JP3665078B2

JP3665078B2 - サンプル中の低レベル分析物の検出

Info

Publication number: JP3665078B2
Application number: JP54199998A
Authority: JP
Inventors: セサレ，ヨセフ，エルディ; ローゼン，スティブン，エム
Original assignee: ザパーキン−エルマーコーポレイション; ロッシュダイアグノスティックシステムズ，インコーポレイテッド．
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2005-06-29
Anticipated expiration: 2018-04-02
Also published as: CA2285219A1; AU732304B2; DE69815325T2; DE69815325D1; EP0972195B1; AU6879398A; WO1998044347A1; US5942442A; JP2000513817A; CA2285219C; EP0972195A1

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明は、凝集反応毛細管スライド試験装置を使用するサンプル中に多分存在する分析物の、低レベル、１０ｐｐｂおよびより詳しくは１ｐｐｂまたはそれ以下の検出用装置および方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
改良された試験装置は凝集反応用物質の検出に設けられた。かかる改良された試験装置の例として、ヒュー・ヴィ・コッティンガムのアメリカ合衆国特許第４，５９６，６９５号；同第４，５９７，９４４号および同第４，７７５，５１５号およびピーター・シュルツのアメリカ合衆国特許第５，０１９，３５１号に開示された凝集スライド装置が記載され得る。
【０００３】
凝集試験は分析物とこの分析物類似物またはそのコンジュゲートで被覆されたラテックス粒子との間の抗体に結合するために競合であるラテックス凝集禁止原理に基礎を置いている。サンプルは分析物類似物またはそのコンジュゲートおよび抗体で被覆されたラテックス粒子に沿って上述したアメリカ合衆国特許第５，０１９，３５１号に開示された型のスライド装置の混合容器中に置かれる。混合物は可視区域に対して毛細管作用によりスライド装置の毛細管通路を横切っている。サンプル中に分析物がないならば、分析物類似物またはそのコンジュゲートとともにラテックス粒子は抗体に結合することにより大きな粒子の集塊（凝集体）を形成する。しかしながら、分析物がサンプル中に存在するとき、抗体との反応のためにラベルが付された（標識化された）ラテックス粒子と競合しかつ分析物は好ましくは抗体に結合しかつラベルが付されたラテックス粒子との抗体の反応を禁止または阻止しかつそれによりラテックス粒子の凝集を禁止または阻止する。したがって、ラテックス粒子の凝集の存在はサンプルから分析物の不存在の証拠であり、一方、ラテックス粒子の顕著な凝集の不存在は、ラテックス粒子の存在または不存在がスライド装置の可視区域において目視で観察されるとき、サンプル中の分析物の存在の証拠である。
【０００４】
上述した技術および上記特許に開示された凝集スライド装置を使用して、試験キットがホルモン、腫瘍発生標識等のごとき種々の生物学的物質の容易で迅速な測定、かつまた尿、血液または他の体液のごとき生物学的サンプルからのアンフェタミン、バルビツール酸塩、コカイン、マリファナ、モルヒネ、フェンシクリジン等のごとき悪用の薬物のために市場に出されている。かかる試験装置および分析方法はかかる生物学的物質および悪用の薬物に関しての生物学的流体の容易かつ迅速な領域分析を許容した。かかる迅速な分析はその分野に容易に導入されることができかつ結果の分析のための機器を必要としない。目視定量結果は、スライド装置の混合容器内でサンプル、ラベルが付されたラテックス粒子および抗体を混合する時間から、一般に約３〜５分以内またはそれ以下で、スライド目視区域において観察可能である。
【０００５】
かかる凝集反応スライド装置の使用は非常に有益であり、現場での領域分析を、すなわち、他の機器を必要とすることなしに簡単で容易な方法によって非実験室設定において許容する。悪用の薬物用のかかる分析試験装置の例は、ニュージャージー州ソマービルのロシュ・ダイアグノスティック・システムズ社により販売されたオントラック試験装置である。かくして、この技術は、幾つかの型の機器を必要とする、薄層クロマトグラフィまたは液体クロマトグラフィ、酵素免疫アッセイ、蛍光偏光免疫アッセイまたは放射線免疫アッセイのごとき、使用が以前に要求されたスクリーニング分析方法を少なくとも部分的に置き換えた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、凝集反応スライド分析技術はとくに極端な欠点、すなわち、分析されているサンプル中の分析物の濃度が、一般に約１６０μｌの合計反応量中に約１１μｌのみのサンプル量をスライド装置の混合容器中に置くことができるので所望の目視結果を設けるように凝集禁止を発生するために少なくとも約５０ｐｐｂまたはそれ以上の比較的高い濃度にしなければならないということを有することが認められた。この欠点はかかる凝集スライド反応分析技術が、殺虫剤残留物または環境毒素が存在するかまたは約１ｐｐｂまたはそれ以下のごとき、非常に低い濃度でのみ存在するかも知れない場合に、水、流出水、土壌、スラッジ、有機質肥料廃棄物または沈殿物等のごとき、環境サンプル中の殺虫剤または環境毒素のごとき分析物を検出するのに使用できることを阻止した。
