JP3634883B2 - 耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及び該酵素を用いるトレハロースの製造方法 - Google Patents
耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及び該酵素を用いるトレハロースの製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及びその用途に関するものであり、さらに詳しくは、バチルス属に属する好熱性細菌が産生する高い熱安定性を有する新規なトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、該好熱性細菌、並びに該酵素を用いるトレハロースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質である。
従来、トレハロースを調製する方法としては、酵母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細菌による発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られている。しかし、これらの方法で調製したトレハロースは、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くなり、非常に高価である。
【０００３】
一方、安価にトレハロースを調製する有効な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、茸類であるグリフォラ・フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）（日本農芸化学会誌、６８、５８０、１９９４）やシゾフィラム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、アガリカス・ビスポーラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、プルロータス・オストレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、リフィラム・ウルマリウム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｕｌｍａｒｉｕｍ）（特開平６−１８９７７９）が産生するトレハロースホスホリラーゼを用い、α−グルコース−１−リン酸とグルコースからトレハロースを製造する方法がある。しかし、本製造方法で用いる酵素は熱安定性が低く、反応温度が２５〜５０℃であるため、製造工程で雑菌汚染が起こる可能性が高いといった問題がある。
【０００４】
また、別な酵素法として、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを用い、マルトースを基質としてβ−グルコース−１−リン酸を経てトレハロースを製造する方法がある（特公昭６３−６０９９８）。しかし、本製造法に使用可能な、既知のトレハロースホスホリラーゼは、緑藻であるユーグレナ・グラチリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３２２３〜３２２８，１９７２）が産生するのみで、この酵素の至適温度は４０℃で温度安定性が悪く、しかも調製が非常に難しいので工業的に利用するのは困難であるといった問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
トレハロースを安価に、且つ、工業的規模で製造する方法としてはトレハロースホスホリラーゼを用いた酵素法が最も有効であると考えられる。
一方、工業的に酵素反応で生産を行う場合、雑菌汚染の低減の目的から、反応温度の高温化が一般的に採られている。また、反応温度の高温化は、基質と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くすることができる、酵素反応速度が早くなり反応時間の短縮化ができる等の利点があり、コスト的にも有効である。
このように高温での酵素反応でトレハロースの製造を行うためには、高い熱安定性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼが要求される。しかし、前述の茸類や緑藻類起源のトレハロースホスホリラーゼは熱安定性は必ずしも高くない。
従って、実際の高温酵素反応に適する酵素、具体的には５５℃以上で安定な酵素の提供が求められていた。
【０００６】
本発明者らは高い熱安定性を有し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸からトレハロースを生成する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを自然界より探索した結果、バチルス属に属する好熱性細菌が上記目的にかなう酵素をよく産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明による耐熱性トレハロースホスホリラーゼ標品の性質は以下の通りである。耐熱性トレハロースホスホリラーゼ標品としては実施例１で得られたものを使用した。
尚、トレハロースホスホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２ｇ／ｄｌトレハロース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、２０分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣＩＩ−テストワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該測定値から生成グルコース量を求めた。またトレハロースホスホリラーゼ活性の定義については、上記測定条件下で１分間に１μｍｏｌのトレハロースを加リン酸分解する酵素量を１単位とした。
【０００８】
（１）作用
式（１）で示すように、トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
【０００９】
【化１】
【００１０】
（２）基質特異性
トレハロース、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行ったところ、トレハロース以外にはグルコースの生成がほとんど認められなかった（表１）。
（３）至適温度
４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたところ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベートし、残存活性を測定したところ、６５℃、１５分間処理で無処理の９５％以上の活性を示した（図２）。
【００１１】
（５）至適ｐＨ
２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜７．７）及び２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．７〜９．０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至適ｐＨは６．５〜７．５であった（図３）。
（６）ｐＨ安定性
１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）及び１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いて６０℃で２４時間インキュベートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図４）。
