JP3633730B2 - 電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＤＮＡやＲＮＡ，蛋白等の分離精製に際して支持体として使用される電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤を関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ＤＮＡ等を電気泳動する際の支持体として、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルが用いられている。アガロースは、紅藻等の海藻から抽出される寒天の主成分であり、寒天を精製して得られる。ポリアクリルアミドは、アクリルアミドと架橋剤メチレンビスアクリルアミドを重合して純粋に化学的に作られる。通常これらは、電気泳動の対象となるＤＮＡの大きさに応じて使い分けられている。ポリアクリルアミドは、１０〜１０００ｂｐのＤＮＡの分離に適し、アガロースゲルは、１００〜１０万ｂｐのＤＮＡの分離に適する。
【０００３】
アガロースは、海藻から抽出精製されるため取扱いが容易で使いやすい基材であるが、電気泳動ゲルとしては次のような難点を持つ。第１に、分解能に限界があり、ポリアクリルアミドゲルのように低分子のＤＮＡを分画する事ができない。第２に、透明度が高くなく、白濁しており、これが塩基配列決定等の分析を難しくしている。特に低分子のＤＮＡを分画するために高濃度ゲルを用いると、白濁が大きくなる。具体的にいえば、通常電気泳動後の状態を確認するために、ＤＮＡを蛍光色素エチジウムブロマイドで染色し、紫外線ランプで照射して蛍光発色させることが行われるが、写真撮影等に当たって背景が乱反射するために鮮明な塩基配列像を得ることが難しい。第３に、微量の不純物として、硫酸基等のアニオン基を含み、これが電気泳動により電気浸透現象を起こす。これは特に等電点電気泳動法においては大きな問題になる。
【０００４】
上述したアガロース電気泳動ゲルの難点を解決するため、次のような方法が提案されている。
▲１▼低分子分離用として開発した高精製アガロースを用い、ヒドロキシエチル化させて、アガロースを高濃度に使ったときの網目構造をより細かくする方法。
▲２▼アガロースとγ線照射ガラクトグルコマンナンを混合してゲルを作ることにより、ゲルの透明性を高め、かつ細かい網目構造を導入する方法（特公平７−８６５０３号公報参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、▲１▼の方法は、反応工程を必要とするため、コストが高いものとなる欠点がある。また、▲１▼，▲２▼いずれの方法でも、上記第３の問題点、即ち等電点電気泳動法に適用するには電気浸透度（ＥＥＯ）が高いという問題は解消されない。
【０００６】
この発明は、上記欠点を除去して、透明性が高く、電気浸透度が低く、優れた分解能を示すアガロース電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明に係る電気泳動ゲルの形成方法は、電気泳動用緩衝液に、寒天より抽出精製したアガロースと共にタマリンド種子より抽出精製したタマリンドガムを添加し、加熱して透明ゾルを形成し、この透明ゾルを注型冷却して電気泳動ゲルを形成することを特徴とする。
この発明において好ましくは、アガロースとタマリンドガムをそれらの合計量に対してタマリンドガムが５〜８０重量％となる割合で添加する。
この発明はまた、電気泳動用緩衝液に入れて加熱溶解して透明ゾルを形成し、この透明ゾルを注型冷却して電気泳動ゲルを形成するための電気泳動ゲル用製剤であって、寒天より抽出精製したアガロースを２０〜９５重量％含み、残部がタマリンド種子より抽出精製したタマリンドガムであることを特徴としている。
【０００８】
タマリンドガムは、東南アジアに生育する多年生豆科植物タマリンドの種子から抽出される中低粘性の天然多糖類ガムであって、透明性に優れ、ニュートン流動粘性を示し、耐熱性は他の多くのガム質に比べて高い。
このタマリンドガムをアガロースと組み合わせて電気泳動ゲルを形成すると、アガロースのみの場合に比べて網目構造が緻密で、白濁が少なく、透明化された電気泳動ゲルが得られる。また、タマリンドを加えることにより、電気浸透度が低くなる。
【０００９】
タマリンドを加えることにより白濁が少なくなる理由は、次のように考えられる。アガロースは溶液状態でランダムコイルの分子状態をとり、冷却によりヘリックス構造をとる。このとき、ヘリックスに結合する水分子を強く引きつけることにより屈折率が大きくなり、光の透過率を下げることになる。一方、タマリンドガムが入ると、上述の結合水の片寄りが少なくなり、光の透過率低下が抑えられる。
また、タマリンドガムを加えることにより電気浸透度が低くなる理由は、ゲル中にタマリンドガムが入ることによりゲルの粘性が増し、緩衝液との接触面の電気二重層が電離基を緩和させ、支持体の帯電を弱めることになるためと考えられる。
従ってこの発明によると、特に等電点電気泳動に適用可能になるという利点が得られる。
【００１０】
この発明において、アガロースとタマリンドガムの合計量に対してタマリンドガムの割合が５重量％より少ないと、透明度向上及び電気浸透度低下の効果が十分に得られない。また、タマリンドガムが８０重量％を越えると、アガロースゲルの形成能が低くなり、作業性が悪くなって均一なゲルが得られ難くなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施例を説明する。
