JP3671403B2

JP3671403B2 - Prostaglandin D receptor, production method thereof, DNA encoding the receptor, vector comprising the DNA, and host cell transformed with the vector

Info

Publication number: JP3671403B2
Application number: JP07538294A
Authority: JP
Inventors: 厚市川; 一和中尾; 周成宮
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1994-03-22
Publication date: 2005-07-13
Anticipated expiration: 2020-07-13
Also published as: JPH07258295A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、哺乳動物のプロスタグランジンＤ受容体、その製造方法、その該受容体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴ）ようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（Annu. Rev. Biochem. 47, 997 (1978)、The Pharmacological Basis of Therapeutics （Gilman, A. G., Good-man, L. S., Rall, T. W., and Murad, F., eds) 7th Ed., pp 660, Macmillan Publishing Co., New York (1985) および Annu. Rev. Pharm. Tox.,10, 213 (1989) 参照のこと）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体によって制御されている（Comprehensive Medicinal Chemistry (Hansch, C., Sammes, P. G., Taylor, J. B. and Emmett, J. C. eds), 3 ,643, Pergamon, Oxford (1990) 参照のこと）。
【０００３】
プロスタノイドの一員であるプロスタグランジンＤ₂（ＰＧＤ₂）は、哺乳動物の多くの組織や細胞中で、種々の生理学的刺激および病理学的刺激によって、アラキドン酸から合成され（Arch. Biochem. Biophys., 260, 521-531 (1988)）、それらの機能を調節するために種々の生理活性を発揮している（Prostaglandins, 35, 277-300 (1988)）。例えば、ＰＧＤ₂は血小板凝集時に生成され、ネガティブフィードバックモジュレータとして作用している（Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)）。また血管、胃および子宮の平滑筋を弛緩し（Brit. J. Pharmacol.,85 ,367-375 (1985), Circulation Res., 71, 1305-1313 (1992), Eur. J. Pharmacol., 81, 141-143 (1982)）、白血球の活性化を抑制し（Brit. J. Pharmacol., 108, 1051-1054 (1993)）、自律神経または知覚神経の伝達を調節するために末梢神経に作用する（Am. J. Physiol., 260, G904-G910 (1991), Brit. J. Pharmacol., 108, 185-190 (1993)）。さらにＰＧＤ₂は免疫反応で重要な役割を果たすために、肥満細胞やマクロファージ系細胞によって放出される（J. Immunol., 129, 1627-1631 (1982), J. Immunol., 143, 2982-2989 (1989)）。中枢神経系においては、ＰＧＤ₂は、睡眠を生理学的にコントロールしているのではないかと考えられている（FASEB J., 5 ,2575-2581 (1991) ）。
【０００４】
このように、ＰＧＤ₂の生理学的作用については大いに注目されているが、ＰＧＤ₂の受容体を同定し、解析するための薬理学的、生化学的研究は遅れている。その理由としては、ＰＧＤ₂は比較的高濃度（１０ｎＭから１μＭ）でその作用を発揮すること（Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)）、他のプロスタグランジン類（ＰＧｓ）と同様に、他のプロスタノイドの受容体とクロスリアクションすること（Prostaglandins, 35, 277-300 (1988), Comprehensive Medicinal Chemistry, 3, 643-714 (1989)）、およびその顕著な生理作用にもかかわらず組織中の受容体の数が少ないことが挙げられる。従って、ＰＧＤ受容体の性質、分布、局在化については現在まで不明である。
【０００５】
【発明の目的】
最近、多数のプロスタノイド受容体のｃＤＮＡが単離され、それらの一次構造が明らかになった。具体的には、ＴＸＡ₂（Nature, 349, 617-620 (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1197-1203 (1992)）、ＰＧＥ受容体のＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ３サブタイプ（J. Biol. Chem., 267 ,6463-6466 (1992), J. Biol. Chem., 268, 7759-7762 (1993), J. Biol. Chem., 268 , 20175-20178 (1993)）、PGI （J. Biol. Chem., (1994)）、およびＰＧＦ（J. Biol. Chem., 269 , 1356-1360 (1994)）の各受容体である。さらに、ヒトＴＸＡ₂受容体の遺伝子構造も明らかにされた（J. Biol. Chem., 268 , 25253-25259 (1993)）。これらの研究によって、プロスタノイドの受容体は、ロドプシンタイプＧ−プロテイン共役受容体スーパーファミリーのサブファミリーを構成していることが判明した（Annu. Rev. Neurosci., 12, 67-83 (1989)）。これらの研究で得られた情報をもとに、本発明者等は、リバーストランスクリプション−ポリメラーゼチェインリアクション（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR ）法によってマウスＰＧＤ受容体をコードするｃＤＮＡを単離することに成功した。さらに単離されたクローンのシークエンスを解析し、またＣＨＯ細胞で発現させて分析した結果、それがマウスＰＧＤ受容体をコードしていることを明らかにして本発明を完成した。
【０００６】
スイスプロット（Swiss Prot Release 2.0）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが確認された。
【０００７】
【発明の構成】
本発明は、実質的に純粋な形である哺乳動物のＰＧＤ受容体に関する。ここでＰＧＤとは、ＰＧＤ₁、ＰＧＤ₂等のＰＧＤ類似体が挙げられるが、好ましくは、ＰＧＤ₂である。また、哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット等が挙げられる。本発明の一態様としては、マウスのＰＧＤ受容体に関する。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
【０００８】
特に、本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および
（４）配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
【０００９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１で示されるアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
