JP3663515B2

JP3663515B2 - ランダム化ペプチドの表面発現ライブラリー

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Publication number: JP3663515B2
Application number: JP51845391A
Authority: JP
Inventors: ディー．フセ，ウィリアム
Original assignee: Applied Molecular Evolution Inc
Current assignee: Applied Molecular Evolution Inc
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 2005-06-22
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Description

発明の背景
本発明は、一般にオリゴヌクレオチドを合成しおよび発現させる方法に関し、さらに詳しくはランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドを発現させる方法に関する。
オリゴヌクレオチドの合成は、段階適反応で個々のモノマーが線状結合することによって進行する。この反応は、一般に、まず、第１モノマーの3'末端を支持体に結合することによって、固相支持体上で行われる。第２モノマーが第１モノマーの５’末端に、縮合反応で付加して、固体支持体に結合したジヌクレオチドが得られる。各結合反応の終わりに、副生成物および未反応の遊離モノマーを洗浄して除去し、合成の次の段階の出発物質を、支持体に結合した純粋なオリゴヌクレオチドとする。この反応計画では、個々のモノマーが、オリゴヌクレオチドの単一の伸長末端に段階的に付加されるので、所望の配列の正確な合成が保証される。さらに、２つのオリゴヌクレオチドの縮合が高い生成物収率で起こるような好ましくない副反応が排除される。
場合によっては、合成オリゴヌクレオチドがランダムヌクレオチド配列を有することが所望されることがある。この結果は、モノマー結合反応において、４種のヌクレオチド全部を等比率で添加し、すべてのヌクレオチドをランダムに組み込み、そしてランダム配列を有するオリゴヌクレオチドの集団を得ることによって達成できる。起こり得るすべての組み合わせのヌクレオチド配列が上記集団の中に示されるので、起こり得るすべてのコドントリプレットもまた示されている。目的が、最終的にランダムペプチド生成物を生成することであれば、この方法には厳しい限界がある。というのは、合成されたランダムコドンは、細胞によるそのDNAのポリペプチドへの翻訳中に組み込まれるアミノ酸を偏らせるからである。
この偏りは遺伝暗号の重複性が原因である。64種の生じる可能性のあるトリプレットコドンをもたらす、４種のヌクレオチドモノマーがある。20種のアミノ酸だけを指定しても、多くのアミノ酸が多重コドンによってコードされる。それ故に、ランダム集団由来のモノマーを連続付加することによって合成されるオリゴヌクレオチドの集団は、20種の異なるアミノ酸の起こり得るすべての組み合わせを等しい比率で示すアミノ酸配列を有するペプチドをコードしない。すなわち、ポリペプチドに組み込まれるアミノ酸の頻度は、多重コドンが指定するこれらのアミノ酸配列に偏らされる。
遺伝暗号の重複性によるアミノ酸の偏りを軽減するために、オリゴヌクレオチドはヌクレオチドトリプレットから合成され得る。この場合、20種の各アミノ酸をコードするトリプレットは、個々のモノマーから合成される。これらのトリプレットは、まず合成されてから、個々のモノマーの代わりに結合反応に使用される。等比率のトリプレットを混合することによって、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの合成を達成し得る。しかし、このようなトリプレットから合成する場合の費用は、トリプレットが市販されていないので、個々のモノマーから合成する場合の費用をはるかに超える。
しかし、縮重コドン配列NNK（但しNは４種のヌクレオチドすべての混合物であり、そしてKはグアニンおよびチミンのヌクレオチドの混合物である）を合成することによって、アミノ酸の偏りを減らすことができる。このコドン配列を有するオリゴヌクレオチド内の各位置は、合計32のコドンを含有している（アミノ酸をコードする12種のコドンが１回現れ、５種のコドンが２回現れ、３種のコドンが３回現れおよび１種のコドンは終止コドンである）。このような縮重コドン配列で発現されるオリゴヌクレオチドは、２回以上現れるそれらのアミノ酸に対して偏った配列を有するペプチド生成物を生成する。従って完全にランダムな配列を有するペプチドの集団は、縮重配列から合成されたオリゴヌクレオチドからは得ることができない。
従って、遺伝重複性を軽減する、完全にランダムかまたは所望により偏った配列を有するオリゴヌクレオチドを発現させる方法が要望されている。本発明はこれらの要望を満たし、さらに別の利点を提供する。
発明の要旨
本発明は、発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有し、かつその発現可能なオリゴヌクレオチドがランダムコドン配列の所望の偏りを有する、複数の原核細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、20の反応容器を用いて、各位置に、ランダムチュプレット（tuplet）を有するヌクレオチドモノマーからオリゴヌクレオチドを合成する場合の概略説明図である。
図２は、10の反応容器を用いて、各位置にランダムチュプレットを有するヌクレオチドモノマーからオリゴヌクレオチドを合成する場合の概略説明図である。
図３は、前駆体オリゴヌクレオチド部分からサブライブラリーおよびライブラリーを作るのに使用される２種のベクターの概略図である。M13IX22（図３Ａ）は、アンチセンス前駆体部分（ハッチングを施した箱枠部分）をクローン化するのに用いられるベクターである。一方向矢印はLac p/o発現配列を示し、二方向矢印は、M13IX42と結合されるM13IX22の結合部分である。生物学的選択のためのアンバー終止コドンおよび関連制限部位もまた示してある。M13IX42（図３Ｂ）は、センス前駆体部分（白箱枠部分）をクローン化するのに用いられるベクターである。太線は、プソイド野生型（ΨgVIII）と野生型（gVIII)の遺伝子VIII配列を示す。二方向矢印は、M13IX22と結合されるM13IX42の部分を示す。２つのアンバー終止コドンおよび関連制限部位もまた示してある。図３Ｃは、サブライブラリー由来のベクター集団を結合して機能性表面発現ベクターM13IXを製造する工程を示す。図３Ｄは、非サプレッサー菌株中に表面発現ライブラリーが生成し、次いで、ファージが生成するのを示す。生成したファージを表面発現のためのサプレッサー菌株（図３Ｅ）に感染させて、ライブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
図４は、ランダムオリゴヌクレオチド集団（M13IX30）から表面発現ライブラリーを生成させるのに使用されるベクターの概略図である。その記号は図３に示したのと同じである。
図５は、M13IX42のヌクレオチド配列である（SEQ ID NO:1）。
図６は、M13IX22のヌクレオチド配列である（SEQ ID NO:2）。
図７は、M13IX30のヌクレオチド配列である（SEQ ID NO:3）。
図８は、M13ED03のヌクレオチド配列である（SEQ ID NO:4）。
図９は、M13IX421のヌクレオチド配列である（SEQ ID NO:5）。
図10は、M13ED04のヌクレオチド配列である（SEQ ID NO:6）。
発明の詳細な説明
本発明は、個々のモノマーを用いて、所望の偏りのランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成しおよび発現させる簡単で安価な方法に関する。この方法は、個々のモノマーをトリプレットの代わりに使い、単に全トリプレットの非縮重サブセットだけを合成することによって、コドン重複性が軽減されるという点で有利である。従って、合成されたオリゴヌクレオチドは、生じ得るランダムトリプレット配列を大きな比率で得ることができることを示す。得られたオリゴヌクレオチドは、例えば、ファージの生存度を変えないか、または所定のペプチド配列に対して生物学的選択を課することができない形態の繊維状バクテリオファージの表面に発現させることができる。それ故に生成したオリゴヌクレオチドは、薬理学および研究用の生成物を無限の数で生成させるのに有用である。
１つの実施態様において、本発明は、モノマーを逐次結合して、所望の偏りのランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを生成する。遺伝暗号のアミノ酸を指定する20種のコドンをランダム化する結合反応は10の異なる反応容器で実施される。各反応容器は、２つの異なるコドンのモノマーが３つの連続反応で結合される支持体が入っている。これらの反応の１つが２種のモノマーの等しい混合物を結合し、その結果、最終生成物は２種の異なるコドン配列を有する。これらのコドンは、支持体を反応容器から取り出してそれらを混合し、特定の位置に20種の全コドンを含有する支持体の単一バッチを生成させることによってランダム化される。次のコドン位置での合成は、予め10の反応容器に支持体の前記混合バッチを等しく分割し、モノマーをコドンの各対に連続して結合させることによって進行させる。支持体を再び混合して、コドンを正に合成される位置でランダム化する。結合、混合および分割のサイクルは、所望の数のコドン位置がランダム化されるまで続ける。最後の位置がランダム化されてから、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを支持体から切断する。次いでそのランダムオリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子VIII−ペプチド融合タンパク質のような繊維状バクテリオファージの表面に発現させることができる。他の遺伝子もまた使用することができる。
その最も広い形態で、本発明は、細胞内で発現できるように、ベクター中に含有されている合成オリゴヌクレオチドの多様な集団を提供する。多様なオリゴヌクレオチドのような集団は、少なくとも１つの部位で、コドンをランダムに変化させることができる限り、１つ以上のコドン部位で充分ランダムであるか、または１つ以上の部位で充分規定され得る。オリゴヌクレオチドの集団は、M13のような繊維状バクテリオファージの表面タンパク質を遺伝子VIIIと結合させた融合生成物として発現され得る。そのベクターは、例えば原核生物のE．coliのような細胞の複数にトランスフェクトされ得る。
オリゴヌクレオチドの多様な集団は、第１と第２の前駆体集団（これらの各集団は、所望の偏りのランダムコドン配列を有している）をランダムに結合することによって製造され得る。発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を合成しおよび発現させる方法もまた提供される。
好ましい実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドの２つの集団が合成される。各集団内のオリゴヌクレオチドは、発現されるべき最後のオリゴヌクレオチドの一部分をコードする。１つの集団内のオリゴヌクレオチドは、発現されるオリゴヌクレオチドのカルボキシ末端部分をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、遺伝子VIII（gVIII）配列とインフレームでクローン化され、その結果その配列が翻訳されてペプチド融合タンパク質が生成する。オリゴヌクレオチドの第２の集団は別のベクターにクローン化される。この集団内の各オリゴヌクレオチドは、発現されるオリゴヌクレオチドのアミノ末端部分のアンチセンスをコードする。このベクターもまた発現に必要な要素を含有している。ランダムオリゴヌクレオチドを含有する２つのベクターは結合され、その結果２つの前駆体オリゴヌクレオチド部分がランダムに結合されて、２つの小さな部分から誘導された大きなオリゴヌクレオチドの集団を形成する。上記のベクターは、２つのオリゴヌクレオチド集団を結合する際に最大の効率を保証するために選択可能なマーカーを含有している。ライブラリーの構築およびスクリーニング中にgVIII−ペプチド融合タンパク質の発現を制御する機構もまた存在する。
「モノマー」または「ヌクレオチドモノマー」という用語は本願で用いる場合、オリゴヌクレオチドの化学合成に用いられる個々のヌクレオチドを意味する。使用できるモノマーには、５種の各標準ヌクレオチド（塩基であるアデニン（それぞれＡもしくはｄＡ）、グアニン（ＧもしくはｄＧ）、シトシン（ＣもしくはｄＣ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）から誘導される）のリボ型およびデオキシリボ型の両方が含まれる。ポリペプチドの生合成を支持できるイノシンのような塩基の誘導体および前駆体もまたモノマーに含まれる。また、化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、モノマーのプリンもしくはピリミジンの塩基、リボースもしくはデオキシリボースの糖、またはリン酸もしくはヒドロキシルの部分の任意の位置に結合した可逆的ブロッキング剤を有するものも含まれる。このようなブロッキング剤には、例えばジメトキシトリチル、ベンゾイル、イソブチリル、β−シアノエチルおよびジイソプロピルアミンの各基があるが、ヒドロキシル環外のアミンおよびリン酸部分を保護するのに用いられる。他のブロッキング剤もまた用いられ得るが、当業者に公知である。
「チュプレット」という用語は、本願で用いる場合、定義可能な大きさの要素の基を意味する。本願で用いるチュプレットの要素は、ヌクレオチドモノマーである。例えばチュプレットは、ジヌクレオチド、トリヌクレオチドまたは４量体以上のヌクレオチドであり得る。
「コドン」または「トリプレット」という用語は、本願で用いる場合、ポリペプチドの生合成で見出される20種の天然に生成するアミノ酸の１つを指定する３つの隣接ヌクレオチドモノマーで構成されているチュプレットを意味する。また、どのアミノ酸も指定しないナンセンスコドンもしくは終止コドンもこの用語に含まれる。
「ランダムコドン」または「ランダム化コドン」は、本願で用いる場合、オリゴヌクレオチド集合物内の１つの位置における２種以上のコドンを意味する。異なるコドンの数は、任意の特定の位置において２から20であってもよい。「ランダム化オリゴヌクレオチド」は、本願で用いる場合、１つ以上の位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの集合物を意味する。「ランダムコドン配列」は、本願で用いる場合、ランダム化オリゴヌクレオチド内の２つ以上のコドンの位置がランダムコドンを含有していることを意味する。例えば、ランダム化ヌクレオチドが６ヌクレオチドの長さ（すなわち２つのコドン）であり、かつ第１および第２のコドンの位置がランダム化されて20種全てのアミノ酸をコードしている場合、第１および第２の位置で20のトリプレットの可能性があるあらゆる組み合わせでランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの集団が、ランダム化オリゴヌクレオチドの上記集団を形成する。可能性があるコドンの組み合わせの数は２０²である。同様に、20種の全アミノ酸をコードする全ての位置にランダムコドン配列を有する、15のヌクレオチドの長さのランダム化オリゴヌクレオチドが合成された場合、20種の各アミノ酸をコードする全トリプレットはあらゆる位置において等比率で見出される。ランダム化オリゴヌクレオチドを構築する集団は、オリゴヌクレオチドの可能性がある異なる種を20¹⁵持っている。「ランダムチュプレット」または「ランダム化チュプレット」は同様に定義される。
「偏り」という用語は、本願で用いる場合、優先選択（preference）を意味する。特定のアミノ酸をコードするコドン配列に対してある程度の優先選択または偏りがあることがわかっている。例えば、コドン配列が特定のアミノ酸を優先的にコードしていないヌクレオチドは、偏りがないので完全にランダムである。またオリゴヌクレオチドのコドン配列を予め決めたコドン配列またはコドン頻度に偏らせることもまた可能であるが、依然として多様およびランダムであるとはいえ、限定されたまたは優先された配列に偏ったコドン配列を示す。
「所望の偏りのランダムコドン配列」という用語は、本願で用いる場合、全体的にランダムなものから、全体的ではないが本質的に限定された（優先された）ものまでの中から選択され得る予め決定された程度の偏りを意味する。しかし、種々のものである、少なくとも１つのコドンの位置がなければならない。
「支持体」という用語は、本願で用いる場合、化学合成のためにモノマーを結合させる固相物質を意味する。そのような支持体は通常、コントロールポアガラスのビーズのような物質から構成されるが、当業者に公知の他の物質でも良い。この用語はまた、別のオリゴヌクレオチド合成反応のために支持体に結合される１つ以上のモノマーを含むことも意図される。
「結合」または「縮合」という用語は、本願で用いる場合、１つのモノマーを第二のモノマーまたは固相に結合させるための化学反応を意味する。そのような反応は、当業者に公知であり、MilliGen/Biosearch Cyclone Plus Synthesizerのような自動DNA合成機を製造業者に推奨された手順で使用することによって、典型的に行われ得る。「連続的な結合」という用語は、本願で用いる場合、モノマーの段階的な付加を意味する。個々のモノマーを使用してのランダムチュプレットを有するオリゴヌクレオチドの合成方法が説明される。この方法は、いくつかのステップからなり、その第一は、ランダム化される各チュプレットのためのヌクレオチドチュプレットの合成である。以下に説明されるように、ヌクレオチドチュプレット（即ち、コドン）は、チュプレットの特殊な例として使用される。いかなる大きさのチュプレットも、本願に開示される方法を使用して機能し、当業者は、あらゆる大きさのランダム化チュプレットを使用する方法を知っている。
