JP3658697B2

JP3658697B2 - 人工リボヌクレアーゼ及びその製造法

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Publication number: JP3658697B2
Application number: JP00493297A
Authority: JP
Inventors: 真小宮山
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-01-14
Filing date: 1997-01-14
Publication date: 2005-06-08
Anticipated expiration: 2017-01-14
Also published as: JPH10191970A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）を特定の位置で選択的に切断する人工リボヌクレアーゼを使用するＲＮＡの選択的切断に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＮＡは生物の遺伝情報の伝達と発現を司る重要な生体高分子であり、これを選択的に切断する技術は、医学、遺伝子工学、農学等様々な分野において、強く認識されている。そのために数多くの研究が報告されている。
本発明者は先に、特定のＲＮＡを選び出し、これを特定の位置で選択的に切断することができる人工リボヌクレアーゼとして、ＲＮＡ分割能を有し、同一分子内に複数のアミノ基を有する分子を、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーに共有結合により結合させた化合物を提供した（特開平７−２５５４８３号参照）。この結合物の使用により、切断部位の数は限定される。
しかしながら、先行の人工リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断能を有する分子を、ターゲットＲＮＡの特定の配列に結合し得るオリゴヌクレオチドの末端に結合したため、これをＲＮＡ基質に作用させた場合、ＲＮＡ基質の１本鎖部分がぶらぶら動き回り、そのため切断部位を確実に特定することは困難であった。加えて、分割体自体もぐらつくため、切断の選択性はさらに低下する傾向があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者は上記の欠点を改良し、基質ＲＮＡを望む箇所で選択的かつ確実に分割し得る人工リボヌクレアーゼを得るため種々検討した結果、分割体分子をＤＮＡ鎖の中間に結合させること、それによって、人工酵素の前後２つのＤＮＡ部分が基質ＲＮＡ中の相補的な部分とヘテロ２本鎖を形成し、分割は正確に分割体部分（アミド）の位置で起ること、及び、ＲＮＡ基質及び人工酵素の分子の動きは、固定的な２本鎖構造によって低下し、切断部位の予測性は向上することを見出し、本発明を完成したもので、本発明の目的は、基質ＲＮＡを望む箇所で選択的かつ確実に分割し得る人工リボヌクレアーゼを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴマーの中間に、ポリエチレンポリアミンの残基がアミド結合により結合されている下記式（ III ）で表される人工リボヌクレアーゼを使用することを特徴とする、リボ核酸（ＲＮＡ）の特定の位置を選択的に切断する方法である。そして、この人工リボヌクレアーゼはＤＮＡ合成の過程において、下記式
【０００５】
【化５】

【０００６】
（式中Ｒはエステル残基、ｎは１〜３の整数、ＤＭＴは水酸基の保護基である）で表わされるホスフォロアミダイトモノマーを反応させて下記式
【０００７】
【化６】

【０００８】
（式中Ｒはエステル残基、ｎは１〜３の整数、Ｂ′はＤＮＡを構成する核酸の官能基を保護された塩基残基である）で表わされるオリゴヌクレオチドを得、次いで、ポリエチレンポリアミンを用いてエステル残基をアミン分解することを特徴とする下記式
【０００９】
【化７】

【００１０】
（式中Ｒ′は、 -(CH ₂ ) ₂ NH ₂ (N ₁ ) ， -(CH ₂ ) ₂ NH(CH ₂ ) ₂ NH ₂ (N ₂ ) ， -(CH ₂ ) ₂ NH(CH ₂ ) ₂ NH(CH ₂ ) ₂ NH ₂ (N ₃ ) ， -(CH ₂ )SS(CH ₂ )NH ₂ (Cys) ， -(CH ₂ ) ₂ SH(SH) で表される基、ｎは１〜３の整数、ＢはＤＮＡを構成する核酸の塩基残基である）で表わされる人工リボヌクレアーゼの製造方法である。
【００１１】
即ち、本発明の人工リボヌクレアーゼは、化学式（III）（図１に相当）示すように、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴマーの中間に、ＲＮＡの加水分解酵素として作用するオリゴアミン分子を結合させた構造を有する。オリゴアミンとしては、ポリエチレンポリアミン、特にトリエチレンテトラミンが好ましいが、その−ＮＨ−の１つが−Ｓ−Ｓ−で置き換えられたシスタミンのような化合物でもよい。さらに、別の官能基が存在してもよい。
本発明の人工リボヌクレアーゼを合成する好ましい方法の１つとして、ＤＮＡ合成の過程において、前記化学式（Ｉ）
【００１２】
【化８】