【００１０】
実質的に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
【００１１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明ポリペプチドとして記載される。
【００１２】
さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００１３】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
【００１４】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、遺伝子組換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
【００１６】
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００１７】
さらに、本発明には、配列番号２または３で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
【００１９】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
【００２０】
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２１】
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列番号１で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
【００２２】
（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
【００２３】
（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２４】
配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
(i) 本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
(ii) 該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、
(iii) 該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
(iv) 得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(v) 得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
(vi) 目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
【００２５】
より詳細に説明すると、工程(i) は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ等）の組織中、ＰＧＤ受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは、肺、血管、白血球等の組織細胞より、Okayama, H. 等の方法（Method in Enzymology, 154 , 3(1987) に記載）、Chirgwin, J. M. 等の方法（Biochem., 18, 5294 (1979) に記載）等の方法に従って行なわれる。(ii)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法（Gene, 25, 263(1983) に記載）に準じて行なわれる。(iii) の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するλ−ＺＡＰIIが用いられる。(iv)の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル（Gene, 96, 23(1990)記載の方法により調製される。）である。最近では、各動物の種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが既に市販されている。これらの市販のｃＤＮＡライブラリーも好適に用いられる。工程(v) は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63 (1980) に記載）等によって行われる。また、適当なプローブとしては、異種動物のＰＧＤ受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。工程(vi)はそれ自体公知であり、例えばジデオキシ・ターミネーター（dideoxy terminator）法やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法により行なわれる。
【００２６】
配列番号２または３で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（polymerase chain reaction ）法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
もちろん、本発明のＤＮＡは、以下の実施例に記載した方法によっても製造することができる。
【００２７】
本発明のポリペプチド（配列番号１）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
【００２８】
遺伝子組換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
【００２９】
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.coli ＤＨ１、E.coli ＪＭ１０９、E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
【００３０】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、それ自体、ＰＧＤ、とりわけＰＧＤ₂と特異的に結合するのでＰＧＤ₂の過剰産生によって生ずる疾患の予防あるいは治療剤、例えば、免疫賦活剤、出血傾向の抑制剤等として用いることができる。また、ＰＧＤ₂のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
【００３２】
さらに、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
【００３３】
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic ）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００３４】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】
実施例１：マウスＰＧＤ受容体のｃＤＮＡクローニング
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による、種々のプロスタノイド受容体と相同性を示すマウス胸腺ｃＤＮＡフラグメントの増幅
一本鎖ｃＤＮＡをマウス胸腺由来全ＲＮＡから、ランダムヘキサヌクレオチドをプライマーとして用いて合成した。ＰＣＲのプライマーとしては、種々のプロスタノイド受容体で高度に保存されているアミノ酸配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成して用いた。すなわち、２番目の細胞外ループ領域中のＧｌｙＴｈｒＴｒｐＣｙｓＰｈｅ（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）および７番目の膜貫通領域中のＡｓｐＰｒｏＴｒｐＩｌｅ（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）に相当する、それぞれ以下に示す合成ヌクレオチドを用いた。
【００３６】
【化１】
