JP3645566B2

JP3645566B2 - 蛍光エネルギー伝達基質

Info

Publication number: JP3645566B2
Application number: JP50040295A
Authority: JP
Inventors: ガーマン，アンドリュー・ジョン
Original assignee: AstraZeneca UK Ltd
Current assignee: AstraZeneca UK Ltd
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: EP0700447B1; GB9410737D0; JPH09504778A; WO1994028166A1; GB9310978D0; DE69432589D1; DE69432589T2; US6291201B1; GB2278356A; AU6801794A; EP0700447A1

Description

加水分解酵素に対する蛍光エネルギー伝達（FRET）基質の概念は、最初にカーメル（Carmel）ら（FEBS Lett.,30,11−14（1973））により示唆された；彼らはナフチルを供与体として、かつアントラセンを受容体として用いるトリプシン基質を記載している。その時以来、この原理を利用した幾つかのプロテアーゼ基質が記載されている。この方法では、供与体である発蛍光団および受容体分子が開裂すべき結合の両側に配置され、供与体である発蛍光団の蛍光の大部分が受容体への無放射（radiationless）エネルギー伝達により消光するのに十分なほど近接している。開裂すると供与体と受容体の距離が大幅に増大し、これは蛍光の増強によって明らかになる。この場合、受容体部分は発蛍光団である必要がない；重要な要件は、吸収最大が供与体である発蛍光団の発光最大と同じであるか、または近接していなければならないということである。所望により受容体自身が発蛍光団であってもよく、この場合、酵素反応に続いて受容体である発蛍光団のエネルギー伝達蛍光の減少が起こる。多様な供与体および受容体が用いられており、一般に知られた対は“インシーケンス（in−sequence）”の供与体としてのトリプトファンと受容体としてのダンシルである。エネルギー伝達基質は、天然基質に置いて開裂部位に対してＣ末端側のアミノ酸を有意に認識するプロテアーゼに特に有用である；このような認識部位をもたない他のプロテアーゼは蛍光原性または色素原性の脱離基をもつペプチドを用いて測定するのが好都合である。
現在のFRET基質はUV励起を必要とする発蛍光団に限定されている。このためそれらを特に化合物のスクリーニング法に使用するのが制限される。さらに供与体種および／または受容体種はペプチド基質の合成中に結合される。これは一般に特殊な試薬およびそれらの使用に関してノウハウを必要とする。従って一連の供与体種および受容体種を特定の基質に関して評価するのは容易になしうることではない。
ワン（Wang）ら（Tet.Lett.,1990,13,6493−6496）は、ペプチド基質のＣ−およびＮ末端への供与体種および受容体種の付加を伴う蛍光原性HIVプロテアーゼ基質の製造方法を記載している。しかし著者らが認めているように、Ｃ末端への発蛍光団の結合を含む後続処理は直接的でない。全体としてこの報文は一般的に利用しうる方法を示していない。
マッジオラ（Maggiora）ら（J.Med.Chem,1992,35,3727−3730）は、ペプチド合成に際して導入される（供与体）EDANS標識グルタミン酸誘導体を用いるFRET基質合成法を記載している。この方法の欠点は、たとえば活性に乏しいためEDANS誘導体が有用な基質を与えない場合、異なる誘導体を製造し、新たにペプチドを合成する必要があることである。従って最適な供与体を選ぶのは容易になしうることではない。
本発明者らは、ポリペプチド基質の合成後に、ポリペプチドに含まれるアミノ酸の側鎖を介して供与体または受容体を結合させることによる、新規かつ有利なFRETプロテアーゼ基質の製造方法を今回考案した。これにより、広範な供与体と受容体の対（それらの大部分が市販されている）をペプチド構造体に結合させることができる。従って望ましい供与体と受容体の組み合わせを容易に選択することができる。