【００１３】
（式中Ｒはエステル残基、ｎは１〜３の整数、ＤＭＴは水酸基の保護基である）で表わされるホスフォロアミダイトモノマーを反応させて、下記式（II）
【００１４】
【化９】

【００１５】
（式中Ｒはエステル残基、ｎは１〜３の整数、Ｂ′はＤＮＡを構成する核酸の官能基を保護された塩基残基である）で表わされるオリゴヌクレオチドを得、次いで、ポリエチレンポリアミンを用いてエステル残基をアミン分解することを特徴とする下記式（III）
【００１６】
【化１０】

【００１７】
（式中Ｒ′はポリエチレンポリアミンのアミド残基、ｎは１〜３の整数、ＢはＤＮＡを構成する核酸の塩基残基である）で表わされる人工リボヌクレアーゼを製造する方法がある。
なお〔化２〕のエステル残基としては、アルキル基、アラルキル基等である。ここで使用したホスフォロアミダイトモノマーの合成方法として、代表的な化合物３及び６を合成する反応式（Ａ）及び（Ｂ）を下記に示す。
【００１８】
【化１１】

【００１９】
ホスフォロアミダイトモノマーは、立体的な動きを少なくするため、市販のホスフォロアミダイトモノマーのリボースがトリメチレン鎖で置き換えられた構造になっている。ＲＮＡ切断能を有するオリゴアミンは、後でエステルのアミン分解によりオリゴヌクレオチドの目指す位置に結合させる。得られた人工リボヌクレアーゼは、基質ＲＮＡを予測した位置で正確に加水分解することができる。
したがって、本発明は、上記の人工リボヌクレアーゼを使用して基質ＲＮＡを選択的に切断することを目的とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに詳細に説明する。
［ホスフォロアミダイトモノマー３及び６の合成］ホスフォロアミダイトモノマー３を前記反応式（Ａ）にしたがって合成した。まず最初に、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とベンジル−４−アミノブチレートを、ブタノール中で塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を使用して縮合させ、化合物１を合成する。次いで化合物１の２つのヒドロキシ基の一方を４，４−ジメトキシ−トリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ）を使用して保護し、最後に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトライソプロピルホスフォロジアミダイトと１Ｈ−テトラゾールを用いてホスファイト化した。もう１つのホスフォロアミダイトモノマー６は、ベンジル−４−アミノブチレートとＥＤＣＩのかわりにグリシンエチルエステルとジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して同様に合成した（反応式（Ｂ））。生成したホスフォロアミダイトモノマー３及び６は、カラムクロマトグラフィーで精製し、ＤＮＡ合成に使用した。
【００２１】
［ホスフォロアミダイトモノマー３及び６を使用するオリゴヌクレオチドの合成］ホスフォロアミダイトモノマー３及び６を使用して、ＤＮＡ自動合成機により、下記のオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２２】
【化１２】

【００２３】
ホスフォロアミダイトモノマー３を使用した場合にはｎ＝３、Ｒ＝Ｂｎのオリゴヌクレオチド（７という）が得られ、ホスフォロアミダイトモノマー６を使用した場合にはｎ＝１、Ｒ＝Ｅｔのオリゴヌクレオチド（８という）が得られる。この段階の結合能力を遊離したＤＭＴの量から計算すると、モノマー３及び６でそれぞれ９８％及び９９％であった。ベンジル及びエチルエステルは、ＤＮＡ合成の間変化しなかった。合成したオリゴヌクレオチドの代表的なものを以下に示す。
５´−ＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＸＴＣＡＴＣＧＴ−３´：（７−１（モノマー３から）又は８−１（モノマー６から）という）及び
５´−ＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＸＡＧＴＣＡＴＣＧＴ−３´：（７−２（モノマー３から）又は８−２（モノマー６から）という）
ここでＸは、モノマー３又は６に由来する残基を示す。
【００２４】
［オリゴヌクレオチド７及び８への官能基の導入］オリゴヌクレオチド７及び８のベンジル又はエチルエステルをアミン分解することによって、部位選択性を有するオリゴアミンを７及び８に導入した。反応式を下記に示す。
【００２５】
【化１３】