20種全てのアミノ酸を特定するコドンのランダム化が１つの位置で望まれる場合、20種の異なるコドンが合成される。同様に、10種のコドンのみを特定の位置で望む場合は、それらの10種のコドンが合成される。2から64までの種のコドンのランダム化が、各所望のトリプレットを合成することによって、達成され得る。遺伝子コードの縮重性のために、好ましくは、2から20種のコドンのランダム化が、あらゆる１つの位置で使用される。１つの位置で選択されるコドンは、次の位置で選択されるのと同じコドンである必要はない。さらに、センスまたはアンチセンス配列のオリゴヌクレオチドが、合成され得る。従って、この方法により、いかなる数のコドンをも、いかなる所望のコドンの位置でも、ランダム化が行われる。
ランダム化されるべきコドンは、各コドンの第一モノマーを別の支持体に結合することによって、連続的に合成される。各コドンの合成のための支持体は例えば、１つの反応容器が１つのコドンのためのモノマー結合反応に対応するように、異なる反応容器中に入れられることができる。この場合および以下の場合に用いる場合、20種のコドンをランダム化するときには、20の反応容器が、各コドンの最初の20種モノマーについて、独立した結合反応で用いることができる。第１モノマーに各コドンの第２モノマーを連続して結合させて、二量体を生成させ、上記の合成された各二量体に、続いて、各コドンの第３モノマーを結合させて三量体を生成させることによって合成が進行する（図１のステップ１において、M₁、M₂およびM₃はそれぞれ、ランダム化すべき各コドンに対する第１、第２および第３のモノマーを示す）。
個々のモノマーから第１コドンを合成した後、ランダム化すべき個々のコドンが入っている20の全反応容器からの支持体を混合することによってランダム化が達成される。その固相支持体をその容器から取り出して混合し、集団内に、全コドンの種のランダム分布を達成することができる（図１、ステップ２）。支持体の混合集団は、全コドン種を構成しているが、次に、これを20の独立した反応容器に再分配する（図１のステップ３）。その結果すべての容器は同一で、固相支持体に結合された20種の全コドンを等比率で含有する。
第２の位置のコドンをランダム化するために、ステップ１の縮合基質のようにステップ３で作製された20の各反応容器中で、20種の付加コドンの合成が行われる（図１のステップ４）。それ故に、ステップ１および４が、コドンを合成する前のサイクル（ステップ１〜３）で製造された支持体を使い、一方ステップ１がオリゴヌクレオチドの第１コドンの最初の合成であることを除いて、ステップ１と４は同一である。ステップ４から得られる支持体には各々２つのコドン（すなわちヘキサヌクレオチド）が結合しており、第１位置のコドンは、20種の生じ得るコドンの任意の１種であり（すなわちランダム）、かつ第２位置のコドンは、20種の生じ得るコドンの１種である。
第２位置のコドンのランダム化と第３位置のコドンの合成を行うために、ステップ２〜４を繰返す。このプロセスによって、各容器内にコドンのオリゴヌクレオチド（すなわち９ヌクレオチド）が得られ、コドン位置１および２がランダム化され、位置３は20種の生じ得るコドンの１種を含有している。ステップ２〜４を繰り返して、第３位置のコドンをランダム化し、次の位置にコドンを合成する。このプロセスは所望の長さのオリゴヌクレオチドが得られるまで続けられる。最後のランダム化ステップを終ってから、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、当業者に公知の方法で単離することができる。あるいは、そのオリゴヌクレオチドは、プローブハイブリダイゼーションを利用する方法に使うために支持体上に残しておくことができる。
コドン配列の多様性、すなわち各種の生じ得るオリゴヌクレオチドの数は、本発明の方法を使うことによって得ることができるが、極めて大きく、利用できる物質の物理的特性によってのみ限定される。例えば、直径が約100μｍのビーズで構成された支持体は、25mgのビーズが入っている１μMの反応容器を用いて、約10,000ビーズ／反応容器に限定される。この大きさのビーズは、１ビーズ当り約１×10⁷のオリゴヌクレオチドを支持し得る。20種の各アミノ酸に対して別個の反応容器を用いる合成法によって、個々のビーズに結合した全オリゴヌクレオチドが同一であるビーズが製造される。これらの条件下で得ることができる多様性は、10,000×20すなわち200,000の異なるランダムオリゴヌクレオチドの約10⁷のコピーである。しかしこの多様性は、本願に開示された基本的方法から逸脱することなく、いくつもの方法で増大させることができる。例えば、生じ得る配列の数は、支持体を構成する個々のビーズの大きさを小さくすることによって増大させることができる。直径が約30μmのビーズによって、１反応器当りのビーズの数が増大し、その結果、合成されるオリゴヌクレオチドの数が増大する。ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの多様性を増大する別の方法は、反応容器の容積を増大することである。例えば、同じ大きさのビーズを用いる場合、容積の大きい容器は小容積の容器よりも多数のビーズを入れることができるので、より多数のオリゴヌクレオチドの合成を支持する。また単一の反応容器内で支持体に連結されるコドンの数を増やすと、ランダムオリゴヌクレオチドの多様性が増大する。全多様性は、合成されるコドン位置の数に、一容器あたり結合されたコドンの数を累乗した数である。例えば、10の反応容器を用いて、各々が2種のコドンを合成して合計20のコドンをランダム化することによって、１つの100μmビーズ当り、10コドンの長さを有する異なるオリゴヌクレオチドの数を増やすことができ、各ビーズは、１種の代わりに、約2¹⁰すなわち１×10³の異なる配列を有する。当業者には、かようなパラメータを修飾して、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの多様性を増大させる方法は公知である。
反応容器の数をランダム化すべきコドンの数より少なくして、個々のモノマーを用いて各位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する方法について説明する。例えば、20種のコドンを、オリゴヌクレオチド集団内の各位置にランダム化する場合、10の反応容器を使うことができる。各位置にランダム化すべきコドンの数より少ない数の反応容器を使う方が好ましい。なぜなら、反応容器の数が少ない方が操作が容易であり、その結果、合成される可能性のあるオリゴヌクレオチドの数が増大するからである。
オリゴヌクレオチド内の所望の位置に、20種のコドンをランダム合成するのに使用する反応容器の数を減らすことは、各反応容器が２以上のコドンの合成生成物を入れることができることを除いて、20の反応容器を用いる上記の方法に類似している。例えば10の反応容器を用いるステップ１の合成は、10の各反応容器に入っている支持体に約２の異なるコドンを結合させることによって進行する。この方法は図２に示すが、異なる支持体に結合させる２つの各コドンは、以下の配列で構成されている。すなわち、(1)PheとValに対する（T/G）TT；(2)SerとProに対する（T/C）CT；(3)TyrとHisに対する（T/C）AT；(4)CysとArgに対する（T/C）GT；(5)LeuとMetに対する（C/A）TG；(6)GlnとGluに対する（C/G）AG；(7)ThrとAlaに対する（A/G）CT；(8)AsnとAspに対する（A/G）AT；(9)TrpとGlyに対する（T/G)GG；および（10)IleとCysに対するA(T/A)Aである。スラッシュ(/)は、スラッシュの各側に示すモノマーの混合物が、指定の結合ステップであたかも単一のモノマーであるように使用される。上記の各コドンのアンチセンス配列は、相補性配列を合成することによって生成させることができる。例えばPheおよびValに対するアンチセンスはAA(C/A)である。上記の配列対の各々でコードされるアミノ酸は、標準の３文字命名法で示される。
この方法でモノマーを結合させると、10の反応容器内の支持体に結合させた20種の天然産アミノ酸をすべて指定するコドンが得られる。しかし使用される個々の反応容器の数は、所望の位置にランダム化すべきコドンの数によって決まるので当業者が決定できる。例えば、10のコドンをランダム化する場合、５の反応容器を結合に使用できる。上記のコドン配列はこの合成法にも使用できる。また、そのコドンの配列も、遺伝暗号を構成する追加の44種のコドンのどれかを組込むか、またはどれかで置換することにより変更することもできる。
少ない数の反応容器を用いて、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する残りのステップは、混合と分割のステップを約半分の数の反応容器から得た支持体で実施することを除いて、20の反応容器を用いる合成法について先に述べたのと同じである。これらの残りのステップは図２に示してある（ステップ２〜４）。
予め決められた位置に少なくとも１つの指定のチュプレットを有し、残りの位置はランダムチュプレットを有するオリゴヌクレオチドも、本願に記載する方法を用いて合成することができる。その合成ステップは、指定のコドン位置の合成を行う前に、異なるコドンを合成するため支持体を別の反応容器に分割することを省略することを除いて、20以下の反応容器を用いる上記のステップに類似している。例えばオリゴヌクレオチドの第２の位置のコドンが指定される場合は、第１位置におけるランダムコドンの合成と支持体の混合を行ってから、混合された支持体を新たな反応容器に分割せず、代わりに、単一の反応容器に入れて指定のコドンを合成する。指定されたコドンは、前記と同様にして、個々のモノマーから逐次合成される。このようにして、反応容器の数を、各ステップで増減させて、指定の１つのコドンまたは所望の数のランダムコドンの合成を行わせることができる。
コドンの合成に続いて、混合された支持体は、ランダム化すべき次のコドンを合成するために個々の反応容器に分割するか（図１、ステップ３）、または引続いて指定のコドンを合成するために分割せずに用いることができる。予め決められていたかまたはランダム化されたコドンを有する所望の数の位置が得られるまで、各コドンを付加する合成のラウンドを繰り返し行う。
第１の位置のコドンが指定されているオリゴヌクレオチドの合成も上記の方法を用いて合成することができる。この場合、第１位置のコドンは、適切なモノマーから合成される。支持体は、第２の位置にランダムコドンを合成するのに要する反応容器の必要数に分割し、次に合成、混合および分割のラウンドを上記と同様にして実施する。
多様であるが予め決められた配列に偏ったチュプレットを有するオリゴヌクレオチドの合成法についてもここで述べる。この方法には２つの反応容器を用いる。すなわち、一方の容器は予め決められた配列の合成に用い、第２の容器はランダム配列の合成に用いる。この方法は、例えばかなりの数のコドン位置が指定配列であるときに使用するのが有利である。というのは、この方法は多数の反応容器の使用を少なくするからである。代わりに、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのヌクレオチドのような４種の異なるモノマーの混合物が、コドン中の第１と第２のモノマーとして使用される。そのコドンは、グアニンとチミンまたはシトシンとアデニンのヌクレオチドのモノマーの対の混合物を、第３のモノマーの位置に結合することによって完成される。第２の容器では、ヌクレオチドモノマーを逐次結合させて予め決められたコドン配列が得られる。２つの支持体を混合することによって、所望の位置に、予め決められたコドンとランダムコドンの両方を含有するオリゴヌクレオチドの集団が得られる。単一の反応容器内の支持体の上記の混合物を用いて、例えば追加の予め決められたコドンを結合させるか、またはさらに２つの反応容器に混合物を分割して追加のランダムコドンを合成することによって、合成を進行させることができる。
上記の２反応容器法は、ランダム化すべき所望のコドン位置で、支持体混合物を２つの部分に分割することによって、予め決められたチュプレット配列を有するオリゴヌクレオチド内にコドンを合成するのに利用することができる。さらに、この方法で、ランダム化の程度を調節することができる。例えば２つの支持体を非等量で混合もしくは分割すると、所望の位置における、ランダムコドンに対する予め決められた配列を有するコドンの比率が変化する。支持体の非等量の混合と分割は、より長いかまたはより短い長さのオリゴヌクレオチド中の有意の数の位置にランダムコドンを合成する必要がある場合に有用である。
ランダム化の程度を、ランダムコドン位置の第１、第２および第３のモノマーを結合するステップにモノマーの非等量混合物を用いることによって調節することができる。非等量の混合物を、任意のもしくはすべての結合ステップに用いて、モノマーの比率を反映して数を増大したコドンの集団を配列中に得ることができる。
ランダム化されたオリゴヌクレオチドの合成は、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。モノマーの線状結合は、例えば、MilliGen/Biosearch Cyclone Plus自動合成機を製造業者（Millipore社、マサチューセッツ州、バーリントン）が説明しているように使用し、ホスホルアミダイト化学法を利用して実施できる。その他の化学的方法と自動合成機も同様に利用することができ、当業者に公知である。
多重コドンの合成は、個々のセットの反応でコドンを別個に合成することによって、合成機を改変することなしに実施することができる。あるいは、コドンを多数の反応容器中で同時に合成するために、自動DNA合成機を改変することができる。
１つの実施態様において、本発明は、発現要素に作動可能に連結された発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の原核細胞を提供するものである。この発現可能なオリゴヌクレオチドは、所望の偏りのランダム配列を有する第１と第２のオリゴヌクレオチドの多様な組合せから製造される所望の偏りのランダムコドン配列を有する。本発明はまた、かような複数の原核細胞を構築する方法も提供するものである。
上記の方法で合成されるオリゴヌクレオチドは、偏りがないか、多様であるが予め決められた配列に対して偏っているか、または予め決められた位置に少なくとも１つの指定のコドンを有する複数のランダムペプチドを発現するのに利用できる。必要性は、ランダムペプチドの生成集団を得るためにどちらの種類のオリゴヌクレオチドを発現すべきかを決定し、当業者に公知である。発現は任意の和合性のベクター／宿主系で実施することができる。このような系には、例えばE.coliのような原核生物、酵母系および哺乳動物の細胞のような他の真核系のプラスミドまたはファージミドが含まれるが、本明細書中では本願の好ましい実施態様、例えば繊維状バクテリオファージの表面での発現が述べられている。繊維状バクテリオファージは例えばM13、f1およびfdであり得る。このようなファージは円形の一本鎖ゲノムと二本鎖の複製DNA型をもっている。さらに、ペプチドは、必要性および使用されるベクトル／宿主系に応じて、可溶性形態もしくは分泌形態で発現することができる。
M13の表面上でのランダムペプチドの発現は、例えば図３に示すベクター系を用いて達成することができる。当業者が作ることができるベクターの構築は、実施例IとIIに明示してある。完全なヌクレオチド配列は図５、６および７（それぞれSEQ ID NO:1,2および3）に示してある。この系は、別のベクターに含有されている２つの小さいオリゴヌクレオチド部分を結合して単一のベクターとすることによって、発現要素とgVIIIに機能的に連結されたランダムオリゴヌクレオチドを生成する。この系または本願に記載の他の系によって得られるオリゴヌクレオチド種の多様性は5×10⁷以上にすることができる。5×10⁷より小さい多様性も得ることができ、発現すべきランダムペプチドの必要性と種類によって決まる。２つの前駆体部分をランダム結合してより大きいオリゴヌクレオチドにすると、集合体の多様性が数倍も増大するので、標準の方法で合成することができるものよりも大きいオリゴヌクレオチドを生成するという利点が加わる。さらに、相関関係は知られていないが、オリゴヌクレオチドが本願に記載のような合成中にとることができる可能な経路の数がビーズの数より大きい場合、合成経路と得られる配列の間に相関関係がある。個別に合成されるオリゴヌクレオチド集団を結合することによって、この相関関係は破壊されるであろう。これ故に、合成手順に固有の偏りは、２つの前駆体部分を結合して、連続したランダムオリゴヌクレオチドにすることによって軽減される。
結合されて発現可能な形態となる前駆体オリゴヌクレオチドの集団は各々個別のベクター中にクローン化される。結合されたオリゴヌクレオチドを構成する２つの前駆体部分は、発現されるペプチドのカルボキシ末端とアミノ末端の部分に対応する。各前駆体オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスをコードすることができ、発現要素の配列およびタンパク質の融合部分をコードする遺伝子ならびに２つの前駆体オリゴヌクレオチドを結合するのに使用される機構に依存している。図３に示すベクターについては、ペプチドのカルボキシ末端部分に対応する前駆体オリゴヌクレオチドはセンス鎖をコードする。アミノ末端に対応する前駆体オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖をコードする。オリゴヌクレオチド集団は、M13IX22とM13IX42のEco RIとSac Iの制限酵素部位の間に挿入されている（図３ＡとＢ）。M13IX42(SEQ ID NO:1)はセンス鎖の前駆体オリゴヌクレオチド部分に用いられるベクターであり、M13IX22(SEQ ID NO:2)はアンチセンス前駆体部分に用いられる。