（７）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
（８）分子量
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア・バイオテク（株））を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子量を求めた結果、本酵素の分子量は１１万〜１５万であった。
（９）等電点
等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移動度から等電点は４．６〜５．２であった。
（１０）阻害剤
１ｍＭのＨｇＣｌ２ で９９％、ＺｎＳＯ４ で８０％の活性阻害が見られた（表２）。
【００１２】
本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及び従来公知の微生物由来のトレハロースホスホリラーゼの酵素学的性質を比較して表３に示す。表３から明らかなように、本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼは、既知のトレハロースホスホリラーゼと比べ、少なくとも起源とする菌種、至適温度及び熱安定性が異なるので、新規であると判断された。
【００１３】
本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼはバチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取することによって製造される。
【００１４】
本発明に使用される微生物としてはバチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよい。好適な微生物としてはバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物があげられる。具体的には本発明者らが神奈川県の山中の土壌から分離したバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）が挙げられる。
【００１５】
本菌の菌学的性質は表４に示す通りである。
これらの性質により、「バージェーズ・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー」第８版に基づき本菌をバチルス・ステアロサーモフィラスと同定した。
しかしながら、これまでにバチルス・ステアロサーモフィラスと同定された微生物中でトレハロースホスホリラーゼを産生するものは知られていない。従って、本発明に用いる耐熱性トレハロースホスホリラーゼ生産菌は新規なものであると考えられる。これを確認するために公的菌株機関が保持する同種の菌株のトレハロースホスホリラーゼ生産能について調べたが、トレハロースホスホリラーゼを生産するものはなかった（比較例１）。
【００１６】
本発明で使用する微生物は野性株に限らず、野性株例えば上記ＳＫ−１株を紫外線、エックス線、放射線、薬品〔ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホネート）等〕等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変異株も、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する限り使用できる。
【００１７】
本発明に使用する栄養培地としては炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマルトース、トレハロース、グルコース、フラクトース、糖 、デキストリン、デンプン、グリセリンなどの炭水化物などが用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物が用いられる。
【００１８】
窒素源としてはまたペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテインなどの窒素含有天然物も使用できる。
無機物としてはリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどが用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じ使用する。
【００１９】
次に本発明においては培地中にトレハロースやマルトースをトレハロースホスホリラーゼの誘導物質として存在せしめることなく耐熱性トレハロースホスホリラーゼを生産することが可能であるが、トレハロースやマルトースの存在によって、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの生成量を増加せしめることができる場合がある。
【００２０】
培養法としては液体培養法（振盪培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は４０〜６５℃の範囲で行うことができるが、４５〜６０℃が好適である。ｐＨは６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件によって変わってくるが、通常２４〜８４時間程度であり、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。
【００２１】
このようにして得られた培養物から本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取するには、まず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体画分に分画する。耐熱性トレハロースホスホリラーゼは前述の両画分に検出されるが、主に培養液画分から得られるので、この画分をさらに、限外ろ過、塩析、透析、溶媒沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点沈澱等の周知の単離・精製方法の単独或いは組み合わせに付すことにより、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの濃縮或いは精製標品を得ることができる。本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの単離・精製の具体例を実施例１に示す。
【００２２】
本発明はまた上記耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下にグルコースとβ−グルコース−１−リン酸とを反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法を包含する。この反応は水性媒体中で行う。
この場合に用いられる耐熱性トレハロースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．０の緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、さらに好ましくは６０〜６５℃のいずれかの温度で、特に６５℃で、１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有するものが好適に用いられる。具体的には上記（１）〜（１０）の酵素化学的性質のうち、少なくとも（１）〜（６）および（８）の性質を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は精製酵素であっても、上記トレハロースの製造方法に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有した粗酵素であっても良い。粗酵素としては上記培養液画分等の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ含有画分から塩析または溶媒沈澱により沈澱させた粗酵素、またはこれをさらに前記したような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定化酵素を用いることも可能である。