【００２６】
ＤＮＡ合成の行われたＣＰＧカラムに、種々のオリゴアミンを乾燥ジオキサン中４５℃で３６時間直接反応させた。この簡単な方法によって、望ましい官能性を有するオリゴヌクレオチド（反応式中の１１−Ｎｍ及び１２−Ｎｍ）が高収率で得られる。ここでｍは、導入したオリゴアミンの種類を示す。例えば、オリゴヌクレオチド７−１とジエチレントリアミンからの生成物は１１−１−Ｎ₂と表示する。これは、ジエチレントリアミンがアミド結合を介して７−１に結合していることを示す（ジエチレントリアミンの末端アミノ基の１つはアミド結合に使われている点に注意）。
同様にして、シスタミン残基を７及び８に導入した。これらシスタミンの結合したオリゴヌクレオチド（１１−Ｃｙｓ及び１２−Ｃｙｓ）は、さらにそのジサルファイド結合をジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いてｐＨ８．９で還元することによって、対応するチオール化合物（１１−ＳＨ及び１２−ＳＨ）に変換された。
１１−１−Ｎ₁をアルカリホスファターゼ及び蛇毒ホスフォジエステラーゼを用いて分解すると、ｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₁）（ここで、Ｘはモノマー３又は６に由来する残基であり、アミノ残基はアミド結合を介してこのＸに結合している）が、４種の普通のデオキシヌクレオシドと共に生成した。生成物のＨＰＬＣ解析結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）の吸収のピーク比（ｄＡ：ｄＣ：ｄＧ：Ｔ：ｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₁）＝４：６：４：５：１）は、理論上の比率と正確に一致する。ｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₁）のピークは、別に調製した真性のサンプルのものと完全に一致した（図２の（ａ）と（ｃ）参照）。ｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₁）のホスフォジエステル結合は、酵素分解に対して抵抗性である。さらに、トリマーｄＡｐＸｐＴは、オリゴヌクレオチドのアミン分解で採用したと同じ条件下にトリエチレンテトラミンと反応させ、生成物を質量スペクトル分析（エレクトロンスプレーイオン化）により分析した。予想どおり、ｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₃）ｐＴのシグナルが観察された（［Ｍ＋Ｈ］⁺：９６５．３、［Ｍ＋Ｎａ］⁺：９８７．３、及び［Ｍ−Ｈ］⁺：９６３．３）。
【００２７】
［オリゴヌクレオチド１１−１−Ｎ₃及び１１−２−Ｎ₃によるＲＮＡの部位選択的切断］ＲＮＡを１１−１−Ｎｍで加水分解した分解生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを図３（Ａ）に示す。基質ＲＮＡが図４に示す２８個の配列である場合、１１−１−Ｎｍの２つのＤＮＡ部分は、基質ＲＮＡのＡ₃−Ａ₉部分及びＵ₁₁−Ａ₂₃部分とそれぞれ相補的である。１１−１−Ｎ₃を使用する場合、切断は、図４に示すように、Ｃ₁₀−Ｕ₁₁結合及びＵ₁₁−Ｕ₁₂結合の位置で起こる。これは、図３（Ａ）のレーン６により確認されている。１１−１−Ｎ₃が基質ＲＮＡとヘテロ２本鎖を形成する場合、ＲＮＡの切断部位はジエチレントリアミノ残基の正面に位置する。この場合の分子モデルを図６（Ａ）に示す。
別の人工リボヌクレアーゼ１１−２−Ｎ₃を使用するＲＮＡの加水分解も、同様にジエチレントリアミノ残基の正面で起こる（図３（Ｂ）のレーン６、図４及び図６（Ｂ）参照）。これに対して、１１−１−Ｎ₁、１１−１−Ｎ₂、１１−２−Ｎ₁、１１−２−Ｎ₂は、ＲＮＡの加水分解に対して不活性であった（図３（Ａ）及び（Ｂ）におけるレーン４及び５）。
【００２８】
［１１−１−Ｎ₃及び１１−２−Ｎ₃の２本鎖構造］変性オリゴヌクレオチドである１１−１−Ｎ₃及び１１−２−Ｎ₃と相補的なＤＮＡ及びＲＮＡとの２本鎖のＣＤ（circuler dichromism ）スペクトルを図５に示す。これらのオリゴヌクレオチドとＲＮＡとのヘテロ２本鎖は、いずれも典型的なＡ−タイプ構造をとる（図５（Ａ）の実線）のに対して、ＤＮＡとの２本鎖はＢ−タイプ構造をとる（図５（Ｂ）の実線）。このような結果は、変性されていないオリゴヌクレオチドの場合（点線）と変わらない。化学的な変性によって２本鎖構造に大きな歪みが生じないことが分かった（図５の実線と点線の対比）。
【００２９】
［変性オリゴヌクレオチドの２本鎖の熱安定性］本発明で合成した変性オリゴヌクレオチドと相補的ＤＮＡとの２本鎖の融解温度（Ｔｍ）を表１に示した。
【００３０】
【表１】