ベクターに挿入されたランダム化オリゴヌクレオチドの集団は、ランダムコドン配列の反対側の末端に隣接するEco RIとSac I認識配列で合成される。上記の部位によって、これらの一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールしてEco RIとSac Iで制限消化された二本鎖オリゴヌクレオチドに連結することができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは標準の変異誘発法によってベクターに挿入することができる。この後者の方法では、一本鎖のベクターDNAはファジーから単離され、ベクター配列に相補的な公知の配列を有するランダムオリゴヌクレオチドとアニールされる。そのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによって延長され、ランダム化オリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ベクターを生成する。
センス鎖オリゴヌクレオチド部分のために使用されるベクターであるM13IX42（図3B）は、Eco RIとSac I制限部位の下流およびインフレームにプソイド−野生型gVIII生成物をコードする配列を含有している。この遺伝子は野生型M13 gVIIIアミノ酸配列をコードするが、同じベクター内に含まれている野生型gVIIIとの相同組換えを減らすためにヌクレオチドレベルで変更されている。この野生型gVIIIは、少なくともいくつかの機能性で非融合のコートタンパク質が生成されるのを保証するために存在している。それ故に野生型gVIIIの含有は、生育不能のファージの生成およびある種のペプチド融合タンパク質に対する生物学的選択の可能性を低下させる。２つの遺伝子の分化調節性も、プソイド型と野生型のタンパク質の相対比を制御するのに使用できる。
また、アンバー終止停止コドンが、Eco RIとSac Iの制御部位の下流およびインフレームにある。その突起変異はSac Iから6コドン下流に位置しているので、挿入されたオリゴヌクレオチドとgVIII配列の間に位置している。野生型gVIIIの機能のように、アンバー終止コドンと、前駆体部分が結合して発現可能なオリゴヌクレオチドを生成するときに生物学的選択を減少させる。これは非サプレッサー（Sup 0）の宿主菌株を用いて達成される。なぜならば、非サプレッサーの菌株は、オリゴヌクレオチド配列の後であるがプイソドgVIII配列の前で発現を停止させるからである。これ故、プイソドgVIIIはこれらの環境下でファージの表面では決して発現されることはない。代わりに、可溶性のペプチドだけが産生される。非サプレッサー菌株中での発現は、可溶性ペプチドの大きな集団を製造したいときに有利に利用できる。オパールおよびオーカーのようなアンバー以外の終止コドン、または誘導リプレッサー要素のような分子スイッチも、表面発現からペプチド発現をアンリンク（unlink）するのに利用できる。別の制御も存在するが、以下に説明する。
アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド部分に対して用いられるベクターであるM13IX22(図3A)は、ペプチド融合タンパク質に対する発現要素を含有している。このベクター中の、Sac IとEco RI部位の上流およびインフレームに、表面発現のためのリーダー配列がある。ペプチド融合タンパク質の複製と翻訳のためのリボソーム結合部位とLac Zプロモーター／オペレーター要素が存在する。
両方のベクターは、２つの前駆体オリゴヌクレオチド部分とそのベクターの配列とを連結するための一対のFok I制限酵素部位（図3Aと3B）を含有している。一方の部位は、連結される各前駆体オリゴヌクレオチドの末端に位置している。ベクター中の第２のFok I部位は、結合されるベクター配列の末端に位置している。この第２のFok I部位の5'オーバーハングは、オリゴヌクレオチド部分内の第一Fok I部位で産生されるオーバーハングには見出されない配列をコードするように変化させた。その２つの部位によって、各円形ベクターを２つの部分に切断し、次に各ベクター内の必須要素を連結して、２つのオリゴヌクレオチド前駆体部分が隣接配列を形成している単一の円形ベクターにすることができる（図3C）。２つのFok I部位で産生される非和合性のオーバーハングは、２つのベクター部分を結合するコンカターマイゼーション（concatermization）反応またはサーキュラリゼーション（circularization）反応を実施するための最適の条件を選択することができる。条件のこのような選択は、反応順序を支配するのに利用することができるので、結合の効率が増大する。
Fok Iは、その認識配列が切断より遠位である制限酵素である。切断点に対して、認識配列の位置を遠位に配置することは重要である。というのは、２つが、結合されるオリゴヌクレオチド部分内で重なった場合には結合部位に非変異のコドン配列をもたらすからである。結合部に非変異コドンが形成するのを少なくするためにFok I認識配列をランダムコドン配列の外側に位置してもよく、ランダム配列内で制限するのにもなお使用される。続いてFok Iによって形成された一本鎖オーバーハングのアニーリングと、２つのオリゴヌクレオチド前駆体部分との連結によって、結合部分を形成することができる。各種の制限酵素がこの機構によってDNAを制限するのでFok Iの代わりに用いて、前駆体オリゴヌクレオチドを非変異のコドン配列を生成することなしに結合することができる。このような酵素としては、例えば、Alw I,Bbu I,Bsp MI,Hga I,Hph I,Mbo II,Mnl I,Ple IおよびSfa NIがある。当業者であれば、上記のような別の酵素認識配列でFok I認識配列を置換する方法を知っており、適切な酵素を使って前駆体オリゴヌクレオチド部分を連結する。
前駆体オリゴヌクレオチドの配列はランダムであり、切断後アニールするのに充分に相補的な配列である２つの前駆体集団内にオリゴヌクレオチドを常にもっているけれども、アニーリングの効率は、一方の前駆体集団内の一本鎖オーバーハングが、第２の前駆体集団内に相補的な配列をもっていることを保証することによって、増大させることができる。これは、２０種の各アミノ酸をコードする、Fok I切断部位において公知の配列の非縮重シリーズを合成することによって達成することができる。Fok Ｉ切断部位は４塩基のオーバーハングを含有するので、20種の全アミノ酸をランダムにコードするためには40種の異なる配列が必要である。例えば、10コドンの長さの２つの前駆体集団を結合する場合は、９番目のコドン位置が合成された後、支持体の混合集団を、各集団について40の反応容器に分割し、対応する各反応容器について、集団間の相補性配列を独立に合成する。その配列を実施例Iの表IIIとVIに示すが、カラム1R〜40Rのオリゴヌクレオチドは、一度切断された対応するカラムIL〜40L上のオリゴヌクレオチドと相補性のオーバーハングを形成する。表VI中の縮重X位置は、前駆体オリゴヌクレオチド部分が結合される場合に読取枠を維持するのに必要である。しかし、平滑末端を生成するMnl Ｉのような制限酵素は、読取り枠を維持する際に導入される縮重を減らすために、Fok Ｉの代わりに使用され得る。
各ベクターが示す最後の特徴は、結合中に失われるベクター部分内の必須のコーディング配列中に位置するアンバー終止コドンである（図3C）。アンバー終止コドンは、生存可能なファージを選択するために存在する。このファージは、前駆体オリゴヌクレオチドとそのベクター配列を単一のベクター種に適切に結合することのみで生成される。他の意味のない突然変異または選択マーカーも同様に作用し得る。
この結合工程によって、２つの集団内の異なる前駆体オリゴヌクレオチドを、ランダムに結合させて単一ベクター（図3C，M13IX）とする。各々独立したベクターであるM13IX22およびM13IX42が与えるベクター配列は、生存可能なファージを産生するのに必要である。また、発現要素がM13IX22に含有され、およびgVIII配列がM13IX42に含有されるで、機能性gVIII-ペプチド融合タンパク質は、その配列がM13IXに示すように結合されるまで発現され得ない。
結合工程は、ランダム化オリゴヌクレオチドを含有するベクターの各々の集団をFok Ｉで制限し、混合し、結合することによって実施される（図3C）。アンバー終止コドンを含有する、いづれの生成ベクターも、非サプレッサー菌株に導入されたときには、生存可能なファージを産生しない（図3D）。それ故に、アンバー終止コドンを含まない配列のみが、ライブラリーに含有されるベクターの最終集団を形成する。これらのベクター配列は、ランダム化ペプチドを表面発現させるのに必要な配列である。類似の方法によって、３以上のベクター部分を結合を、ランダムペプチドを発現する単一のベクターに結合し得る。
本発明は、ランダムペプチドの集団由来のリガンド結合タンパク質で捕捉できるペプチドを選択する方法であって；
(a)ランダムコドン配列の所望の偏りを有する第１オリゴヌクレオチドの多様集団を第１ベクターとして使用し得るように結合し；(b)ランダムコドン配列の所望の偏りを有する第２オリゴヌクレオチドの多様集団を第２ベクターとして使用し得るように結合し；(c)工程(a)と(b)でのベクター生成物を、第１と第２のオリゴヌクレオチドの前記の集団が互いに結合して結合ベクターの１つの集団になる条件下で結合させ；(d)前記の結合ベクターの集団を前記のランダムペプチドの集団を発現するのに充分な条件下で、和合性宿主内に導入し；および(e)前記の結合タンパク質に結合するペプチドを決定する方法。本発明は、また、このようなペプチドのコーディング核酸配列も決定する。
ランダムペプチドライブラリーの表面発現は、アンバーサプレッサー菌株内で実施される。上に記載したようにランダムコドン配列とgVIII配列の間のアンバー終止コドンは、非サプレッサー菌株中、２つの要素をアンリンクする。非サプレッサー菌株から産生されたファージを単離し、サプレッサー菌株を感染させて、発現中にランダムコドン配列をgVIII配列に結合させる（図3E）。感染後に、サプレッサー菌株を培養することにより、ライブラリー内のすべてのペプチドの種はgVIII-ペプチド融合タンパク質として発現する。または、そのDNAを非サプレッサー菌株から単離し、サプレッサー菌株に導入して同じ目的を達成し得る。
gVIII-ペプチド融合タンパク質の発現のレベルは、さらに、転写のレベルで制限され得る。gVIII-ペプチド融合タンパク質は、Lac Zプロモーター／オペレーター系の誘導制御下にある。他の誘導プロモーターも同様に作用し、当業者には公知である。高水準に表面発現を行うために、サプレッサーライブラリーを、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（IPTG）のようなLac Zプロモーターの誘導物質中で培養する。誘導制御は有利である。その理由は、非機能性gVIII-ペプチド融合タンパク質を除く生物学的選択を、非発現条件下でのライブラリーの培養によって最小化し得るからである。発現はスクリーニング時にのみ誘導され、ライブラリー内のオリゴヌクレオチドの全集団がファージ表面に正確に発現されることが保証され得る。また、これは、ファージ表面上のペプチドの原子価の制御に用いられ得る。
標準的なアフィニティー単離法により、リガンド結合タンパク質を捕捉する特異的ペプチドについて表面発現ライブラリーをスクリーニングする。そのような方法としては、例えばパニング法（panning）、アフィニティークロマトグラフィー、および固相ブロッティング法がある。ParmleyおよびSmith，Gene 73:305-318（1998）に記載されたパニング法（この文献を本発明に援用する）が好ましい。理由は、高力価のファージが、容易かつ迅速に小容積でスクリーニングされ得るからである。さらに、この方法により、外の方法では検出できないかつ実質的に均一な集団に拡張された集団内での少ないペプチド種を選別し得る。選別されたペプチド配列は、そのファージ集団を増幅させた後、このようなペプチドをコードする核酸の配列の決定より決定され得る。
本発明は、使用され得るように発現配列に連続されたランダムコドン配列の望ましい偏りを有するオリゴヌクレオチドの多様集団を含有する複数の原核細胞を提供する。また、本発明は、このような細胞集団の構築方法を提供する。
前に記載した方法で合成されたランダムオリゴヌクレオチドは、前駆体オリゴヌクレオチドを互いに結合することなく、例えばM13のような繊維状バクテリオファージの表面で発現させ得る。図４に示すようなベクターM13IX30も使用され得る。このベクターは、gVIII−ペプチド融合タンパク質の表面発現について、図３Ｃに示す結合ベクターの機能的特徴のすべてを示す。M13IX30(SEQ ID NO:3)の完全ヌクレオチド配列を図７に示す。
M13IX30は、ファージ生存のための野生型gVIIIおよびペプチド融合のためのプソイドgVIII配列を含有する。このベクターは、また、フレーム中に、ランダムペプチドをクローン化するための制限部位を含有する。ベクター中のクローン化部位は、Xho I、Stu I、およびSpe Iである。従って、アニーリングおよび連続または挿入突然変異誘発を行なうのに適する相補性末端を有するオリゴヌクレオチドが合成される。あるいは適切な末端は、PCRで生成され得る。制限部位とプソイドgVIII配列の間に、フレーム内アンバー終止コドンがあり、ライブラリーを構築および操作する間、ファージが完全に生存することを保証する。発現とスクリーニングは、前駆体部分から生成されるオリゴヌクレオチドの表面発現ライブラリーについて上に記載したようにして実施する。
このように、本発明は、リガンド結合タンパク質によって捕捉し得るペプチドを、ランダムペプチドの集団化から選別する以下の方法を提供する；(a)ランダムコドン配列の所望の偏りを有するオリゴヌクレオチドの多様集団を発現要素に使用し得るように結合し；(b)前記のランダムペプチドの集団を発現するのに充分な条件で、前記のベクターの集団を和合性宿主内に導入し；次いで(c)前記結合タンパク質に結合するペプチドを決定する方法。また、このよう選別されたペプチドをコードする核酸配列を決定する方法を提供する。
以下の実施例は例示を目的とし、本発明を限定するものではない。
実施例Ｉ
右半分および左半分のランダムオリゴヌクレオチドから生成されるペプチドリガンドの単離と特性の決定
この実施例は、ランダムオリゴヌクレオチドの合成およびコードされたランダム化ペプチドの表面発現ライブラリーの発現を示す。この実施例のランダムペプチドは、２種のランダムオリゴヌクレオチドを混合し、結合させることによって生成される。ペプチドリガンドの単離および特性決定および特異的結合タンパク質に対応するヌクレオチド配列もまた示される。
ランダムオリゴヌクレオチドの合成
２つのランダム化オリゴヌクレオチドの合成を以下に示す。これらのランダム化オリゴヌクレオチドは、長い方のランダム化オリゴヌクレオチドの短い部分に対応する。２つの短い部分の各々が長いオリゴヌクレオチドの半分を構成する。各々の半分を構成するランダム化オリゴヌクレオチドの集団を、右半分および左半分と命名する。右半分および左半分の各々の集団は、10コドンの長さであり、各位置に20種のランダムコドンを含有する。右半分は、ランダム化オリゴヌクレオチドのセンス配列に対応し、発現されるペプチドのカルボキシ末端側の半分をコードする。左半分は、ランダム化オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列に対応し、発現されるペプチドのアミノ末端側の半分をコードする。ランダム化オリゴヌクレオチド集団の右半分および左半分は、別々のベクター種にクローン化され、次いで混合され結合された。その結果、右半分および左半分はともにランダム結合し、20コドンの長さのランダム化オリゴヌクレオチドの集団を含有する単一の発現ベクターを生成する。ベクター集団を適する宿主にエレクトロポーレーション法で導入して、ランダムペプチドを表面で発現する繊維状バクテリオファージを生成させる。
オリゴヌクレオチド合成用の反応容器は、自動合成機のメーカー(Millipore、米国、マサチューセッツ州、バーリントン；MilliGen/Biosearch Cyclone Plus Systhesizerのメーカー)から入手した。容器は、空の反応カラム(1μmole)、フリット、クリンプ、およびプラグ（MilliGen/Biosearch,カタログ # GEN 860458)を含むパッケージとして販売された。誘導体化および非誘導体化された調整微細孔ガラス、ホスホルアミダイトヌクレオチド、および合成試薬もMilliGen/Biosearchから入手した。クリンパーおよびデクリンパーの工具は、米国、ペンシルベニア州、ピッツバーグ、Fisher Scientific Co.から入手した（カタログ番号は、各々06-406-20および06-406-25Aである。）
10の反応カラムを使用し、長さが10コドンのランダムオリゴヌクレオチドの右半分を合成した。オリゴヌクレオチドは、配列の３’末端に５つのモノマー5'GAGCT3'を有し、配列の5'末端に８つのモノマー5'AATTCCAT3'を有する。合成機に、チミンヌクレオチドで誘導体化されたカラム（T-カラム、MilliGen/Biosearch # 0615.50）を取り付け、そして、独立の反応セット中で10の各カラムについて表Ｉに示しす配列を合成するように合成機にプログラムした。最後の３つのモノマーの配列（合成は3'から5'へ進むので右から左へ）は、指定のアミノ酸をコードする：