【００２３】
この反応に用いるグルコースとβ−グルコース−１−リン酸は試薬等であってもよいし、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属細菌が産生する既知のマルトースホスホリラーゼ（特開平１−９７７８、特開昭６０−５４０３６）や市販のマルトースホスホリラーゼをマルトースに作用させて生成したグルコースとβ−グルコース−１−リン酸であってもよい。
水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸・水酸化ナトリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２４】
グルコースとβ−グルコース−１−リン酸の使用比率はモル比で３：１〜１：３、好ましくは１：１が適当であり、酵素は両者のうち少量成分０．１モルに対して０．０５〜１０単位、好ましくは０．１〜１単位が適当である。
上記反応は温度、一般に５５℃以上、雑菌汚染をさらに避けるとともに収率を上げるため好ましくは６０〜７０℃、ｐＨ一般に４．５〜９．０、好ましくは５．５〜８．５で行うのが適当である。上記条件下で十分なトレハロースの生成が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常３０分〜７２時間で終了する。
【００２５】
反応終了後、反応液の加熱による酵素の失活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、エタノール晶出処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせてトレハロースを得ることができる。
【００２６】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。
（培養）
ＳＫ−１株を、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、ポリペプトン１ｇ／ｄｌ、マルトース１ｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）からなる、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌した液体培地に１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養後、遠心分離によって菌体と培養液とを分離した。
【００２７】
（粗酵素の調製）
分離した培養液に硫安を４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、粗酵素液とした。
（イオン交換クロマトグラフィー）
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、５カラム容量の０〜０．４ｍＭＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩後、更に、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
【００２８】
（疎水クロマトグラフィー）
４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、８カラム容量の４０〜０％飽和硫酸アンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
（吸着クロマトグラフィー）
０．３ｍＭとなるようにＣａＣｌ２ を溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＰＥＮＴＡＸ ＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、１０カラム容量の１０〜３００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
【００２９】
（ゲル濾過クロマトグラフィー）
０．２ＭとなるようにＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテク（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
（ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動）
上記精製酵素溶液をネイティブアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバンドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認できた。
【００３０】
実施例２
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
酵母エキス ２ｇ／ｄｌ、ポリペプトン １ｇ／ｄｌ、マルトース １ｇ／ｄｌを含有する培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、ＳＫ−１株を１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離に付して菌体を分離し、上清液に硫安を４０〜８０％飽和となるように溶解し、析出したタンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、１２単位／ｍｌ粗酵素液８ｍｌを得た。
【００３１】
（トレハロースの生成）
この様にして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液０．３ｍｌ（１．５単位／ｍｌ）、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、蒸留水０．２８ｍｌからなる反応液を５５℃、１時間、２時間、１６時間、及び７０℃、１時間インキュベートした。反応の停止は、１０分間の煮沸によって行った。反応終了後、各反応液を、ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｏ８０カラム（２５０ｘ４．６ｍｍφ）（東ソー（株））、溶離液アセトニトリル／水（７６／２４（ｖ／ｖ） ）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））（検出手段）を用いる高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。結果を表５に示す。５５℃、１６時間の反応で生成したトレハロースは２４．３ｍＭであった。
【００３２】
実施例３
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
実施例１で調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液１００ｍｌをＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥト−ヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））１６０ｍｌを充鎮したカラムに吸着させた後、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）と塩化ナトリウム０．４Ｍを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いて８００ｍｌの直線濃度勾配溶出を行った。溶出液８ｍｌずつ分取したところ、フラクション番号５５〜７５の画分に目的の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ活性が認められた。この画分を限外濾過により濃縮、脱塩し、酵素単位１５．５単位／ｍｌの部分精製酵素液２０ｍｌを得た。
