JP3686482B2 - ヘモグロビンａ１ｃの管理試料 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビンＡ1Cの凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させたヘモグロビンＡ1C の管理試料に関する技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のヘモグロビンは、α鎖Ｎ末端のアミノ酸のバリンのアミノ基とグルコースのアルデヒド基の間の非酵素的な反応によりグルコースと結合する。この結合の第一段階は、可逆的なシッフ塩基反応であるが、さらにアマドリ転移反応を経て不可逆的なケトアミンを形成する。このようにして生成するヘモグロビンとグルコースの結合物は、ヘモグロビンＡ1C（以下、ＨｂＡ1Cともいう）として知られている。
ヘモグロビンの血液中での寿命は約３ヵ月であり、その間グルコースと結合して生成するＨｂＡ1Cが徐々に蓄積するが、その一方で寿命が尽きたＨｂＡ1Cは逐次分解されていく。すなわち、ある時点で血液中に存在しているＨｂＡ1Cの濃度は、その時点からヘモグロビンの寿命のおよそ半分の１〜２ヵ月程遡った過去の血液中のグルコース濃度、すなわち血糖濃度を平均的に反映するものである。
【０００３】
このような特徴を有するＨｂＡ1Cは、一般的な糖尿病の指標である血糖濃度等のように一時的な変動が無く過去の血糖状態を正確に把握できる。そのため、血中のＨｂＡ1C濃度は糖尿病患者の血糖コントロール指標として、今日重要である。
ＨｂＡ1Cの定量法には、イオン交換カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという），ｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体を用いたアフィニティーカラム法，，ラテックス凝集法，免疫比濁法，等電点電気泳動法，フィチン酸法，チオバルビツール酸法等があるが、感度，特異性，再現性に優れており、また専用の簡便な自動分析機が普及したこともあって、ＨＰＬＣ法が臨床検査においては標準的な測定法となっている。
【０００４】
ここで問題となるのは、ＨｂＡ1C測定における標準としたり、また測定機器や施設間、あるいはデータの継続性等の精度管理の基準として使用する「管理試料」を得ることである。ＨｂＡ1C管理試料の製造方法についてはいくつかの検討例がある。例えば、赤血球の溶血液に保存料を添加して製造する方法（東独特許第１５０５４３号，米国特許第３５１９５７２号，英国特許第９３４４６１号）、シアンメトヘモグロビン，オキシヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合物，一酸化炭素ヘモグロビンを用いて製造する方法〔ドイツ特許第３３１１４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1985)”〕、Ｎ−〔５−ニトロトロポン−２−イル〕ヘモグロビンとヘモグロビンとの混合物からなるもの（特公昭６３−１９８２８号公報）、ポリヒドロキシ化合物により全血から得られる溶血液を脱脂する方法（特開昭５８−３７５６１号公報）、シアンメトヘモグロビンに変換し凍結乾燥する方法（特開昭５９−１８３３７０号公報）、ＨｂＡ1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンより製造する方法（特開平３−２２０４５７号公報）、ヘモグロビンを一酸化炭素ヘモグロビン，アザイドメトヘモグロビン又はシアンメトヘモグロビンに変換した状態でインビトロでグルコースとヘモグロビンとを結合させた後，不安定なシッフ塩基結合のものを還元剤により分解し，安定なＨｂＡ1Cを回収して製造する方法（特表平６−５０８６９０号公報）等を挙げることができる。
なお、現在Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の製品〔Bio-Rad Laboratories. Hemoglobin A1cMicro Column test Instruction Manual. March 1990〕をはじめとして、いくつかの製品が市販されているが、これらの製品の製法は明らかにされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このＨｂＡ1Cの管理試料においては、実際の検体である新鮮血液と分析時の挙動が同等であることが必要である。
何故なら、ヘモグロビンは、時間，温度等の負荷によって、主に酸化による変性を起こし、酸化されたヘモグロビンであるメトヘモグロビンと、酸化していないヘモグロビンであるオキシヘモグロビンとは、その電荷が異なるからである。
【０００６】
ＨｂＡ1Cの主流である上記のイオン交換ＨＰＬＣ法は、ＨｂＡ1Cをその他のヘモグロビンとの電荷の差により分離するものであるが、上述のように酸化されたヘモグロビン（酸化されたＨｂＡ1Cを含む）が混合すると、クトマトグラムの分離パターンが乱れ、非常に鋭敏なＨＰＬＣにおいては、新鮮血液本来のものとはかなり異なるものとなる。
よって、ＨｂＡ1Cの管理試料としては、個々のロットが長期に継続することが要求される。また、この管理試料が凍結乾燥品の場合には、凍結乾燥時の安定性のみならず、使用時に精製水等を加え溶解し復元した後の安定性も要求される。
【０００７】
なお、このＨｂＡ1Cの管理試料に要求される安定性を満たす従来の手段としては、例えば▲１▼始めから全成分をメトヘモグロビンとして、ヘモグロビンをそれ以上酸化変性する余地をなくし、全成分中での電荷の差を、ＨｂＡ1Cとその他のヘモグロビンとの間のものだけとし、ＨｂＡ1Cとその他のヘモグロビンとの分離を明確にする方法；▲２▼一酸化炭素と２価の状態のヘム鉄との結合が酸素のほぼ数万倍は強いことに着目し、全成分を一酸化炭素ヘモグロビンとして、ヘム鉄が３価に変わるヘモグロビンの酸化を防ぐ方法〔▲１▼▲２▼に該当する先行技術文献としては、前出のドイツ特許第３３１１４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1985)”；特開昭５９−１８３３７０号公報；特表平６−５０８６９０号公報〕等を挙げることができる。
【０００８】
しかしながら、これらの方法における問題点として、全体がメトヘモグロビンの場合は、ＨＰＬＣ法の分離パターンが新鮮血液と同一であっても全体的にリテンションタイムが新鮮血液のリテンションタイムから外れるために、新鮮血液のための機器調整等に必ずしも適合するものではなく、メト化したＨｂＡ1Cのリテンションタイムに基づき機器の調整をした場合、新鮮血液の本来のＨｂＡ1CのピークをＨｂＡ1Cのものとして機器が識別することができないという点が挙げられる。また、新鮮血液のＨｂＡ1Cのピークに異常が現れるようなＨＰＬＣのカラムの劣化等の異常がある場合に、メトヘモグロビンの管理試料ではこのような異常をモニターすることができないという点も挙げることができる（▲１▼）。