5´-GG(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)TGGTG(C/T)TT(C/T)(A/T)T-3´ および
5´-A(T/G)(A/G)(A/T)A(A/G/T)ATCCA(A/G/C/T)GG(A/G)TC-3´
【００３７】
増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃＤＮＡフラグメントは、pBluescript SK II (+) (Stratagene 社製) ベクターにサブクローニングした。ランダムにピックアップしたクローンについてシークエンシングした結果、フラグメントＰＧ２５は、他のプロスタノイド受容体の５番目と６番目の膜貫通領域と高い相同性を有するシークエンスを含んでいた。
【００３８】
（２）ハイブリダイゼーションによるマウスジェノミックライブラリーのスクリーニング
マウスジェノミックライブラリー、λＦＩＸII（Stratagene社製）中の２×１０⁵のクローンを、³²ＰでラベルしたＰＧ２５フラグメントをプローブとしてプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５×Denhardt´s溶液（0.1 ％ Ficoll 、0.1 ％ポリビニルピロリドン（ polyvinylpyrrolidone ）および0.1 ％ウシ血清アルブミン）と0.5 ％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含有する６×ＳＳＣ（９００ｍＭＮａＣｌ，９０ｍＭクエン酸ナトリウム）中、５８℃で１５時間行ない、ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６５℃で３０分間、１％ＳＤＳ含有 0.2×ＳＳＣで２回洗浄した。４個のポジティブクローンが単離された。最長クローンのインサートは１３ｋｂであった。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、ふたつのＸｂａＩフラグメント（ 3.3ｋｂｐおよび６ｋｂｐ）がプローブにハイブリダイズすることが見出された。これらのフラグメントはそれぞれサブクローニングし、塩基配列を決定した。核酸の塩基配列は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain termination method）により行なった。
【００３９】
（３）オープンリーディングフレームの構築
前記（１）および（２）より、ＰＧ２５は、ふたつのエクソンにまたがっていることが判った。そこで、ＰＧ２５の５′上流と３′下流の配列を得るために、マウス肺由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）から、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。
【００４０】
【化２】
5´-GGAGTGCTGGCTGTCTCT-3´および
5´-CTTCAGTGCTGATCCCTC-3´
【００４１】
増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃＤＮＡフラグメントを、pBluescript SK II (+) (Stratagene 社製）ベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。得られたクローン（ＰＧｃ１）は、８２４ｂｐからなり、ジェノミッククローンのエクソンに相当することが判った。ＰＧｃ１をＮａｒＩで消化し、消化したフラグメントの３’部分をジェノミッククローンのＰｓｔＩ−ＮａｒＩフラグメントにライゲーションし、 1.2ｋｂｐのフラグメント、ＰＧｃ９を構築した。ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を図１に示す（オープンリーディングフレームは斜線で示される。）。このようにして、完全長ｃＤＮＡに相当するクローンを得た。全長の塩基配列を配列番号３に、また、オープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号２に示す。さらに、オープンリーディングフレームより推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４２】
実施例２：ＣＨＯ細胞によるマウスＰＧＤ受容体の発現と各種リガンドとのバインディングアッセイ
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子（Biochem. Biophys. Res. Commun., 164 , 39 (1989) ）をセレクションマーカーとして含む、真核細胞発現ベクター、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒにＰＧｃ９をサブクローンし、得られたプラスミドＤＮＡ、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒ−ＰＧｃ９をJ. Biol. Chem., 267 , 2437 (1992) に記載の方法に従って、ジヒドロ葉酸還元酵素活性の欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ^-）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) に記載）に形質転換した。ジヒドロ葉酸還元酵素を発現する細胞群は、１０％透析ウシ胎児血清を含有するα−ＭＥＭ（−）培地（Cell Culture Laboratories 社製）中で培養し、選択した。特異的な［³Ｈ］ＰＧＤ２結合活性を示すクローンがいくつか単離された。それらのクローンのうちの一つ、ＣＨＯ−Ｊを以下の実験に供した。
【００４３】
ＣＨＯ−Ｊ細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（−）培地で培養した後、ホスフェートバッファーセーラインで一度洗浄し、培養プレートから回収した後、８００×ｇで１５分間遠心分離して沈降させた。得られたセルペレットを１０倍量のホモジネート用バッファー（２５ｍＭＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、２５０ｍＭｄ−マンニトール、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、１ｍＭベンズアミジン塩酸塩からなる）中に懸濁させ、超音波処理してホモジネートした。得られたホモジネートを、標識しない各リガンドの存在下または非存在下、１０ｎＭ［³Ｈ］ＰＧＤ₂と４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷した洗浄用バッファー（２５ｍＭＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１４０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌよりなる）を加えて反応を停止し、素早くワットマン（Whatman ）ＧＦ／Ｃグラスファイバーフィルターで濾過した。フィルターを氷冷した洗浄用バッファーで４回洗浄した後、フィルター上の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。標識していないＰＧＤ₂を２００倍以上存在させた時の、フィルターに結合した放射活性をもって非特異的な結合とした。
【００４４】
このアッセイの結果、ＰＧＤ２受容体に対するリガンドである［³Ｈ］ＰＧＤ₂は、ＰＧｃ９を発現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することが判った。この結合のスキャッチャード（Scatchard ）分析の結果は、図２に示す。さらに、［³Ｈ］ＰＧＤ２の特異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性を図２に示す。種々のプロスタノイドによる結合阻害は、ＰＧＤ₂＞＞ＢＷ２４５Ｃ＝ＢＷＡ８６８Ｃ＞ＳＴＡ₂であり、Iloprost、ＰＧＥ₂およびＰＧＦ_２αには結合しなかった。
【００４５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質