【０００７】
同様に、生物学的サンプル中の、ＬＳＤ、すなわち、リゼグル酸ジエチルアミドの一般に低いレベル、例えば、尿中で約１．５ｐｐｂ以下のため、この一般的な悪用の薬物を検出するためのオントラック試験装置を利用することが不可能であった。
【０００８】
また、薄膜に直接取着された機能的グループおよび抗体を備えた親和性薄膜が関心のある分析物を含有してる疑わしいサンプルと親密に接触させた親和性クロマトグラフィ技術の使用によって分析物を検出することが提案された。しかしながら、低い表面結合区域および抗体の機能性の損失を含んでいる、多数の理由のために不十分な結合能力が存在し、かつそれゆえ、一般に、約２０％〜約４０％のみの分析物が検出および分析に関して回収され得る。したがって、かかる親和性クロマトグラフィ技術は、また、環境サンプル中の殺虫剤および環境毒素の１０ｐｐｂまたは１ｐｐｂのレベルの検出に十分な領域分析方法を提供しなかった。
【０００９】
それゆえ、凝集スライド反応分析装置が環境サンプル中の殺虫剤または他の有機毒素のごとき低レベルの分析物および生物学的サンプル中の低レベルＬＳＤまたは他の悪用の薬物を含有している迅速、容易な、領域内分析に利用できることが非常に望ましい。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、サンプル中の、とくに環境または生物学的サンプル中の低レベルの分析物の検出用の改良された凝集反応スライド分析装置および方法を提供する。
【００１１】
本発明によれば、上述した特許に開示された型の凝集反応スライド装置は、今や、１ｐｐｂまたはそれ以下でも同様に、１０ｐｐｂ以下のレベルでサンプル中に存在する分析物を検出するのに使用され得る。これは、その開示が参考のために本書に組み込まれる、上述したアメリカ合衆国特許第５，０１９，３５１号に開示された型の凝集反応スライド装置において凝集禁止分析方法に沿って新規なサンプル濃縮化装置を利用している新規なサンプル濃縮化方法によって達成される。
【００１２】
本発明によれば、１０ｐｐｂまたはそれ以下の量において、とくに１ｐｐｂまたはそれ以下の量において、サンプル中の、とくに環境または生物学的サンプル中の分析物の存在を検出するための方法において、この方法が：
（１）サンプルの測定可能な量を用意し；
（２）液密ハウジング内に透過性薄膜を設け、前記ハウジングがこの薄膜の第１表面への入口ポートおよびこの薄膜の第２の、反対表面からの出口ポートを有し、前記透過性薄膜が約０．４μｍ〜０．７μｍの細孔または裂け目を有しかつ前記透過性薄膜の前記第１表面に、分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆された約０．８〜１．０μｍの粒径のラテックス粒子を有し；
（３）前記サンプルの測定可能な量を、他と異なる圧力下で、前記透過性薄膜を通ってかつ出口ポートの外への流出のために入口ポートに導入し、サンプル中の分析物を粒子上に被覆された抗体または親和性反応剤に結合させ；
（４）その後、サンプルの前記測定可能な量よりも少ない量の溶出溶媒を使用し、前記溶出溶媒がメタノール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびＮａＣｌの溶液からなっており、分析物を少なくとも約５０ｐｐｂの分析物の棒度を有する濃縮された分析物溶液として被覆された粒子から溶出させて出口ポートから容器に送り出し；
（５）凝集反応スライド分析装置の受容容器内に、混合物を形成するために、（ａ）前記濃縮された分析物溶液、（ｂ）分析物類似物またはそのコンジュゲートで被覆された粒子、および（ｃ）分析物に対する抗体を導入しかつ混合し、この混合物を受容容器からスライド分析装置の毛細管軌道領域に導入しそして前記混合物を前記スライド分析装置の目視領域に対して毛細管軌道領域を横切らせ；そして
（６）前記スライド分析装置の前記目視領域における顕著な凝集された粒子の、それぞれ、存在または不存在を観察することにより前記測定可能な量のサンプル中の分析物の不存在または存在を目視測定することからなっている。
本発明のより特別な態様において、１ｐｐｂまたはそれ以下の量において、環境サンプル中に存在する分析物の存在を検出するための方法において、この方法が：
（１）環境サンプルの測定可能な量を用意し；
（２）液密ハウジング内に透過性薄膜を設け、前記ハウジングがこの薄膜の第１表面への入口ポートおよびこの薄膜の第２の、反対表面からの出口ポートを有し、前記透過性薄膜が約０．４μｍ〜０．７μｍの細孔または裂け目を有しかつ前記透過性薄膜の前記第１表面に、分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆された約０．８〜１．０μｍの粒径のラテックス粒子を有し；
（３）前記環境サンプルの測定可能な量を、他と異なる圧力下で、前記透過性薄膜を通ってかつ出口ポートの外への流出のために入口ポートに導入し、サンプル中の分析物を粒子上に被覆された抗体または親和性反応剤に結合させ；
（４）その後、環境サンプルの前記測定可能な量よりも少ない量の溶出溶媒を使用し、前記溶出溶媒がメタノール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびＮａＣｌの溶液からなっており、分析物を少なくとも約５０ｐｐｂの分析物の棒度を有する濃縮された分析物溶液として被覆された粒子から溶出させて出口ポートから容器に送り出し；