そして、一酸化炭素ヘモグロビンを用いる場合においても、次の製造工程において、グルコースと反応させるために加温したりした場合には、完全に変性を防ぐことはできない（▲２▼）。
【０００９】
さらに、上記に例示した方法の他に、電荷がＨｂＡ1Cと等しく、ＨＰＬＣ法において、ＨｂＡ1Cと同じ位置にピークを示すため、ＨｂＡ1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンを用いる方法も挙げられるが、この場合のＨＰＬＣのクロマトグラムのパターンもまたＨｂＡ1Cと同一とはいえない。
すなわち、これらの従来のいずれの方法によって製造されたＨｂＡ1C管理試料も、ＨｂＡ1C測定の主流である上記のＨＰＬＣ法に適しているとはいえない。
【００１０】
そこで、本発明の解決すべき課題は、長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ1Cの管理試料を提供する手段を見出すことにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、通常検体の安定剤としてサッカロースをＨｂＡ1Cと共存させることにより、ＨｂＡ1Cの安定性，特に凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させることができることを見出し本発明を完成した。
【００１２】
また、このサッカロースと共存させる、糖尿病診断に特に有用なＨｂＡ1Cの調製方法として、ｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトクロマトグラム担体を用いた特定の手段を用いることで、極めて優れたＨｂＡ1Cの管理試料を提供し得ることを見出して本発明を完成した。
すなわち本発明者は、以下の発明を提供する。
【００１３】
請求項１において、ヘモグロビンＡ1C及びサッカロースを含んでなるヘモグロビンＡ1C組成物の管理試料を提供する。
【００１４】
請求項２において、ヘモグロビンＡ1Cが、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得られるヘモグロビンＡ1Cである前記請求項１記載の管理試料を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
Ａ．本発明ヘモグロビンＡ1C 管理試料（以下、本発明試料ともいう）は、ＨｂＡ1Cとサッカロースとを含んでなる。本発明試料中におけるＨｂＡ1Cの形態は、特に限定されない。すなわち、新鮮血中のＨｂＡ1Cをそのまま用いることもできるし、上記のように、メトヘモグロビンとグルコースとが結合したＨｂＡ1C等も許容され、一酸化炭素結合ヘモグロビンとグルコースとが結合したＨｂＡ1Cも許容され、ＨｂＡ1Cの代用物質、例えばアセチル化ヘモグロビン等も許容される。
【００１６】
しかしながら、可能な限り生体内のＨｂＡ1Cの状態を反映させたＨＰＬＣクロマトグラムを得ることが検査の信頼性を向上させる上で好ましいことを考慮すると、新鮮血中のＨｂＡ1Cをそのまま用いることが好ましい。
【００１７】
そして、この新鮮血中のＨｂＡ1Cを得る手段は特に限定されるものではなく、公知のＨｂＡ1Cの入手手段を用いることができる。すなわち、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法；イオン交換カラムで分離して得る方法；電気泳動で分離して得る方法等を挙げることができる。
【００１８】
これらのＨｂＡ1Cの入手法のうちでも、特に前述したＨｂＡ1Cの管理試料を得る場合には、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法を選択することが好ましい。
このＨｂＡ1Cの調製方法については、後述する。
【００１９】
本発明試料中に上記ＨｂＡ1Cと共に配合するサッカロースは、総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部以上，同１０重量部以下の範囲で配合される。総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部未満では所望するＨｂＡ1Cの安定効果が十分に発揮されずに好ましくなく、同１０重量部を越えて配合すると凍結乾燥の際、余剰のサッカロースに対する結合水が気化せずバイアルに水分が残留し、好ましくない。
【００２０】
また、好適なサッカロースの配合量は、総ヘモグロビンの濃度によって異なる。具体的には、総ヘモグロビン濃度が通常の検体程度，すなわち１０〜１５g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対して１重量部程度が適当であり、総ヘモグロビン濃度がさらに希薄な場合，すなわち１．０g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対して５重量部程度が適当である。
【００２１】
このように、ＨｂＡ1Cとサッカロースを組み合わせて配合することにより、ＨｂＡ1Cの安定性、特に凍結乾燥後のＨｂＡ1Cの安定性を飛躍的に向上させることができる。
【００２２】
なお、本発明試料中には、上記必須成分の他に、ヘモグロビンの酸化防止等を目的として、本発明の所期の効果を損なわない範囲で他の任意成分を配合することが可能である。例えば、アスコルビン酸，三リン酸塩，カテキン，亜硫酸ナトリウム，亜硫酸水素ナトリウム，硫酸第一鉄，グルタチオン等を本発明試料中に配合することができる。
【００２３】
なお、本発明試料の所期の経時的安定効果を発揮させる最も好適な形態は、凍結乾燥品としての形態であるが、この凍結乾燥品の調製に際しては通常公知の方法を採ることができる。
【００２４】
例えば、−３０℃〜−４０℃で試料を凍結し、減圧し、棚温−２０℃〜４℃で５〜１００時間程度乾燥することにより所望する凍結乾燥製剤を得ることができる。なお、本発明においては、特に本発明試料中のサッカロースを乾燥させるために、９０〜１００時間程度乾燥させることが好ましい。
【００２５】
このように調製した本発明試料は、格段に経時的な安定性に優れており、後述するごとくＨｂＡ1Cの管理試料として特に優れた組成物である。また、その特性を生かして、本発明はＨｂＡ1Cの検出を目的とする検体試料にも適用することができる。すなわち、ＨｂＡ1Cの検出を目的とする後述する溶血処理を施した血液検体に、上記の配合割合でサッカロースを添加することによって、従来のＨｂＡ1Cの検出を目的とする血液検体よりも保存性が格段に向上した本発明試料としての血液検体を得ることができる。なお、この本発明試料としての血液検体は、上記の管理試料と同様の凍結乾燥品としての形態を採ることも可能であるが、凍結乾燥処理を省略した液状形態や乾燥処理を省略した凍結形態としての形態を採ることも可能である。
【００２６】