【００４６】
配列番号：２
配列の長さ：１０７１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA

【００４７】
配列番号：３
配列の長さ：１２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA

【００４８】
配列番号：４
配列の長さ：１２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：mouse
組織の種類：肺
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＰ
存在位置：37..1110
特徴を決定した方法：Ｐ

【図面の簡単な説明】
【図１】ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を示す図である。オープンリーディングフレームは斜線で示される。
【図２】［³Ｈ］ＰＧＤ₂の、ＰＧｃ９をトランスフェクトした細胞膜への結合に対する種々のリガンドの阻害活性を示すグラフである。また、図中の図は、［³Ｈ］ＰＧＤ₂のスキャッチャード（Scatchard ）分析の結果を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a mammalian prostaglandin D receptor, a method for producing the same, a DNA encoding the receptor, a replication or expression vector comprising the DNA, and a host cell transformed with the vector.
[0002]
[Prior art]
Prostanoids such as prostaglandins (PG), thromboxanes (TX), and leukotrienes (LT) are a family of oxidative metabolites of arachidonic acid and have various physiological actions to maintain local homeostasis in vivo. (Annu. Rev. Biochem. 47 , 997 (1978), The Pharmacological Basis of Therapeutics (Gilman, AG, Good-man, LS, Rall, TW, and Murad, F., eds) 7th Ed. , pp 660, Macmillan Publishing Co., New York (1985) and Annu. Rev. Pharm. Tox., 10 , 213 (1989)). Their physiological actions are controlled by the plasma membrane receptors unique to each prostanoid (Comprehensive Medicinal Chemistry (Hansch, C., Sammes, PG, Taylor, JB and Emmett, JC eds), 3 , 643, Pergamon, See Oxford (1990)).
[0003]
Prostaglandin D ₂ (PGD ₂ ), a member of the prostanoid, is synthesized from arachidonic acid by a variety of physiological and pathological stimuli in many mammalian tissues and cells (Arch. Biochem. Biophys., 260 , 521-531 (1988)) and exhibit various physiological activities to regulate their functions (Prostaglandins, 35 , 277-300 (1988)). For example, PGD ₂ is produced during platelet aggregation and acts as a negative feedback modulator (Prostaglandins, 16 , 373-388 (1978)). It also relaxes the smooth muscles of blood vessels, stomach and uterus (Brit. J. Pharmacol., 85 , 367-375 (1985), Circulation Res., 71 , 1305-1313 (1992), Eur. J. Pharmacol., 81 , 141-143 (1982)) and inhibits leukocyte activation (Brit. J. Pharmacol., 108 , 1051-1054 (1993)) and acts on peripheral nerves to regulate autonomic or sensory nerve transmission (Am. J. Physiol., 260 , G904-G910 (1991), Brit. J. Pharmacol., 108 , 185-190 (1993)). Furthermore, PGD ₂ plays an important role in immune responses and is released by mast cells and macrophage cells (J. Immunol., 129 , 1627-1631 (1982), J. Immunol., 143 , 2982-2989). (1989)). In the central nervous system, PGD ₂ is thought to be physiologically controlling sleep (FASEB J., 5 , 2575-2581 (1991)).
[0004]
Thus, it has been much attention for physiological effects of PGD _2, to identify the receptor of PGD _2, pharmacologic for analyzing biochemical studies are delayed. The reason is that PGD ₂ exerts its action at a relatively high concentration (from 10 nM to 1 μM) (Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)), and, like other prostaglandins (PGs), Cross-react with other prostanoid receptors (Prostaglandins, 35 , 277-300 (1988), Comprehensive Medicinal Chemistry, 3, 643-714 (1989)), and in tissues despite their marked physiological effects The number of receptors is small. Therefore, the nature, distribution, and localization of the PGD receptor are unknown to date.
[0005]
OBJECT OF THE INVENTION
Recently, a number of prostanoid receptor cDNAs have been isolated and their primary structure revealed. Specifically, TXA ₂ (Nature, 349, 617-620 (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184 , 1197-1203 (1992)), EP1, EP2 and EP3 subtypes of PGE receptor ( J. Biol. Chem., 267 , 6463-6466 (1992), J. Biol. Chem., 268 , 7759-7762 (1993), J. Biol. Chem., 268 , 20175-20178 (1993)), PGI (J. Biol. Chem., (1994)) and PGF (J. Biol. Chem., 269 , 1356-1360 (1994)). Furthermore, the gene structure of the human TXA ₂ receptor was also revealed (J. Biol. Chem., 268 , 25253-25259 (1993)). These studies revealed that prostanoid receptors constitute a subfamily of the rhodopsin type G-protein coupled receptor superfamily (Annu. Rev. Neurosci., 12 , 67-83 (1989)). ). Based on the information obtained in these studies, the present inventors obtained a cDNA encoding the mouse PGD receptor by the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Successfully isolated. Further, the sequence of the isolated clone was analyzed and analyzed by expressing it in CHO cells. As a result, it was revealed that it encoded the mouse PGD receptor, and the present invention was completed.
[0006]
The amino acid sequence of a known polypeptide registered in the Swiss plot (Swiss Prot Release 2.0) was examined, but none had the same sequence as the polypeptide of the present invention. Furthermore, the nucleotide sequence registered in GeneBank (GenBank Release 70.0) was also examined, but no sequence identical to the cDNA encoding the polypeptide of the present invention was found. Therefore, it was confirmed that the polypeptide of the present invention is completely novel.
[0007]
[Structure of the invention]
The present invention relates to mammalian PGD receptors that are in substantially pure form. Here, the PGD is, PGD _1, although PGD analogs of PGD ₂ and the like, preferably, PGD _2. In addition, examples of mammals include humans, mice, and rats. One embodiment of the present invention relates to a mouse PGD receptor. Specifically, the present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a homologue thereof, a fragment of the sequence, and a homologue thereof. The present invention further relates to DNA encoding these polypeptides. More specifically, the present invention relates to a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 and a DNA having a fragment that selectively hybridizes to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3.