表中、括弧内の２つのモノマーは、コドン中の単一モノマーの位置を示し、各モノマーの等量混合物を結合するために反応中に添加することを示す。10の各カラムのモノマー結合反応は、メーカーが推薦する通りにして実施した（アミダイト・バージョン S1.06，# 8400-050990，尺度1μM）。最後の結合反応の後、カラムをアセトニトリルで洗浄し、凍結乾燥して乾固した。
合成が終了した後、デクリンパーを用いてプラグを各カラムから外し、反応生成物を単一秤量ボート(single weigh boat)に注入した。最初、ビーズの重量がモノマーの重量のために増加するが、合成の最後の一課程において原料は消失する。いずれの場合でも、原料は、非誘導体化された調整微細孔ガラスによって均等化され、十分に混合されて、20種の全コドン種のランダム分布が得られた。次に、一度に物質を25mgずつ取り出し、別々の反応カラムに入れて、反応生成物を新しい10の反応カラムに分割した。或いは、ビーズを分散させて保持するのに十分な高密度を有する液体、好ましくは密度がビーズに等しい液体に、ビーズを分散させ、次いでその分散液の等容積づつを別々の反応カラムに分割することによっても、反応生成物を分割し得る。フリットが乗っているカラムの内側のリップは、シリンジと25 Gの針で真空吸引を利用して原料が除去された。新しいフリットをリップの上に置き、プラグをカラムに取り付け、クリンパーを用いて所定の位置にクリンプした。
第2コドン位置の合成には、第1コドンの合成からの反応生成物のランダム混合物を含有する、上記の10のカラムを用いた。第2コドン位置のためのモノマー結合反応を表IIに示す。第1位置のAは、いかなるモノマーも合成機にプログラムされ得ることを意味する。その位置において、第1モノマー位置は合成機によって結合は行われない。その理由は、ソフトウェアがモノマーはすでにカラムに結合すると見なすからである。またAは、前のコドン合成からのカラムを、現在の合成課程で用いるために合成機に装着するべきことを示す。さらに、表IIに示すように各カラムについて反応を逐次繰り返し、次いで反応生成物を上記のように洗浄して乾燥した。