【００３１】
すべてのケースでＴｍは５０℃より高い。したがって、２本鎖は、生理学的な条件で十分に形成できる。１１−Ｎｍ及び１２−Ｎｍの２本鎖の熱安定性は、ｍが大きくなるにつれて大きくなる。これは、プラスのチャージが大きくなるにつれて相手方のＤＮＡのマイナスにチャージされたホスフェートに対する静電的な作用が増加する結果である。
【００３２】
［人工リボヌクレアーゼとＲＮＡ基質とのヘテロ２本鎖の分子モデル］
分子モデルによれば、１１−１−Ｎ₃とＲＮＡ基質とのヘテロ２本鎖は、Ｎ₃残基（触媒活性部分）がＲＮＡのＣ１０とＵ１１残基の間のリン酸ジエステル結合（Ｃ１０−ｐ−Ｕ１１）の近くに位置している場合に最も安定である。該当する構造を図６（Ａ）に示す。Ｎ₃残基がＵ１１−ｐ−Ｕ１２結合（もう１つの切断部位）に存在する場合にも同様に安定な構造となる。１１−２−Ｎ₃とＲＮＡとのヘテロ２本鎖の場合は、Ｕ１２−ｐ−Ｇ１３結合が最も切断されやすい部位であるが（図６（Ｂ）、Ｕ１１−ｐ−Ｕ１２も容易に切断される。図３及び図４に示すように、本発明の人工酵素による選択的切断は、Ｎ₃残基が２本鎖を過度に不安定にすることなく受け入れられるような位置で起こる。
【００３３】
［ＲＮＡ加水分解のメカニズム］１１−１−Ｎ₃及び１１−２−Ｎ₃によるＲＮＡの加水分解は、ジエチレントリアミノ残基中の中性アミノ基とアンモニウムカチオンとの分子内酸塩基反応に起因する。したがって、切断は、ｐＨ７．０−８．５において効果的である。この条件では、２つのアミノ基はプロトン化され、残りの１つ（中央に位置する）は中性となる。ジエチレントリアミンのｐＫａ値は４．６、８．６及び９．７である（中央のアミンのプロトン化は、近隣の２つのプラスチャージによって、静電気的に妨げられている）。可能性として、第１アンモニウムイオンと中央の中性アミノ基が互いに応答して触媒作用をすると考えられる。
提起したメカニズムは、１１−１−Ｎ₂及び１１−２−Ｎ₂が図３（Ａ）及び（Ｂ）のレーン５に示すとおり触媒作用を示さないことによっても支持されている。エチレンジアミンの２つのアミノ基が両方ともにホスフォジエステル結合の近辺に位置することは立体的に困難である。モノアミンは分子内酸塩基反応が起こらないため、本質的に活性に乏しく、したがって、１１−１−Ｎ₁及び１１−２−Ｎ₁がＲＮＡを加水分解しないこと（図３（Ａ）及び（Ｂ）のレーン４）は理屈に合っている。よく知られた金属キレート化剤であるエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）は、選択的切断に効果を示さない。しかしながら、反応液中に存在する金属イオンがＲＮＡの加水分解に影響する可能性があるため、図２に示したＲＮＡの加水分解は全て、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在化に行なった。溶媒として使用する水は、金属イオンによる汚染を慎重に回避するよう注意すべきである。
【００３４】
【発明の効果】
［分割体分子を２つのＤＮＡオリゴマーの間に介在させたことによる効果］本発明の変性されたオリゴヌクレオチドは、相補的な核酸配列と２本鎖を形成する場合、２つのＤＮＡオリゴマーの間に介在させたＲＮＡ分割体は、基質ＲＮＡの目指すホスフォロジエステル結合に向かって正確に位置取る。ヘテロ２本鎖中の分割体及びホスフォロジエステル結合の両者の分子運動は取るに足りない。したがって、官能基の位置は正確にコントロールでき、反応は目指す部位で選択的に起こる。このような場合、切断部位の予測は簡単である。明らかに本発明の人工リボヌクレアーゼはそれ以前のものに比べて実用面で格段に優れている。分子モデルを検討することによって切断部位を予測できることは注目に値する。本発明の人工酵素は、切断部位の予測性、調節性のために、分子生物学、生物工学、薬理学等に利用できる。
【００３５】
［新規なホスフォロアミダイトモノマーの使用による効果］ホスフォロアミダイトモノマー３及び６は、本発明の人工リボヌクレアーゼを合成する上で重要な要件である。これは、市販のホスフォロアミダイトモノマーのリボースがトリメチレン鎖で置き換えられた構造になっているため、分子の立体的な動きが少なく、また、トリメチレン鎖は暈がより小さく弾力的であるため、立体障害も少ない。これら新規なホスフォロアミダイトモノマーは、普通のホスフォロアミダイトモノマーと同様の反応で、オリゴヌクレオチドの主鎖に３個の炭素原子を導入できる。さらに、そのエステルの分解によって、オリゴアミンばかりでなく、種々の官能性残基がオリゴヌクレオチドの所望の箇所に容易にかつ高収率で導入できる。図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すＣＤスペクトル及び表１に示すＴｍの測定結果からみて、これら新規なホスフォロアミダイトモノマーで変性された本発明のオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれとも、構造上重大な歪みのない安定な２本鎖を形成すること分かる。これらは、本発明の合成方法及び合成された人工リボヌクレアーゼの大きな可能性を示すものである。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例をもって、本発明を詳細に述べる。
実施例１
ベンジル４−［Ｎ−｛２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル｝アミノ］ブチレート（１）