Ｂ．本発明試料を構成するＨｂＡ1Cの最も好ましい調製方法は、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法である。特に、ＨｂＡ1Cの管理試料の製造を前提とする場合には、この手段を選択することが特に有効である。
【００２７】
これは、以下に掲げる理由による。
▲１▼従来のＨｂＡ1Cの管理試料は、一般的にそのレベル調製の際に問題がある。特に、高いＨｂＡ1Cレベルを得る必要性がある場合に問題がある。
すなわち、ＨｂＡ1Cのレベルの正常値は、ヘモグロビン全量に対して４．０〜５．８重量％程度であるが、糖尿病の発病に伴い生体の血糖コントロールが悪化するとこれより高値となり、同１０重量％を越える場合もある。これに対応して臨床検査用のＨｂＡ1Cの管理試料としてのふさわしいレベルとしては、低値用でヘモグロビン全量に対して４．０〜５．０重量％程度であり、高値用としては、同１０〜１５重量％程度である。
【００２８】
どのような手段を採るにしても、ＨｂＡ1Cの原材料は、人血をはじめとする哺乳動物の新鮮血なのであるから、新鮮血中のある程度のＨｂＡ1C量のばらつきは避けることができない。特に、高値用の管理試料を製造する場合にはＨｂＡ1C量が高値である糖尿病患者の血液を用いる必要があり、これの確保には非常な困難を伴うのが常である。また、インビトロでヘモグロビンとグルコースを人為的に結合させるためには、時間とある程度の温度が必要になり、前述のようなヘモグロビンの変性を伴うことは避けがたいことである。
【００２９】
この点において、上記の担体捕捉法を用いることにより、健常人の新鮮血を原材料として、ヘモグロビンを変性させずにＨｂＡ1Cを高値に加工することが容易である。
【００３０】
▲２▼検体のヘモグロビン濃度に応じた管理試料が必要である。
すなわち、ＨｂＡ1C量の測定においては、検体として全血又は沈降赤血球を用い、ここから得られるヘモグロビン溶液の全ヘモグロビン中におけるＨｂＡ1Cの相対量（％）として測定される。この検体は通常全ヘモグロビン濃度を希釈するが、この希釈倍率がそれぞれの測定法毎に大きく異なる。従って、ＨｂＡ1Cの管理試料は、相対的にＨｂＡ1Cが高濃度で存在しても低濃度で存在しても、少なくともあらゆる測定法に対応できるだけの濃度、具体的には１．０g/dl以上の濃度であることが理想的である。
【００３１】
上記の担体捕捉法は、ＨｂＡ1Cの高値成分の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、アフィニティカラムがＨｂＡ1Cを特異的に吸着する。そのために、ＨｂＡ1Cとそれ以外のヘモグロビンとを両者の溶出速度の差を用いて分離する必要がなく、単にＨｂＡ1C以外のヘモグロビンを溶出液で押し出すことのみにより両者を分離することができる。すなわち、上記の担体捕捉法においては、イオン交換樹脂等による分離の場合に比べて、ＨｂＡ1Cとそれ以外のヘモグロビンとを分離する際に用いる溶出液量を格段に節約することが可能になるため、結果としてＨｂＡ1Cの高値成分の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、試料における総ヘモグロビン濃度を１．０g/dl以上の濃度とすることができる。
【００３２】
上記の担体捕捉法において用いる血液試料は、通常溶血試料を用いる。この溶血試料の調製工程は、常法に従い行われる。すなわち、採取した新鮮血液から分離した赤血球の細胞膜を破壊することにより行うことができる。この破壊手段は、例えば激しく振盪して細胞膜を破壊する振盪法，超音波で細胞膜を破壊する超音波法，低張溶液中で細胞膜を破壊する浸透圧法，界面活性剤で膜を溶解する方法等通常公知の破壊手段を用いることが可能である。通常この溶血を行った後、破断した赤血球膜脂質等を脱脂処理等の手段により除去する。
【００３３】
なお、この赤血球の細胞膜の破壊に先立ち、予め赤血球を十分に洗浄して遊離のグルコースを除去し、Labile ＨｂＡ1C（シッフ塩基結合の段階のグルコースとヘモグロビンとの結合物、可逆性がある）を分解しておくことが好ましい。
このようにして、通常は１０g/dl以上のヘモグロビン濃度の精製溶血液を得ることができる。
【００３４】
次に、上記血液試料（精製溶血液）をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉処理を行い、この担体に捕捉されたＨｂＡ1Cを選択的に分離する。
ｍ−アミノフェニルボロン酸は、シスジオール基と結合する性質を有するために、このｍ−アミノフェニルボロン酸をアガロースやポリアクリルアミド等の担体にリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラフィーにかけることにより、全ヘモグロビンの中から、シスジオール基を有するグルコースと結合しているＨｂＡ1Cを選択的に捕捉して分離することができる。
【００３５】
上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を担体に固定するためのスペーサーは、通常公知のものを用いることが可能であり、例えばＮＨ2(ＣＨ2)nＣＯＯＨ等をスペーサーとして用いることができる。
なお、このようなスペーサーを用いずに活性化したアガロースにｍ−アミノフェニルボロン酸を結合させることも可能である。
【００３６】
また、ｍ−アミノフェニルボロン酸は、ＨｂＡ1Cを特異的に捕捉することができるリガンドとして最も好ましいものであるが、この他の（オルト）ほう酸基を有する物質や抗ＨｂＡ1C抗体等のＨｂＡ1Cを特異的に吸着することができる物質をリガンドとすることができる。
【００３７】
このｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体は、通常公知の方法を組み合わせて調製することも可能であるが、市販品を用いることも可能である。例えばシグマ社からｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体が市販されている。
【００３８】
さらに、コンディショニングしたｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に、上記血液試料を仕込み、この担体に選択的に捕捉されたＨｂＡ1Cを個別的に溶出させて分離することができる。
【００３９】
この工程では、先ず担体に吸着するＨｂＡ1Cが変性しない条件（２〜８℃程度の低温及び遮光条件下）で、十分な時間をかけて血液試料中のＨｂＡ1Cを担体に吸着させる。
このような条件で、選択的に担体に吸着させたＨｂＡ1Cを溶出させて所望するＨｂＡ1Cを得ることができる。
【００４０】
この溶出の際の溶出液は、通常ＨｂＡ1Cと同じくシスジオール基を有する成分，例えばソルビトール等を含むものを用いる。