（５）凝集反応スライド分析装置の受容容器内に、混合物を形成するために、（ａ）前記濃縮された分析物溶液、（ｂ）分析物類似物またはそのコンジュゲートで被覆された粒子、および（ｃ）分析物に対する抗体を導入しかつ混合し、この混合物を受容容器からスライド分析装置の毛細管軌道領域に導入しそして前記混合物を前記スライド分析装置の目視領域に対して毛細管軌道領域を横切らせ；そして
（６）前記スライド分析装置の前記目視領域における顕著な凝集された粒子の、それぞれ、存在または不存在を観察することにより前記測定可能な量のサンプル中の分析物の不存在または存在を目視測定することからなっている。
【００１３】
【発明を実施するための最良の形態】
この発明は、約１ｐｐｂまたはそれ以下の非常に低い濃度で環境サンプル中に存在する殺虫剤、多芳香族有機化合物、有機毒素およびバクテリアのごとき微生物のごとき、分析物、とくに有機分析物の検出用の容易かつ信頼し得る領域凝集反応分析を提供する。この発明は、環境サンプルが分析されている低レベルの分析物を含有する場合に測定するために約１０分以下で導かれるような領域分析を可能にしている。
【００１４】
この発明の分析方法は環境サンプル中の低レベルの分析物のかかる検出にとくに有用であるけれども、また、その種々の態様において、本発明の方法および装置は、また、上首尾の凝集反応分析に必要とみなされる５０ｐｐｂレベルよりかなり低いレベルでの生物学的サンプル中の分析物の存在のためスライド凝集反応方法によってこれまで適宜に分析し得なかった、例えば、ＬＳＤのごとき生物学的サンプル中の悪用の薬物用のスライド凝集反応分析にとくに有用である。この発明の方法は凝集反応スライド分析方法によって生物学的サンプル中のＬＳＤまたは他の低レベルの悪用の薬物の分析を可能にする。
【００１５】
この発明の分析方法は、分析物が約１ｐｐｂまたはそれ以下の量において存在するかも知れない、例えば、水、流出水、土壌、スラッジ、廃棄物または沈殿物等のごとき、いずれの型の領域環境サンプルの分析においても使用するのにとくに適する。分析方法は環境サンプル中のどのような適宜な分析物を分析するのにも使用され得る。特別な関心は殺虫剤、多芳香族の発癌性物質、有機毒素およびバクテリアのごとき微生物である。例えば、この発明の改良された分析方法はアトラジン、アルドリン、α−ＢＨＣ，β−ＢＨＣ，γ−ＢＨＣ，δ−ＢＨＣ，４，４’−ＤＤＤ，４，４’−ＤＤＥ，４，４’−ＤＤＴ，ディルドリン、エンドスルファンＩ、エンドスルファンＩＩ、エンドスルファンサルフェイト、エンドリン、エンドリンアルデヒド、エンドリンケトン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、メトキシクロル等のごとき殺虫剤、ポリ塩化ビフェニル、ポリ塩化ポリフェニルおよびＰＣＰのごとき多芳香族発癌性物質およびイー・コーライ微生物、サルモネラ菌微生物等のごとき微生物を分析するのに使用され得る。
【００１６】
加えて、この発明の分析方法は、また、スライド凝集反応分析において現在必要とされている実質上５０ｐｐｂ以下のレベルにおいて生物学的サンプル中に存在するかも知れない、ＬＳＤのごとき分析物に関して、尿、血液、血漿、または他の体液のごとき生物学的サンプルを分析することにおいて使用するのに適している。
【００１７】
凝集反応分析は上述したアメリカ合衆国特許第５，０１９，３５１号に開示されかつ第１図に示される装置のごとき、当該技術において知られている適宜な凝集反応スライド装置上で導かれ得る。分析試験要素は総括的な参照符号１０によって示されている。試験要素は、分析物に関して分析されるべきサンプルおよび分析物に対する抗体および分析物類似物またはそのコンジュゲートで被覆された粒子を含んでいる適切な反応剤が混合される受容および混合容器１７からなっている。混合物は次いで上流の毛細管入口１５を通って曲がりくねった形状の毛細管軌道１４に流入させられる。混合物は上流の毛細管領域１９、中間の毛細管領域２１および下流の毛細管領域２０を通って軌道１４に沿って進み、下流の毛細管軌道出口１６によって毛細管軌道を出て、監視容器１８の形の監視または観察領域に入る。監視領域１８はこの監視領域を通気するための孔２２を備えている。壁２３が、受容区域１７、監視区域１８および毛細管軌道領域１４のまわりに、これらの領域のまわりに流体密閉結合を設けるために延びている。
【００１８】
疑われた分析物の約１０ｐｐｂ以下、とくに約１ｐｐｂ以下を含有している環境または生物学的サンプルが第１図の反応スライド装置において分析され得る前に、サンプルは強化または濃縮されねばならない。第２図、第３図および第４図に示されるのは、参照符号２６で総括的に示される、かかるサンプル濃縮装置用要素である。要素２６は濃縮要素内に収納されかつ保持ハウジング３４によって入口キャップ３０と出口キャップ３２との間に保持される適宜な多孔性または透過可能な薄膜２８からなっている。入口キャップ３０は略中心に置かれた入口ポート３６を備えかつ出口キャップ３２は略中央に置かれた出口ポート３８を備えている。保持ハウジング３４は入口キャップ３０、透過可能な薄膜２８および出口キャップ３２のまわりに流体密閉ハウジングを設けている。透過可能な薄膜２８は第４図により詳細に示される。
【００１９】
薄膜２８は、それ自体、分析されるべき分析物に対して不活性である透過可能な固体相材料から作られた円板４０である。薄膜円板４０はそれを貫通する細孔または裂け目を備えた頂部面４２および底部面４４を有している。分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆された粒子４６が、薄膜円板４０の頂部面４２に配置される。
【００２０】
