JP3640388B2 - 標識された核酸またはタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識された核酸またはタンパク質を製造する方法に関し、特に標識がアイソトープや色素によらない方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、核酸やタンパク質を識別し、同定するための手段としては、一般的に、32P、14C、3H、125Iなどの放射性同位元素を利用して核酸やタンパク質を標識することが行われてきた。また、多種類の核酸を識別し、同定するための手段としては、特性の異なった蛍光を発するビーズ、例えば、Luminex100などで核酸を標識することが行われてきた。
【０００３】
しかしながら、この蛍光を用いた方法においては、最大の識別数が異なった蛍光を発する蛍光ビーズの種類に依存してしまうため、100種類以上の核酸を識別するためには、異なった蛍光を発する同数のビーズを開発する必要があった。このため、この方法では、例えば、イネのDNAのクローン50,000種類あるいはタンパク質10,000種類に対して、それぞれ異なる標識を行うことは不可能であり、その識別数に限界があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたもので、その目的とするところは、核酸やタンパク質を、その種類の数に制限されることなく、効率的に標識することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、外部より非接触的に書き込み及び読み込み可能なLSI（Large scale integrated circuit）と核酸やタンパク質とを結合させ、核酸やタンパク質の情報をLSIに記録することにより、10000種以上もの多種類の核酸やタンパク質であっても効率的に識別し同定することが可能であることを見出した。本発明の方法は、従来のように物質を利用して標識するのではなく、情報を利用して標識することを特徴とするため、標識可能な物質の種類に特に制限はなく、LSIへの記録という作業を通じて簡便に標識が可能である。従って、ゲノム解析の成果として見出された多量の核酸や蛋白質であっても、本発明によれば網羅的かつ効率的に標識することが可能である。
【０００６】
本発明は、より詳しくは、
（１） 標識された核酸またはタンパク質を製造する方法であって、核酸またはタンパク質とLSIとを結合させ、特定の情報をLSIに記録することを特徴とする方法、
（２） 特定の情報が、LSIが結合される核酸または蛋白質の特徴である、（１）に記載の方法、
（３） 核酸またはタンパク質とLSIとの結合において、基質を介在させる、（１）に記載の方法、
（４） 基質が、セルロース酢酸ビニル、アルファシアノアクリレート、シリコン変性ポリマー、エポキシ樹脂、および硫酸カルシウムからなる群より選択される、（３）に記載の方法、
（５） タンパク質とLSIとの結合において、該タンパク質に結合する抗体を介在させる、（１）に記載の方法、
（６） タンパク質の糖鎖とLSIとを結合させ、タンパク質の糖鎖の特徴をLSIに記述する、（１）に記載の方法、を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、標識された核酸またはタンパク質を製造する新規な方法を提供する。本発明の方法は、核酸またはタンパク質とLSIとを結合させ、特定の情報をLSIに記録することを特徴とする。
【０００８】
本発明において「LSI」とは、通信制御を行うICやマイコン不揮発性メモリー等により構成されるLSIチップを意味する。本発明に用いる「LSI」としては、外部からの書き込み及び読みとりができるものであれば特に制限はない。LSIのメモリーは、数10万から数100万の分子を識別するためには、好ましくは32億ビット以上を有する。本発明に用いるLSIは、取り扱い易さの観点から微少であることが好ましい。LSIの市販品としては、ICカードやミューチップ（日立）を例示することができる。また、非接触型ICカードを本発明に用いることも可能である。
【０００９】
本発明において「核酸」とは、DNAおよびRNAなどのポリヌクレオチドを意味する。本発明に用いる核酸の形態は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、直鎖状であっても、環状であってもよい。これら核酸は、天然由来であっても、人為的に合成したものであってもよい。また、DNAは、cDNAであってもゲノムDNAであってもよい。本発明において用いる核酸分子は、ベクターに挿入された形態でありうる。
【００１０】
また、本発明において「蛋白質」とは、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した分子を意味する。従って、本発明の蛋白質には、完全な蛋白質のほか、いわゆるオリゴペプチドやポリペプチドも含まれる。また、天然由来でもよく、人工的に合成されたペプチドであってもよい。
【００１１】
LSIと核酸または蛋白質との結合の形態としては、安定した結合を維持しうる限り特に制限はなく、共有結合、ファンデルワールス力、水素結合等が考えられる。例えば、固相法によりLSIに蛋白質のアミノ基、カルボキシル基、アビジン基などを共有結合させることにより、LSIと蛋白質とを結合させることができる。