なお、上記のＨｂＡ1Cの選択的な吸着−溶出工程において、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に仕込む際に、過剰量の血液試料を仕込むことで、所望する濃度でＨｂＡ1Cを含む管理試料を容易に調製することができる。
【００４１】
すなわち、過剰の血液試料を仕込んで、ゲルベットの部分に残っている血液試料を低値用管理試料と高値用管理試料とに分別して、原料ヒト健常者血液のままのＨｂＡ1C濃度の精製溶血液と両者の試料とを任意の比率で混合することにより所望するＨｂＡ1C濃度の管理試料を調製することができる。
【００４２】
低値用管理試料については、例えばゲルベットの部分に残っているが担体に吸着されていない血液試料を、ＨｂＡ1Cと担体との吸着状態を保持できる溶液で溶出させて、これを低値用管理試料として用いることができる（この血液試料は、血液試料中に存在する本来の濃度のＨｂＡ1Cの一部分が担体に吸着されているので、ＨｂＡ1Cの存在量が血液試料本来のものよりも低濃度となる。）。
また、高値用管理試料は、例えば前記のように担体に選択的に吸着されたＨｂＡ1Cを溶出させることにより得ることができる。
【００４３】
なお、このようにして得たＨｂＡ1Cが高値と低値の溶液を透析にかけることにより、前記したＨｂＡ1Cの安定剤であるサッカロースを添加して試料を凍結乾燥にかける際の水分の蒸発を妨げるマグネシウムイオンやソルビトール等の成分を除去することが好ましい（なお、この透析における希釈を考慮して、透析試料をさらに濃縮することが好ましい）。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例等によりさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこの実施例等により限定されるものではない。
【００４５】
〔製造例〕本発明試料の製造
（１）溶血液の調製４５０mlの健常人のヒト全血を、５０ml容遠沈管に約４５mlずつ分注し、遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、上清の血漿，血小板，白血球を除去して赤血球を分離した。この分離した赤血球に３／２容量の生理食塩水を加えて混合し、これを再び遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、生理食塩水を除去した。この生理食塩水による洗浄操作を８回繰り返した（８回目の遠心時間は１０分間）。このようにして、洗浄赤血球２００mlを調製した。得られた洗浄赤血球に等量の氷冷した精製水を加え、激しく振盪して赤血球を溶血させて溶血液４００mlを調製した。
【００４６】
次に、上記の溶血液に対して、１／４容量のトルエンを加えて激しく振盪し、遠心分離（１８００×ｇ，３０min ，４℃）にかけ、３層に分離したうちの下層部分を回収した。回収した画分を再び遠心分離（１８００×ｇ，１５min ，４℃）にかけ、上層に浮くか又は底に沈澱した不溶解物を除き、透明な部分のみを回収して、これを精製溶血液とした〔この精製溶血液のうち１５０mlを取り，安定剤（サッカロースの５０重量％水溶液）を，１６．７ml加え均一になるまで混合して、これを「原料血液そのままのＨｂＡ1C濃度の溶液」とした。
【００４７】
（２）ゲルの調製
内径５０mmのカラムに、ｍ−アミノフェニルボロン酸アガロースゲル（シグマ社製）を約２５０ml充填した。
ゲル調整液として水酸化ナトリウム０．０８重量％溶液を流速約５０ml／min で約１０００ml流した後、同じくゲル調整液として酢酸０．３重量％溶液を流速約５０ml／min で約１２５０ml流した。次いで、精製水を流速約５０ml／min で約２５００ml流した。なお、このゲルの調整工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。
【００４８】
このようにして調整したゲルに、平衡化液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要量），塩化ナトリウム（０．８７７重量％），塩化マグネシウム・６水塩（０．２０３重量％），精製水（残量）〕を流速約５０ml／min で約２５００ml流してゲルを平衡化した。なお、このゲルの平衡化工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。
【００４９】
（３）ＨｂＡ1Cのゲル吸着
上記（２）において平衡化したゲルに上記（１）で調製した精製溶血液を３０００ml混合し、垂直に立てたカラム内で２〜８℃で遮光し、１６〜２４時間静置した。
次に、ゲルベットの上に溜まった精製溶血液を駒込ピペットでカラム上から排出した。なお、この排出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。
【００５０】
（４）ＨｂＡ1C低値溶液の溶出
上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／min で１０００ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。
０．５g ／dlのヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそこの対照よりも濃い分画をビーカーにプールした。
【００５１】
（５）ＨｂＡ1C高値溶液の溶出
上記（４）に引続き、上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／min で１５００ml流した（この工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した）。なお、この工程の間に溶出した液は廃棄した。
【００５２】
次に、分離液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要量），Ｄ−ソルビトール（１．８２２重量％），精製水（残量）〕を流速約２５ml／min で１５００〜２０００ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。 ０．５g ／dlのヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそこの対照よりも特に濃い分画から約１００mlまでプールした。
【００５３】
（６）透析及び濃縮
上記（４）（５）により得られたＨｂＡ1C低値溶液及び同高値溶液をそれぞれ透析チューブに詰め（低値溶液約180 ml/ チューブ，高値溶液約100ml/ チューブ ）
、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約２時間スターラーで精製水を攪拌した〔低値溶液の精製水約２０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。この透析の終了後、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約１６時間静置した〔低値溶液の精製水約２０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。