第2コドン位置のランダム化は、反応生成物を各カラムから取り出し、その物質を十分に混合することによって行った。その物質を新しい反応カラムに分割し、上記のようにモノマー結合反応のために準備した。
次の7つのコドン(3〜9の位置)のランダム合成は、第２コドン位置について、先に述べたサイクルと同様にして行い、再度、表IIのモノマー配列を使用した。前のコドン位置の合成からの反応生成物としてランダム混合物を含有するカラムであって、新しくリパックされた各々のカラムを、次のコドン位置の合成に用いた。第9位のコドンの合成と反応生成物の混合を行った後、その物質を分割し、40の異なるカラムにリパックし、表IIIに示すモノマー配列を、独立した反応で、40の各カラムに結合させた。40の各カラムからのオリゴヌクレオチドをもう一度混合し、メーカーが推奨するようにして、調整微細孔ガラスから切り離した。

ランダムオリゴヌクレオチドの左半分の合成は、右半分の合成と同様にして行った。オリゴヌクレオチドのこの半分は、コードされたランダム化ペプチドのアンチセンス配列に対応する。従って、表Ｉ〜表IIIのコドンの相補性配列が合成される。左半分のオリゴヌクレオチドも配列の3'末端に５つのモノマー5'GAGCT3'を有し、配列の5'末端に8つのモノマー5'AATTCCAT3'を持つ。合成、洗浄、乾燥、混合、および分割の一課程は、上に記載しものと同様である。
第1コドン位置について、合成機にT-カラムを取り付け、独立の反応セットで10の各カラムについて表IVに示す配列を合成するようにプログラムした。右半分の合成の場合と同様に、最後の3つのモノマー配列（右から左へ）は指定のアミノ酸をコードする。

洗浄および乾燥の後に、各カラムのプラグを取り外し、混合し、上に記載したように10の新しい反応カラムに分割した。第2コドン位置の合成は、第1コドン合成からの反応生成物のランダム混合物を含有する、これらの10のカラムを用いて実施した。第２コドン位置のためのモノマー結合反応を表Ｖに示す。

反応生成物の各カラムからの取外しおよび充分なビーズの混合を行なうことによって、再度、第２コドン位置のランダム化を実施した。そのビーズを10の新しい反応カラムにリパックした。
次の７つのコドン位置のランダム合成は、第２コドン位置について、先に述べたサイクルと同様に実施し、再度、表Ｖのモノマー配列を用いた。第９位のコドンの合成および反応生成物の混合の後に、物質を40の異なるカラムに分割し、リパックし、次いで表ＶＩに示すモノマー配列を、独立の反応で40の各カラムに結合させた。

「X」で示される２つの第１モノマーは、その位置における４つすべてのヌクレオチドの等しい混合物を表す。これは、右半分および左半分のオリゴヌクレオチドとの結合部で比較的偏っていないコドン配列を保持するのに必要である。上記の右半分および左半分のランダムオリゴヌクレオチドを、支持体から切り離して精製し、下記の表面発現ライブラリーの構築に用いた。
ベクターの構築
２つのM13ベースのベクターのM13IX42（SEQ ID NO:1）とM13IX22（SEQ ID NO:2）の各々を、ランダムオリゴヌクレオチドの右半分および左半分の集団をクローン化し、増幅させるために構築した。ベクターは、特に、右半分および左半分のオリゴヌクレオチド集団のランダム結合と逐次発現を容易に行なうために構築された。その集団内の各々のベクターは、ともに結合した集団からの１つの右半分オリゴヌクレオチドと１つの左半分オリゴヌクレオチドを含有し、22のコドンの長さのランダムコドンを有する単一の連続オリゴヌクレオチドを形成する。生成したベクター集団は、表面発現ライブラリーの構築のために用いられる。
M13IX42または右半分のベクターは、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分集団を保持するために構築された。M13mp18（Pharmacia、米国、ニュージャージー州、ピスカチウエイ）が出発ベクターであった。このベクターを遺伝子工学的に修飾し、ベクター内にすでに存在し、コードされた野生型M13遺伝子VIIIに加えて、次のものを含有させた：(1)終止コドン（アンバー）を有するプソイド野生形M13遺伝子VIII配列（これは、ランダム化オリゴヌクレオチドのEco RI-Sac Iクローン化部位との間に配置される）；(2)M13IX22すなわち左半分のベクターとの結合に用いられる一対のFok Ｉ部位；(3)このベクターの、左半分ベクターと結合される部分に対して反対側に配置された第２のアンバー終止コドン；および(4)重複制限部位を除くための他の突然変異部およびLac Zのアミノ末端部。
プソイド野生形M13遺伝子VIIIを、ランダムペプチドの表面発現に用いた。このプソイド野生型遺伝子は、野生型遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードする。しかしそのヌクレオチド配列は改変されており、この遺伝子とコードされた野生型遺伝子VIIIとの同一性は63％にすぎない。表面発現のために用いられる遺伝子VIIIのヌクレオチド配列の修飾によって、該ベクターに含有されている野生型遺伝子VIIIによる相同的組換えの可能性が減少する。さらに、野生型M13遺伝子VIIIは、該ベクター中に保持され、少なくともある種の機能性で非融合のコードタンパク質が生成することを保証する。従って、野生型遺伝子VIIIの含有によって、ランダムペプチド融合遺伝子から非生存性のファージが生成する可能性が減少する。
プソイド野生型遺伝子VIIIは、遺伝子の両方のストランドをコードする一連のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって構築された。そのオリゴヌクレオチドを表VII（SEQ ID NO:7〜16）に示す。