１−エチル−３−（３−ジメチルアモノプロピル）カ−ボジイミド（ＥＤＣＩ：３．００ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を、ベンジル４−アミノブチレート（２．９９ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（２．０９ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＢｔ：２．１２ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．７２ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１０ｍｌ）の混合物に加えた。１２時間室温で撹拌した後、溶媒を除去し、１００ｍｌの酢酸エチルを加えた。有機層を１００ｍｌのＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（１回）及びＮａＣｌ飽和水溶液（２回）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ＝９５：５）で精製して２．８４ｇの化合物１を得た（収率６３％）。¹Ｈ-ＮＭＲ［ＣＤＣｌ₃（ＴＭＳ）］δ７．３３（ｂｒｓ，５Ｈ），７．２（ｂｒｓ，１Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），３．６７（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，４Ｈ），３．２６（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）１．８４（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．０５（ｓ，３Ｈ）。Ｒｆ＝０．２８（ＣＨ₂Ｃl₂：ＭｅＯＨ＝１０：１）。
【００３７】
実施例２
ベンジル４−［Ｎ−｛２−（４，４−ジメトキシトリチル）オキシメチル−２−（ヒドロキシメチル）プロピオニル｝アミノ］ブチレート（２）
化合物１（２．８４ｇ、８．２２ｍｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ：５３ｍｇ、Ｏ．４１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１０ｍｌ）を窒素雰囲気下に氷で冷却し、その中に４、４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ−Ｃｌ：０．３４ｇ、９．８６ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）溶液を滴下した。１２時間後、反応混合物に１００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂を注加した。ＣＨ₂Ｃｌ₂層をＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（２回）及びＮａＣｌ飽和水溶液（１回）で洗浄した後無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ｉ−ＰｒＯＨ：Ｅｔ₃Ｎ＝９７．５：２．５：１）で精製して４．８７ｇの化合物２を得た（収率５９％）。¹Ｈ−ＮＭＲ［ＣＤＣｌ₃（ＴＭＳ）］δ ７．２０−７．４１（ｍ，１４Ｈ），７．０４（ｂｒｔ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２０−３．３２（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．１９（ｓ，３Ｈ）。Ｒｆ＝０．１９（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ｉ−ＰｒＯＨ：Ｅｔ₃Ｎ＝９７．５：２．５：１）。
【００３８】
実施例３
ホスフォロアミダイトモノマー（３）
化合物２（０．２８ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトライソプロピルホスフォロジアミダイト（０．１６ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）と１Ｈ−テトラゾール（３５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）とを、乾燥アセトニトリル溶液中で窒素下に反応させた。反応に先立って、化合物２及び１Ｈ−テトラゾールを乾燥アセトニトリルと共蒸発させて乾燥した（二回）。１時間の反応後、生成物を１００ｍｌの酢酸エチルに加え、有機溶液を１００ｍｌのＮａＨＣＯ₃飽和水溶液及びＮａＣｌの飽和水溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、脱塩し、最後に溶媒を減圧除去した。残留した生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製して０．２２ｇのホスフォロアミダイトモノマー３を得た（収率６７％）。¹Ｈ−ＮＭＲ［ＣＤＣｌ₃（ＴＭＳ）］δ７．１９−７．４４（ｍ，１４Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．６８（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，２Ｈ），３．２４（ｍ，４Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．４８（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．７６（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．０７−１．２９（ｍ，１５Ｈ）。³¹ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ １５２．３７，１５２．４１。Ｒｆ＝０．５９（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）。