電気泳動用緩衝液ＴＡＥ（ＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−酢酸）に対して、２重量％のアガロースと、０．５重量％の精製タマリンドガムを入れて加熱溶解した後、スロット形成用コームをセットしたゲルトレイに入れて冷却凝固した。
ＤＮＡ分子量マーカーφｘ１７４ ／Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔと、ｐＢＲ３２２／Ｍｓｐ Ｉ ｄｉｇｅｓｔを用いて、定電圧５０Ｖで２時間電気泳動した。
【００１２】
比較例として、アガロースとγ線照射ガラクトグルトマンナンを混合したゲルを同様の条件で電気泳動した。
実施例及び比較例の試料をエチジウムブロマイドで染色後、トランスイルミネータでＤＮＡパターンを観察した。
図１は、実施例と比較例のパターンを撮影した写真である。実施例のゲルの方が明らかに分解能に優れ、鮮明なパターンが得られることが確認された。
【００１３】
また、精製されたアガロース粉末とタマリンドガム粉末を、タマリンドガムが全体の５〜８０重量％となる比率で均一に混合した製剤を用意し、この製剤を用いて同様に電気泳動ゲルを形成して電気泳動試験を行った結果、アガロースのみの場合に比べて分解能の点で有意な差が得られることが確認された。
【００１４】
【発明の効果】
以上述べたようにこの発明によれば、電気泳動用緩衝液にアガロースとタマリンドガムを入れて加熱して透明ゾルを形成することにより、電気浸透度が低くかつ透明で優れた分解能を示す電気泳動ゲルが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例及び比較例のゲルを用いた電気泳動パターンを示す写真である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＤＮＡやＲＮＡ，蛋白等の分離精製に際して支持体として使用される電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤を関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ＤＮＡ等を電気泳動する際の支持体として、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルが用いられている。アガロースは、紅藻等の海藻から抽出される寒天の主成分であり、寒天を精製して得られる。ポリアクリルアミドは、アクリルアミドと架橋剤メチレンビスアクリルアミドを重合して純粋に化学的に作られる。通常これらは、電気泳動の対象となるＤＮＡの大きさに応じて使い分けられている。ポリアクリルアミドは、１０〜１０００ｂｐのＤＮＡの分離に適し、アガロースゲルは、１００〜１０万ｂｐのＤＮＡの分離に適する。
【０００３】
アガロースは、海藻から抽出精製されるため取扱いが容易で使いやすい基材であるが、電気泳動ゲルとしては次のような難点を持つ。第１に、分解能に限界があり、ポリアクリルアミドゲルのように低分子のＤＮＡを分画する事ができない。第２に、透明度が高くなく、白濁しており、これが塩基配列決定等の分析を難しくしている。特に低分子のＤＮＡを分画するために高濃度ゲルを用いると、白濁が大きくなる。具体的にいえば、通常電気泳動後の状態を確認するために、ＤＮＡを蛍光色素エチジウムブロマイドで染色し、紫外線ランプで照射して蛍光発色させることが行われるが、写真撮影等に当たって背景が乱反射するために鮮明な塩基配列像を得ることが難しい。第３に、微量の不純物として、硫酸基等のアニオン基を含み、これが電気泳動により電気浸透現象を起こす。これは特に等電点電気泳動法においては大きな問題になる。
【０００４】
上述したアガロース電気泳動ゲルの難点を解決するため、次のような方法が提案されている。
▲１▼低分子分離用として開発した高精製アガロースを用い、ヒドロキシエチル化させて、アガロースを高濃度に使ったときの網目構造をより細かくする方法。
▲２▼アガロースとγ線照射ガラクトグルコマンナンを混合してゲルを作ることにより、ゲルの透明性を高め、かつ細かい網目構造を導入する方法（特公平７−８６５０３号公報参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、▲１▼の方法は、反応工程を必要とするため、コストが高いものとなる欠点がある。また、▲１▼，▲２▼いずれの方法でも、上記第３の問題点、即ち等電点電気泳動法に適用するには電気浸透度（ＥＥＯ）が高いという問題は解消されない。
【０００６】
この発明は、上記欠点を除去して、透明性が高く、電気浸透度が低く、優れた分解能を示すアガロース電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明に係る電気泳動ゲルの形成方法は、電気泳動用緩衝液に、寒天より抽出精製したアガロースと共にタマリンド種子より抽出精製したタマリンドガムを添加し、加熱して透明ゾルを形成し、この透明ゾルを注型冷却して電気泳動ゲルを形成することを特徴とする。
この発明において好ましくは、アガロースとタマリンドガムをそれらの合計量に対してタマリンドガムが５〜８０重量％となる割合で添加する。
この発明はまた、電気泳動用緩衝液に入れて加熱溶解して透明ゾルを形成し、この透明ゾルを注型冷却して電気泳動ゲルを形成するための電気泳動ゲル用製剤であって、寒天より抽出精製したアガロースを２０〜９５重量％含み、残部がタマリンド種子より抽出精製したタマリンドガムであることを特徴としている。
【０００８】
タマリンドガムは、東南アジアに生育する多年生豆科植物タマリンドの種子から抽出される中低粘性の天然多糖類ガムであって、透明性に優れ、ニュートン流動粘性を示し、耐熱性は他の多くのガム質に比べて高い。