[0008]
In particular, the present invention
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) DNA encoding the polypeptide described in (1) above,
(3) DNA having the base sequence shown by SEQ ID NO: 2 and (4) DNA having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3
About.
[0009]
The polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is represented not only by the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also by the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide by SEQ ID NO: 1. It means a polypeptide to which a separate polypeptide within 20%, more preferably 5% of the number of amino acids is added.
[0010]
A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in substantially pure form is generally an amino acid wherein 90% or more, eg, 95, 98, or 99% of the polypeptide as produced is represented by SEQ ID NO: 1. It means that the polypeptide contains a sequence.
[0011]
A homologue of a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is generally a sequence of at least 50, preferably at least 100, such as 150, 200 or 250, at least 70%, preferably at least 80 Or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologs are hereinafter described as polypeptides of the invention.
[0012]
Furthermore, a fragment of the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a homologous fragment thereof is a portion of at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, such as 20, 25, 30, 40, 50 or 60 amino acids. Means.
[0013]
The DNA that selectively hybridizes to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 is generally a continuous base sequence region of at least 50, preferably at least 100, for example, 150, 200, or 250. At least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such DNA is hereinafter described as DNA of the present invention.
[0014]
A fragment of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 means a portion of at least 10 bases, preferably at least 15 bases, such as 20, 25, 30 or 40 bases. Included in DNA.
[0015]
The DNA of the present invention can be obtained by a gene recombination method, a synthesis method or a method known to those skilled in the art.
[0016]
Furthermore, the present invention includes a replication or expression vector comprising the DNA of the present invention. Examples of the vector include a plasmid, virus, or phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the DNA, a promoter control factor, and the like. The vector may contain one or more selective marker genes, such as an ampicillin resistance gene.
[0017]
Furthermore, the present invention also includes a host cell transformed with a vector for replicating or expressing the DNA of the present invention containing the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 or the open reading frame thereof. It is. Examples of the cell include bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells.
[0018]
Furthermore, the present invention includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
[0019]
As the polypeptide of the present invention, in addition to the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a polypeptide lacking a part thereof (for example, a polypeptide comprising only a part essential for expression of biological activity in a mature protein) ), A part of which is substituted with another amino acid (for example, a part of which is substituted with an amino acid having similar physical properties), and a part of which is substituted or inserted with another amino acid.
[0020]
As is well known, 1 to 6 types of codons encoding one amino acid are known (for example, 1 type of methionine (Met) and 6 types of leucine (Leu)). Therefore, the base sequence of DNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
[0021]
The DNA of the present invention specified by (2) includes all base sequence groups that encode the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, respectively. Polypeptide productivity may be improved by changing the base sequence.
[0022]
The DNA specified in (3) is an embodiment of the DNA shown in (2) and represents a natural sequence.
[0023]
The DNA shown in (4) shows a sequence obtained by adding a natural untranslated portion to the DNA specified in (3).
[0024]
The DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is produced according to the following method.
That is,
(i) separating mRNA from cells in which the polypeptide of the present invention is produced;
(ii) synthesizing a first strand (single-stranded DNA) and then a second strand (double-stranded DNA) from the mRNA (production of cDNA);
(iii) incorporating the cDNA into an appropriate plasmid vector;
(iv) transforming host cells with the obtained recombinant vector (production of cDNA library),
(v) Isolating the target DNA-containing plasmid from the obtained cDNA library by a hybridization method,
(vi) It can be prepared by determining the base sequence of the target DNA.
[0025]