【００３３】
（トレハロースの生成）
この様にして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液を約１０倍に希釈したもの０．３ｍｌ（０．４単位／ｍｌ）、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍ，、蒸留水０．２８ｍｌからなる反応液を６５℃で１時間インキュベートした。反応の停止は、１０分間の煮沸によって行った。反応終了後、反応液を、実施例１と同じ条件での高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。生成したトレハロースは１０．９ｍＭであった。
【００３４】
実施例４
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及びマルトースホスホリラーゼの調製）耐熱性トレハロースホスホリラーゼは実施例１と同様にＳＫ−１株の培養液から硫安沈澱によって得た。活性は１．５単位／ｍｌであった。
一方、既知マルトースホスホリラーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）の調製は以下のように行った。酵母エキス０．２ｇ／ｄｌ、ペプトン１ｇ／ｄｌ、マルトース１ｇ／ｄｌ、酢酸ナトリウム１ｇ／ｄｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．０２ｇ／ｄｌ、硫酸マンガン４水和物０．０００２ｇ／ｄｌを含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、ラクトバチルス ブレビスＩＦＯ３３４５を１白金耳植菌し、３０℃で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離に付して菌体を集め、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁後、超音波細胞破砕機により菌体を破砕し、菌体破砕物を遠心分離に付し、上清液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の活性は０．８単位／ｍｌであった。
【００３５】
（トレハロースの生成）
まず、このようにして調製したマルトースホスホリラーゼ粗酵素液０．５ｍｌ（０．４単位／ｍｌ）、７．２ｇ／ｄｌマルトース０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０８ｍｌ、蒸留水０．２２ｍｌからなる反応液を３７℃で１時間インキュベートした。この反応液中には７．０ｍＭのβ−グルコース−１−リン酸が生成していた。
さらに、この反応液１ｍｌに耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液０．１４ｍｌを加え、７０℃で１時間インキュベートした後、１０分間煮沸して反応を停止した。反応終了後、反応液を実施例１と同じ条件での高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。その結果、反応液中には４．６ｍＭのトレハロースが生成していた。
【００３６】
比較例１
これまでにトレハロースホスホリラーゼを産生するバチルス・ステアロサーモフィラスの報告はなく、（財）発酵研究所保存の同種菌株について活性の有無を調べたがトレハロースホスホリラーゼ活性は検出されなかった。すなわち、バチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０、ＩＦＯ１２９８３、ＩＦＯ１３７３７及びＳＫ−１を液体培地（酵母エキス１ｇ／ｄｌ、ポリペプトン２ｇ／ｄｌ、Ｃ源としてトレハロースまたはマルトース２ｇ／ｄｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養し、遠心分離によって菌体と培養液に分けた。菌体は洗浄後、超音波細胞破砕によって菌体内粗酵素液を調製した。培養液は硫安を８０％飽和になるように溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離で回収した。これをリン酸緩衝液に溶解した後、透析を行い菌体外粗酵素液とした。それぞれの粗酵素液は以下の条件で反応を行い、トレハロースの合成を調べることでトレハロースホスホリラーゼ活性の有無を判定した。結果を表６に示す。
【００３７】
反応液：粗酵素液０．３ｍｌ、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、蒸留水０．２８ｍｌ
反 応：５５℃、１６時間
検 出：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））を用いる高速液体クロマトグラフィーによってトレハロースのピークの検出を行った。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によって提供されるトレハロースホスホリラーゼは耐熱性を有し、グルコースとグルコース−１−リン酸からトレハロースを生成する。この酵素を用いて高い反応温度で酵素反応を行うことにより、トレハロースを、雑菌汚染の低減、反応時間の短縮化を図りつつ、工業的に有利に製造することができる。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適温度を示す。
【図２】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの熱安定性を示す。
【図３】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適ｐＨを示す。
【図４】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼのｐＨ安定性を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及びその用途に関するものであり、さらに詳しくは、バチルス属に属する好熱性細菌が産生する高い熱安定性を有する新規なトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、該好熱性細菌、並びに該酵素を用いるトレハロースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質である。
従来、トレハロースを調製する方法としては、酵母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細菌による発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られている。しかし、これらの方法で調製したトレハロースは、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くなり、非常に高価である。
【０００３】
一方、安価にトレハロースを調製する有効な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、茸類であるグリフォラ・フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）（日本農芸化学会誌、６８、５８０、１９９４）やシゾフィラム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、アガリカス・ビスポーラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、プルロータス・オストレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、リフィラム・ウルマリウム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｕｌｍａｒｉｕｍ）（特開平６−１８９７７９）が産生するトレハロースホスホリラーゼを用い、α−グルコース−１−リン酸とグルコースからトレハロースを製造する方法がある。しかし、本製造方法で用いる酵素は熱安定性が低く、反応温度が２５〜５０℃であるため、製造工程で雑菌汚染が起こる可能性が高いといった問題がある。