【００３９】
実施例４
Ｎ−｛２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル｝−２−アミノエチレート（４）
トリエチルアミン（６．９５ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）を、グリシンエチルエステル塩酸塩（７．００ｇ、５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液に加え、生成するトリエチルアンモニウム塩酸塩を濾過して除去する。濾液に２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（７．４０ｇ、５５ｍｍｏｌ）を加え、この混合物中に氷冷しながらジシクロヘキシルカ−ボジイミド（ＤＣＣ：１１．４ｇ、５５ｍｍｏｌ）のヂオキサン（２０ｍｌ）溶液をゆっくりと滴下する。混合物を室温で１２時間撹拌し、再び濾過する。ろ液を減圧下に濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して８．１９ｇの化合物４を得た。¹Ｈ-ＮＭＲ［ＣＤＣｌ3 （ＴＭＳ）］δ７．６８（ｂｒｔ，１Ｈ），４．１２（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｂｒｓ，６Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０９（ｓ，３Ｈ）。Ｒｆ＝０．１１（ＣＨ₂Ｃl₂：ｉ−ＰｒＯＨ＝１００：５）。
【００４０】
実施例５
エチル２−［Ｎ−｛２−（４，４−ジメトキシトリチル）オキシメチル−２−（ヒドロキシメチル）プロピオニル｝アミノ］エチレート（５）化合物４（５．５８ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．２ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）溶液を窒素雰囲気下に氷で冷却し、その中にＤＭＴ−Ｃｌ（６．７８ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）溶液を滴下した。１２時間後に生成物を化合物２の場合と同様に処理し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ｉ−ＰｒＯＨ＝１００：２）で精製して４．８０ｇの化合物５を得た（収率４３％）。¹Ｈ−ＮＭＲ［ＣＤＣｌ₃（ＴＭＳ）］δ７．１８−７．４３（ｍ，９Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，４Ｈ），４．１９（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｄｄ，Ｊ＝４．３，５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３０（ｄｄ，Ｊ＝９．２，２３．４Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．１８（ｓ，３Ｈ）。Ｒｆ＝０．３９（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ＝９５：５）。
【００４１】
実施例６
ホスフォロアミダイトモノマー（６）
化合物５（０．５２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトライソプロピル−ホスフォロジアミダイト（０．３５ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（１０ｍｌ）溶液を窒素雰囲気下に１Ｈ−テトラゾール（７７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）で１時間処理した。いつもの操作の後、混合物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製して０．３３ｇのホスフォロアミダイト６を得た（収率５２％）。¹Ｈ−ＮＭＲ［ＣＤＣｌ₃（ＴＭＳ）］δ７．１８−７．４３（ｍ，９Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，４Ｈ），４．１７（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．６６−３．７５（ｍ，４Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．２９（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｍ，２Ｈ），１．０８−１．２８（ｍ，１８Ｈ）。³¹ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１５４．０３，１５４．０７。Ｒｆ＝０．５４（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）。
【００４２】
実施例７
変性オリゴヌクレオチド７及び８の合成