薄膜円板４０の細孔または裂け目は大きさまたは直径が被覆された粒子４６の直径より小さい。例えば、粒子は約０．８から１．０μｍの直径を有し、そして細孔または裂け目は一般に約０．４から約０．７μｍ、好ましくは０．４から０．５μｍの範囲にある。薄膜円板は、例えば、ペーパー、ガラス繊維、綿、セルロース、セルロースアセテートおよびポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフッ化物等の合成重合材料のごとき、反応剤に対して不活性の適宜な物質から構成され得る。好適な薄膜円板は直径が約２５ｍｍでありかつ少なくとも１μｇの分析物の容量を有し、最も好ましくは前記大きさのガラス繊維薄膜円板である。粒子は、例えば、シリカまたはガラス、セルロースおよび合成重合体のごとき、広範な適宜な材料から作られ得る。粒子の好適な形状はポリスチレンビーズのラテックスである。
【００２１】
粒子は、共有結合または非共有結合で、一般に知られた方法において分析物に対する抗体または親和性反応剤にまず結合される。粒子に被覆されるべき特定の材料の選択は分析されるべき分析物によって決定される。分析物に対する抗体または親和性反応剤のごとき分析物に対する選択的な親和性を有する適宜な材料を選択する。次いで、手動操作の注射器（第５図）のごとき、吸い込み／吐き出し装置が被覆された粒子を薄膜円板４０の頂部面に配置するのに使用される。
【００２２】
注射器５０は一端にハウジングへの物質の吸い込みおよびハウジングからの物質の吐き出し用の中央に置かれた導管５４を有する管状ハウジング５２からなっている。反対端で管状ハウジングは肩部５６で終端している。ハウジング５２内に置かれるのは、Ｏ−リングのごとき、密封手段６０によって管状ハウジング５２の内部に流体密閉関係に保持される可動管状ピストン５８である。ハウジング５２の外部でピストン５８は物質の手動吸い込みおよび吐き出し用の適宜なハンドル６２を備えている。
【００２３】
適宜な流体媒体中の抗体または親和性反応剤で被覆された粒子４６は導管５４を通して注射器５０のハウジング５２に吸い込まれ、その場合に導管は濃縮装置２６の入口ポート３６（第６図）に置かれ、そして被覆された粒子は注射器から濃縮装置に押出されて円板４０の頂部面４２に捕獲され、流体媒体は円板４０を介してかつ出口ポート３８から出て適宜な回収容器７０に通過する。注射器は次いで入口ポート３６から取り外される。
【００２４】
頂部面上に置かれた被覆された粒子を有する薄膜円板４０は、薄膜に直接結合される抗体または親和性反応剤により通常得られる約１０〜４０％の回収分析物に比して、少なくとも約８８％またはそれ以上、一般に約９５〜１００％の分析物の回収を導いている濃縮装置を通して処理されているサンプル中の実質上すべての分析物を結合することが可能である。
【００２５】
その後、分析物の約１０ｐｐｂ以下、好ましくは約１ｐｐｂ以下を含有しているサンプルが注射器５０に吸い込まれ、注射器は同様に入口ポート３６に取着されそしてサンプルは濃縮装置２６内に放出される。サンプル中の分析物は円板４０の頂部面上にある抗体または親和性反応剤で被覆された粒子に結合する一方サンプル中の流体は円板を透過しかつ適宜な回収容器または容器７０に出口ポート３８を通って流れ出る。
【００２６】
薄膜円板４０上で被覆粒子に結合された分析物は次いで被覆された粒子から分析物を結合解除するために濃縮装置２６の入口細孔３６に導入された同様な注射器５０または圧縮可能な容器から少量の溶出溶媒で溶出されそして自由にされた分析物を出口ポート３８から適宜な回収容器または容器７０内に溶出する。選択溶媒は、スライド装置内に発生している凝集反応と適合しかつそれと干渉しない溶媒にすべきであり、スライド装置内の反応混合物の運動を許容しかつ凝集反応スライド中の分析物に結合する抗体の劣化作用を持たないように、水と同様な、十分な粘性を有している。かかる適宜な溶出溶媒の例として、例えば、メタノールまたはメタノール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよび塩化ナトリウムの溶液、とくに約６０％のメタノール(ｖ／ｖ)、約４０％のエチレングリコール(ｖ／ｖ)、約４％のポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）が記載され得る。
【００２７】
溶出溶媒の使用量は濃縮装置に導入されたサンプルの容量に比して少ない。例えば、１ｐｐｂの濃度において分析物を含有している５０ｍｌサンプルの使用および１ｍｌの溶出溶媒の使用は、溶出された１ｍｌサンプルが約５０ｐｐｂの濃度で分析物を含有するように約５０倍の濃度係数を得ることを可能にしている。
【００２８】
サンプルが前記方法において適宜に補強または濃縮された後、濃縮された分析物溶液の約１１μｌが分析物類似物またはそのコンジュゲートおよび分析物に対する抗体および必要な反応緩衝剤で被覆された粒子に沿ってスライド装置１０の受容／混合容器１７に導入される。この混合物は上流入口１５を通って毛細管軌道領域１４に導入されかつ下流の出口１６にかつ監視領域１８に曲がりくねった毛細管軌道１９，２１，２０を横切らせられる。分析物が環境サンプル中に、かつしたがってその濃縮された溶液中に存在しないならば、抗体が粒子の凝集を発生する毛細管軌道中の分析物類似物またはそのコンジュゲートと反応する。しかしながら、分析物が環境サンプル中に、かつその濃縮した溶液中に存在するならば、分析物はその抗体に結合しかつ被覆されたラテックス粒子の分析物類似物またはそのコンジュゲートと抗体が反応するのを阻止または禁止し、かくして粒子凝集を阻止または禁止する。
【００２９】
毛細管軌道を通るサンプルおよび反応剤の横断後、監視区域の観察は分析物の正量＝凝集なし；分析物の負担＝凝集が目視で測定されるような結果を可能にする。