本発明の第１観点においては、アミノ酸の側鎖を介して結合した供与体種または受容体種を有する蛋白質加水分解開裂に対するポリペプチド基質を製造するための方法であって、適切な反応性の供与体種または受容体種を、それとの反応に適合したアミノ酸の側鎖を有するポリペプチド基質と接触させることを含む方法が提供される。
好ましくはこの方法を用いて、適宜な供与体種と受容体種を蛋白質加水分解開裂部位の反対側に有するFRETプロテアーゼ基質を製造する。これはポリペプチド基質と対応する反応性の供与体種または受容体種とを、予め、または後で反応させることにより達成される。“対応する”とは、供与体を最初に結合させた場合、適切なエネルギー伝達受容体をその後に結合させること、またはその逆を意味する。所望により供与体種および受容体種の両方を、アミノ酸の側鎖を介して基質に結合させてもよい。
ポリペプチド基質は直接合成、たとえばSolid Phase Peptide Synthesis,アサートンおよびシェパード（E.Atherton,R.C.Sheppard）,IRLプレス,1989に概説されたものにより製造することが好都合である。ポリペプチド基質は天然のアミノ酸、もしくは修飾されたペプチド結合により結合した天然もしくは非天然（たとえばＤ−）アミノ酸、またはその任意の組み合わせを含むことができる。
ポリペプチド上において反応性の供与体種または受容体種が結合する部位は、アミノ基およびチオール基により提供されることが好都合である。これらの基がそれぞれシステイン残基のＮ末端および側鎖に含まれることがより好都合である。適切な基が配列中に天然に存在しない場合、これを好ましくは重要でない残基の交換によって、任意の好都合な位置に導入することができる。たとえばチオール基は、重要でない残基をシステインで交換することによって導入しうる。“反応に適合した”とは、反応に本来適した、または化学的に修飾されたアミノ酸をいずれも包含することは明らかであろう。
あるいはポリペプチド基質上のこれらの部位は、化学的に修飾された残基をペプチド合成中に導入することによって提供されてもよい。従って“アミノ酸の側鎖を介して結合”とは、修飾されたもの、または任意の好都合な化学結合により交換されたもののいずれであっても、任意のアミノ酸の側鎖を介した結合を包含する。アミノ酸残基のα−炭素にある水素原子を置換する任意の好都合な結合を介した結合を排除するものではない。
供与体種および受容体種ならびにそれらの結合手段を、基質の蛋白質加水分解開裂が有意の程度に影響されないように選ぶことは自明であろう。一般に、選ばれたペプチドのＮ末端は、その修飾が活性に有意に影響しないために、蛋白質加水分解開裂の部位から十分な距離となるように選ばれる。これは酵素毎に異なるが、たとえばＮ末端は開裂部位から少なくともアミノ酸３個分離れた位置にあることが好都合であり、アミノ酸５個分より多く離れた位置にあることがより好都合である。同様に側鎖上の供与体／受容体の結合位置も、活性に有意に影響しないように選ばれる。これも酵素によって異なるが、たとえば蛋白質加水分解開裂部位から少なくともアミノ酸３個分、好ましくはアミノ酸５個分離れているべきである。結合部位間の全距離は、有用な量のエネルギー伝達が起こりうるものである必要がある。理論的考察によって拘束されるのは望まないが、これは溶液中でペプチドがとる三次元コンホメーションに依存するであろう。最悪の場合は、両者が直線構造であり、かつアミノ酸が3.8Åであると仮定することにより推定しうる。よって50％のエネルギー伝達につき、かつ好ましい双極子の整列であると仮定すると、供与体と受容体を分離するアミノ酸の数はRo/3.8未満とすべきである。ここでRoは50％の伝達を与える距離である。より十分な考察のためには、たとえばラコヴィッツ（J.R.Lakowicz）,Principles of Fluorescence Spectroscopy,プレナム（Plenum）,1983を参照されたい。供与体種および受容体種の結合に最適な位置を決定するのに適切な実験は、当業者に自明であろう。