More specifically, in step (i), in a tissue of a mammal (eg, human, mouse, rat, cow, etc.), a tissue considered to express a PGD receptor, preferably lung, blood vessel, From tissue cells such as leukocytes, methods such as Okayama, H. et al. (Described in Method in Enzymology, 154 , 3 (1987)), methods such as Chirgwin, JM (described in Biochem., 18, 5294 (1979)), etc. Done according to the method. Steps (ii), (iii) and (iv) are steps for preparing a cDNA library and are performed according to the modified Gubler & Hoffman method (described in Gene, 25 , 263 (1983)). Many plasmid vectors used in the step (iii) are known which function in E. coli (for example, pBR322) and those which function in Bacillus subtilis (for example, pUB110). Λ-ZAPII is used which functions in Many host cells used in the step (iv) are already known, and any of them may be used, but preferably prepared by the method described in DH5 competent cells (Gene, 96 , 23 (1990)). Is). Recently, cDNA libraries of various tissues of each animal are already on the market. These commercially available cDNA libraries are also preferably used. Step (v) is known per se and is performed, for example, by a plaque hybridization method, a colony hybridization method (described in Gene, 10 , 63 (1980)), or the like. Moreover, as a suitable probe, DNA of a heterologous animal PGD receptor or a fragment thereof or DNA having homology with the DNA is used. Step (vi) is known per se and is carried out, for example, by the dideoxy terminator method or the Maxam-Gilbert method.
[0026]
Once the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 is confirmed, then, by chemical synthesis, by PCR (polymerase chain reaction) method, or by a hybridization method using a fragment of the base sequence as a probe, The DNA of the present invention can be obtained. Furthermore, a necessary amount of the target DNA of the present invention can be obtained by introducing a vector DNA containing the present DNA into an appropriate host and propagating it.
Of course, the DNA of the present invention can also be produced by the methods described in the following examples.
[0027]
As a method for obtaining the polypeptide of the present invention (SEQ ID NO: 1),
(1) A method for purification and isolation from living organisms or cultured cells,
(2) a method of peptide synthesis, or (3) a method of production using gene recombination technology,
Industrially, the method described in (3) is preferable.
[0028]
Examples of the expression system (host-vector system) for producing a polypeptide using a gene recombination technique include expression systems for bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells.
[0029]
For example, when expressed in E. coli, DNA encoding the protein portion (for example, DNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2) is converted into an appropriate promoter (for example, trp promoter, lac promoter, λPL promoter, T7 An expression vector is prepared by inserting it into a vector (for example, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) that is connected downstream of a promoter and the like and functions in E. coli. Next, E. coli transformed with this expression vector (for example, E. coli DH1, E. coli JM109, E. coli HB101 strain, etc.) is cultured in an appropriate medium, and the desired polypeptide is obtained from the cells. Can be obtained. In addition, if a bacterial signal peptide (for example, a pelB signal peptide) is used, the target polypeptide can be secreted into the periplasm. In addition, fusion proteins with other polypeptides can be produced.
[0030]
When expressed in mammalian cells, for example, a DNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is used as an appropriate vector (for example, a retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia virus vector, SV40 vector, etc.) An expression vector is prepared by inserting it downstream of an appropriate promoter (for example, SV40 promoter, LTR promoter, metallothionein promoter, etc.). Next, by transforming an appropriate mammalian cell (for example, monkey COS-7 cell, Chinese hamster CHO cell, mouse L cell, etc.) with the obtained expression vector, the transformant is cultured in an appropriate medium. The desired polypeptide is secreted into the culture solution. The polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method.
[0031]
【The invention's effect】
The polypeptide of the present invention itself binds specifically to PGD, particularly PGD ₂ and therefore is used as a preventive or therapeutic agent for diseases caused by overproduction of PGD ₂ , such as an immunostimulant and a bleeding tendency inhibitor. be able to. It is also used for screening for substances having PGD ₂ agonist or antagonist activity.
[0032]
Furthermore, the polypeptide can be quantified in a living body using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody of the polypeptide, and can be used for studying the relationship between the polypeptide and a disease or for diagnosing a disease. Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared by conventional methods using the polypeptide or a fragment thereof as an antigen.
[0033]
The DNA of the present invention is not only an important and essential template for producing the polypeptide of the present invention, which is expected to be of great utility, but can also be used for diagnosis and treatment of genetic diseases. In addition, genomic DNA can be separated using the DNA of the present invention as a probe. Similarly, it is possible to isolate a gene of a human related polypeptide having a high homology with the DNA of the present invention, or a gene of a polypeptide having a high homology with the polypeptide of the present invention in a non-human organism.
[0034]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[0035]
Example 1: cDNA cloning of mouse PGD receptor (1) Amplification of mouse thymus cDNA fragment showing homology with various prostanoid receptors by RT-PCR method Randomized single stranded cDNA from total RNA derived from mouse thymus Synthesis was performed using hexanucleotide as a primer. As PCR primers, oligonucleotides corresponding to amino acid sequences highly conserved in various prostanoid receptors were synthesized and used. That is, the following synthetic nucleotides corresponding to GlyThrTrpCysPhe (Ile / Leu) in the second extracellular loop region and AspProTrpIle (Tyr / Phe) (Ile / Leu) in the seventh transmembrane region were used, respectively. .