【００３０】
ここで記載された分析方法は特別な機器を必要としない比較的簡単な方法でありかつしたがって迅速な領域分析、すなわち、自然の状態または事務所または家庭等におけるごとく、実験室でない環境における分析を容易に導く。一般に、濃縮段階および凝集反応試験の両方を含んでいる分析方法全体はサンプル濃縮相に関して約１０分またはそれ以下、一般に、約５分またはそれ以下そして凝集反応試験相に関して５分またはそれ以下で実施され得る。
【００３１】
そのうえ、分析方法に必要とされるすべての材料および装置は容易に製造され、安価でありそして環境許容方法において容易に処理され得る。
【００３２】
理解されることは、被覆されたラテックス粒子４６が分析されるべき特別な分子物に対する適切な抗体または親和性反応剤で被覆されるということである。粒子４６、薄膜円板４０の細孔および裂け目の相対的な大きさは粒子が円板の頂部面上に保持されそして円板を貫通しないようになっている。
【００３３】
１０ｐｐｂまたはそれ以下の、とくに１ｐｐｂまたはそれ以下のレベルで環境サンプル中に存在する分析物に関する領域分析を行うのに必要とされるすべては薄膜の前方面上に適切に被覆された粒子を有する薄膜を備えた濃縮装置、１またはそれ以上の注射器および回収容器、凝集反応スライド装置および溶出溶媒のごとき、適切な反応剤、分析物またはそれに結合されたコンジュゲートを有するラテックス粒子、分析物に対する抗体および要求されるかまたは必要とみなされる反応緩衝剤である。
【００３４】
本発明を、さらに、殺虫剤アストラジンのかつＬＳＤの分析の以下の例示の例によって例示する。
【００３５】
例１
アトラジンに対する抗体、ラビットからの多クローン性抗血清が０．８μｍのポリスチレンラテックス粒子を被覆するのに使用された。抗体はこの抗体を沈殿させるように氷浴中で抗血清に等量の飽和（１００％）硫酸アンモニウムをゆっくり添加することにより硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮された。沈殿させられた抗体は約ｐＨ７．０±０．１で燐酸塩緩衝剤生理食塩水溶液中に再び懸濁されかつ約１７ｍｇ／ｍｌの抗体の濃度を設けるように遠心分離された。
【００３６】
３０％貯蔵液中で０．８μｌの市場で入手可能な白いポリスチレンラテックス粒子が貯蔵緩衝液を除去するように約４℃でｐＨ６．０±０．１で５０ｍＭメチルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤溶液で４回洗浄された。
【００３７】
純化された抗体は５０ｍＭＭＥＳ緩衝剤で希釈されそして等量の順次希釈された抗体溶液が洗浄されたラテックス粒子と混合されかつ洗浄されたラテックス粒子を感じやすくするように一晩中攪拌された。ラテックス微小粒子上の結合されない光景は抗体−ラテックス微小粒子混合物にＭＥＳ緩衝剤中に等量の１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することにより遮断される。約１時間の遮断後、ラテックス−抗体−ＢＳＡ混合物が洗浄されかつ５０ｍＭＭＥＳ緩衝剤中に懸濁されそして最終のラテックス溶液が１０％固体に調整された。
【００３８】
注射器を使用して、０．６ｍｌの１００％固体のラテックス粒子−抗体−ＢＳＡ混合物が注射器に吸い込まれかつそれから０．５ｍｌ／分の流量で、０．４５μｍの細孔または裂け目を有するガラス繊維製薄膜円板を介して、薄膜円板の頂部面上に結合されたラテックス粒子をトラップするように、第２図に示したような濃縮装置内に押し出される。その後、注射器を使用して、約１ｐｐｂのアトラジンを含有するように知られた約５０ｍｌの環境溶液が、薄膜円板中のかつその上の抗体で被覆されたラテックス粒子に分析物サンプル中のアトラジンを結合するように、３ｍｌ／分の流量で薄膜円板を介して注射器室から通される。
【００３９】
濃縮装置の薄膜円板を通る５０ｍｌのアトラジン溶液の通過後、結合された分析物が約１ｍｌ／分の流量で１ｍｌの１００％ＨＰＬＣ等級メタノールによりラテックス粒子から溶出され、そして溶出液は適宜な回収容器内に回収される。回収された溶出液はアトラジンの約５０倍に濃縮された溶液である。
【００４０】
濃縮された分析物溶液の分析は、本発明によれば、約１１μｌの濃縮されたアトラジン分析物溶液、約５０μｌのアトラジン−ＢＳＡで結合されたラテックス粒子、約５０μｌのアトラジンに対する抗体、約５０μｌの緩衝剤を第１図に示した型の凝集反応スライド装置の受容および混合容器中に配置し、前記容器中で反応剤を混合し、混合物を毛細管軌道に導入しそしてスライドの監視区域に反応混合物を流させることによって行われる。監視における凝集されたラテックス粒子の不存在は環境水溶液中のアトラジンの存在を確認する。対比において、１ｐｐｂのアトラジンを含有する環境水サンプルが濃縮方法なしに同一の凝集反応分析に従わされるならば、分析はスライド中のラテックス粒子の凝集を結果として生じ、環境水溶液中のアトラジンの不存在を誤って示す。
【００４１】
例２
ＬＳＤに対する抗体、ヤギからの多クローン性抗血清が０．８μｍのポリスチレンラテックス粒子を被覆するのに使用された。抗体はこの抗体を沈殿させるように氷浴中で抗血清に等量の飽和（１００％）硫酸アンモニウムをゆっくり添加することにより硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮された。沈殿させられた抗体は約ｐＨ７．０±０．１で燐酸塩緩衝剤生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中に再び懸濁されかつ約２８ｍｇ／ｍｌの抗体の濃度を設けるように遠心分離された。