【００５４】
上記透析工程の終了したそれぞれの透析チューブを、約５l の濃縮剤〔ポリエチレングリコール20000 の３０重量％水溶液〕に浸漬し、２〜８℃で遮光してスターラーで濃縮剤を攪拌した。
ＨｂＡ1C低値溶液の透析チューブは、約２時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これに１／９容量の安定剤（サッカロースの５０重量％水溶液）を加え、均一になるまで混合し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。
【００５５】
また、ＨｂＡ1C高値溶液の透析チューブは、約４時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これに１／９容量の上記安定剤を加え、均一になるまで混合し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。
【００５６】
（７）ＨｂＡ1C及び総ヘモグロビン量の濃度調製
前記（１）において調製した「原料血液そのままのＨｂＡ1C濃度の溶液」並びに前記（６）において調製した「ＨｂＡ1C低値溶液」及び「ＨｂＡ1C高値溶液」の総ヘモグロビン量をアザイドメトヘモグロビン法により定量し、次にＨｂＡ1C濃度をＨＰＬＣ法〔ＨＬＣ−７２３ＨｂIII 型ＨｂＨｂＡ1C自動分析機（東ソー社製）による〕により定量した。
【００５７】
次いで、「原料血液そのままのＨｂＡ1C濃度の溶液」と「ＨｂＡ1C低値溶液」又は「ＨｂＡ1C高値溶液」を混合して、それぞれ所望のＨｂＡ1C濃度に調整した上で、安定剤（サッカロースの５重量％水溶液）を加えて総ヘモグロビン濃度を１．０g/dlに合わせた。
【００５８】
（８）凍結乾燥
上記（７）で濃度調整した「ＨｂＡ1C低値溶液」及び「ＨｂＡ1C高値溶液」を１０ml容褐色バイアルに２mlずつ分注し、これらのバイアルを凍結乾燥機に入れ、制御運転〔第１段階：−２０℃・１０時間，第２段階：−２０℃・１０時間，第３段階：−４℃・１０時間，最終制御：４℃・６０〜７０時間；到達真空度：約１０mTorr 〕を行い、凍結乾燥品を得た。凍結乾燥が終了したそれぞれのバイアルに窒素を充填し、封栓しアルミシールを施した。このように、ＨｂＡ1Cの管理試料を得た。
【００５９】
〔試験例〕本発明試料の凍結乾燥前後における経時的安定性の検討
（１）本発明試料においてＨｂＡ1Cの安定剤として配合するサッカロースの凍結乾燥前後における経時的安定性を、他の糖類を配合した場合との比較において検討した。すなわち、予め凍結乾燥前の全ヘモグロビン量を１０g/dlに調整した各試料における全ヘモグロビン量中のＨｂＡ1C量を上記製造例（７）で示したと同様の方法で測定した。
【００６０】
次に、これらの各試料を上記製造例（８）に示したと同様の方法で凍結乾燥した後、これらの凍結乾燥品に精製水０．５mlを加えて、各試料における全ヘモグロビン量中のＨｂＡ1C量を上記と同じく測定した。
この結果を第１表に示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
この第１表において、糖類を添加しなかった試料は、凍結乾燥後は、この凍結乾燥操作自体によるヘモグロビンの変性が著しく、ＨＰＬＣ分析に耐えられないものとなった。
また、アルドース系単糖類であるＤ−キシロース又はＤ−アラビノースを添加した群は、凍結乾燥操作によるヘモグロビンの変性は抑制されたが、凍結乾燥中の反応により凍結乾燥前後でＨｂＡ1C値が大きく異なるものとなった。
【００６３】
この結果より、ＨｂＡ1Cの凍結乾燥における安定性を付与するための安定剤としては、アルドース単糖類は不適当であることが明らかになった。
なお、Ｄ−ガラクトース，Ｄ−マンニトール，ラクトースはヘモグロビン溶液における溶解度が低いのでこの試験系からは除外した。
【００６４】
（２）次に、この試験系で安定性に優れていたＤ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾燥後における経時的安定性を検討した。
すなわち、Ｄ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾燥直後におけるＨｂＡ1Cの安定性を、試料の凍結乾燥直後のＨｂＡ1C値と凍結乾燥後１ヵ月後（室温）のＨｂＡ1C値をＨＰＬＣ法により比較した。
この結果を第２表に示す。
【００６５】
【表２】
この結果、凍結乾燥後長期間経過時におけるＨｂＡ1Cを安定に保つためには、安定剤としてサッカロースを添加することが最適であることが明らかになった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ1C の管理試料が提供される。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビンＡ1Cの凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させたヘモグロビンＡ1C の管理試料に関する技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のヘモグロビンは、α鎖Ｎ末端のアミノ酸のバリンのアミノ基とグルコースのアルデヒド基の間の非酵素的な反応によりグルコースと結合する。この結合の第一段階は、可逆的なシッフ塩基反応であるが、さらにアマドリ転移反応を経て不可逆的なケトアミンを形成する。このようにして生成するヘモグロビンとグルコースの結合物は、ヘモグロビンＡ1C（以下、ＨｂＡ1Cともいう）として知られている。
ヘモグロビンの血液中での寿命は約３ヵ月であり、その間グルコースと結合して生成するＨｂＡ1Cが徐々に蓄積するが、その一方で寿命が尽きたＨｂＡ1Cは逐次分解されていく。すなわち、ある時点で血液中に存在しているＨｂＡ1Cの濃度は、その時点からヘモグロビンの寿命のおよそ半分の１〜２ヵ月程遡った過去の血液中のグルコース濃度、すなわち血糖濃度を平均的に反映するものである。
【０００３】
このような特徴を有するＨｂＡ1Cは、一般的な糖尿病の指標である血糖濃度等のように一時的な変動が無く過去の血糖状態を正確に把握できる。そのため、血中のＨｂＡ1C濃度は糖尿病患者の血糖コントロール指標として、今日重要である。
ＨｂＡ1Cの定量法には、イオン交換カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという），ｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体を用いたアフィニティーカラム法，，ラテックス凝集法，免疫比濁法，等電点電気泳動法，フィチン酸法，チオバルビツール酸法等があるが、感度，特異性，再現性に優れており、また専用の簡便な自動分析機が普及したこともあって、ＨＰＬＣ法が臨床検査においては標準的な測定法となっている。