【０００４】
また、別な酵素法として、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを用い、マルトースを基質としてβ−グルコース−１−リン酸を経てトレハロースを製造する方法がある（特公昭６３−６０９９８）。しかし、本製造法に使用可能な、既知のトレハロースホスホリラーゼは、緑藻であるユーグレナ・グラチリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３２２３〜３２２８，１９７２）が産生するのみで、この酵素の至適温度は４０℃で温度安定性が悪く、しかも調製が非常に難しいので工業的に利用するのは困難であるといった問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
トレハロースを安価に、且つ、工業的規模で製造する方法としてはトレハロースホスホリラーゼを用いた酵素法が最も有効であると考えられる。
一方、工業的に酵素反応で生産を行う場合、雑菌汚染の低減の目的から、反応温度の高温化が一般的に採られている。また、反応温度の高温化は、基質と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くすることができる、酵素反応速度が早くなり反応時間の短縮化ができる等の利点があり、コスト的にも有効である。
このように高温での酵素反応でトレハロースの製造を行うためには、高い熱安定性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼが要求される。しかし、前述の茸類や緑藻類起源のトレハロースホスホリラーゼは熱安定性は必ずしも高くない。
従って、実際の高温酵素反応に適する酵素、具体的には５５℃以上で安定な酵素の提供が求められていた。
【０００６】
本発明者らは高い熱安定性を有し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸からトレハロースを生成する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを自然界より探索した結果、バチルス属に属する好熱性細菌が上記目的にかなう酵素をよく産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明による耐熱性トレハロースホスホリラーゼ標品の性質は以下の通りである。耐熱性トレハロースホスホリラーゼ標品としては実施例１で得られたものを使用した。
尚、トレハロースホスホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２ｇ／ｄｌトレハロース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、２０分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣＩＩ−テストワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該測定値から生成グルコース量を求めた。またトレハロースホスホリラーゼ活性の定義については、上記測定条件下で１分間に１μｍｏｌのトレハロースを加リン酸分解する酵素量を１単位とした。
【０００８】
（１）作用
式（１）で示すように、トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
【０００９】
【化１】
（２）基質特異性
トレハロース、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行ったところ、トレハロース以外にはグルコースの生成がほとんど認められなかった（表１）。
（３）至適温度
４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたところ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベートし、残存活性を測定したところ、６５℃、１５分間処理で無処理の９５％以上の活性を示した（図２）。
【００１１】
（５）至適ｐＨ
２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜７．７）及び２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．７〜９．０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至適ｐＨは６．５〜７．５であった（図３）。
（６）ｐＨ安定性
１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）及び１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いて６０℃で２４時間インキュベートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図４）。
（７）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
（８）分子量
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア・バイオテク（株））を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子量を求めた結果、本酵素の分子量は１１万〜１５万であった。
（９）等電点
等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移動度から等電点は４．６〜５．２であった。
（１０）阻害剤
１ｍＭのＨｇＣｌ２ で９９％、ＺｎＳＯ４ で８０％の活性阻害が見られた（表２）。
【００１２】
本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及び従来公知の微生物由来のトレハロースホスホリラーゼの酵素学的性質を比較して表３に示す。表３から明らかなように、本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼは、既知のトレハロースホスホリラーゼと比べ、少なくとも起源とする菌種、至適温度及び熱安定性が異なるので、新規であると判断された。
【００１３】
本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼはバチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取することによって製造される。
【００１４】
本発明に使用される微生物としてはバチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよい。好適な微生物としてはバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属し、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する微生物があげられる。具体的には本発明者らが神奈川県の山中の土壌から分離したバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）が挙げられる。
【００１５】