【００４２】
３０％貯蔵液中で０．８μｌの市場で入手可能な白いポリスチレンラテックス粒子が貯蔵緩衝液を除去するように約４℃でｐＨ６．０±０．１で５０ｍＭメチルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤溶液で４回洗浄された。
【００４３】
純化された抗体は５０ｍＭＭＥＳ緩衝剤で希釈されそして等量の順次希釈された抗体溶液が洗浄されたラテックス粒子と混合されかつ洗浄されたラテックス粒子を感じやすくするように一晩中攪拌された。ラテックス微小粒子上の結合されない光景は抗体−ラテックス微小粒子混合物にＭＥＳ緩衝剤中に等量の１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することにより遮断される。約１時間の遮断後、ラテックス−抗体−ＢＳＡ混合物が洗浄されかつ５０ｍＭＭＥＳ緩衝剤中に再び懸濁されそして最終のラテックス溶液が１０％固体に調整された。
【００４４】
注射器を使用して、０．６ｍｌの１００％固体のラテックス粒子−抗体−ＢＳＡ混合物が注射器に吸い込まれかつそれから０．５ｍｌ／分の流量で、０．４５μｍの細孔または裂け目を有するガラス繊維製薄膜円板を介して、薄膜円板の頂部面上に結合されたラテックス粒子をトラップするように、第２図に示したような濃縮装置内に押し出される。その後、注射器を使用して、約１ｐｐｂのＬＳＤを含有するように知られた約５０ｍｌの尿サンプルが、薄膜円板中のかつその上の抗体で被覆されたラテックス粒子に分析物サンプル中のＬＳＤを結合するように、３ｍｌ／分の流量で薄膜円板を介して注射器室から通される。
【００４５】
濃縮装置の薄膜円板を通る５０ｍｌの分析物溶液の通過後、結合されたＬＳＤが約１ｍｌ／分の流量で１ｍｌの１００％ＨＰＬＣ等級メタノールによりラテックス粒子から溶出され、そして溶出液は適宜な回収容器内に回収される。回収された溶出液はＬＳＤの約５０倍に濃縮された溶液である。
【００４６】
濃縮された分析物溶液の分析は、本発明によれば、約１１μｌの濃縮されたＬＳＤ分析物溶液、約５０μｌのＬＳＤ−ＢＳＡで結合されたラテックス粒子、約５０μｌのＬＳＤに対する抗体、約５０μｌの緩衝剤を第１図に示した型の凝集反応スライド装置の受容および混合容器中に配置し、前記容器中で反応剤を混合し、混合物を毛細管軌道に導入しそしてそのスライドの監視区域に反応混合物を流させることによって行われる。監視における凝集されたラテックス粒子の不存在は最初の尿サンプル中のＬＳＤの存在を確認する。対比において、１ｐｐｂのＬＳＤを含有する尿サンプルが濃縮方法なしに同一の凝集反応分析に従わされるならば、分析はスライド中のラテックス粒子の凝集を結果として生じ、環境水溶液中のＬＳＤの不存在を誤って示す。
【００４７】
本発明の前記説明により、当該技術に熟練した者にはその精神から逸脱することなく本発明に変更がなされ得ることは明らかである。それゆえ、本発明の範囲は説示された特別な実施例に制限されるようには意図されない。
【００４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるサンプルの凝集試験用凝集反応スライド分析装置を示す部分図
【図２】この発明に使用の流体密閉ハウジング内の透過可能な薄膜を示す斜視図
【図３】第２図の線３−３に沿う断面図
【図４】第３図の薄膜要素を示す拡大断面図
【図５】この発明の分析方法に使用の圧力差供給装置を示す部分断面図
【図６】この発明の分析方法に使用の濃縮した分析物溶液を用意するための装置を示す部分断面図

Claims

１０ｐｐｂまたはそれ以下の量においてサンプル中に存在する分析物の存在を検出するための方法において、この方法が：
（１）前記サンプルの測定可能な量を用意し；
（２）液密ハウジング内に透過性薄膜を設け、前記ハウジングがこの薄膜の第１表面への入口ポートおよびこの薄膜の第２の、反対表面からの出口ポートを有し、前記透過性薄膜が約０．４μｍ〜０．７μｍの細孔または裂け目を有しかつ前記透過性薄膜の前記第１表面に、分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆された約０．８μｍ〜１．０μｍの粒径のラテックス粒子を有し；
（３）前記サンプルの測定可能な量を、他と異なる圧力下で、前記透過性薄膜を通ってかつ出口ポートの外への流出のために入口ポートに導入し、前記サンプル中の分析物を粒子上に被覆された抗体または親和性反応剤に結合させ；
（４）その後、サンプルの前記測定可能な量よりも少ない量の溶出溶媒を使用し、前記溶出溶媒がメタノール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびＮａＣｌの溶液からなっており、分析物を少なくとも約５０ｐｐｂの分析物の濃度を有する濃縮された分析物溶液として被覆された粒子から溶出させて出口ポートから容器に送り出し；
（５）凝集反応スライド分析装置の受容容器内に、混合物を形成するために、（ａ）前記濃縮された分析物溶液、（ｂ）分析物類似物またはそのコンジュゲートで被覆された粒子、および（ｃ）分析物に対する抗体を導入しかつ混合し、この混合物を前記受容容器からスライド分析装置の毛細管軌道領域に導入しそして前記混合物を前記スライド分析装置の目視領域に対して毛細管軌道領域を横切らせ；そして
（６）前記スライド分析装置の前記目視領域における顕著な凝集された粒子の、それぞれ、存在または不存在を観察することにより前記測定可能な量のサンプル中の分析物の不存在または存在を目視測定することからなっていることを特徴とする分析物の存在検出方法。