ホスフォロアミダイトモノマー３及び６を、市販のホスフォロアミダイトモノマーＥｘｐｅｄｉｔｅｔｅ（登録商標）とともに使用することによって、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／ＢｉｏｓｅａｒｃｈＣｙｃｌｏｎＰｌｕｓのＤＮＡ合成機上で、種々のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。ホスフォロアミダイトモノマー３及び６は、乾燥アセトニトリル中５２ｍＭの濃度で使用した。この濃度は、使用したＥｘｐｅｄｉｔｅｔｅ（登録商標）の濃度の１．５倍であった。
【００４３】
実施例８
オリゴヌクレオチド７及び８へのアミノ化合物の付加
ＤＮＡを合成した後、ＣＰＧカラムはにアミンとジオキサンの１：２混合物１，５ｍｌ中、４５℃に３６時間保ち、次いで、室温で１時間濃アンモニア水で処理する。オリゴヌクレオチド（ＤＭＴの付加された）を逆層ＨＰＬＣで精製し、さらに酢酸とアセトニトリルの４：１混合物で１時間処理する。最後にもう一度ＨＰＬＣで精製した（条件：５−２０％アセトニトリル／水（２０分）、５０ｍＭギ酸アンモニウム、２６０ｎｍ、１．０ｍｌ／分）。
得られたオリゴヌクレオチドは、濃度を測定し、構造を確認するために、アルカリホスファターゼ及び蛇毒ホスフォジエステラーゼを使用して、ｐＨ７．０、３７℃で２時間加水分解した。分解物を逆層ＨＰＬＣにより解析した。１１−１−Ｎｍ、１１−２−Ｎｍ及び１２−１−Ｎｍは５−１０％アセトニトリル／水（２０分）であり、他は５−２０％（２０分）であった。
【００４４】
実施例９
ｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₁）の真性サンプルの調製
ｄＡ（Ｎ⁶−ｔ−ブチルフェノキシアセチル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシ−トリチル）−２′−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスフォロアミダイト））のためのＥｘｐｅｄｉｔｅｔｅ（登録商標）（１００ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）及び化合物２（６５ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）と１Ｈ−テトラゾール（２４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１０ｍｌ）中で窒素雰囲気下、室温で１時間反応させた。次いで、反応混合物によう素（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液と２，６−ルチジン１ｍｌを加えた。３０分後、混合物を濃縮し、１００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂にとかした。有機層を１００ｍｌのＮａ₂Ｓ₂Ｏ₃飽和水溶液及びＮａＨＣＯ₃飽和水溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：Ｅｔ₃Ｎ＝１００：１０：１）で精製して完全に保護されたｄＡｐＸを収率２５％で得た（３８ｍｇ）。
保護されたｄＡｐＸをエチレンジアミンとジオキサンの１：２混合物１．５ｍｌ中で４０℃に４８時間保持する。生成物を室温で、２９％のＮＨ4 ＯＨにより１時間、次いで４：１の酢酸−アセトニトリル溶液により１時間、十分に処理する。生成物を水に溶かし、濾過し、ＨＰＬＣで精製した［５０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む５−２０％アセトニトリル／水（２０分）］。¹Ｈ−ＮＭＲ［Ｄ₂Ｏ（ＴＳＰ）：δ８．３４（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），６．５１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｑ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．９０（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．６２（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．８４−１．９０（ｍ，１Ｈ），２．７３−２．７６（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．７７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．２４（ｓ，３Ｈ）
【００４５】
実施例１０
ｄＡｐＸｐＴとトリエチレンテトラミンの反応生成物の質量スペクトル分析
ＤＮＡ合成機によって調製されたｄＡｐＸｐＴを、トリエチレンテトラミンとジオキサンの１：２混合物１．５ｍｌ中で３６時間４５℃に保つ。これを２９％のＮＨ₄ＯＨで１時間処理し、濃縮した後、逆層ＨＰＬＣで精製し、質量スペクトル分析により分析した。イオン化は電子スプレー法によった。
【００４６】
実施例１１
融解温度の測定
２本鎖の融解状況は、テフロンストッパーで固定された１ｃｍ長さの石英の小部屋で２６０ｎｍで測定した。加熱速度は０．５℃／分とした。標本には、変性されたオリゴヌクレオチド（１μＭ）、相補的ＤＮＡ（１μＭ）及びＮａＣｌ（１００ｍＭ）をｐＨ７．０のカコジル酸塩緩衝液（１０ｍＭ）に溶かしたものを含ませた。１１−１−ＳＨ及び１２−１−ＳＨの場合には、チオール基の酸化を防止するために、０．１ｍＭのＤＴＴを溶液中に加えた。Ｔｍの実験誤差は、０．５℃と考えられる。
【００４７】
実施例１２
スペクトル分析