【０００４】
ここで問題となるのは、ＨｂＡ1C測定における標準としたり、また測定機器や施設間、あるいはデータの継続性等の精度管理の基準として使用する「管理試料」を得ることである。ＨｂＡ1C管理試料の製造方法についてはいくつかの検討例がある。例えば、赤血球の溶血液に保存料を添加して製造する方法（東独特許第１５０５４３号，米国特許第３５１９５７２号，英国特許第９３４４６１号）、シアンメトヘモグロビン，オキシヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合物，一酸化炭素ヘモグロビンを用いて製造する方法〔ドイツ特許第３３１１４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1985)”〕、Ｎ−〔５−ニトロトロポン−２−イル〕ヘモグロビンとヘモグロビンとの混合物からなるもの（特公昭６３−１９８２８号公報）、ポリヒドロキシ化合物により全血から得られる溶血液を脱脂する方法（特開昭５８−３７５６１号公報）、シアンメトヘモグロビンに変換し凍結乾燥する方法（特開昭５９−１８３３７０号公報）、ＨｂＡ1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンより製造する方法（特開平３−２２０４５７号公報）、ヘモグロビンを一酸化炭素ヘモグロビン，アザイドメトヘモグロビン又はシアンメトヘモグロビンに変換した状態でインビトロでグルコースとヘモグロビンとを結合させた後，不安定なシッフ塩基結合のものを還元剤により分解し，安定なＨｂＡ1Cを回収して製造する方法（特表平６−５０８６９０号公報）等を挙げることができる。
なお、現在Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の製品〔Bio-Rad Laboratories. Hemoglobin A1cMicro Column test Instruction Manual. March 1990〕をはじめとして、いくつかの製品が市販されているが、これらの製品の製法は明らかにされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このＨｂＡ1Cの管理試料においては、実際の検体である新鮮血液と分析時の挙動が同等であることが必要である。
何故なら、ヘモグロビンは、時間，温度等の負荷によって、主に酸化による変性を起こし、酸化されたヘモグロビンであるメトヘモグロビンと、酸化していないヘモグロビンであるオキシヘモグロビンとは、その電荷が異なるからである。
【０００６】
ＨｂＡ1Cの主流である上記のイオン交換ＨＰＬＣ法は、ＨｂＡ1Cをその他のヘモグロビンとの電荷の差により分離するものであるが、上述のように酸化されたヘモグロビン（酸化されたＨｂＡ1Cを含む）が混合すると、クトマトグラムの分離パターンが乱れ、非常に鋭敏なＨＰＬＣにおいては、新鮮血液本来のものとはかなり異なるものとなる。
よって、ＨｂＡ1Cの管理試料としては、個々のロットが長期に継続することが要求される。また、この管理試料が凍結乾燥品の場合には、凍結乾燥時の安定性のみならず、使用時に精製水等を加え溶解し復元した後の安定性も要求される。
【０００７】
なお、このＨｂＡ1Cの管理試料に要求される安定性を満たす従来の手段としては、例えば▲１▼始めから全成分をメトヘモグロビンとして、ヘモグロビンをそれ以上酸化変性する余地をなくし、全成分中での電荷の差を、ＨｂＡ1Cとその他のヘモグロビンとの間のものだけとし、ＨｂＡ1Cとその他のヘモグロビンとの分離を明確にする方法；▲２▼一酸化炭素と２価の状態のヘム鉄との結合が酸素のほぼ数万倍は強いことに着目し、全成分を一酸化炭素ヘモグロビンとして、ヘム鉄が３価に変わるヘモグロビンの酸化を防ぐ方法〔▲１▼▲２▼に該当する先行技術文献としては、前出のドイツ特許第３３１１４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1985)”；特開昭５９−１８３３７０号公報；特表平６−５０８６９０号公報〕等を挙げることができる。
【０００８】
しかしながら、これらの方法における問題点として、全体がメトヘモグロビンの場合は、ＨＰＬＣ法の分離パターンが新鮮血液と同一であっても全体的にリテンションタイムが新鮮血液のリテンションタイムから外れるために、新鮮血液のための機器調整等に必ずしも適合するものではなく、メト化したＨｂＡ1Cのリテンションタイムに基づき機器の調整をした場合、新鮮血液の本来のＨｂＡ1CのピークをＨｂＡ1Cのものとして機器が識別することができないという点が挙げられる。また、新鮮血液のＨｂＡ1Cのピークに異常が現れるようなＨＰＬＣのカラムの劣化等の異常がある場合に、メトヘモグロビンの管理試料ではこのような異常をモニターすることができないという点も挙げることができる（▲１▼）。
そして、一酸化炭素ヘモグロビンを用いる場合においても、次の製造工程において、グルコースと反応させるために加温したりした場合には、完全に変性を防ぐことはできない（▲２▼）。
【０００９】
さらに、上記に例示した方法の他に、電荷がＨｂＡ1Cと等しく、ＨＰＬＣ法において、ＨｂＡ1Cと同じ位置にピークを示すため、ＨｂＡ1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンを用いる方法も挙げられるが、この場合のＨＰＬＣのクロマトグラムのパターンもまたＨｂＡ1Cと同一とはいえない。
すなわち、これらの従来のいずれの方法によって製造されたＨｂＡ1C管理試料も、ＨｂＡ1C測定の主流である上記のＨＰＬＣ法に適しているとはいえない。
【００１０】
そこで、本発明の解決すべき課題は、長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ1Cの管理試料を提供する手段を見出すことにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、通常検体の安定剤としてサッカロースをＨｂＡ1Cと共存させることにより、ＨｂＡ1Cの安定性，特に凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させることができることを見出し本発明を完成した。
【００１２】
また、このサッカロースと共存させる、糖尿病診断に特に有用なＨｂＡ1Cの調製方法として、ｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトクロマトグラム担体を用いた特定の手段を用いることで、極めて優れたＨｂＡ1Cの管理試料を提供し得ることを見出して本発明を完成した。
すなわち本発明者は、以下の発明を提供する。
【００１３】
請求項１において、ヘモグロビンＡ1C及びサッカロースを含んでなるヘモグロビンＡ1C組成物の管理試料を提供する。