アミノおよびチオール化学を用いる場合、ポリペプチド基質をまず供与体種または受容体種と、これが基質のアミノ酸の側鎖を介して結合するように接触させることが好都合である。次いで得られた基質を対応する供与体種または受容体種と接触させ、これによりFRETプロテアーゼ基質が得られる。
従って本発明の好ましい観点においては、供与体種と受容体種を蛋白質加水分解開裂部位の反対側に有するFRETプロテアーゼ基質を製造する方法であって、チオール基を介する反応に適合したアミノ酸の側鎖を含むポリペプチド基質を適宜な反応性供与体種または受容体種と接触させ、次いでこうして得られた基質のアミノ基を適宜な反応性供与体種または受容体種と接触させることを含む方法を提供する。
チオール基における反応に好都合な試薬には、マレイミドまたはハロアセチル基で誘導体化した供与体／受容体が含まれる。これらを一般に中性または中程度にアルカリ性のpHにおいて、好ましくは化学量論的量で反応させることができる。過剰の試薬が存在する場合に試薬からのペプチド誘導体の分離精製は、たとえばゲル濾過または逆相hplc（高速液体クロマトグラフィー）により行うことが好都合である。他の方法、たとえば抽出を利用してもよい。
アミノ基における反応に好都合な試薬には、イソチオシアネート、カルボン酸の活性エステル、たとえばスクシンイミジルエステル、またはハロゲン化スルホニルで誘導体化した供与体／受容体が含まれる。これらは一般に中程度にアルカリ性のpHにおいて、ペプチドより過剰量で反応させる。精製はたとえばゲル濾過または逆相hplcにより達成しうる。他の方法、たとえば抽出を当業者は利用してもよい。
本発明方法に用いるのに好都合な供与体および受容体試薬は当業者に自明であろう。それらの種には“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals"−リチャード P.ホーランド（Richard P.Hauland）−モレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッド、に示されているものが含まれる。希望する試薬が市販されていない場合、その合成法は当業者に自明であろう。
供与体種および受容体種の結合を達成するために、所望により１種類の基のみを必要とする。たとえばアミノ基またはチオール基、好ましくはチオール基のみを必要とする。ほぼ化学量論的量の適宜な供与体および受容体試薬を添加すると、目的基質の約50％を含む混合物が得られる。
前記の方法は蛋白質加水分解開裂に対する任意の好都合な基質に利用しうる。基質の具体例はビッグエンドセリン（big endothelin）である。認識部位（１または２以上）および蛋白質加水分解開裂に対する部位が存在する限り、基質配列の任意の好都合な部分を用いうることは自明であろう。好都合な例はビッグエンドセリン［16−38］である。
前記の方法は、任意の適切なプロテアーゼ、たとえば下記のものに対する基質の合成に利用しうる：トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、トロンビン、エンドセリン変換酵素、アンギオテンシン変換酵素、HIVプロテアーゼ、マトリックス分解性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、プロホルモンプロセシング酵素、プロサイトカイン−１、成長因子プロセシング酵素、およびシグナルペプチダーゼ。
２種以上の給与体種および受容体種がRFETプロテアーゼ基質に付与されてもよいことは理解されるであろう。ただし実際には３対以上はさほど好都合ではない。
本発明の他の観点においては、本発明方法により製造されるFRETプロテアーゼ基質が提供される。
以上から、本発明は広範な供与体および受容体対をペプチド構造体に容易に結合させることができ、最も適切な対を選択しうるのは明らかであろう。この選択に際して考慮される因子には、得られる活性の水準、エネルギー伝達の程度（これは基質の蛍光の初期水準を決定するであろう）、ならびに供与体または受容体の励起および発光の波長が含まれる。
本発明の用途の具体例は、たとえば医薬および農薬の分野、ならびにより全般的研究における化合物スクリーニングのためのFRETプロテアーゼ基質の提供である。これらの方法については、大部分の被験化合物の吸収波長を避けることが好ましい