前記透過性薄膜がガラス繊維薄膜であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の分析物の存在検出方法。
前記被覆粒子がポリスチレンラテックス粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の分析物の存在検出方法。
前記サンプルが環境サンプルでありかつ前記分析物が有機性殺虫剤であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の分析物の存在検出方法。
前記分析物がアトラジンであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の分析物の存在検出方法。
前記サンプルが生物学的サンプルであり、前記分析物がＬＳＤであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の分析物の存在検出方法。
前記サンプルが環境サンプルであり、前記分析物がアトラジンであり、前記被覆粒子が約０．８〜１．０μｍ内のポリスチレンラテックス粒子であり、前記透過性薄膜が約０．４〜０．７μｍの範囲の細孔または裂け目を有するガラス繊維薄膜でありそして溶出溶媒の使用量がサンプルの前記測定可能な量の約１／５０より大きくないことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の分析物の存在検出方法。
前記溶出溶媒が約６０％のメタノール（ｖ／ｖ）、約４０％のエチレングリコール（ｖ／ｖ）、約４％のポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）からなる溶液であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の分析物の存在検出方法。
前記溶出溶媒が約６０％メタノール（ｖ／ｖ）、約４０％エチレングリコール（ｖ／ｖ）、約４％ポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）からなる溶液であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の分析物の存在検出方法。
１０ｐｐｂまたはそれ以下の量において環境サンプル中に存在する分析物の存在を検出するための方法において、この方法が：
（１）前記環境サンプルの測定可能な量を用意し；
（２）液密ハウジング内に透過性薄膜を設け、前記ハウジングがこの薄膜の第１表面への入口ポートおよびこの薄膜の第２の、反対表面からの出口ポートを有し、前記透過性薄膜が約０．４μｍ〜０．７μｍの細孔または裂け目を有しかつ前記透過性薄膜の前記第１表面に、分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆された約０．８μｍ〜１．０μｍの粒径のラテックス粒子を有し；
（３）前記環境サンプルの測定可能な量を、他と異なる圧力下で、前記透過性薄膜を通ってかつ出口ポートの外への流出のために入口ポートに導入し、前記サンプル中の分析物を粒子上に被覆された抗体または親和性反応剤に結合させ；
（４）その後、サンプルの前記測定可能な量より少ない量の溶出溶媒を使用し、前記溶出溶媒がメタノール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびＮａＣｌの溶液からなっており、前記分析物を少なくとも約５０ｐｐｂの分析物の濃度を有する濃縮された分析物溶液として被覆された粒子から溶出させて出口ポートから容器に送り出し；
（５）凝集反応スライド分析装置の受容容器内に、混合物を形成するために、（ａ）前記濃縮された分析物溶液、（ｂ）分析物類似物またはそのコンジュゲートで被覆された粒子、および（ｃ）分析物に対する抗体を導入しかつ混合し、この混合物を前記受容容器からスライド分析装置の毛細管軌道領域に導入しそして前記混合物を前記スライド分析装置の目視領域に対して毛細管軌道領域を横切らせ；そして
（６）前記スライド分析装置の前記目視領域における顕著な、凝集された粒子の、それぞれ、存在または不存在を観察することにより前記測定可能な量の環境サンプル中の分析物の不存在または存在を目視測定することからなっていることを特徴とする分析物の存在検出方法。
前記透過性薄膜がガラス繊維薄膜であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の分析物の存在検出方法。
前記被覆粒子がポリスチレンラテックス粒子であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の分析物の存在検出方法。
前記分析物がアトラジンであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の分析物の存在検出方法。
前記分析物がアトラジンであり、前記被覆粒子が約０．８〜１．０μｍ内のポリスチレンラテックス粒子であり、前記透過性薄膜が約０．４〜０．７μｍの範囲の細孔または裂け目を有するガラス繊維薄膜でありそして溶出溶媒の使用量がサンプルの前記測定可能な量の約１／５０より大きくないことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の分析物の存在検出方法。