【００１４】
請求項２において、ヘモグロビンＡ1Cが、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得られるヘモグロビンＡ1Cである前記請求項１記載の管理試料を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
Ａ．本発明ヘモグロビンＡ1C 管理試料（以下、本発明試料ともいう）は、ＨｂＡ1Cとサッカロースとを含んでなる。本発明試料中におけるＨｂＡ1Cの形態は、特に限定されない。すなわち、新鮮血中のＨｂＡ1Cをそのまま用いることもできるし、上記のように、メトヘモグロビンとグルコースとが結合したＨｂＡ1C等も許容され、一酸化炭素結合ヘモグロビンとグルコースとが結合したＨｂＡ1Cも許容され、ＨｂＡ1Cの代用物質、例えばアセチル化ヘモグロビン等も許容される。
【００１６】
しかしながら、可能な限り生体内のＨｂＡ1Cの状態を反映させたＨＰＬＣクロマトグラムを得ることが検査の信頼性を向上させる上で好ましいことを考慮すると、新鮮血中のＨｂＡ1Cをそのまま用いることが好ましい。
【００１７】
そして、この新鮮血中のＨｂＡ1Cを得る手段は特に限定されるものではなく、公知のＨｂＡ1Cの入手手段を用いることができる。すなわち、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法；イオン交換カラムで分離して得る方法；電気泳動で分離して得る方法等を挙げることができる。
【００１８】
これらのＨｂＡ1Cの入手法のうちでも、特に前述したＨｂＡ1Cの管理試料を得る場合には、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法を選択することが好ましい。
このＨｂＡ1Cの調製方法については、後述する。
【００１９】
本発明試料中に上記ＨｂＡ1Cと共に配合するサッカロースは、総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部以上，同１０重量部以下の範囲で配合される。総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部未満では所望するＨｂＡ1Cの安定効果が十分に発揮されずに好ましくなく、同１０重量部を越えて配合すると凍結乾燥の際、余剰のサッカロースに対する結合水が気化せずバイアルに水分が残留し、好ましくない。
【００２０】
また、好適なサッカロースの配合量は、総ヘモグロビンの濃度によって異なる。具体的には、総ヘモグロビン濃度が通常の検体程度，すなわち１０〜１５g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対して１重量部程度が適当であり、総ヘモグロビン濃度がさらに希薄な場合，すなわち１．０g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対して５重量部程度が適当である。
【００２１】
このように、ＨｂＡ1Cとサッカロースを組み合わせて配合することにより、ＨｂＡ1Cの安定性、特に凍結乾燥後のＨｂＡ1Cの安定性を飛躍的に向上させることができる。
【００２２】
なお、本発明試料中には、上記必須成分の他に、ヘモグロビンの酸化防止等を目的として、本発明の所期の効果を損なわない範囲で他の任意成分を配合することが可能である。例えば、アスコルビン酸，三リン酸塩，カテキン，亜硫酸ナトリウム，亜硫酸水素ナトリウム，硫酸第一鉄，グルタチオン等を本発明試料中に配合することができる。
【００２３】
なお、本発明試料の所期の経時的安定効果を発揮させる最も好適な形態は、凍結乾燥品としての形態であるが、この凍結乾燥品の調製に際しては通常公知の方法を採ることができる。
【００２４】
例えば、−３０℃〜−４０℃で試料を凍結し、減圧し、棚温−２０℃〜４℃で５〜１００時間程度乾燥することにより所望する凍結乾燥製剤を得ることができる。なお、本発明においては、特に本発明試料中のサッカロースを乾燥させるために、９０〜１００時間程度乾燥させることが好ましい。
【００２５】
このように調製した本発明試料は、格段に経時的な安定性に優れており、後述するごとくＨｂＡ1Cの管理試料として特に優れた組成物である。また、その特性を生かして、本発明はＨｂＡ1Cの検出を目的とする検体試料にも適用することができる。すなわち、ＨｂＡ1Cの検出を目的とする後述する溶血処理を施した血液検体に、上記の配合割合でサッカロースを添加することによって、従来のＨｂＡ1Cの検出を目的とする血液検体よりも保存性が格段に向上した本発明試料としての血液検体を得ることができる。なお、この本発明試料としての血液検体は、上記の管理試料と同様の凍結乾燥品としての形態を採ることも可能であるが、凍結乾燥処理を省略した液状形態や乾燥処理を省略した凍結形態としての形態を採ることも可能である。
【００２６】
Ｂ．本発明試料を構成するＨｂＡ1Cの最も好ましい調製方法は、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法である。特に、ＨｂＡ1Cの管理試料の製造を前提とする場合には、この手段を選択することが特に有効である。
【００２７】
これは、以下に掲げる理由による。
▲１▼従来のＨｂＡ1Cの管理試料は、一般的にそのレベル調製の際に問題がある。特に、高いＨｂＡ1Cレベルを得る必要性がある場合に問題がある。
すなわち、ＨｂＡ1Cのレベルの正常値は、ヘモグロビン全量に対して４．０〜５．８重量％程度であるが、糖尿病の発病に伴い生体の血糖コントロールが悪化するとこれより高値となり、同１０重量％を越える場合もある。これに対応して臨床検査用のＨｂＡ1Cの管理試料としてのふさわしいレベルとしては、低値用でヘモグロビン全量に対して４．０〜５．０重量％程度であり、高値用としては、同１０〜１５重量％程度である。
【００２８】
どのような手段を採るにしても、ＨｂＡ1Cの原材料は、人血をはじめとする哺乳動物の新鮮血なのであるから、新鮮血中のある程度のＨｂＡ1C量のばらつきは避けることができない。特に、高値用の管理試料を製造する場合にはＨｂＡ1C量が高値である糖尿病患者の血液を用いる必要があり、これの確保には非常な困難を伴うのが常である。また、インビトロでヘモグロビンとグルコースを人為的に結合させるためには、時間とある程度の温度が必要になり、前述のようなヘモグロビンの変性を伴うことは避けがたいことである。
【００２９】
この点において、上記の担体捕捉法を用いることにより、健常人の新鮮血を原材料として、ヘモグロビンを変性させずにＨｂＡ1Cを高値に加工することが容易である。
【００３０】
▲２▼検体のヘモグロビン濃度に応じた管理試料が必要である。