【００１２】
本発明におけるLSIと核酸または蛋白質との「結合」は、直接的であっても、間接的であってもよい。従って、核酸またはタンパク質とLSIとの結合においては、例えば、基質を介在させることもできる。基質としては、親水性のものが好ましく、例えば、セルロース酢酸ビニル、アルファシアノアクリレート、シリコン変性ポリマー、エポキシ樹脂、硫酸カルシウムなどを本発明に用いることができる。疎水性のものであっても、その後の処理により親水性になるものであれば、本発明において好適に用いることができる。例えば、フッ素樹脂は疎水性であるが、レーザー光処理によりカルボン酸を生成して親水性になるため、本発明に適用しうる。基質とLSIとの結合あるいは基質と核酸やタンパク質との結合は、例えば、吸着あるいは包埋の手法で行うことが可能である。
【００１３】
また、蛋白質を標識する場合には、基質を用いる以外に、蛋白質に特異的な親和性を有する化合物、例えば、抗体を用いることもできる。抗体は、蛋白質に特異性を有する限り、その形態に特に制限はなく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、一本鎖抗体や抗体の断片であってもよい。
【００１４】
本発明においては、核酸または蛋白質に結合されたLSIに「特定の情報」を記録することにより、該核酸または蛋白質を標識する。特定の情報としては、識別可能な情報であれば特に制限はなく、例えば、個々の核酸や蛋白質の特徴であってもよい。核酸や蛋白質の特徴としては、例えば、鎖長、鎖の数、分子量、糖鎖の特徴、活性、機能、由来などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００１５】
LSIに記録された情報は、非接触的に電磁波で読み取ることができるため、本発明によれば蛋白質や核酸の識別は容易に行うことができる。また、LSIを用いれば、一群の核酸や蛋白質を電磁波の塊として読み取ることができる。このため、従来のDNAアレイや蛋白質アレイのようにガラス等の基板上に整列させることなく、簡便に一群の核酸や蛋白質を分類することが可能である。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例を制限するものではない。
[実施例１] LSIで標識された核酸の調製
LSI上に貼り付けた基質、セルロース酢酸ビニル（１）、アルファシアノアクリレート（２）、シリコン変性ポリマー（３）、エポキシ樹脂（４）、硫酸カルシウム（５）上に、グルテリンcDNAあるいはリボゾーム遺伝子を添加し、3ヶ月冷蔵庫にて放置した。その後100mLの溶解緩衝液（1 mM EDTA, 0.5 M NH4OAc, 10 mM MgCl2, 0.1% SDS）にて回収後、70％エタノール沈殿にて濃縮し、1％アガロースゲル電気泳動にて回収率を確認した。（５）の硫酸カルシウムにおいては核酸が吸着されてしまい回収ができなかったが、その他の基質については30％位の割合で回収できた。
【００１７】
[実施例２] LSIで標識されたタンパク質の調製
LSI上に貼り付けた基質、セルロース酢酸ビニル（１）、アルファシアノアクリレート（２）、シリコン変性ポリマー（３）、エポキシ樹脂（４）、硫酸カルシウム（５）上に、精製タンパク質であるフォスフォリラーゼあるいは牛血清アルブミンを5mL（１mg）添加し、3ヶ月冷蔵庫にて放置した。その後、5mLの試料用緩衝液（SDS-sample buffer）にて回収後、SDS-PAGE電気泳動しクマシーブリリアントブルー染色・脱色にて回収率を確認した。図中、Cは対象を示し、精製タンパク質である１mgフォスフォリラーゼあるいはアルブミンを直接電気泳動した。シリコン変性ポリマー（３）においてフォスフォリラーゼについては100％、アルブミンについては90％の回収率を示した。
【００１８】
【発明の効果】
従来は、多種類の核酸や蛋白質を識別するために、その種類の数に応じて、異なるシグナルを発する「物質」を開発する必要があったが、本発明の方法は、LSIという同一の物質に、識別すべき核酸や蛋白質に応じた異なる「情報」を記録し、情報の差異に基づいて識別するという手法を採用している。このため、情報の種類に制限がない以上、理論上は、識別しうる核酸や蛋白質の種類の数にも制限はない。さらに、識別が情報の内容によるため簡便かつ確実であり、また、常時認識できるという利点も有する。従って、本発明により、標識しうる核酸および蛋白質の種類および標識の効率を飛躍的に向上させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々の基質を利用してLSIとフォスフォリラーゼとを結合させた場合における、フォスフォリラーゼの回収率を示す電気泳動像である。
【図２】 種々の基質を利用してLSIとアルブミンとを結合させた場合における、アルブミンの回収率を示す電気泳動像である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識された核酸またはタンパク質を製造する方法に関し、特に標識がアイソトープや色素によらない方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、核酸やタンパク質を識別し、同定するための手段としては、一般的に、32P、14C、3H、125Iなどの放射性同位元素を利用して核酸やタンパク質を標識することが行われてきた。また、多種類の核酸を識別し、同定するための手段としては、特性の異なった蛍光を発するビーズ、例えば、Luminex100などで核酸を標識することが行われてきた。