このタマリンドガムをアガロースと組み合わせて電気泳動ゲルを形成すると、アガロースのみの場合に比べて網目構造が緻密で、白濁が少なく、透明化された電気泳動ゲルが得られる。また、タマリンドを加えることにより、電気浸透度が低くなる。
【０００９】
タマリンドを加えることにより白濁が少なくなる理由は、次のように考えられる。アガロースは溶液状態でランダムコイルの分子状態をとり、冷却によりヘリックス構造をとる。このとき、ヘリックスに結合する水分子を強く引きつけることにより屈折率が大きくなり、光の透過率を下げることになる。一方、タマリンドガムが入ると、上述の結合水の片寄りが少なくなり、光の透過率低下が抑えられる。
また、タマリンドガムを加えることにより電気浸透度が低くなる理由は、ゲル中にタマリンドガムが入ることによりゲルの粘性が増し、緩衝液との接触面の電気二重層が電離基を緩和させ、支持体の帯電を弱めることになるためと考えられる。
従ってこの発明によると、特に等電点電気泳動に適用可能になるという利点が得られる。
【００１０】
この発明において、アガロースとタマリンドガムの合計量に対してタマリンドガムの割合が５重量％より少ないと、透明度向上及び電気浸透度低下の効果が十分に得られない。また、タマリンドガムが８０重量％を越えると、アガロースゲルの形成能が低くなり、作業性が悪くなって均一なゲルが得られ難くなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施例を説明する。
電気泳動用緩衝液ＴＡＥ（ＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−酢酸）に対して、２重量％のアガロースと、０．５重量％の精製タマリンドガムを入れて加熱溶解した後、スロット形成用コームをセットしたゲルトレイに入れて冷却凝固した。
ＤＮＡ分子量マーカーφｘ１７４ ／Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔと、ｐＢＲ３２２／Ｍｓｐ Ｉ ｄｉｇｅｓｔを用いて、定電圧５０Ｖで２時間電気泳動した。
【００１２】
比較例として、アガロースとγ線照射ガラクトグルトマンナンを混合したゲルを同様の条件で電気泳動した。
実施例及び比較例の試料をエチジウムブロマイドで染色後、トランスイルミネータでＤＮＡパターンを観察した。
図１は、実施例と比較例のパターンを撮影した写真である。実施例のゲルの方が明らかに分解能に優れ、鮮明なパターンが得られることが確認された。
【００１３】
また、精製されたアガロース粉末とタマリンドガム粉末を、タマリンドガムが全体の５〜８０重量％となる比率で均一に混合した製剤を用意し、この製剤を用いて同様に電気泳動ゲルを形成して電気泳動試験を行った結果、アガロースのみの場合に比べて分解能の点で有意な差が得られることが確認された。
【００１４】
【発明の効果】
以上述べたようにこの発明によれば、電気泳動用緩衝液にアガロースとタマリンドガムを入れて加熱して透明ゾルを形成することにより、電気浸透度が低くかつ透明で優れた分解能を示す電気泳動ゲルが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例及び比較例のゲルを用いた電気泳動パターンを示す写真である。
Claims (3)
- 電気泳動用緩衝液に、寒天より抽出精製したアガロースと共にタマリンド種子より抽出精製したタマリンドガムを添加し、加熱して透明ゾルを形成し、この透明ゾルを注型冷却して電気泳動ゲルを形成する
ことを特徴とする電気泳動ゲルの形成方法。 - アガロースとタマリンドガムをそれらの合計量に対してタマリンドガムが５〜８０重量％となる割合で添加する
ことを特徴とする請求項１記載の電気泳動ゲルの形成方法。 - 電気泳動用緩衝液に入れて加熱溶解して透明ゾルを形成し、この透明ゾルを注型冷却して電気泳動ゲルを形成するための製剤であって、寒天より抽出精製したアガロースを２０〜９５重量％含み、残部がタマリンド種子より抽出精製したタマリンドガムである
ことを特徴とする電気泳動ゲル用製剤。
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|---|---|---|---|
| JP20716996A JP3633730B2 (ja) | 1996-08-06 | 1996-08-06 | 電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP20716996A JP3633730B2 (ja) | 1996-08-06 | 1996-08-06 | 電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1048181A JPH1048181A (ja) | 1998-02-20 |
| JP3633730B2 true JP3633730B2 (ja) | 2005-03-30 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20716996A Expired - Fee Related JP3633730B2 (ja) | 1996-08-06 | 1996-08-06 | 電気泳動ゲルの形成方法および電気泳動ゲル用製剤 |
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1996
- 1996-08-06 JP JP20716996A patent/JP3633730B2/ja not_active Expired - Fee Related
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