ＣＤスペクトルは、ＪＡＳＣＯＪ−５００Ａスペクトル偏光計を用いて、変性ＤＮＡ（３μＭ）、相補的２１個の配列のＲＮＡ又は３１個の配列のＤＮＡ（３μＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ），ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ：ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖の場合のみ）を含むｐＨ８の溶液中で、１５℃で測定した。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（内部スタンダードとしてＴＭＳ又はＴＳＰ）及び³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトル（外部スタンダードとしてＤ₂Ｏ中８５％のＨ₃ＰＯ₄）は、ＪＥＯＬＥＸ−２７０ＮＭＲスペクトロメーターを用いて、それぞれ２７０ＭＨＺ及び１０９．４ＭＨＺで記録した。
【００４８】
実施例１３
オリゴアミン付加オリゴヌクレオチドを使用するＲＮＡの配列選択的加水分解５´末端を³²Ｐでラベルした２８個の配列のＲＮＡ（０．２μＭ）を、２０μＭの人工リボヌクレアーゼと１０ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス緩衝液５０ｍＭ中で反応させた。３７℃で１６時間後、反応混合物を２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。
【００４９】
実施例１４
分子モデル化の研究
ＢｉｏｓｙｍＤｉｓｃｏｖｒｅ／Ｉｎｓｉｇｈｔ II ソフトウエアを使用して、人工酵素と基質ＲＮＡとの２本鎖の最適モデル化を行なった。下記の仮定を設けた：（１）ヘテロ２本鎖はＡタイプ構造を取る（図５のＣＤスペクトル参照）。（２）化合物３に由来するトリメチレン残基の中央の炭素原子はＳ−配位である。（３）切断部位は核酸の中のマイナー溝の中で働く。（４）ホスフォロジエステルの結合していない酸素原子とＮ₃の第１級の窒素原子との間の距離は、３．０Åに制限される。一方、リボースの２′−ＯＨの水素原子（分割部位の５′側）とＮ₃の第２級の窒素原子との間の距離は、コンスタントに１．８Åに保たれる。４番目の仮定は、アミノ残基の１つが２′−ＯＨからプロトンを引き付け、隣接するアンモニウムイオンが普通の酸触媒のように作用するという触媒反応のメカニズムに基づいて設けた。これらの仮定のもとで、基質ＲＮＡのホスフォロジエステル結合の各々について最小エネルギーを計算した。その際、２本鎖の表面に５Åの水分子の層が存在するとみなした。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で合成した変性オリゴヌクレオチドの構造式
【図２】（Ａ）はオリゴヌクレオチド１１−１−Ｎ₁の、（Ｂ）はその酵素分解物の、（Ｃ）はｄＡｐ（Ｘ−Ｎ₁）の真性サンプルの、それぞれのＨＰＬＣ図である。なお、酵素分解には、アルカリホスファターゼ及び蛇毒ホスフォジエステラーゼを使用した。
【図３】５′末端を３２Ｐでラベルした２８配列のＲＮＡの加水分解物を、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた場合のオートラジオグラフである。１１−１−Ｎｍで加水分解した場合を（Ａ）に、１１−２−Ｎｍで加水分解した場合を（Ｂ）に示した。（Ａ）のレーン１はリボヌクレアーゼで、レーン２は無処理、レーン３はアルカリ性加水分解、レーン４は１１−１−Ｎ₁で、レーン５は１１−１−Ｎ₂で、レーン６は１１−１−Ｎ₃で処理した場合を示す。（Ｂ）のレーン１は無処理、レーン２はリボヌクレゼで、レーン３はアルカリ性加水分解、レーン４は１１−２−Ｎ₁で、レーン５は１１−２−Ｎ₂で、レーン６は１１−２−Ｎ₃で処理した場合を示す。
【図４】ＲＮＡを人工リボヌクレアーゼ１１−１−Ｎ₃及び１１−２−Ｎ₃で加水分解した場合の切断図である。ＸはＮ₃残基を保持する残基を示す。切断部位は矢印で示した。
【図５】（Ａ）基質ＲＮＡと１１−１−Ｎ₃（Ａ）及び１１−２−Ｎ₃（Ｂ）との２本鎖の最も安定な構造の立体図である。太線はジエチレントリアミン（Ｎ₃）を含む側鎖を示し、加水分解されるホスフォジエステル結合は、矢印を付した丸で示した。計算はＢｉｏｓｙｍＤｉｓｃｏｖｒｅ／Ｉｎｓｉｇｈｔ II プログラムを使用して人工リボヌクレアーゼ及びＲＮＡの９つの残基の各々について行なった。計算に際して採用した仮定は、実施例１４に示した。
【図６】変性されたオリゴヌクレオチドと相補的なＲＮＡ又はＤＮＡとの２本鎖のＣＤスペクトル図である。１１−１−Ｎ₃を使用する場合を左側に、１１−２−Ｎ₃を使用する場合を右側に、また、ＲＮＡを使用する場合をＡ段に、ＤＮＡを使用する場合をＢ段に実線で示した。点線は変性されていないＤＮＡを使用した場合の対応するＣＤスペクトル図である。測定条件は実施例１２に示した。

Claims

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴマーの中間に、ポリエチレンポリアミンの残基がアミド結合により結合されている下記式（ III ）で表される人工リボヌクレアーゼを使用することを特徴とする、リボ核酸（ＲＮＡ）の特定の位置を選択的に切断する方法。

（式中Ｒ′は、 -(CH ₂ ) ₂ NH ₂ (N ₁ ) ， -(CH ₂ ) ₂ NH(CH ₂ ) ₂ NH ₂ (N ₂ ) ， -(CH ₂ ) ₂ NH(CH ₂ ) ₂ NH(CH ₂ ) ₂ NH ₂ (N ₃ ) ， -(CH ₂ )SS(CH ₂ )NH ₂ (Cys) ， -(CH ₂ ) ₂ SH(SH) で表される基、ｎは１〜３の整数、ＢはＤＮＡを構成する核酸の塩基残基である）