【０００３】
しかしながら、この蛍光を用いた方法においては、最大の識別数が異なった蛍光を発する蛍光ビーズの種類に依存してしまうため、100種類以上の核酸を識別するためには、異なった蛍光を発する同数のビーズを開発する必要があった。このため、この方法では、例えば、イネのDNAのクローン50,000種類あるいはタンパク質10,000種類に対して、それぞれ異なる標識を行うことは不可能であり、その識別数に限界があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたもので、その目的とするところは、核酸やタンパク質を、その種類の数に制限されることなく、効率的に標識することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、外部より非接触的に書き込み及び読み込み可能なLSI（Large scale integrated circuit）と核酸やタンパク質とを結合させ、核酸やタンパク質の情報をLSIに記録することにより、10000種以上もの多種類の核酸やタンパク質であっても効率的に識別し同定することが可能であることを見出した。本発明の方法は、従来のように物質を利用して標識するのではなく、情報を利用して標識することを特徴とするため、標識可能な物質の種類に特に制限はなく、LSIへの記録という作業を通じて簡便に標識が可能である。従って、ゲノム解析の成果として見出された多量の核酸や蛋白質であっても、本発明によれば網羅的かつ効率的に標識することが可能である。
【０００６】
本発明は、より詳しくは、
（１） 標識された核酸またはタンパク質を製造する方法であって、核酸またはタンパク質とLSIとを結合させ、特定の情報をLSIに記録することを特徴とする方法、
（２） 特定の情報が、LSIが結合される核酸または蛋白質の特徴である、（１）に記載の方法、
（３） 核酸またはタンパク質とLSIとの結合において、基質を介在させる、（１）に記載の方法、
（４） 基質が、セルロース酢酸ビニル、アルファシアノアクリレート、シリコン変性ポリマー、エポキシ樹脂、および硫酸カルシウムからなる群より選択される、（３）に記載の方法、
（５） タンパク質とLSIとの結合において、該タンパク質に結合する抗体を介在させる、（１）に記載の方法、
（６） タンパク質の糖鎖とLSIとを結合させ、タンパク質の糖鎖の特徴をLSIに記述する、（１）に記載の方法、を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、標識された核酸またはタンパク質を製造する新規な方法を提供する。本発明の方法は、核酸またはタンパク質とLSIとを結合させ、特定の情報をLSIに記録することを特徴とする。
【０００８】
本発明において「LSI」とは、通信制御を行うICやマイコン不揮発性メモリー等により構成されるLSIチップを意味する。本発明に用いる「LSI」としては、外部からの書き込み及び読みとりができるものであれば特に制限はない。LSIのメモリーは、数10万から数100万の分子を識別するためには、好ましくは32億ビット以上を有する。本発明に用いるLSIは、取り扱い易さの観点から微少であることが好ましい。LSIの市販品としては、ICカードやミューチップ（日立）を例示することができる。また、非接触型ICカードを本発明に用いることも可能である。
【０００９】
本発明において「核酸」とは、DNAおよびRNAなどのポリヌクレオチドを意味する。本発明に用いる核酸の形態は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、直鎖状であっても、環状であってもよい。これら核酸は、天然由来であっても、人為的に合成したものであってもよい。また、DNAは、cDNAであってもゲノムDNAであってもよい。本発明において用いる核酸分子は、ベクターに挿入された形態でありうる。
【００１０】
また、本発明において「蛋白質」とは、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した分子を意味する。従って、本発明の蛋白質には、完全な蛋白質のほか、いわゆるオリゴペプチドやポリペプチドも含まれる。また、天然由来でもよく、人工的に合成されたペプチドであってもよい。
【００１１】
LSIと核酸または蛋白質との結合の形態としては、安定した結合を維持しうる限り特に制限はなく、共有結合、ファンデルワールス力、水素結合等が考えられる。例えば、固相法によりLSIに蛋白質のアミノ基、カルボキシル基、アビジン基などを共有結合させることにより、LSIと蛋白質とを結合させることができる。
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本発明におけるLSIと核酸または蛋白質との「結合」は、直接的であっても、間接的であってもよい。従って、核酸またはタンパク質とLSIとの結合においては、例えば、基質を介在させることもできる。基質としては、親水性のものが好ましく、例えば、セルロース酢酸ビニル、アルファシアノアクリレート、シリコン変性ポリマー、エポキシ樹脂、硫酸カルシウムなどを本発明に用いることができる。疎水性のものであっても、その後の処理により親水性になるものであれば、本発明において好適に用いることができる。例えば、フッ素樹脂は疎水性であるが、レーザー光処理によりカルボン酸を生成して親水性になるため、本発明に適用しうる。基質とLSIとの結合あるいは基質と核酸やタンパク質との結合は、例えば、吸着あるいは包埋の手法で行うことが可能である。