前記溶出溶媒が約６０％のメタノール（ｖ／ｖ）、約４０％のエチレングリコール（ｖ／ｖ）、約４％のポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）からなる溶液であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の分析物の存在検出方法。
前記溶出溶媒が約６０％メタノール（ｖ／ｖ）、約４０％エチレングリコール（ｖ／ｖ）、約４％ポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）からなる溶液であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の分析物の存在検出方法。
１０ｐｐｂまたはそれ以下の量においてサンプル中に最初に存在する分析物を濃縮するためのサンプル濃縮装置において、
液密ハウジング内に透過性薄膜を設け、前記ハウジングがこの薄膜の第１表面への入口ポートおよびこの薄膜の第２の、反対表面からの出口ポートを有し、前記透過性薄膜が約０．４μｍ〜０．７μｍの細孔または裂け目を有しかつ前記透過性薄膜の前記第１表面に被覆された粒子を有し、前記粒子が約０．８〜１．０μｍの粒径で、かつ前記分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆されていることを特徴とするサンプル濃縮装置。
前記透過性薄膜がガラス繊維薄膜でありそして前記被覆粒子がポリスチレンラテックス粒子であることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載のサンプル濃縮装置。
前記粒子が有機殺虫剤に対する抗体で被覆されることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載のサンプル濃縮装置。
前記粒子がアトラジンに対する抗体で被覆されることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載のサンプル濃縮装置。
前記粒子がＬＳＤに対する抗体で被覆されることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載のサンプル濃縮装置。
１０ｐｂｂまたはそれ以下の量においてサンプル中に存在する分析物を濃縮するための方法において、この方法が：
（１）前記サンプルの測定可能な量を用意し；
（２）液密ハウジング内に透過性薄膜を設け、前記ハウジングがこの薄膜の第１表面への入口ポートおよびこの薄膜の第２の、反対表面からの出口ポートを有し、前記透過性薄膜が約０．４μｍ〜０．７μｍの細孔または裂け目を有しかつ前記透過性薄膜の前記第１表面に、分析物に対する抗体または親和性反応剤で被覆された約０．８μｍ〜１．０μｍの粒径のラテックス粒子を有し；
（３）サンプルの前記測定可能な量を、他と異なる圧力下で、透過性薄膜を通ってかつ出口ポートの外への流出のために入口ポートに導入し、前記サンプル中の分析物を粒子上に被覆された抗体または親和性反応剤に結合させ；
（４）その後、サンプルの前記測定可能な量よりも少ない量の溶出溶媒を使用し、前記溶出溶媒がメタノール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびＮａＣｌの溶液からなっており、分析物を少なくとも約５０ｐｐｂの分析物の濃度を有する濃縮された分析物溶液として被覆された粒子から溶出させて出口ポートから容器に送り出すことを特徴とする分析物濃縮方法。
前記透過性薄膜がガラス繊維薄膜であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記被覆粒子がポリスチレンラテックス粒子であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記サンプルが環境サンプルでありかつ前記分析物が有機性殺虫剤であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記分析物がアトラジンであることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記サンプルが生物学的サンプルであり、前記分析物がＬＳＤであることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記サンプルが環境サンプルであり、前記分析物がアトラジンであり、前記被覆粒子が約０．８〜１．０μｍ内のポリスチレンラテックス粒子であり、前記透過薄膜が約０．４〜０．７μｍの範囲の細孔または裂け目を有するガラス繊維薄膜でありそして溶出溶媒の使用量がサンプルの前記測定可能な量の約１／５０より大きくないことを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記溶出溶媒が約６０％のメタノール（ｖ／ｖ）、約４０％のエチレングリコール（ｖ／ｖ）、約４％のポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）からなる溶液であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の分析物濃縮方法。
前記溶出溶媒が約６０％メタノール（ｖ／ｖ）、約４０％エチレングリコール（ｖ／ｖ）、約４％ポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）および約２％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）からなる溶液であることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の分析物濃縮方法。