本菌の菌学的性質は表４に示す通りである。
これらの性質により、「バージェーズ・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー」第８版に基づき本菌をバチルス・ステアロサーモフィラスと同定した。
しかしながら、これまでにバチルス・ステアロサーモフィラスと同定された微生物中でトレハロースホスホリラーゼを産生するものは知られていない。従って、本発明に用いる耐熱性トレハロースホスホリラーゼ生産菌は新規なものであると考えられる。これを確認するために公的菌株機関が保持する同種の菌株のトレハロースホスホリラーゼ生産能について調べたが、トレハロースホスホリラーゼを生産するものはなかった（比較例１）。
【００１６】
本発明で使用する微生物は野性株に限らず、野性株例えば上記ＳＫ−１株を紫外線、エックス線、放射線、薬品〔ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホネート）等〕等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変異株も、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ産生能を有する限り使用できる。
【００１７】
本発明に使用する栄養培地としては炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマルトース、トレハロース、グルコース、フラクトース、糖 、デキストリン、デンプン、グリセリンなどの炭水化物などが用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物が用いられる。
【００１８】
窒素源としてはまたペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテインなどの窒素含有天然物も使用できる。
無機物としてはリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどが用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じ使用する。
【００１９】
次に本発明においては培地中にトレハロースやマルトースをトレハロースホスホリラーゼの誘導物質として存在せしめることなく耐熱性トレハロースホスホリラーゼを生産することが可能であるが、トレハロースやマルトースの存在によって、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの生成量を増加せしめることができる場合がある。
【００２０】
培養法としては液体培養法（振盪培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は４０〜６５℃の範囲で行うことができるが、４５〜６０℃が好適である。ｐＨは６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件によって変わってくるが、通常２４〜８４時間程度であり、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。
【００２１】
このようにして得られた培養物から本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取するには、まず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体画分に分画する。耐熱性トレハロースホスホリラーゼは前述の両画分に検出されるが、主に培養液画分から得られるので、この画分をさらに、限外ろ過、塩析、透析、溶媒沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点沈澱等の周知の単離・精製方法の単独或いは組み合わせに付すことにより、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの濃縮或いは精製標品を得ることができる。本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの単離・精製の具体例を実施例１に示す。
【００２２】
本発明はまた上記耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下にグルコースとβ−グルコース−１−リン酸とを反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法を包含する。この反応は水性媒体中で行う。
この場合に用いられる耐熱性トレハロースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．０の緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、さらに好ましくは６０〜６５℃のいずれかの温度で、特に６５℃で、１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有するものが好適に用いられる。具体的には上記（１）〜（１０）の酵素化学的性質のうち、少なくとも（１）〜（６）および（８）の性質を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は精製酵素であっても、上記トレハロースの製造方法に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有した粗酵素であっても良い。粗酵素としては上記培養液画分等の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ含有画分から塩析または溶媒沈澱により沈澱させた粗酵素、またはこれをさらに前記したような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定化酵素を用いることも可能である。
【００２３】
この反応に用いるグルコースとβ−グルコース−１−リン酸は試薬等であってもよいし、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属細菌が産生する既知のマルトースホスホリラーゼ（特開平１−９７７８、特開昭６０−５４０３６）や市販のマルトースホスホリラーゼをマルトースに作用させて生成したグルコースとβ−グルコース−１−リン酸であってもよい。
水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸・水酸化ナトリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２４】
グルコースとβ−グルコース−１−リン酸の使用比率はモル比で３：１〜１：３、好ましくは１：１が適当であり、酵素は両者のうち少量成分０．１モルに対して０．０５〜１０単位、好ましくは０．１〜１単位が適当である。
上記反応は温度、一般に５５℃以上、雑菌汚染をさらに避けるとともに収率を上げるため好ましくは６０〜７０℃、ｐＨ一般に４．５〜９．０、好ましくは５．５〜８．５で行うのが適当である。上記条件下で十分なトレハロースの生成が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常３０分〜７２時間で終了する。
【００２５】
反応終了後、反応液の加熱による酵素の失活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、エタノール晶出処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせてトレハロースを得ることができる。
【００２６】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。
（培養）
