAT medium was added. After culturing for 1 week, half of the culture supernatant was removed and 100 μl of GIT medium was added.
[0036]
About 2 weeks after cell fusion, only the hybridoma in which myeloma and spleen cells were fused formed a colony, and the culture was continued until the diameter of the colony was about 1 mm. The antibody secreted into the culture supernatant at this time was sandwiched with the above synthetic peptide and a commercially available secondary antibody (horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse Ig's (γ + L) antibody: manufactured by TAGO). The assay was performed by ELISA. Among these, hybridomas in wells with high antibody titers were cloned by limiting dilution to obtain monoclonal antibody-producing hybridoma strains. Furthermore, hybridomas that produce monoclonal antibodies that bind to human tyrosinase and mouse tyrosinase but do not substantially bind to tyrosinase-related proteins were selected from hybridomas that produce monoclonal antibodies that bind to synthetic peptides. This strain is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERMBP-4801.
[0037]
<2> Preparation of monoclonal antibody Fab fragment that specifically binds to tyrosinase
The hybridoma cell line obtained above was cultured, and monoclonal antibodies that specifically bound to tyrosinase were collected.
[0038]
The hybridoma is cultured in GIT medium, and the cell concentration is about 5 × 10 6 The culture supernatant was collected by centrifugation at a concentration of 1 / ml, filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm, and the filtrate was purified with a protein A column kit (Amersham Japan) to obtain an anti-human tyrosinase monoclonal antibody. Got.
[0039]
When the class and subclass of the obtained monoclonal antibody were examined with an isotyping kit (manufactured by Amersham Japan), the class was IgG and the subclass was IgG. 1 It turned out to be.
[0040]
The obtained antibody was IgG 1 Partial digestion was performed using a Fab preparation kit (Pierce), and the Fc fragment was adsorbed and removed from the digest on a protein A column to obtain a Fab fragment. The molecular weight of this product was about 50,000 as measured by electrophoresis. From this value, the obtained fragment was F (ab ′) 2 It was found to be a Fab fragment, not a fragment.
[0041]
<3> Evaluation of anti-tyrosinase monoclonal antibody Fab fragment
(1) Specificity of anti-tyrosinase monoclonal antibody Fab fragment for human tyrosinase
Specificity of the monoclonal antibody Fab fragment obtained above was evaluated by Western blotting using extracts of MeWo cells (cultured cells derived from human malignant melanoma) and HeLa cells (cultured cells derived from human cervical cancer) ( Enzyme immunoblot method).
[0042]
The culture supernatant of MeWo and HeLa cells cultured in the culture flask was removed, and after washing several times with Dulbecco's PBS buffer (hereinafter simply referred to as “PBS”), the cells were collected using a rubber policeman. The collected cells were washed again several times with PBS and suspended in a cell lysis buffer (0.1 M sodium phosphate buffer containing 0.5% Triton X-100, pH 6.9).
[0043]
The cells were crushed by treatment with an ultrasonic cell crusher (manufactured by Toago Denki) for 30 seconds, and centrifuged at 16,000 × G for 10 minutes. The protein concentration contained in the obtained supernatant was measured and used as a sample protein. This was subjected to electrophoresis using a 5-20% density gradient polyacrylamide gel (Pagel: manufactured by ATTO). The amount applied is 10 μg / lane as the amount of protein per lane. Electrophoresis was performed according to a conventional method. After the completion of electrophoresis, the gel was taken out, one lane was cut out, and tyrosinase activity staining (DOPA staining) was performed to detect the position of tyrosinase on the gel.
[0044]
On the other hand, a membrane in which the remaining lane of the gel was immersed in a transfer buffer (100 mM, Tris; 192 mM, glycin) and then the electrophoresis product was previously immersed in the transfer buffer from the gel using a blotting device (semi-driving blotting device: manufactured by ATTO). (Immobilon; manufactured by Millipore).