本発明のFRETプロテアーゼ基質を、個々の、または混合物としての化合物を試験するための種々の均質または不均質アッセイに使用しうることは自明であろう。
本発明の他の観点においては、可視光線−発蛍光団を含むFRETプロテアーゼ基質が提供される。発蛍光団をプロテアーゼ基質のポリペプチド鎖の合成後に結合させることが好ましい。可視光線−発蛍光団をポリペプチド鎖に含まれるアミノ酸の側鎖を介して結合させることがより好ましい。適切な可視光線−発蛍光団（約350nm以上で供与体の励起最大）には、フルオレセイン、フシファー・イエロー、アクリジンオレンジ、ローダミンおよびその誘導体、たとえばテトラメチルローダミンおよびテキサスレッド、ならびにユーロピウムの蛍光性キレートまたはクリプテートが含まれる。好ましい発蛍光団はフルオレセインである。
適切なエネルギー伝達対は文献、たとえばApplications of Fluorescence in Immunoassay（ヘミラ（I.A.Hemmila），ワイリー・インターサイエンス,1991）中に見られるか、または当業者がたとえばラコヴィッツ（J.R.Lakowicz）,Principles of Fluorescence Spectroscopy,（プレナム,1983）に概説されたエネルギー伝達の原理に従って考案することができる。
下記を参照して本発明方法を説明するが、これに限定されない：
1.蛋白質加水分解開裂部位を含む目的ペプチド配列を選択する。
2.この部位に対してＣ末端側の、システインに変異させることができ、かつ基質活性の損失なしに結合部位として用いることができる位置を選択する。
3.下記により上記ペプチドを合成する：
（ａ）有利Ｎ末端（Ｃ末端は必要に応じて遊離しているか、またはアミド化されていてもよい）；
（ｂ）蛋白質加水分解開裂部位に対してＣ末端側にあるか、または酵素活性に対して耐えられないと考えられるリシンをいずれも、非反応性類似体（たとえばアルギニンまたはジメチルリシン）に“変異”させるか、または可逆的に保護する；
（ｃ）蛋白質加水分解開裂部位に対してＮ末端側にあるリシンはいずれも、上記と同様に処理するか、またはそれらが結合反応に対して耐えられると考えられる場合はそのまま残すことができる（その場合、Ｎ末端を所望により修飾してもよい）。
この時点でペプチドは開裂部位の一方側に１個または２個以上のアミノ基、そして他方側に１個のチオールを有する。発蛍光団および受容体分子の広範なチオール反応性およびアミノ反応性誘導体が市販されており、これにはスペクトルの可視領域で作動するものが多数含まれる。従って上記ペプチドに関しては異なる対および異なる配向の広範な好都合なエネルギー伝達基質を合成することができる。
ビッグエンドセリン［16−38］をFRETプロテアーゼ基質として用いる場合、リシンが存在しないので、上記の複雑な処理は適用されない。この基質については供与体−受容体対の選択が活性に対して著しい影響をもち、従って異なる対および配向をスクリーニングしうるのは極めて有用であることを本発明者らは明らかにした。
遊離システインを含むペプチドは一般的であるとは思われないが、リシンに関して上記に述べた方法と同様な様式でこれらを調節しうると考えられる。
以下の実施例および図面を参照して本発明を説明するが、これらに限定されない。
図１は、時間（Ｘ軸）および蛍光単位（Ｙ軸）に対して測定した２反応の経路を示す。これらのうち最初のものは基質Ａのみを反応混合物に添加し、これに対し第２の場合は基質Ａおよび酵素の両方を添加する。この第２の酵素触媒反応を終止させるために、ホスホラミドンを添加する。
図２は、ブドウ球菌V8プロテアーゼに対する基質として基質Ｄを用いて経時的に得られた蛍光の増加を示す（実施例２参照）。反応は初期水準より約6.3倍高い水準でプラトーに達する。インキュベーション中に基質が完全に変換されたと仮定すると、これは基質Ｄが約84％消費されたことを示す。
実施例１
出発ペプチドの製造
選ばれたペプチド配列はヒトビッグエンドセリン−１、16−37に由来し、Glu−26がCysに変換したものである：