末端オリゴヌクレオチドVIII 03（SEQ ID NO:7）とVIII 08（SEQ ID NO:12）を除いて、上記のオリゴヌクレオチド［オリゴヌクレオチドVIII 04〜VIII 07および09〜12（SEQ ID NO:8〜11および13〜16）］を、10μｌの最終容積中、各々200ngづつ混合し、1mM ATPを用い、37℃で１時間、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）でリン酸化した。この反応を65℃にて５分間保持してから停止させた。末端オリゴヌクレオチドを混合物に添加し、次いで６５℃で５分間加熱し、アニールして二本鎖形とした。次いで、30分間かけて室温まで冷却した。アニールさせたオリゴヌクレオチドを、1.0UのT4 DNAリガーゼ（BRL）を用いて互いに結合した。オリゴヌクレオチドをアニールし結合することによって、その5'末端にBam HI部位が隣接され、その3'末端にHind III部位が隣接された二本鎖DNAを得た。翻訳終止コドン（アンバー）がBam HI部位に続く。遺伝子VIII配列は、終止コドンに対して２コドン3'側のコドンGAA（Glu）で始まる。二本鎖挿入断片を、T4 DNAキナーゼ（Pharmacia、米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）とATP（10mMトリス-HCl pH7.5、10mM MgCl₂）を用いてリン酸化し、次いで、M13ポリリンカー内のRco RIおよびSac I部位のフレーム中にクローン化した。これを行うために、M13mp18をBam HI（New England Biolabs、米国、マサチューセッツ州、ベバリー）とHind III（New England Biolabs）で消化し、1:10モル比で二重鎖挿入断片と結合させた。この結合は、1.0UのT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）を含有する1メリガーゼ緩衝液（50mM トリス-HCl、pH7.8、10mM MgCl₂、20mM DTT、1mM ATP、50μg/ml BSA）中、16℃で一夜行われた。結合混合物において宿主を形質転換し、該技術分野の標準方法によって正のクローンをスクリーニングした。
いくつかの突然変異を右半分ベクター内に発生させ、機能性のM13IX42を得た。この突然変異は、Kunkelら、Meth．Enzymol．154:367-382（1987）の方法（部位特異的変異誘発法）によって発生させた。この文献を本発明に援用する。試薬、菌株、およびプロトコルは、Bio Rad Mutagenesis Kit（Bio Rad、カリフォルニア州、リッチモンド）から入手し、変異誘発はメーカーによって推奨されたようにして行った。
右半分および左半分の結合に用いられるFok I部位は、オリゴヌクレオチド5'-CTCGAATTCGTACATCCTGGTCATAGC-3'（SEQ ID NO:17）が用いられ、ユニークEco RI部位に対して８ヌクレオチド5'側に生成させた。ベクターに保持される第２のFok I部位は、自然に3547位にコードされる。しかしオーバーハング内の配列は、CTTCをコードするように変化られた。M13mp18の239と7244の位置にある２つのFok Iおよびプソイド遺伝子VIII配列の末端にあるHind III部位をベクターから取り出した。取り出しには、突然変異オリゴヌクレオチド5'-CATTTTTGCAGATGGCTTAGA-3'（SEQ ID NO:18）および5'-TAGCATTAACGTCCAATA-3'（SEQ ID NO:19）を用いた。新しいHind IIIとMlu Iの部位を、またM13IX42の3919および3951の位置に導入した。この変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、各々、5'-ATATATTTTAGTAAGCTTCATCTTCT-3'（SEQ ID NO:20）および5'-GACAAAGAACGCGTGAAAACTTT-3'（SEQ ID NO:21）の配列を有した。Lac Zのアミノ末端部位は、突然変異オリゴヌクレオチド5'-GCGGGCCTCTTCGCTATTGCTTAAGAAGCCTTGCT-3'（SEQ ID NO:22）が用いられ、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発法によって欠失された。この欠失によって、M13mp18由来のFok I部位の1/3が除かれた。スペーサ配列を挿入することによって、Eco RI部位およびSac I部位との間の距離が増大され、完全な二重消化が保証された。そのスペーサ配列は、オリゴヌクレオチド5'-TTCAGCCTAGGATCCGCCGAGCTCTCCTACCTGCGAATTCGTACATCC-3'（SEQ ID NO:23）を用いて挿入した。最後にアンバー終止コドンを突然変異オリゴヌクレオチド5-TGGATTATACTTCTA AATAATGGA-3'（SEQ ID NO:24）を用いて4492位に配置した。このアンバー終止コドンは、生物学的選択として用いられる。これによって、ベクター配列を適切に組替え、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分および左半分の結合が保証される。上記の突然変異を行う際に、M13のコーディング領域内でなされる全ての変化は、そのようなアミノ酸配列が変化することなく残るように行われた。M13mp18内にはいくつかの突然変異が見い出され、これらは発表された配列とは異なることに留意すべきである。これらの配列の差異が、見つかった場合には、見出された通りにその差異を本発明に記載したので、M13mp18の発表された配列とは正確には一致しない。
得られたベクターM13IX42の配列を図５（SEQ ID NO:1）に示す。図3Aはまた、M13IX42を示す。このM13IX42は右半分および左半分のランダム化オリゴヌクレオチド間に表面発現ライブラリーを生成するのに必要な各々の要素にマーク付けされる。矢印で示される２つのFok Ｉ部位の間の配列は、M13IX42の部分である。この部分は、左半分のベクターの部分と結合され、遺伝子VIIIの融合タンパク質としてランダムオリゴヌクレオチドを生成する。
M13IX22または左半分のベクターは、ランダム化オリゴヌクレオチドの左半分集団を保持させるために構築された。このベクターは、M13mp19（Pharmacia、米国、ニュージャージー州、ビスカタウエイ）から構築し、以下のものを含有する：(1)M13IX42と混合し、ランダム化オリゴヌクレオチドの左半分および右半分を結合させる２つのFok Ｉ部位；(2)プロモーター、シグナル配列、および翻訳開始シグナルのような発現に必要な配列；(3)ランダム化オリゴヌクレオチドのEco RI-Sac Iクローン化部位；および(4)左半分および右半分のオリゴヌクレオチドを結合させる際の生物学的選択としてのアンバー終止コドン。
M13IX22をM13IX42と混合するために使用いられる２つのFox Ｉ部位のうちの１つは、M13mp18およびM13mp19（3547位）の中に自然にコードされる。M13IX42の場合、この自然に存在するFok Ｉ部位内のオーバーハングをCTTCに変えた。他方のFox Ｉ部位は、翻訳開始シグナルの構築の後に、オリゴヌクレオチドの5'-TAACACTCATTCCGGATGGAATTCTGGAGTCTGGGT-3'（SEQ ID NO:25）を用い、部位特異的変異誘発法によって導入した。
翻訳開始シグナルは、先に述べたように、オーバーラップするオリゴヌクレオチドをアニールし、5' Eco RI部位および3' Hind III部位を含有する二本鎖挿入断片を生成させることによって構築した。オーバーラップするオリゴヌクレオチドを表VIII（SEQ ID NO:26〜36）に示す。このオリゴヌクレオチド、プソイド遺伝子VIII挿入断片に関して記述したようにM13mp18のEco RI部位およびHind III部位との間に、二本鎖挿入断片として結合された。リボソーム結合部位(AGGAGAC)は、オリゴヌクレオチド015(SEQ ID NO:26)内に位置し、翻訳開始コドン（ATG)はオリゴヌクレオチド016(SEQ ID NO:27)の最初の３つのヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチド017(SEQ ID NO:27)は、ATGコドンから67ヌクレオチド下流にSac I制限部位を含有する。自然に存在するEco RI部位を除去し、新しい部位をSac Iから25のヌクレオチド下流に導入した。各々の突然変異を生じさせるために、オリゴヌクレオチドとして、各々、5'-TGACTGTCTCCTTGGCGTGTGAAATTGTTA-3'SEQ ID NO:35)および5'-TAACACTCATTCCGGATGGAATTCTGGAGTCTGGGT-3'(SEQ ID NO:36)を用いた。アンバー終止コドンを、また、M13mp18の3263位置に導入した。この導入には、オリゴヌクレオチド5'-CAATTTTATCCTAAATCTTACCAAC-3'(SEQ ID NO:37)を用いた。
上記の突然変異に加えて、各種の他の修飾を行ない、ある種の配列および重複制限部位を除いた。LAC Zリボソーム結合部位は、M13mp18中のもとのEco RI部位を突然変移させたときに除去された。またM13mp18の239、6361および7244位置にあるFok Ｉ部位は同様に、それぞれ突然変異オリゴヌクレオチドの5'-CATTTTTGCAGATGGCTTAGA-3'（SEQ ID NO:38）、5'-CGAAAGGGGGGTGTGCTGCAA-3'（SEQ ID NO:39）および5'-TAGCATTAACGTCCAATA-3'（SEQ ID NO:40）とともに、それぞれ除去された。やはり、コーディング領域内の突然変異によってアミノ酸配列は変化しなかった。
得られたベクターM13IX22は、7320塩基対の長さを有し、その配列は図6に示す(SEQ ID NO:2)，Sac IとEco RIのクローン化部位はそれぞれ6290と6314の位置にある。図3AもM13IX22を示すが、右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチド間の表面発現ライブラリーを生成するのに必要な各要素にはマークがつけてある。
ライブラリーの構築
カラム1R〜40Rとカラム1L〜40L由来の右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチドの各集団をそれぞれ、別々にM13IX42とM13IX22にクローン化して、右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチドのサブライブラリーを作製する。それ故に、合計80のサブライブラリーを生成させる。右半分と左半分のオリゴヌクレオチドのアニーリングの効率を確実に最大にするために、ランダム化オリゴヌクレオチドの各集団は最終のスクリーニングのステップが実施されるまで、別個に保管される。効率が高い程、得ることができるランダム化オリゴヌクレオチド合計数が増大する。あるいは、右半分のオリゴヌクレオチドの40の集団全体（カラム1R〜40R）を混合し、1つの集団にし、左半分のオリゴヌクレオチドの40の集団全体（カラム1L〜40L）を混合して第２の集団にして、各々について1つのサブライブラリーを作ることができる。
サブライブラリーを作るために、ランダム化オリゴヌクレオチドの上記の各集団を、適切なベクターに、別々にクローン化する。右半分のオリゴヌクレオチドをM13IX42にクローン化して、サブライブラリーM13IX42.1R〜M13IX42.40Rを生成させる。左半分のオリゴヌクレオチドを同様に、M13IX22にクローン化して、サブライブラリーM13IX22.IL〜M13IX22.40Lを生成させる。各ベクターは、消化したときにそれぞれ5'と3'の一本鎖オーバーハングを生成する、ユニークEco RI制限酵素部位とユニークSac I制限酵素部位を含有している。その一本鎖オーバーハングは、相補的一本鎖ランダムオリゴヌクレオチドをアニーリングし連結するのに用いられる。
ランダム化オリゴヌクレオチド集団は、逐次消化と連結のステップによって、Eco RI部位とSac I部位の間にクローン化される。各ベクターは、37℃で2時間、過剰のEco RI(New England Biolabs社)で処理し、次いで4〜24単位の仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim社，インディアナ州，インディアナポリス)を添加する。反応をフェノール／クロロホルム抽出で停止させ、エタノールで沈澱させた。得られたペレットを、蒸留水もしくは脱イオン水（dH₂O)の適切な量に再懸濁させる。約10pmolのベクターを、1.0UのT4 DNAリガーゼ(BRL社，メリーランド州，ゲイサーズバーグ)を含有する1Xリガーゼ緩衝液(50mMトリス-HCl，pH7.8，10mM MgCl₂，20mM DTT，1mM ATP，50μg/ml BSA)の10μl中のランダム化オリゴヌクレオチドの各集団の5000倍過剰モルと混合した。得られた連結液を16℃で16時間インキュベートする。反応は75℃で15分加熱することによって停止させ、DNAを過剰のSac I(New England Biolabs社)で2時間消化する。Sac Iを75℃で15分間加熱することによって不活性化し、次にその反応混合物の容積を、適当量の10Xリガーゼ緩衝液およびdH₂Oによって300μlに調節する。1単位のT4 DNAリガーゼ(BRL社)を添加し、生成した混合物を16℃で一夜インキュベートする。DNAをエタノールで沈澱させ、TE(10mMトリス-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中に再懸濁させた。各連結液からのDNAを、エレクトロポレーションでXL1 Blue^TM細胞(Stratagene社，カリフォルニア州，ラ・ジョラ)中に、下記のようにして導入してサブライブラリーを生成させた。
E．coli XL1 Blue^TMは、Smithら、Focus，12巻，38〜40頁，1990年に記載されているのと同様にして、エレクトロポレーションに付す。尚、この文献は本願に参考として援用するものとする。その細胞は、マグネシウムなしのSOB(20gのバクト-トリプトン、5gのバクト-酵母エキス、0.584g NaCl、0.186g KCl、dH₂Oで1000mlとする)の5mlにXL1の新しいコロニーを接種することによって作製し、激しく通気しながら37℃で一夜増殖させる。マグネシウムなしのSOB(500ml)に1:1000の比率で上記の一夜培養物を接種し、OD₅₅₀が0.8になるまで(約2〜3時間)37℃で激しく通気しながら増殖させる。GS3ローター(Sorvall社，コネチカット州，ニュータウン)を用い、4℃にて10分間、5,000rpm(2,600x g)で遠心分離して細胞を収穫し、その細胞を氷冷10％(V/V)滅菌グリセリンの500ml中に再懸濁させ、遠心分離し、同じ方式で第２回目の再懸濁を行った。第3回目の遠心分離を行った後、細胞を最終容積約2mlの10％滅菌グリセリン中に再懸濁させる。その結果、懸濁液のOD₅₅₀は200〜300になる。通常、再懸濁液は上澄み液を除去して底に残る10％グリセリン液で行われる。細胞は、微量遠心分離管中に40μlずつ入れて、ドライアイス−エタノール浴を用いて凍結し、-70℃で凍結貯蔵する。
凍結細胞を、使用する前に氷上で徐々に解凍し、細胞懸濁液40μl当り約10pg〜500ngのベクターと混合することによってエレクトロポレーションに付す。40μlずつを、0.1cmのエレクトロポレーションチャンバー(Bio-Rad社，カリフォルニア州，リッチモンド)中に入れ、次に、200Ω並列抵抗器25μF，1.88KVを用いて0℃で1回パルスする（この抵抗器は約4msのパルス幅(r)を与える）。パルスされた細胞の10μlずつを、12×75mm培養管に入れた1ml SOC(98ml SOBプラス1mlの2M MgCl₂および1mlの2Mグリコース)で希釈し、その培養物は、37℃で1時間振盪した後、選択培地で培養される（以下参照）。
80のサブライブラリーを各々、当業者に公知の方法を用いて培養する。このような方法は、Sanbrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989年，およびAusubelら，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，1989年に記載されている。両文献はともに本願に参考として援用するものとする。簡単に述べれば、上記のサブライブラリーの培養物1mlを、2XYT培地(16gトリプトン，10g酵母エキス，5g NaCl)で50倍希釈し、次に37℃にて5〜8時間培養して増殖させた。10,000x gで遠心分離して細菌をペレットにした。ファージを含有する上澄み液を滅菌試験管に移し、4℃で保存した。
右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチド挿入断片を含有する二本鎖ベクターDNAを、各サブライブラリーの細胞ペレットから単離した。簡単に述べれば、該ペレットをTE(10mMトリス、pH8.0，1mM EDTA)中で洗浄し、Sorval遠心分離器(コネチカット州，ニュータウン）で5'について7,000rpmで遠心分離して再度収集した。ペレットを、10％スクロース，50mMトリス，pH8.0含有液6mlに再懸濁させる。10mg/μlのリゾチン液3.0mlを添加し、氷上で20分間インキュベートする。0.2M NaOH，１％SDSの液12mlを添加し、10分間氷上でインキュベートする。生成した懸濁液に3M NaOAc，pH4.6の液7.5mlを添加した後、20分間氷上でインキュベートする。得られた試料を4℃にて、15,000rpmで15分間遠心分離する。RNアーゼで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、次にエタノールで沈澱させる。ペレットを再懸濁させ、秤量し、次いで同重量のCsCl₂を各試験管内で溶解して密度を1.60g/mlとする。EtBrを600μg/mlになるまで添加し、TV-1665ローター(Sorval)を用い、50,000rpmで6時間平衡遠心分離を行って二本鎖DNAを単離する。右半分と左半分の各ライブラリーから得たこれらのDNAを使用して、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分と左半分がランダムに結合している40のライブラリーを生成させる。
40の各サブライブラリーは、1つの右半分サブライブラリーと1つの左半分のサブライブラリーを結合させて作製する。結合させた2つのサブライブラリーは、右半分と左半分のランダムオリゴヌクレオチドの合成のための同じカラム番号に相当する。例えば、サブライブラリーM13IX42.1RはM13IX22.1Lと結合させて、表面発現ライブラリーM13IX.1RLを作製する。右半分の全合成と左半分の全合成の集団を混合して、2つだけのサブライブラリーが得られる別の状態の場合には、1つだけの表面発現ライブラリーが生成する。
右半分と左半分のオリゴヌクレオチド集団をランダム結合させて、単一の表面発現ベクター種とするために、各サブライブラリーから単離したDNAを、過剰のFox I(New England Biolabs社)で消化する。反応をフェノール／クロロホルム抽出で停止させ、次いでエタノールで沈澱させる。ペレットをdH₂O中に再懸濁させる。対応する右半分と左半分のサブライブラリーから単離し、Fox Iで消化したDNAの等モル量(5〜10pmol)を、1.0UのT4 DNAリガーゼ（Bethesda Research Laboratories社，メリーランド州，ガイサーズバーグ）を含有する1Xリガーゼ緩衝液10μl中で連結することによって、各表面発現ライブラリーを生成させる。この連結は16℃で一夜行われ、次いでXL1細胞について先に記載したのと同様にして、エレクトロポレーションに付してsup O菌株MK30-3（Boehringer Mannheim Biochemical社(BMB)，インディアナ州，インディアナポリス）中に導入する。MK30-3はsup Oであるから、導入されるランダム化オリゴヌクレオチドをコードするベクター部分だけが生存可能なファージを生成する。
表面発現ライブラリーのスクリーニング
4℃で貯蔵されたファージの貯蔵品から10のm.o.i.で感染させたXL1 Blue^TM細胞(Stratagene社)の液体培養物50mlから、精製ファージを作製する。その培養物は2mM IPTGによって誘導される。全培養物の上澄み液を合わせ、2回遠心分離に付して透明にし、次いで1/7.5容積のPEG溶液(25％PEG-8000,2.5M NaCl)を添加することによってファージを沈澱させ、次いで4℃にて一夜インキュベートする。生成した沈澱を10,000×gで90分間遠心分離することによって回収する。ファージのペレットを、0.01Mトリス-HCl，pH7.6，1.0mM EDTAおよび0.1％Sarkosylを含有する液25ml中に再懸濁させ、室温下30分間、ゆっくりと振盪する。生成した溶液を、0.5M NaClに調節し、5％ポリエチレングリコールの最終濃度にする。4℃で2時間保存した後、ファージを含有する沈澱を、15,000×gで1時間遠心分離を行って回収する。得られた沈澱を10mlのNET緩衝液(0.1M NaCl，1.0mM EDTAおよび0.01Mトリス-HCl,pH7.6)中に再懸濁させ、十分に混合し、次いで170,000×gで3時間遠心分離してファージを再ペレット化する。ファージのペレットを続いて、2mlのNET緩衝液中に一夜再懸濁させ、次に110,000×gで18時間塩化セシウム遠心分離に付す(10mlの緩衝液中3.86gの塩化セシウム含有)。ファージのバンドを収集し、NET緩衝液で７倍に希釈し、170,000×gで３時間再度遠心分離し、再懸濁し、0.1mMアジ化ナトリウムを含有するNET緩衝液0.3ml中、４℃にて貯蔵する。
ストレプタビジンでコートした皿上でパニングを行うのに用いるリガンド結合タンパク質を、まずビオチニル化し、次にUVで不活性化されたブロッキングファージに対して吸収させる（以下参照）。ビオチニル化試薬をジメチルホルムアミドに次の比率で溶解する。すなわち2.4mgの固体のNHS-SS-ビオチン〔スルフォスクシンイミジル2-（ビオチンアミド）エチル-1,3'-ジチオプロピオナート；Pierce社、イリノイ州、ロックフォード〕：1mlの溶媒の比率である。得られた溶液をメーカーの推奨するとおりに使用する。小規模の反応は、滅菌重炭酸塩緩衝液(0.1M NaHCO₃、pH8.6)で希釈したリガンド結合タンパク質(1mg/ml)の43μlを、1μlの溶解された試薬と混合することによって行う。25℃で２時間経過後、残留ビオチニル化試薬を、500μlの1Mエタノールアミン（HClでpHを９に調節する）と、さらに２時間反応させる。全試料を、1mg/ml BSAを含有するTBSの1mlで希釈し、次いでCentricon 30 ultra filter（Amicon社）で約50μlまで濃縮し、そのフィルター上で、2ml TBSで３回、0.02%NaN₃と７×10¹²のUVで不活性化されたブロッキングファージ（以下参照）を含有するTBSの1mlで１回洗浄し、最終の残留液（60〜80μl）を４℃で貯蔵する。NHS-SS-ビオチン試薬でビオチニル化したリガンド結合タンパク質を、ジスルフィド含有連鎖によってビオチニンに連結させる。
偶然に繊維状ファージを捕捉する結合タンパク質をブロックするために、一般にUV照射したM13ファージを使用した。M13mp8（MessingおよびVieira, Gene,19巻、262〜276頁、1982年；この文献は本願に参考として援用するものとする）を選択した。というのはM13mp8は２つのアンバー終止コドンをもっており、これらのコドンは、表面発現ライブラリーを滴定するのに用いられるsup O菌株中に少数のファージを生存させる照射が生じないことを保証するからである。５×10¹³のM13mp8ファージを含有する5mlの試料を、先に述べたのと同様にして精製し、小ペトリ皿に入れ、２フィートの距離をおいて７分間、殺菌灯の光を照射した（フラックス150μW／cm²）。NaN₃を0.02%になるまで添加し、Centricon 30-kDaウルトラフィルター（Amicon社）上でファージ粒子を10¹⁴粒子/mlまで濃縮した。
パニングを行うために、ポリスチレン製ペトリ皿（60×15mm、Falcon；Becton Dickinson、ニュージャージー州、リンカーンパーク）を、１mg/mlのストレプタビジン(BMB)を含有する0.1M NaHCO₃、pH8.6-0.02%NaN₃の1mlとともに、小さな気密性プラスチックボックス内で、冷室中で一夜インキュベートする。翌日ストレプタビジンを除き、少なくとも10mlのブロッキング溶液(29mg/mlのBSA；3μg/mlのストレプタビジン；0.1M NAHCO₃pH8.6-0.02%NaN₃)で置換し、少なくとも１時間室温でインキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、プレートを0.5%のTween20を含有するトリス緩衝食塩水(TBS-0.5%Tween20)で３回迅速に洗浄する。
リガンド結合タンパク質で捕捉されたファージ発現ペプチドの選択は、各ライブラリーの50μl部分と反応させた、ブロックされかつビオチニル化されたリガンド結合タンパク質の５μl（2.7μgのリガンド結合タンパク質）で行う。各混合物を一夜４℃でインキュベートし、1mlのTBS-0.5%Tween20で希釈し、上記のようにして作製したストレプタビジンでコートしたペトリ皿に移す。10分間室温で振盪させた後、未結合のファージを除去し、プレートをTBS-0.5%Tween20で10回、30〜90分間洗浄する。結合したファージを、800μlの滅菌溶離緩衝液（1mg/ml BSA、0.1M HCl、グリセリンでpHを2.2に調節する）を用いて15分間プレートから溶離し、溶出液を48μlの2Mトリス（pHは調節しない）で中和する。各溶出液の20μlずつを、MK30-3濃度細胞について、インプットしたファージを希釈し滴定する。
パニングの第２ラウンドは、各ライブラリーからの最初の溶出液750μlを5mM DTTで10分間処理して、ビオチミン基を残留ビオチニル化結合タンパク質に連結するジスルフィド結合を切断することによって行う。処理された溶出液をCentricon 30ウルトラフィルター(Amicon社)で濃縮し、TBS-0.5%Tween20で３回洗浄し、最終容積約50μlまで濃縮する。最終残留物を、5.0μl（2.7μgのリガンド結合タンパク質）のブロックされかつビオチニル化されたリガンド結合タンパク質が入っている試験管に移し入れ、一夜インキュベートする。生成した溶液を1mlのTBS-0.5%Tween20で希釈しパニングを行い、先に述べたのと同様にして、新しいストレプタビジン被覆ペトリ皿上に溶出させる。第２の溶出液全体(800μl)を48μlの2Mトリスで中和し、その20μlを、第１溶出液とインプットファージの希釈液で同時に滴定する。
個々のファージ集団を２〜３ラウンドのプラーク精製法で精製する。簡単に述べれば、第２溶出液の滴定プレートをニトロセルロースフィルター（Schleicher & Schuell．Inc.、ニューハンプシャー州、キーン）でリフトし、TBS(10mMトリス-HCl、pH7.2、150mM Nacl)中で15分間洗浄することによって処理し、続いて、5%の脱脂乾燥牛乳を含有するTBS(TBS-5%NDM)を0.5ml/cm²で用いてさらに１時間37℃で振盪しながらインキュベートする。洗浄液は排棄し、リガンド結合タンパク質を1nM〜100mM、好ましくは１〜100μM含有する新しいTBS-5%NDMを添加する(0.1ml/cm²)。インキュベーションはすべてヒートシールが可能なパウチ(Sears社)中で行う。リガンド結合タンパク質とともに行うインキュベーションは、振盪しながら４℃で12〜16時間実施する。フィルターをバッグから取り出し、0.1%のNDMと0.2%のNP-40（Sigma社、ミズーリ州、セントルイス）を含有するTBSの150mlで３回30分ずつ室温で洗浄する。次にフィルターを、TBS-0.5%NDMで適切に希釈した、リガンド結合タンパク質に対する抗血清中で、室温にて２時間インキュベートし、上記のように、0.1%NDMと0.2%NP-40を含有するTBSを３回変えて洗浄し、１×10⁶cpmの¹²⁵I標識プロテインＡ（比活性＝2.1×10⁷cpm/μg)とともに0.1%NDMと0.2%NP-40を含有するTBS中でインキュベートする。先に述べたのと同様にして0.1%NDMと0.2%NP-40を含有するTBSで洗浄した後、そのフィルターをサランラップで包み、Dupont Cronex Lightning Plus Intensifying Screens(Dupont社、デラウェア州、ウィルミントン）を用いて、-70℃で1-12時間、Kodak X-Omat X線フィルム（Kodak社、ニューヨーク州、ロチェスター）に暴露させる。
同定された正のプラークをパスツールピペットの大きい端部でコア（core)して、1mlのSM（5.8gのNaCl、2gのMaSO₄・7H₂O、50mlの1Mトリス-HCl、pH7.5、5mlの2%ゼラチン、dH₂Oで1000mlとする）プラス１〜３滴のCHCl₃中に入れて、37℃で２〜３時間または４℃で一夜インキュベートする。ファージをSMで1:500の比率で希釈し、その２μlを、300μlのXL1細胞プラス3mlの軟寒天/100m²プレートに添加する。XL1細胞は、100μlの20%マルトース液と100μlの1M MgSO₄溶液を含有する10mlのLB(10gのバクト-トリプトン、5gのバクト-酵母エキス、10gのNaCl、1000mlのdH₂O)中で１コロニーを一夜増殖させることによってプレーティング用に作製する。2000×gで10分間遠心分離することによって細菌をペレット化し、そのペレットを、10mlの10mM MgSO₄溶液にゆるやかに再懸濁させる。その懸濁液に30mlの10mM MgSO₄溶液を添加して４倍に希釈して、OD₆₀₀を約0.5にする。第２と第３のラウンドのスクリーンは、プラークをパスツールピペットの小末端でコアして0.5mlのSMプラス１滴のCHCl₃中に入れて、インキュベーション後1〜5μlのファージを希釈せずにプレーティングに用いることを除いて、前に述べたのと同一である。精製の第３ラウンドが終わってから、個々のプラークを拾い上げて、配列決定のための鋳型を作成する。
鋳型の製造および配列の決定
XL1を個々のプラークとともに一夜培養したものの1:100希釈物を含有する2XYTの培養物1mlを接種することによって、配列決定用の鋳型を作製する。滅菌トゥースピックを用いてプラークを拾い集める。その培養物を、37℃で5〜6時間振盪しながらインキュベートし、次に1.5mlのミクロフュージ管に移す。200μlのPEG溶液を添加し、次いで攪拌し、氷上に１０分間置く。ミクロフュージ管中で12,000x gにて５分間遠心分離することによってファージの沈澱を回収する。上澄み液を廃棄し、イエローピペットチップでゆっくりピペッティングを行うことによって、ペレットを230μlのTE（10mMトリス-HCl、pH7.5、1mM EDTA）中に再懸濁させる。フェノール（200μl）を添加し、続いて軽く攪拌し、ミクロフュージして相を分離する。水相を別の管に移し、フェノール抽出について先に述べたのと同様にして、200μlのフェノール／クロロホルム（1:1）で抽出する。0.1容積の3M NaOAcを添加し、次に2.5容積のエタノールを添加して、-20℃で20分間沈澱させる。沈澱させた鋳型を、マイクロフュージ管中で、12,000x gにて８分間遠心分離することによって回収する。得られたペレットを70％エタノールで洗浄し、乾燥し、25μlのTEに再懸濁させる。配列決定は、メーカー（U.S．Biochemical社、オハイオ州、クリーブランド）が提供するプロトコルに従って、Sequenase^TM配列決定キットを用いて行った。
実施例II
２つの予め決められた位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドから生成させたペプチドリガンドの単離および特性決定
この実施例は、ランダム化コドンを有するオリゴヌクレオチドの集団由来の表面発現ライブラリーの生成について示す。そのオリゴヌクレオチドは10のコドンの長さを有し、M13遺伝子VIIIベースの表面発現ライブラリーを生成させるために、単一のベクター種にクローン化する。この実施例はまた、リガンド結合タンパク質のペプチドの選択およびそのコードされた核酸配列の特性決定についても述べる。
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを実施例Iに記載されたようにして合成した。合成器を、表IXに示す配列を合成するようにプログラムした。これらの配列は、ベクターのリーダー配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの合成された第１ランダムコドン位置および3'フランキング配列に相当する。相補性配列は、オリゴヌクレオチドの合成された集団の挿入突然変異誘発に用いられる。