[0036]
[Chemical 1]
5´-GG (A / G / C / T) AC (A / G / C / T) TGGTG (C / T) TT (C / T) (A / T) T-3´ and
5´-A (T / G) (A / G) (A / T) A (A / G / T) ATCCA (A / G / C / T) GG (A / G) TC-3´
[0037]
Amplification was performed 35 times at 95 ° C for 1 minute, 38 ° C for 1 minute and 70 ° C for 1 minute. The amplified cDNA fragment was subcloned into pBluescript SK II (+) (Stratagene) vector. As a result of sequencing the randomly picked clone, fragment PG25 contained a sequence having high homology with the fifth and sixth transmembrane regions of other prostanoid receptors.
[0038]
(2) Screening of mouse genomic library by hybridization Screening of 2 × 10 ⁵ clones in mouse genomic library, λFIXII (Stratagene) by plaque hybridization using PG25 fragment labeled with ³² P as a probe did. Hybridization was performed using 6 × SSC (900 mM NaCl, 90 mM buffer) containing 5 × Denhardt's solution (0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone and 0.1% bovine serum albumin) and 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate). The solution was washed for 15 hours at 58 ° C. in sodium acid). After hybridization, the filter was washed twice with 0.2 × SSC containing 1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes. Four positive clones were isolated. The insert of the longest clone was 13 kb. By Southern blot hybridization, two XbaI fragments (3.3 kbp and 6 kbp) were found to hybridize to the probe. Each of these fragments was subcloned and the nucleotide sequence was determined. The nucleotide sequence of the nucleic acid was determined by the dideoxy chain termination method.
[0039]
(3) Construction of open reading frame From (1) and (2) above, it was found that PG25 spans two exons. Therefore, in order to obtain 5 ′ upstream and 3 ′ downstream sequences of PG25, PCR was performed from a mouse lung-derived cDNA library (manufactured by Clontech) using the following oligonucleotides.
[0040]
[Chemical formula 2]
5´-GGAGTGCTGGCTGTCTCT-3´ and
5´-CTTCAGTGCTGATCCCTC-3´
[0041]
Amplification was performed 35 times at 95 ° C for 1 minute, 38 ° C for 1 minute and 70 ° C for 1 minute. The amplified cDNA fragment was subcloned into pBluescript SK II (+) (Stratagene) vector, and the nucleotide sequence was determined. The obtained clone (PGc1) was composed of 824 bp and was found to correspond to an exon of a genomic clone. PGc1 was digested with NarI, and the 3 ′ portion of the digested fragment was ligated to the PstI-NarI fragment of the genomic clone to construct a 1.2 kbp fragment, PGc9. The relationship between genomic clones, RT-PCR products, PG25, PGc1 and PGc9 is shown in FIG. 1 (open reading frames are shown with diagonal lines). In this way, a clone corresponding to the full-length cDNA was obtained. The full-length base sequence is shown in SEQ ID NO: 3, and the open reading frame base sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Furthermore, the amino acid sequence deduced from the open reading frame is shown in SEQ ID NO: 1.
[0042]
Example 2: Expression of mouse PGD receptor by CHO cells and binding assay with various ligands Mouse dihydrofolate reductase (dhfr) gene (Biochem. Biophys. Res. Commun., 164 , 39 (1989)) was used as a selection marker. PGc9 was subcloned into a eukaryotic cell expression vector, pdKCR-dhfr, and the resulting plasmid DNA, pdKCR-dhfr-PGc9, was obtained according to the method described in J. Biol. Chem., 267 , 2437 (1992). CHO cells lacking folate reductase activity (CHO-dhfr ⁻ ) (described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 , 4216 (1980)) were transformed. A cell group expressing dihydrofolate reductase was selected by culturing in an α-MEM (−) medium (manufactured by Cell Culture Laboratories) containing 10% dialyzed fetal bovine serum. Several clones were isolated that showed specific [ ³ H] PGD2 binding activity. One of those clones, CHO-J, was subjected to the following experiment.
[0043]
CHO-J cells were cultured in α-MEM (−) medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin and streptomycin, then washed once with phosphate buffer saline, collected from the culture plate, and then at 800 × g. Centrifugation for 15 minutes was allowed to settle. The obtained cell pellet was mixed with 10 times the amount of homogenate buffer (25 mM HEPES / NaOH (pH 7.4), 1 mM EDTA, 5 mM MgCl ₂ , 250 mM d-mannitol, 2 mM β-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM. (Consisting of benzamidine hydrochloride) and sonicated and homogenized. The resulting homogenate was incubated with 10 nM [ ³ H] PGD ₂ for 60 minutes at 4 ° C. in the presence or absence of each unlabeled ligand. After incubation, the reaction was stopped by adding ice-cold washing buffer (consisting of 25 mM HEPES · NaOH (pH 7.4), 1 mM EDTA, 5 mM MgCl ₂ , 140 mM NaCl, 5 mM KCl), and the Whatman GF / C. Filtered with a glass fiber filter. The filter was washed 4 times with ice-cold washing buffer, and then the radioactivity on the filter was measured with a liquid scintillation counter. The non-specific binding was defined as the radioactivity bound to the filter when 200 times or more of unlabeled PGD ₂ was present.
[0044]
As a result of this assay, it was found that [ ³ H] PGD ₂ which is a ligand for the PGD2 receptor specifically binds to the cell membrane of CHO cells expressing PGc9. The result of Scatchard analysis of this binding is shown in FIG. Furthermore, the inhibitory activity of various prostanoids on the specific binding of [ ³ H] PGD2 is shown in FIG. Binding inhibition by various prostanoids was PGD ₂ >> BW245C = BWA868C >> STA ₂ and did not bind to Iloprost, PGE ₂ and PGF _2α .
[0045]
[Sequence Listing]
SEQ ID NO: 1
Sequence length: 357
Sequence type: Amino acid Topology: Linear sequence type: Protein