このペプチド（ペプチドＩ）は、Solid Phase Peptide Synthesis,アサートンおよびシェパード（E.Atherton,R.C.Sheppard）,IRLプレス,1989、の記載に従って、一般的なFmoc化学により、ポリアミド支持体上において合成された。
（［Cys−26］フルオレセイニル）ペプチドＩの製造
水中のペプチドＩの溶液（2mg/ml）に、等モル量の５−マレイミドフルオレセイン（モレキュラー・プローブズ、DMSO中の5mM溶液として添加）を添加した。10分後に0.3容量の0.1M NaHCO₃、0.9％NaCl緩衝液（pH8.5）を添加した。さらに10分後に、エルマン試薬を用いて試料をチオール含量につきアッセイした。チオール含量はゼロであることが認められ、結合の完了が示された。
テトラメチルローダミニル（［Cys−26］フルオレセイニル）ペプチド（基質Ａ）の製造
（［Cys−26］フルオレセイニル）ペプチドＩに、DMSO中20mMのテトラメチルローダミンイソチオシアネート（モレキュラー・プローブズ、ＲまたはＧ異性体または混合物）を最終濃度2mMとなるように添加し、反応物を室温で一夜、暗所においてインキュベートした。混合物を水中で平衡化したセファデックスG15のカラムにより脱塩した。UV/可視スペクトルは495nmおよび553nmに同様な大きさのピークを示し、ペプチド中にフルオレセインおよびテトラメチルローダミン部分が共にほぼ等モル量存在することを示した。
ジメトキシフルオレセイン（［Cys−26］フルオレセイニル）ペプチド（基質Ｂ）の製造
（［Cys−26］フルオレセイニル）ペプチドＩ（0.58ml）に、DMSO中の50mMジメトキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Anal.Biochem.108,156−161）0.116mlを添加した。２時間後に0.5mlのDMSOを添加して、少量の沈殿物質を再溶解し、さらにDMSO（1.5ml）中の2.0mgジメトキシフルオレセイン試薬を添加した。さらに２時間後に、0.2MトリスHCl緩衝液（pH7.2）:DMSO、4:1で平衡化したセファデックスG15のカラム（約10ml）に導通することにより生成物を単離した。495nmにおけるフルオレセイン吸光のほかに、生成物のUVスペクトルは518nmにおける吸光を示し、これは約1mol/molジメトキシフルオレセインに一致した。
（［Cys−26］エオシニル）ペプチドＩの製造
水中のペプチドＩの溶液（2mg/ml）に、1.1当量の５−マレイミドエオシン（モレキュラー・プローブズ、DMSO中の5mM溶液として添加）を添加した。15分後に0.3容量の0.1M NaHCO₃、0.9％NaCl緩衝液（pH8.5）を添加した。さらに15分後に、エルマン試薬を用いて試料をチオール含量につきアッセイした。若干のチオールが検出されたので、さらに0.16当量の５−マレイミドエオシンを添加した。さらに約0.5時間の反応期間後にチオール含量はゼロであることが認められ、結合の完了が示された。
フルオレセイニル（［Cys−26］エオシニル）ペプチドＩ（基質Ｃ）の製造
（［Cys−26］エオシニル）ペプチドＩに、DMSO中のフルオレセイン５−イソチオシアネート（モレキュラー・プローブズ）を最終濃度2.5mg/mlとなるように添加し、反応物を室温で一夜、暗所においてインキュベートした。混合物を0.2MトリスHCl緩衝液（pH7.2）中で平衡化したセファデックスG15のカラムにより脱塩した。UV/可視スペクトルは495nmおよび553nmに同様な大きさのピークを示し、ペプチド中にフルオレセインおよびテトラメチルローダミン部分が共にほぼ等モル量存在することを示した。
基質の評価
エンドセリン変換酵素（ECE）の試料をオカダ（Okada）ら,Biochem.Biophys.Res.Comm.,３,1192−1198、の方法に従って得た。基質Ｃの評価に用いた、より精製された試料は、アボット（M.Abbott）（ゼネカ）の贈与であった。
約10uMの基質を0.2MトリスHCl緩衝液（pH7.2）中でインキュベートし、そしてECEと共に37℃で黒色ミクロタイタープレート（ラブシステムズ）のウェル内においてインキュベートした。フルオレセインの蛍光をラブシステムズ・フルオロスキャン蛍光プレート読み取り装置により種々の期間を置いて測定した。励起および発光フィルターはそれぞれ490および545nmに設定された。約0.5時間の初期インキュベーション後に（安定なメニスカスを形成させるためと考えられる）、直線的な蛍光増強が得られた。これを基質Ａにつき図１に示す。この図には、酵素が存在しない対照、および既知のECE阻害剤であるホスホラミドンを最終濃度0.3mMとなるように添加した影響も示される。
単位時間当たりの変換率％を各基質につき計算し、結果を高圧液体クロマトグラフィー（hplc）により判定したbig−ETに対するECE調製物の変換率（一般に約25％／時であることが認められた）と比較した。これにより３種の基質の活性は下記のとおりであることが認められた：