次の８つのランダムコドン位置は、実施例Iの表Vに記載されたのと同様にして合成した。９番目の位置の合成をした後、反応生成物をもう１度結合して混合し、新しい１０のカラムに再分配した。最後のランダムコドン位置および5'フランキング配列の合成を表Xに示す。

反応生成物を再度混合し、オリゴヌクレオチドをメーカーが推奨するとおりに切断および精製した。オリゴヌクレオチドの精製された集団は、以下に述べるようにして表面発現ライブラリーを生成させるのに使用した。
ベクターの構築
単一のオリゴヌクレオチド集団から（すなわち右半分および左半分のオリゴヌクレオチドを結合させることなしに）表面発現ライブラリーを生成させるのに使用されるベクターについて以下に説明する。このベクターは、遺伝子VIII-ペプチド融合タンパク質の合成を誘導するM13ベースの発現ベクター（図４）である。このベクターは、実施例Iの右半分および左半分のベクターを結合したものが示すすべての機能を示す。
ランダムオリゴヌクレオチドの集団のクローン化および表面発現を行うためのM13-ベースのベクターを構築した（図４，M13IX30）。M13mp19（Pharmacia社）が出発ベクターであった。このベクターは、修飾した結果、コードされた野生型M13遺伝子VIIIに加えて：(1)プソイド野生型遺伝子、すなわちアンバー終止コドンを有する遺伝子VIII配列（該終止コドンは、遺伝子VIII配列とオリゴヌクレオチドをクローン化するための制限部位との間に位置している）；(2)オリゴヌクレオチドをクローン化するための、プソイド野生型gVIIIのフレーム中のStu I、Spe IおよびXho I制限部位；(3)プロモーター、シグナル配列および翻訳開始シグナルのような発現に必要な配列；(4)重複制限部位を除くための他の各種の変異部分およびLac Zのアミノ末端部分、を含有している。
M13IX30の構築を４つのステップで実施した。第１ステップでは、プソイド遺伝子VIIIおよび他の各種の突然変異部分を含有している前駆体ベクターM13IX01Fを構築した。第２ステップでは、別個のM13mp18ベクター中に小さなクローン化部位を構築してM134IX03を得た。第３ステップでは、発現配列およびクローン化部位をM13IX03内に構築して中間ベクターM13IX04Bを生成させた。第４ステップでは、中間ベクターから新しく構築した配列をM13IX01Fに組込んでM13IX30を得た。これらの配列を組み込んでそれらをプソイド遺伝子VIIIを連結した。
前駆体ベクターM13IX01Fの構築は、下記の特徴を除いて実施例Iに記載のM13IX42の構築と同様であった。その特徴は、(1)M13mp19が出発ベクターとして使用された；(2)ユニークEco RI部位に対し5'側のFok I部位は組み込まれておらず、かつ3547位置における自然に存在しているFok I部位のオーバーハングは5'-CTTC-3'に変化させなかった；(3)Eco RI部位とSac I部位との間にスペーサ−配列は組み込まなかった；および(4)4492位置のアンバーコドンは組み込まなかった；ことである。
第２ステップにおいて、M13mp18は突然変異によって、Lac Zの5'末端をLac i結合部位まで除かれ、Lac Zリボソーム結合部位および出発コドンを有している。さらに、ポリリンカーを除去しMlu I部位をLac Zのコーディング領域に導入した。単一オリゴヌクレオチドを、これらの変異誘発に用いたが、それは配列5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAGTGACGCGTGTGAAATTGTTATCC-3'（SEQ ID NO:41）を有した。Hind IIIおよびEco RIの制限酵素部位を、オリゴヌクレオチド5'-GGCGAAAGGGAATTCTGCAAGGCGATTAAGCTTGGGTAACGCC-3'（SEQ ID NO:42）を用いて、Miu I部位の下流に導入した。M13mp18をこのように修飾することによってベクターM13IX03を得た。
発現配列およびクローン化部位は、所望の配列の両方のストランドをコードする一連のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによってM13IX03に導入した。そのオリゴヌクレオチドを表XIに示す（SEQ ID NO:43〜50）。

表XIの末端オリゴヌクレオチド084（SEQ ID NO:43）および085（SEQ ID NO:47）を除いて、上記のオリゴヌクレオチドを、実施例Iに記載されているのと同様にして、混合し、リン酸化し、アニールし、そして連結して二本鎖挿入断片を形成した。しかし、中間ベクターに直接クローン化する代わりに、挿入断片は、まず、末端オリゴヌクレオチド084（SEQ ID NO:43）および085（SEQ ID NO:47）をプライマーとして用いて、PCRによって増幅される。末端オリゴヌクレオチド084（SEQ ID NO:43）は、その5'末端に対して内側に10のヌクレオチドの位置にHind III部位を有する。オリゴヌクレオチド085（SEQ ID NO:47)はその5'末端にEco RI部位を有する。増幅してから、生成物を、Hind IIIとEco RIで制限し、実施例Ｉに記載したのと同様にして、同じ２つの酵素で消化したM13mp18のポリリンカーに連結した。生成した二本鎖挿入断片は、リボース結合部位、翻訳開始コドン、このコドンに続くリーダー配列、およびランダムオリゴヌクレオチドをクローン化するための３つの制限酵素部位（Xho I、Stu I、Spe I）を含有している。このベクターはM13IX04と命名した。
上記二本鎖挿入断片のクローン化中に、オリゴヌクレオチド028中のGCCコドンの１つと031中のその補体とが欠失することが見いだされた。この欠失は機能に影響がなかったので、最終の構造は２つのGCCコドンのうち１つが失われている。さらにオリゴヌクレオチド032は、GAGコドンが必要な場所にGTGコドンをもっていた。変異誘発を、オリゴヌクレオチド5'-TAACGGTAAGAGTGCCAGTGC-3'（SEQ ID NO:51）を用いて行い、該コドンを所望の配列に変換した。得られた中間ベクターは、M13IX04Bと命名した。
M13IX30を構築する第４ステップには、M13IX04B由来の発現とクローニングの配列を、M13IX01F中、プソイド野生型gVIIIの上流に挿入するステップが含まれている。これは、M13IX04BをDra IIIとBan HIで消化し、目標の配列を含有する700塩基対の挿入断片をゲル単離することによって行った。M13IX01Fを同様にDra IIIとBam HIで消化した。挿入断片を３：１のモル比で二重消化ベクターと混合し、実施例Ｉに記載したベクターの修飾はすべて配列分析によって確認されていることに留意すべきである。最終構造体M13IX30の配列を図７に示す（SEQ ID NO:3）。図４もM13IX30を示すが、ランダム化オリゴヌクレオチドの表面発現に必要な各要素にはマークをつけてある。
コードされたオリゴヌクレオチドのライブラリーの構築、スクリーニングと特性の決定
M13IX30表面発現ライブラリーの構築は、上記のオリゴヌクレオチドを、連結法によらずに変異誘発法でM13IX30に挿入することを除いて、サブライブラリー構築について実施例Ｉに記載したのと同じにして行う。このライブラリーは、MK30-3(BMB)上に構築して増殖させ、次にXLI細胞の感染およびスクリーニングに用いるファージのストックを製造する。表面発現ライブラリーをスクリーニングし、次いで実施例Ｉに記載したのと同様にして、コードしているオリゴヌクレオチドの特性を決定する。
実施例III
右半分と左半分の縮重オリゴヌクレオチドから生成させたペプチドリガンドの単離と特性決定
この実施例は、縮重オリゴヌクレオチドの表面発現ライブラリーの構築と発現を示す。この実施例のコードされたペプチドは、２つの別個のオリゴヌクレオチド集団を混合し、結合させることによって生成する。またペプチドリガンドの単離と特性決定および特定の結合タンパク質に対するそれらの対応するヌクレオチド配列も説明する。
オリゴヌクレオチド集団の合成
左半分の縮重オリゴヌクレオチドと右半分の縮重オリゴヌクレオチドの集団を、実施例Ｉに記載した標準の自動化した方法を用いて合成した。
オリゴヌクレオチドの各集団の縮重コドン配列は、トリプレットNNG/T（Nは４つのヌクレオチドすべての等量混合物）を逐次合成することによって生成させた。オリゴヌクレオチドの各集団に対するアンチセンス配列を合成したが、各集団は、ベクター配列の相補的な5'および3'のフランキング配列を有していた。相補的末端は、オリゴヌクレオチドの各集団を、標準の変異誘発法で、それぞれのベクターに組み込むのに使った。このような方法は、先に実施例Ｉと詳細な説明の項に記載されている。一本鎖形のベクターはセンス鎖としてしか得られないので、各集団のアンチセンス配列を合成する必要があった。
次の配列：5'-AGCTCCCGGATGCCTCAGAAGATG(A/CNN)₉GGCTTTTGCCACAGGGG-3'（SEQ ID NO:52）を有する左半分オリゴヌクレオチド集団を合成した。次の配列：5'-CAGCCTCGGATCCGCC(A/CNN)₁₀ATG(A/C)GAAT-3'（SEQ ID NO:53）を有する右半分オリゴヌクレオチド集団を合成した。これらの２つのオリゴヌクレオチド集団は、そのそれぞれのベクターに組み込んでともに連結したとき、19の縮重位置を有する20コドンのオリゴヌクレオチドおよび予め決められた内部コドン配列をコードする。
ベクターの構築
先に記載したベクターの修飾形を、右半分と左半分のサブライブラリーを構築するのに使用した。左半分のサブライブラリーの構築は、M13ED03と命名されるM13ベースのベクター中で行った。このベクターは先に述べたM13IX30ベクターの修飾形であり、M13IX30とM13IX22の両者の必須の特徴をすべてもっている。M13ED03は、野生型とプソイド野生型の遺伝子VIIIに加えて、発現に必要な配列、および右半分のオリゴヌクレオチドサブライブラリーと結合するための２つのFOK I部位をもっている。それ故に、このベクターは、単一オリゴヌクレオチド集団からの表面発現ライブラリーの生成と発現を行うのに使用できるか、または１つのサブライブラリーと結合して、右半分と左半分のオリゴヌクレオチドの集団と結合して１つの表面発現ライブラリーとすることができる点で、先に述べた両方のベクターの利点を兼ね備えている。
M13ED03は、２つのステップでM13IX30から構築した。第１ステップでは、M13IX30を修飾して、重複配列を除き、ヒトβ−エンドルフィンの８つのアミノ末端残基をコードする配列を組み込んだ。リーダ配列も変異させて、産生物の分泌を増大させた。
M13IX04（実施例IIに記載されているM13IX30に対する中間ベクター）を構築中、６ヌクレオチドの配列が、オリゴヌクレオチド027（SEQ ID NO:44）およびその補体032（SEQ ID NO:49）中に重複した。この配列、5'-TTACCG-3'は、M13IX30の構築時に変異誘発法で欠失させた。その変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、5'-GGTAAACAGTAACGGTAAGAGTGCCAG-3'（SEQ ID NO:54）であった。リーダー配列中の突然変異は、オリゴヌクレオチド：5'-GGGCTTTTGCCACAGGGGT-3'（SEQ ID NO:55）を用いて起こさせた。この変異誘発によって、M13IX30の6353位のＡ残基がＧ残基に変化した。得られたベクターはM13IX32と命名した。
M13ED01を生成させるために、β−エンドルフィンをコードするヌクレオチド配列（β−エンドルフィン＋３つのエキストラアミノ酸残基の８つのアミノ酸残基）を変異誘発法によってリーダー配列の後に組み込んだ。使用したオリゴヌクレオチドは次の配列：5'-AGGGTCATCGCCTTCAGCTCCGGATCCCTCAGAAGTCATAAACCCCCCATAGGCTTTTGCCAC-3'（SEQ ID NO:56）をもっていた。またこの突然変異誘発によって、Spe Ｉ部位の下流の配列のいくつかが除去された。
M13ED03構築の第２ステップでは、β−エンドルフィンの配列を下流のプソイド遺伝子VIIIの配列のフレーム中に入れるベクターの変化と、右半分のオリゴヌクレオチドのサブライブラリーと結合するためのFOX I部位の組み込みを行った。このベィターは、コードされたβ−エンドルフィン配列に隣接もしくはオーバーラップしている配列に相補的な配列を用いて変異誘発法でオリゴヌクレオチド集団を組み込むよう設計した。それ故に、変異誘発を行った後、β−エンドルフィンの発現がない場合は、変異誘発の頻度を測定するのに利用できる。上記のベクターの変化に加えて、またM13ED03は、右半分と左半分のサブライブラリーを結合中に生物学的選択を行うために、3262位にアンバーコドンを含有するよう修飾した。
突然変異は実施例Ｉに記載した標準の変異誘発法を用いて組み込んだ。上記のフレームシフトの変異とFOK I部位は、オリゴヌクレオチド：5'-TCGCCTTCAGCTCCCGGATGCCTCAGAAGCATGAACCCCCCATAGGC-3'（SEQ ID NO:57）を用いて生成させた。アンバーコドンはオリゴヌクレオチド5'-CAATTTTATCCTAAATCTTACCAAC-3'（SEQ ID NO:58）を用いて生成させた。得られたベクターM13ED03の全配列は図８（SEQ ID No.4）に示す。
右半分のオリゴヌクレオチドサブライブラリーの構築は、M13IX42ベクターの修飾形で行った。この新しいベクターM13IX421は、Eco RI-SacIクローン化部位間のアンバーコドンとプソイド遺伝子VIII配列とが除去されたことを除いてM13IX42と同じである。この変化に依って、Lac Zプロモーターのすべての発現オフがペプチド遺伝子VIII融合タンパク質を確実に生成させる。アンバーコドンの除去は、下記のオリゴヌクレオチド：5'-GCCTTCAGCCTCGGATCCGCC-3'（SEQ ID NO:59）を用いて変異誘発法で実施した。M13IX421の全配列を図９に示す（SEQ ID NO:5）。
コードされたオリゴヌクレオチドのライブラリー構築、スクリーニングおよび特性決定
サブライブラリーを、オリゴヌクレオチドの縮重集団の先に記載したものの各々について構築した。オリゴヌクレオチドの左半分の集団をM13ED03.Lに組み込んでサブライブラリーM13IX421.Rを生成させた。各オリゴヌクレオチド集団を、実施例Ｉに記載した部位特異的変異誘発法を用いてそれぞれのベクターに組み込んだ。簡単に述べれば、縮重コドン配列に隣接するヌクレオチド配列は、組み込み部位においてベクターと相補的であった。ヌクレオチドの集団は、一本鎖のM13ED03ベクターまたはM13IX421ベクターとハイブリダイズし、T4 DNAポリメラーゼによって延長し、二本鎖環状ベクターを生成した。変異体の鋳型は、Kunkelらの前記文献に記載されているのと同様にして生体内ウリジン選択法で得た。各ベクター集団は、実施例Ｉに記載されているようにして、エレクトロポレーションに付して宿主細胞に導入し、増殖させた。
右半分と左半分のサブライブラリーをランダム結合させて単一表面発現ライブラリーにすることは、各ベクター集団をFok Iで消化する前に、まず各ベクターの不必要な部分を切断する酵素で消化することを除いて、実施例Ｉに記載されているとおりに実施した。簡単に述べれば、M13ED03.LをBgl II(7094位を切断)で消化し、およびM13IX421.RをHind III(3919位を切断)で消化した。消化された各集団は、さらにアルカリホスファターゼで処理して、末端が再結合しないよう保証し、次いで過剰のFok Iで消化した。連結、エレクトロポレーション、および生成したライブラリーの増殖を、実施例Ｉに記載したのと同様に行った。
表面発現ライブラリーを、修飾パニング法を用いて、リガンド結合タンパク質についてスクリーニングを行った。簡単に述べれば、１mlのライブラリーすなわち約10¹²のファージ粒子を、1〜5μgのリガンド結合タンパク質に添加した。そのリガンド結合タンパク質は、抗体または受容体グロブリン(Rg)の分子であった(Aruffoら，Cell，61巻，1303-1313頁，1990年)。この文献は本願に参考として援用するものとする。ファージは、アフィニティーリガンドとともに、室温にて、1〜3時間、振盪しながらインキュベートし、次いでヤギ−抗マウスIgGでコートしたラテックスビーズ(Biosite社，カリフォルニア州，サンディエゴ)の200μlを添加した。この混合物を、振盪しながらさらに1〜2時間、室温でインキュベートした。マイクロフュージで2分間遠心分離することによってビーズをペレット化し、0.1％Tween 20を含有していてもよいTBSで洗浄した。3回追加の洗浄を行ったが、最後の洗浄液はTween 20を含有していなかった。捕捉されたファージは、200μlの0.1Mグリセリン-HCl、pH2.2で15分間溶離し、ビーズを遠心分離で分離させた。ファージを含有する上澄み液（溶出液）を取り出し、リガンド結合タンパク質に対して結合性を示すファージを、パニングのサイクルをさらに1〜2回行うことによって濃縮した。第1溶出液の一般的な収量は約1×10⁶〜5×10⁶pfuであった。第２および第３の溶出液の収量はそれぞれ一般に、約5×10⁶〜2×10⁷pfuおよび5×10⁷〜1×10¹⁰pfuであった。
第２もしくは第３の溶出液を、プラーク同定スクリーニングおよび正のクローンの配列決定のため適切な密度でプレートした（すなわち、希有クローンに対しては集密的にプレートし、純清のプラークが必要なときは200〜500プラーク／プレートでプレートする）。簡単に述べれば、プラークを37℃で約6時間増殖させ、2mM IPTGに予め浸漬したニトロセルロースフィルターをかぶせて簡単に乾燥させる。このフィルターは室温で一夜プラークの上に置き、取り外し、ブロッキング溶液中に1〜2時間入れた。ブロッキングを行った後、1μg／mlのリガンド結合タンパク質を含有するブロッキング溶液中で、室温にて1〜2時間インキュベートした。ヤギ抗マウスIgを結合させたアルカリホスファターゼ(Fisher社)1:1000希釈比率で添加し、フィルターを、ガラス製減圧フィルター上で、10mlのTBSもしくはブロック溶液で迅速に洗浄した。検出のためアルカリホスファターゼで展開した後、正のプラークを同定した。
縮重オリゴヌクレオチドライブラリーをいくつかの異なるリガンド結合タンパク質でスクリーニングして、各リガンドに結合したペプチド配列を同定した。例えば、β−エンドルフィンに対する抗体でスクリーニングして、抗体と相互作用することが知られているコアアミノ酸配列を本来もっている約30〜40の異なるクローンが検出された。コア配列に隣接する配列は異なっていたが、このことは、この配列が独立して誘導され、同じクローンの複製物ではないことを示している。57として知られている抗体によるスクリーニングは類似の結果を生じた（すなわち、コアの共通配列は同定されたが、クローン間の隣接配列は異なっていた）。
実施例IV
左半分のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの生成
この実施例は、左半分のランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーの合成と構築を示す。
5'末端と3'末端に異なる配列を合成して、変異誘発法でベクターに容易に挿入できるようにしたことを除いて、実施例Ｉに記載したのと同様にして、9つのコドンの長さのランダムオリゴヌクレオチドの集団を合成した。また、反応生成物のランダム分布を起こさせる混合と分割のステップは、等容積のビーズ懸濁液を分配する他の方法で行った。ビーズを分散したままに保存するのに十分に高密度の液体として選択されたのは、100％アセトニトリルであった。
簡単に述べれば、各カラムは、48μmol/g容量のビーズ(Genta社，カリフォルニア州，サン・ディエゴ)の22mg(1μmole)を0.5mlの100％アセトニトリル中に懸濁させることによって、第1結合反応用に作製した。これらのビーズは実施例Ｉに記載したビーズより小さく、かつグアニンヌクレオチドで誘導体化されている。またこのビーズは大きさは調整されていない。次にビーズ懸濁液を空の反応カラムに移した。懸濁液は、移す間にゆっくりピペットで採取することによって、比較的分散状態が保持されるようにした。カラムに栓をして、モノマー結合反応を表XIIに示すようにした。