ＳＫ−１株を、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、ポリペプトン１ｇ／ｄｌ、マルトース１ｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）からなる、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌した液体培地に１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養後、遠心分離によって菌体と培養液とを分離した。
【００２７】
（粗酵素の調製）
分離した培養液に硫安を４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、粗酵素液とした。
（イオン交換クロマトグラフィー）
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、５カラム容量の０〜０．４ｍＭＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩後、更に、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
【００２８】
（疎水クロマトグラフィー）
４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、８カラム容量の４０〜０％飽和硫酸アンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
（吸着クロマトグラフィー）
０．３ｍＭとなるようにＣａＣｌ２ を溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＰＥＮＴＡＸ ＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、１０カラム容量の１０〜３００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
【００２９】
（ゲル濾過クロマトグラフィー）
０．２ＭとなるようにＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテク（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。
（ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動）
上記精製酵素溶液をネイティブアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバンドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認できた。
【００３０】
実施例２
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
酵母エキス ２ｇ／ｄｌ、ポリペプトン １ｇ／ｄｌ、マルトース １ｇ／ｄｌを含有する培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、ＳＫ−１株を１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離に付して菌体を分離し、上清液に硫安を４０〜８０％飽和となるように溶解し、析出したタンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、１２単位／ｍｌ粗酵素液８ｍｌを得た。
【００３１】
（トレハロースの生成）
この様にして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液０．３ｍｌ（１．５単位／ｍｌ）、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、蒸留水０．２８ｍｌからなる反応液を５５℃、１時間、２時間、１６時間、及び７０℃、１時間インキュベートした。反応の停止は、１０分間の煮沸によって行った。反応終了後、各反応液を、ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｏ８０カラム（２５０ｘ４．６ｍｍφ）（東ソー（株））、溶離液アセトニトリル／水（７６／２４（ｖ／ｖ） ）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））（検出手段）を用いる高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。結果を表５に示す。５５℃、１６時間の反応で生成したトレハロースは２４．３ｍＭであった。
【００３２】
実施例３
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
実施例１で調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液１００ｍｌをＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥト−ヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））１６０ｍｌを充鎮したカラムに吸着させた後、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）と塩化ナトリウム０．４Ｍを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いて８００ｍｌの直線濃度勾配溶出を行った。溶出液８ｍｌずつ分取したところ、フラクション番号５５〜７５の画分に目的の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ活性が認められた。この画分を限外濾過により濃縮、脱塩し、酵素単位１５．５単位／ｍｌの部分精製酵素液２０ｍｌを得た。
【００３３】
（トレハロースの生成）
この様にして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液を約１０倍に希釈したもの０．３ｍｌ（０．４単位／ｍｌ）、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍ，、蒸留水０．２８ｍｌからなる反応液を６５℃で１時間インキュベートした。反応の停止は、１０分間の煮沸によって行った。反応終了後、反応液を、実施例１と同じ条件での高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。生成したトレハロースは１０．９ｍＭであった。
【００３４】
実施例４
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及びマルトースホスホリラーゼの調製）耐熱性トレハロースホスホリラーゼは実施例１と同様にＳＫ−１株の培養液から硫安沈澱によって得た。活性は１．５単位／ｍｌであった。
一方、既知マルトースホスホリラーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）の調製は以下のように行った。酵母エキス０．２ｇ／ｄｌ、ペプトン１ｇ／ｄｌ、マルトース１ｇ／ｄｌ、酢酸ナトリウム１ｇ／ｄｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．０２ｇ／ｄｌ、硫酸マンガン４水和物０．０００２ｇ／ｄｌを含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、ラクトバチルス ブレビスＩＦＯ３３４５を１白金耳植菌し、３０℃で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離に付して菌体を集め、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁後、超音波細胞破砕機により菌体を破砕し、菌体破砕物を遠心分離に付し、上清液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の活性は０．８単位／ｍｌであった。