３種の基質は著しく異なる水準の活性を示す。これは、異なる発蛍光団および受容体を用いたFRETプロテアーゼ基質の活性を調べるために本発明方法を容易に利用しうることを示す。
実施例２
出発ペプチドの製造
選ばれたペプチド配列は下記のものであった：
1.エンドセリン変換酵素については、ヒトビッグエンドセリン−１、Glu−26がCysに変化したもの：

2.ブドウ球菌V8プロテアーゼについては：

上記ペプチドＩおよびIIは、Solid Phase Peptide Synthesis,アサートンおよびシェパード（E.Atherton,R.C.Sheppard）,IRLプレス,1989、の記載に従って、一般的なFmoc化学により、ポリアミド支持体上において合成された。
［Cys−13］フルオレセイニルペプチドIIの製造
水中のペプチドIIの溶液（2.5mg/ml）に、等モル量の５−マレイミドフルオレセイン（モレキュラー・プローブズ、DMSO中の13.3mM溶液として添加）を添加した。10分後に室温で0.3容量の0.1M NaHCO₃（pH8.5）を添加し、溶液をさらに15分間インキュベートした。エルマン試薬を用いて試料をチオール含量につきアッセイした：これはチオール消失98％を与え、本質的に結合の完了を示した。
テトラメチルローダミニル［Cys−13］フルオレセイニルペプチドII（基質Ｄ）の製造
［Cys−13］フルオレセイニルペプチドIIに、DMSO中の40mMテトラメチルローダミンイソチオシアネート（モレキュラー・プローブズ、異性体Ｇ）を最終濃度4.3mMとなるように添加し、反応混合物を室温で一夜、暗所においてインキュベートした。次いで混合物を水中で平衡化したセファデックスG15のカラムにより脱塩した。UV/可視スペクトルは495nmおよび553nmに同様な大きさのピークを示し、ペプチド中にフルオレセインおよびテトラメチルローダミン部分が共にほぼ等モル量存在することを示した。
エンドセリン変換酵素基質（基質Ａ、ＢおよびＣ）の評価
これは実施例１に述べたプロトコールに従って行われた。
ブドウ球菌V8基質（基質Ｄ）の評価
ブドウ球菌V8プロテアーゼはパース・ケミカル・コーポレーションから得られた。
基質Ｄの溶液（0.2MトリスHCl緩衝液（pH7.2）中、約0.5μＭ、0.6ml）に、蛍光キュベット内でV8プロテアーゼ（0.04ml、300単位）を添加し、蛍光の増強をスペックス・フルオロマックス蛍光計により、495nmにおける励起および515nmにおける発光、ならびにOD1.0濃度フィルターおよび5nmスリット幅で監視した。インキュベーションは周囲温度で行われた。
図２は得られた蛍光増強を示す。反応は初期水準より約6.3倍高い水準でプラトーに達する。インキュベーション中に基質が完全に変換されたと仮定すると、これは基質Ｄが約84％消費されたことを表す。
これは基質Ｄがブドウ球菌V8プロテアーゼの推定に有用な基質であることを示す

Claims

ペプチド蛍光エネルギー伝達（FRET）プロテアーゼ基質の製造方法であって、
蛋白質加水分解開裂部位を含有する望ましいペプチド配列を選択すること、
前記ペプチド配列のアミノ酸をチオール側鎖を保有するアミノ酸によって置換して前記ペプチドを合成すること、
供与体または受容体上のチオール反応性基と前記ペプチドのアミノ酸上のチオールを保有する側鎖との間における反応によって、前記供与体または受容体を結合させ、そして
対応する供与体または受容体上のアミノ反応性基と前記ペプチドのアミノ基との間における反応によって前記対応する供与体または受容体を結合させる、ことを含み、
それによって、前記供与体が蛋白質加水分解開裂部位の一方の側にあり、前記受容体が蛋白質加水分解開裂部位の他方の側にある、
前記製造方法。
前記アミノ基が前記ペプチドのＮ末端にある、請求項１記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。
前記対応する供与体および受容体が各々、前記蛋白質加水分解開裂部位から少なくともアミノ酸残基３個分離れた位置にある、請求項１または２記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。
前記対応する供与体および受容体の一方が、可視光線領域において励起最大を有する発蛍光団である、請求項１ないし３のいずれか１項記載のペプチド FRETプロテアーゼ基質の製造方法。
チオール側鎖を保有する前記アミノ酸がシステインである、請求項１ないし４のいずれか１項記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。
チオール側鎖を保有する前記アミノ酸がシステインであって、前記アミノ基がＮ末端にある、請求項１ないし５のいずれか１項記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。
結合に利用し得るチオールを保有する側鎖がただ１つのみ存在する、請求項１ないし６のいずれか１項記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。
チオール側鎖を保有する前記アミノ酸が前記蛋白質加水分解開裂部位に対してＣ末端にある、請求項１ないし７のいずれか１項記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。
前記供与体または受容体上のチオール反応性基と前記ペプチドのアミノ酸上のチオールを保有する側鎖との間における前記反応の後に、前記対応する供与体または受容体上のアミノ反応性基と前記ペプチドのアミノ基との間における前記反応を行う、請求項１ないし８のいずれか１項記載のペプチドFRETプロテアーゼ基質の製造方法。