最後のモノマーを結合させた後、先に記載したようにカラムの栓を外し、その内容物を1.5mlのマイクロフュージ管に注入した。カラムを100％アセトニトリルですすぎ、残っているビーズを回収した。すすぎに使う容積は、ビーズが分配されている新しい各反応カラムについて、全ビーズ懸濁液の最終容積が約100μlになるように決定した。混合物をゆっくりと攪拌して均一に分散した懸濁液を生成させ、次に混合物を一定量ずつピペット採取して等容積に分割した。次にビーズの各混合物を空の反応カラムに移した。空の管を少容積の100％アセトニトリルで洗浄してそれぞれのカラムに移した。次に実施例Ｉに記載したようにして、この場合、混合と分割のステップは100％アセトニトリルへの懸濁液を用いて、ランダムコドン位置2〜9の合成を行った。コドン位置2〜9の結合反応を表XIIIに示す。

第9のコドン位置に対して最後のモノマーを結合させた後、反応生成物を混合し、一部分を空の反応カラムに移した。カラムに栓をして次のモノマーのカップリング反応を行った。

得られたランダムオリゴヌクレオチドの集団を精製して変異誘発法によって左半分のベクターM13ED04に組み込んだ。
M13ED04は実施例IIIに記載したM13ED03ベクターを修飾したものである。従ってそのベクターの全ての特徴を有している。M13ED03とM13ED04との差は、M13ED04が、抗-β-エンドルフィン抗体が認識する5つのアミノ酸の配列(Tyr Gly Gly Phe Met)を含有していないということである。上記の配列は、オリゴヌクレオチド5'-CGGATGCCTCAGAAGGGCTTTTGCCACAGG(SEQ ID NO:61)を用いて変異誘発法で欠失させた。このベクターの全ヌクレオチド配列を図10に示す（SEQ ID NO:6）。
本発明は、本発明の好ましい実施態様を引用して記載したが、種々の改変は本発明の思想から逸脱することなく行うことができると解すべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：フセ，ウィリアムディー．
(ii)発明の名称：ランダム化ペプチドの表面発現ライブラリー
(iii)配列数：61
（iv)関連住所：
(A)住所人：プリティー，シュローダー，ブリューゲマンアンドクラーク
(B)番地：スイート2000，サウスフラワーストリート 444
(C)市：ロサンゼルス
(D)州：カリフォルニア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：90071
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントインリリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：キャンベル，キャサリンエイ．
(B)登録番号：31,815
(C)照会／記録番号：P31 9072
(ix)電話回線情報：
(A)電話：（619）535-9001
(B)テレファックス：（619）535-8949
(2)SEQ ID NO:1の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7294塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：両形態
(D)トポロジー：環状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:1:

(2)SEQ ID NO:2の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7320塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：両形態
(D)トポロジー：環状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:2：

(2)SEQ ID NO:3の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7445塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：両形態
(D)トポロジー：環状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:3：

(2)SEQ ID NO:4の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7409塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：両形態
(D)トポロジー：環状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:4：

(2)SEQ ID NO:5の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7294塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：両形態
(D)トポロジー：環状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:5：

(2)SEQ ID NO:6の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：7394塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：両形態
(D)トポロジー：環状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:6：

(2)SEQ ID NO:7の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：37塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:7：

(2)SEQ ID NO:8の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:8：

(2)SEQ ID NO:9の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:9：

(2)SEQ ID NO:10の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:10：

(2)SEQ ID NO:11の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：18塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:11：

(2)SEQ ID NO:12の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:12：

(2)SEQ ID NO:13の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：36塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:13：

(2)SEQ ID NO:14の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:14：

(2)SEQ ID NO:15の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：34塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:15：

(2)SEQ ID NO:16の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：16塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:16：

(2)SEQ ID NO:17の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：27塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:17：

(2)SEQ ID NO:18の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：21塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:18：

(2)SEQ ID NO:19の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：18塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:19：

(2)SEQ ID NO:20の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：26塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:20：

(2)SEQ ID NO:21の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：23塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:21：

(2)SEQ ID NO:22の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:22：

(2)SEQ ID NO:23の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：48塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:23：

(2)SEQ ID NO:24の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：24塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:24：

(2)SEQ ID NO:25の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：36塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:25：

(2)SEQ ID NO:26の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：22塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:26：

(2)SEQ ID NO:27の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:27：

(2)SEQ ID NO:28の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:28：

(2)SEQ ID NO:29の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:29：

(2)SEQ ID NO:30の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：13塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:30：

(2)SEQ ID NO:31の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：35塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:31：

(2)SEQ ID NO:32の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:32：

(2)SEQ ID NO:33の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:33：

(2)SEQ ID NO:34の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：37塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:34：

(2)SEQ ID NO:35の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:35：

(2)SEQ ID NO:36の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：36塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:36：

(2)SEQ ID NO:37の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：25塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:37：

(2)SEQ ID NO:38の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：21塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:38：

(2)SEQ ID NO:39の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：21塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:39：

(2)SEQ ID NO:40の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：18塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:40：

(2)SEQ ID NO:41の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：43塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:41：

(2)SEQ ID NO:42の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：43塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:42：

(2)SEQ ID NO:43の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：36塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:43：

(2)SEQ ID NO:44の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：42塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:44：

(2)SEQ ID NO:45の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：42塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:45：

(2)SEQ ID NO:46の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：44塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:46：

(2)SEQ ID NO:47の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：38塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:47：

(2)SEQ ID NO:48の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：42塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:48：

(2)SEQ ID NO:49の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：42塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:49：

(2)SEQ ID NO:50の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：42塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:50：

(2)SEQ ID NO:51の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：21塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:51：

(2)SEQ ID NO:52の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：68塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)NAME/KEY：misc_difference
(B)存在位置：置換（25,""）
(D)他の情報：／注＝"Mは、この存在位置および存在位置28,31,34,37,40,43,46および49でのAおよびCの等量混合を表す"
(xi)配列記載：SEQ ID NO:52：

(2)SEQ ID NO:53の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：54塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)NAME/KEY：misc_difference
(B)存在位置：置換（17,""）
(D)他の情報：／注＝"Mは、この存在位置および存在位置20,23,26,29,32,35,38,41,44および50でのAおよびCの等量混合を表す"
(xi)配列記載：SEQ ID NO:53：

(2)SEQ ID NO:54の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：27塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:54：

(2)SEQ ID NO:55の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：19塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:55：

(2)SEQ ID NO:56の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：63塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:56：

(2)SEQ ID NO:57の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：47塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:57：

(2)SEQ ID NO:58の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：25塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:58：

(2)SEQ ID NO:59の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：21塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:59：

(2)SEQ ID NO:60の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：21塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:60：

(2)SEQ ID NO:61の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列記載：SEQ ID NO:61：

Claims

発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１および第２オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された所望の偏りのランダムコドン配列を有し、ここで、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、遺伝子VIIIと該ランダムコドン配列との融合物をコードする、組成物。
前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、請求項１に記載の組成物。
前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が予め決められた配列に対して偏っている、請求項１に記載の組成物。
ランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、請求項１に記載の組成物。
前記細胞がE．coliである、請求項１に記載の組成物。
発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが所望の偏りのランダムコドン配列を有し、かつ該ランダムコドン配列との遺伝子VIII融合物をコードする、組成物。
前記細胞がE．coliである、請求項６に記載の組成物。
前記発現可能なオリゴヌクレオチドが繊維状バクテリオファージの表面にペプチド融合タンパク質として発現される、請求項６に記載の組成物。
前記繊維状バクテリオファージがM13である、請求項６に記載の組成物。
所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの前記多様な集団が、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１および第２オリゴヌクレオチドの多様な集団の結合から生成される、請求項６に記載の組成物。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、請求項６に記載の組成物。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、請求項６に記載の組成物。
所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、請求項６に記載の組成物。
所望の偏りのランダムコドン配列を有し、かつ該ランダムコドン配列との遺伝子VIII融合物をコードする、発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、複数のベクター。
前記オリゴヌクレオチドが繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現可能である、請求項１４に記載のベクター。
前記繊維状バクテリオファージがM13である、請求項１５に記載のベクター。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、請求項１４に記載のベクター。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、請求項１４に記載のベクター。
所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、請求項１４に記載のベクター。
所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドを含有するベクターの多様な集団を構築する方法であって、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素および遺伝子VIII融合物をコードする配列に作動可能に結合させる工程を包含する、方法。
前記オリゴヌクレオチドが繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現可能である、請求項２０に記載の方法。
前記繊維状バクテリオファージがM13である、請求項２１に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、請求項２０に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、請求項２０に記載の方法。
所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、請求項２０に記載の方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記作動可能に結合させる工程が、
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
(b)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
(c)該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程；
をさらに包含する、方法。
前記(a)から(c)の工程が２回以上繰り返される、請求項２６に記載の方法。
ランダムペプチドの集団由来の結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって：
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素および遺伝子VIII融合物をコードする配列に作動可能に結合させる工程；
(b)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；および
(c)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
を包含する、方法。
前記ランダムペプチドの集団が繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現される、請求項２８に記載の方法。
前記繊維状バクテリオファージがM13である、請求項２９に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、請求項２８に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、請求項２８に記載の方法。
所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、請求項２８に記載の方法。
請求項２８に記載の方法であって、前記工程(a)が、
(a1)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
(a2)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
(a3)該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が、結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程；
をさらに包含する、方法。
前記（a1)から(a3)の工程が２回以上繰り返される、請求項３４に記載の方法。
ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって：
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素および遺伝子VIII融合物をコードする配列に作動可能に結合させる工程；
(b)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；
(c)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
(d)該ペプチドをコードする核酸を単離する工程；および
(e)該核酸の配列を決定する工程；
を包含する、方法。
前記ランダムペプチドの集団が繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現される、請求項３６に記載の方法。
前記繊維状バクテリオファージがM13である、請求項３７に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、請求項３６に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、請求項３６に記載の方法。
前記所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、請求項３６に記載の方法。
請求項３６に記載の方法であって、前記工程(a)が、
(a1)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
(a2)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
(a3)該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程；
をさらに包含する、方法。
前記(a1)から(a3)の工程が２回以上繰り返される、請求項４２に記載の方法。