【００１３】
また、蛋白質を標識する場合には、基質を用いる以外に、蛋白質に特異的な親和性を有する化合物、例えば、抗体を用いることもできる。抗体は、蛋白質に特異性を有する限り、その形態に特に制限はなく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、一本鎖抗体や抗体の断片であってもよい。
【００１４】
本発明においては、核酸または蛋白質に結合されたLSIに「特定の情報」を記録することにより、該核酸または蛋白質を標識する。特定の情報としては、識別可能な情報であれば特に制限はなく、例えば、個々の核酸や蛋白質の特徴であってもよい。核酸や蛋白質の特徴としては、例えば、鎖長、鎖の数、分子量、糖鎖の特徴、活性、機能、由来などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００１５】
LSIに記録された情報は、非接触的に電磁波で読み取ることができるため、本発明によれば蛋白質や核酸の識別は容易に行うことができる。また、LSIを用いれば、一群の核酸や蛋白質を電磁波の塊として読み取ることができる。このため、従来のDNAアレイや蛋白質アレイのようにガラス等の基板上に整列させることなく、簡便に一群の核酸や蛋白質を分類することが可能である。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例を制限するものではない。
[実施例１] LSIで標識された核酸の調製
LSI上に貼り付けた基質、セルロース酢酸ビニル（１）、アルファシアノアクリレート（２）、シリコン変性ポリマー（３）、エポキシ樹脂（４）、硫酸カルシウム（５）上に、グルテリンcDNAあるいはリボゾーム遺伝子を添加し、3ヶ月冷蔵庫にて放置した。その後100mLの溶解緩衝液（1 mM EDTA, 0.5 M NH4OAc, 10 mM MgCl2, 0.1% SDS）にて回収後、70％エタノール沈殿にて濃縮し、1％アガロースゲル電気泳動にて回収率を確認した。（５）の硫酸カルシウムにおいては核酸が吸着されてしまい回収ができなかったが、その他の基質については30％位の割合で回収できた。
【００１７】
[実施例２] LSIで標識されたタンパク質の調製
LSI上に貼り付けた基質、セルロース酢酸ビニル（１）、アルファシアノアクリレート（２）、シリコン変性ポリマー（３）、エポキシ樹脂（４）、硫酸カルシウム（５）上に、精製タンパク質であるフォスフォリラーゼあるいは牛血清アルブミンを5mL（１mg）添加し、3ヶ月冷蔵庫にて放置した。その後、5mLの試料用緩衝液（SDS-sample buffer）にて回収後、SDS-PAGE電気泳動しクマシーブリリアントブルー染色・脱色にて回収率を確認した。図中、Cは対象を示し、精製タンパク質である１mgフォスフォリラーゼあるいはアルブミンを直接電気泳動した。シリコン変性ポリマー（３）においてフォスフォリラーゼについては100％、アルブミンについては90％の回収率を示した。
【００１８】
【発明の効果】
従来は、多種類の核酸や蛋白質を識別するために、その種類の数に応じて、異なるシグナルを発する「物質」を開発する必要があったが、本発明の方法は、LSIという同一の物質に、識別すべき核酸や蛋白質に応じた異なる「情報」を記録し、情報の差異に基づいて識別するという手法を採用している。このため、情報の種類に制限がない以上、理論上は、識別しうる核酸や蛋白質の種類の数にも制限はない。さらに、識別が情報の内容によるため簡便かつ確実であり、また、常時認識できるという利点も有する。従って、本発明により、標識しうる核酸および蛋白質の種類および標識の効率を飛躍的に向上させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々の基質を利用してLSIとフォスフォリラーゼとを結合させた場合における、フォスフォリラーゼの回収率を示す電気泳動像である。
【図２】 種々の基質を利用してLSIとアルブミンとを結合させた場合における、アルブミンの回収率を示す電気泳動像である。
Claims (6)
- 標識された核酸またはタンパク質を製造する方法であって、核酸またはタンパク質とLSIとを結合させ、特定の情報をLSIに記録することを特徴とする方法。
- 特定の情報が、LSIが結合される核酸または蛋白質の特徴である、請求項１に記載の方法。
- 核酸またはタンパク質とLSIとの結合において、基質を介在させる、請求項１に記載の方法。
- 基質が、セルロース酢酸ビニル、アルファシアノアクリレート、シリコン変性ポリマー、エポキシ樹脂、および硫酸カルシウムからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
- タンパク質とLSIとの結合において、該タンパク質に結合する抗体を介在させる、請求項１に記載の方法。
- タンパク質の糖鎖とLSIとを結合させ、タンパク質の糖鎖の特徴をLSIに記述する、請求項１に記載の方法。
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