[0046]
SEQ ID NO: 2
Sequence length: 1071
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: cDNA to mRNA

[0047]
SEQ ID NO: 3
Sequence length: 1240
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: cDNA to mRNA

[0048]
SEQ ID NO: 4
Sequence length: 1240
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: cDNA to mRNA
Origin organism name: mouse
Tissue type: Lung sequence feature symbol: CDP
Location: 37..1110
Method for determining characteristics: P

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the relationship among genomic clones, RT-PCR products, PG25, PGc1 and PGc9. Open reading frames are shown with diagonal lines.
FIG. 2 is a graph showing the inhibitory activity of various ligands on the binding of [ ³ H] PGD ₂ to cell membranes transfected with PGc9. The figure in the figure shows the result of Scatchard analysis of [ ³ H] PGD ₂ .

Claims

A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a polypeptide comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising PGD and A polypeptide having an action of specifically binding.

The polypeptide according to claim 1, which consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

The polypeptide comprising a sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, added or inserted, and has a function of specifically binding to PGD. Polypeptide.

The polypeptide according to claim 3, which is a polypeptide comprising a sequence in which one amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is deleted, substituted, added or inserted, and which specifically binds to PGD. .

A DNA containing a DNA having a base sequence encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 4.

The DNA according to claim 5, which has the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.

The DNA according to claim 5, which has the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.

A replication or expression vector comprising the DNA according to any one of claims 5 to 7.

A host cell transformed with the replication or expression vector of claim 8.

A method for producing the polypeptide, comprising culturing the host cell according to claim 9 under conditions for expressing the polypeptide according to any one of claims 1 to 4.

A monoclonal antibody or a polyclonal antibody against the polypeptide according to any one of claims 1 to 4.

The method for quantifying a polypeptide according to any one of claims 1 to 4, wherein the antibody according to claim 11 is used.