[0045]
The membrane to which the electrophoretic material has been transferred is immersed in a PBS buffer for 15 minutes, and then immersed in a blocking buffer (PBS buffer containing 5% skim milk or 1% BSA and 0.1% Tween 20), and gently shaken at 25 ° C. for 1 hour. did.
[0046]
Thereafter, the membrane was washed with PBS buffer containing 0.1% Tween 20 (TPBS buffer) (once for 15 minutes and twice for 5 minutes), and the Fab fragment solution obtained in the above <2> (5 μg / ml solution) And was gently shaken at 25 ° C. for about 1 hour. After the membrane was washed, the membrane was further immersed in a commercially available secondary antibody solution (horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse Ig's (γ + L) antibody: manufactured by TAGO, 10,000-fold diluted solution about 2 ml), It was gently shaken at 25 ° C. for about 1 hour.
[0047]
After washing the membrane with TPBS buffer (15 min once, 5 min 4 times), using a commercially available HRP detection kit (Amersham ECL kit), the anti-human tyrosinase monoclonal antibody Fab fragment bound. A band was detected. The band to which HRP is bound can also be detected using 4-chloro-1-naphthol as a substrate.
[0048]
As a result of immunoblotting performed as described above, a band was observed at the same position as the DOPA-stained band considered to be tyrosinase from the result of the activity staining, and the monoclonal antibody Fab fragment obtained above exhibited human tyrosinase activity. It has been found that it binds to a protein band, ie, human tyrosinase. Furthermore, this Fab fragment did not bind to extracts of HeLa cells.
[0049]
(2) Reactivity of anti-tyrosinase monoclonal antibody Fab fragment
The monoclonal antibody Fab fragment obtained above was compared with non-protease-treated IgG for non-specific staining by enzyme-labeled antibody assay (ELISA).
[0050]
The culture supernatant of MeWo cells cultured in the culture flask was removed, and after washing several times with Dulbecco's PBS buffer (PBS), the cells were recovered using a rubber policeman. The collected cells were washed again several times with PBS and suspended in a cell lysis buffer (0.1 M sodium phosphate buffer containing 0.5% Triton X-100, pH 6.9).
[0051]
The cells were crushed by treatment with an ultrasonic cell crusher (manufactured by Toago Denki) for 30 seconds, and centrifuged at 16,000 × G for 10 minutes. The protein concentration contained in the obtained supernatant was measured to obtain a cell extract. This was designated as an antigen protein.
[0052]
Next, 50 μl of the antigen protein (10 μg / ml) is placed in each well of an ELISA microplate (Sumilon type H (manufactured by Sumitomo Bakelite)) and left at 37 ° C. for 1 hour, and then contains 1% bovine serum-derived albumin. 100 μl of PBS was added and blocking was performed at 25 ° C. for 1 hour. An antigen solid phase well containing tyrosinase was prepared by washing twice with PBS. 50 μl each of purified tyrosinase monoclonal antibody IgG (500 ng / ml) and Fab fragment (500 ng / ml) were added to the plate and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing in the same manner as described above, horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse Ig's (γ + L) antibody (manufactured by TAGO) 50 μl was added as a secondary antibody and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Similarly, after washing, 75 μl of a coloring solution containing o-phenylenediamine hydrochloride was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped with 25 μl of 1M sulfuric acid and the absorbance at 420 nm was measured.
[0053]
As shown in Table 1, Fab has higher reactivity to tyrosinase than IgG, and can be used at a lower concentration in actual use, thereby preventing nonspecific reaction.
[0054]
[Table 1]
[0055]
Although the Fab fragment of the present invention was weak, it was found that it reacts specifically with mouse melanoma cell melanoma B-16 in the same manner.
[0056]
【The invention's effect】
The Fab fragment of the monoclonal antibody of the present invention is highly reactive with tyrosinase and can prevent non-specific binding. In addition, since it does not contain the Fc part, it is less susceptible to macrophages. This monoclonal antibody can be obtained by partial digestion of the anti-tyrosinase monoclonal antibody of the present invention with a proteolytic enzyme.
[0057]
[Sequence Listing]