【００３５】
（トレハロースの生成）
まず、このようにして調製したマルトースホスホリラーゼ粗酵素液０．５ｍｌ（０．４単位／ｍｌ）、７．２ｇ／ｄｌマルトース０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０８ｍｌ、蒸留水０．２２ｍｌからなる反応液を３７℃で１時間インキュベートした。この反応液中には７．０ｍＭのβ−グルコース−１−リン酸が生成していた。
さらに、この反応液１ｍｌに耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液０．１４ｍｌを加え、７０℃で１時間インキュベートした後、１０分間煮沸して反応を停止した。反応終了後、反応液を実施例１と同じ条件での高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、生成したトレハロースを定量した。その結果、反応液中には４．６ｍＭのトレハロースが生成していた。
【００３６】
比較例１
これまでにトレハロースホスホリラーゼを産生するバチルス・ステアロサーモフィラスの報告はなく、（財）発酵研究所保存の同種菌株について活性の有無を調べたがトレハロースホスホリラーゼ活性は検出されなかった。すなわち、バチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０、ＩＦＯ１２９８３、ＩＦＯ１３７３７及びＳＫ−１を液体培地（酵母エキス１ｇ／ｄｌ、ポリペプトン２ｇ／ｄｌ、Ｃ源としてトレハロースまたはマルトース２ｇ／ｄｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、５５℃で７２時間通気攪拌培養し、遠心分離によって菌体と培養液に分けた。菌体は洗浄後、超音波細胞破砕によって菌体内粗酵素液を調製した。培養液は硫安を８０％飽和になるように溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離で回収した。これをリン酸緩衝液に溶解した後、透析を行い菌体外粗酵素液とした。それぞれの粗酵素液は以下の条件で反応を行い、トレハロースの合成を調べることでトレハロースホスホリラーゼ活性の有無を判定した。結果を表６に示す。
【００３７】
反応液：粗酵素液０．３ｍｌ、６ｇ／ｄｌグルコース０．１２ｍｌ（４０ｍＭ）、６ ｇ／ｄｌβ−グルコース−１−リン酸ナトリウム塩０．２ｍｌ（４０ｍＭ）、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、蒸留水０．２８ｍｌ
反 応：５５℃、１６時間
検 出：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））を用いる高速液体クロマトグラフィーによってトレハロースのピークの検出を行った。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によって提供されるトレハロースホスホリラーゼは耐熱性を有し、グルコースとグルコース−１−リン酸からトレハロースを生成する。この酵素を用いて高い反応温度で酵素反応を行うことにより、トレハロースを、雑菌汚染の低減、反応時間の短縮化を図りつつ、工業的に有利に製造することができる。
【００３９】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適温度を示す。
【図２】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの熱安定性を示す。
【図３】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適ｐＨを示す。
【図４】実施例１で得られた耐熱性トレハロースホスホリラーゼのｐＨ安定性を示す。
Claims (6)
- 下記の酵素化学的性質を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ：
（１）作用
トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
（２）基質特異性
トレハロースに特異的に作用する。
（３）至適温度
トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６５℃、１５分間処理後に無処理の９５％以上の活性を有する。
（５）至適ｐＨ
６．５〜７．５
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ６．０〜８．０で安定。
（７）分子量
１１万〜１５万（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇを用いるゲルろ過クロマトグラフィーによる）。 - 下記の酵素化学的性質を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ：
（１）作用
トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を生成する。
（２）基質特異性
トレハロースに作用するが、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドには作用しない。
（３）至適温度
トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す。
（４）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６５℃、１５分間処理後に無処理の９５％以上の活性を有する。
（５）至適ｐＨ
６．５〜７．５
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ６．０〜８．０で安定。
（７）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
（８）分子量
１１万〜１５万（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇを用いるゲルろ過クロマトグラフィーによる）。
（９）等電点
４．６〜５．２。
（１０）阻害剤
Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋で活性が著しく阻害される。 - バチルス・ステアロサーモフィラスに属し、請求項１又は２記載の耐熱性トレハロースホスホリラーゼを産生する能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取することを特徴とする耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造方法。
- 請求項１又は２記載の耐熱性トレハロースホスホリラーゼを産生する能力を有するバチルス・ステアロサーモフィラス。
- バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５６７）。
- 請求項１又は２記載の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下にグルコースとβ−グルコース−１−リン酸とを反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法。
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-
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