すなわち、ＨｂＡ1C量の測定においては、検体として全血又は沈降赤血球を用い、ここから得られるヘモグロビン溶液の全ヘモグロビン中におけるＨｂＡ1Cの相対量（％）として測定される。この検体は通常全ヘモグロビン濃度を希釈するが、この希釈倍率がそれぞれの測定法毎に大きく異なる。従って、ＨｂＡ1Cの管理試料は、相対的にＨｂＡ1Cが高濃度で存在しても低濃度で存在しても、少なくともあらゆる測定法に対応できるだけの濃度、具体的には１．０g/dl以上の濃度であることが理想的である。
【００３１】
上記の担体捕捉法は、ＨｂＡ1Cの高値成分の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、アフィニティカラムがＨｂＡ1Cを特異的に吸着する。そのために、ＨｂＡ1Cとそれ以外のヘモグロビンとを両者の溶出速度の差を用いて分離する必要がなく、単にＨｂＡ1C以外のヘモグロビンを溶出液で押し出すことのみにより両者を分離することができる。すなわち、上記の担体捕捉法においては、イオン交換樹脂等による分離の場合に比べて、ＨｂＡ1Cとそれ以外のヘモグロビンとを分離する際に用いる溶出液量を格段に節約することが可能になるため、結果としてＨｂＡ1Cの高値成分の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、試料における総ヘモグロビン濃度を１．０g/dl以上の濃度とすることができる。
【００３２】
上記の担体捕捉法において用いる血液試料は、通常溶血試料を用いる。この溶血試料の調製工程は、常法に従い行われる。すなわち、採取した新鮮血液から分離した赤血球の細胞膜を破壊することにより行うことができる。この破壊手段は、例えば激しく振盪して細胞膜を破壊する振盪法，超音波で細胞膜を破壊する超音波法，低張溶液中で細胞膜を破壊する浸透圧法，界面活性剤で膜を溶解する方法等通常公知の破壊手段を用いることが可能である。通常この溶血を行った後、破断した赤血球膜脂質等を脱脂処理等の手段により除去する。
【００３３】
なお、この赤血球の細胞膜の破壊に先立ち、予め赤血球を十分に洗浄して遊離のグルコースを除去し、Labile ＨｂＡ1C（シッフ塩基結合の段階のグルコースとヘモグロビンとの結合物、可逆性がある）を分解しておくことが好ましい。
このようにして、通常は１０g/dl以上のヘモグロビン濃度の精製溶血液を得ることができる。
【００３４】
次に、上記血液試料（精製溶血液）をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉処理を行い、この担体に捕捉されたＨｂＡ1Cを選択的に分離する。
ｍ−アミノフェニルボロン酸は、シスジオール基と結合する性質を有するために、このｍ−アミノフェニルボロン酸をアガロースやポリアクリルアミド等の担体にリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラフィーにかけることにより、全ヘモグロビンの中から、シスジオール基を有するグルコースと結合しているＨｂＡ1Cを選択的に捕捉して分離することができる。
【００３５】
上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を担体に固定するためのスペーサーは、通常公知のものを用いることが可能であり、例えばＮＨ2(ＣＨ2)nＣＯＯＨ等をスペーサーとして用いることができる。
なお、このようなスペーサーを用いずに活性化したアガロースにｍ−アミノフェニルボロン酸を結合させることも可能である。
【００３６】
また、ｍ−アミノフェニルボロン酸は、ＨｂＡ1Cを特異的に捕捉することができるリガンドとして最も好ましいものであるが、この他の（オルト）ほう酸基を有する物質や抗ＨｂＡ1C抗体等のＨｂＡ1Cを特異的に吸着することができる物質をリガンドとすることができる。
【００３７】
このｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体は、通常公知の方法を組み合わせて調製することも可能であるが、市販品を用いることも可能である。例えばシグマ社からｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体が市販されている。
【００３８】
さらに、コンディショニングしたｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に、上記血液試料を仕込み、この担体に選択的に捕捉されたＨｂＡ1Cを個別的に溶出させて分離することができる。
【００３９】
この工程では、先ず担体に吸着するＨｂＡ1Cが変性しない条件（２〜８℃程度の低温及び遮光条件下）で、十分な時間をかけて血液試料中のＨｂＡ1Cを担体に吸着させる。
このような条件で、選択的に担体に吸着させたＨｂＡ1Cを溶出させて所望するＨｂＡ1Cを得ることができる。
【００４０】
この溶出の際の溶出液は、通常ＨｂＡ1Cと同じくシスジオール基を有する成分，例えばソルビトール等を含むものを用いる。
なお、上記のＨｂＡ1Cの選択的な吸着−溶出工程において、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に仕込む際に、過剰量の血液試料を仕込むことで、所望する濃度でＨｂＡ1Cを含む管理試料を容易に調製することができる。
【００４１】
すなわち、過剰の血液試料を仕込んで、ゲルベットの部分に残っている血液試料を低値用管理試料と高値用管理試料とに分別して、原料ヒト健常者血液のままのＨｂＡ1C濃度の精製溶血液と両者の試料とを任意の比率で混合することにより所望するＨｂＡ1C濃度の管理試料を調製することができる。
【００４２】
低値用管理試料については、例えばゲルベットの部分に残っているが担体に吸着されていない血液試料を、ＨｂＡ1Cと担体との吸着状態を保持できる溶液で溶出させて、これを低値用管理試料として用いることができる（この血液試料は、血液試料中に存在する本来の濃度のＨｂＡ1Cの一部分が担体に吸着されているので、ＨｂＡ1Cの存在量が血液試料本来のものよりも低濃度となる。）。
また、高値用管理試料は、例えば前記のように担体に選択的に吸着されたＨｂＡ1Cを溶出させることにより得ることができる。
【００４３】
なお、このようにして得たＨｂＡ1Cが高値と低値の溶液を透析にかけることにより、前記したＨｂＡ1Cの安定剤であるサッカロースを添加して試料を凍結乾燥にかける際の水分の蒸発を妨げるマグネシウムイオンやソルビトール等の成分を除去することが好ましい（なお、この透析における希釈を考慮して、透析試料をさらに濃縮することが好ましい）。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例等によりさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこの実施例等により限定されるものではない。
【００４５】
〔製造例〕本発明試料の製造
（１）溶血液の調製４５０mlの健常人のヒト全血を、５０ml容遠沈管に約４５mlずつ分注し、遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、上清の血漿，血小板，白血球を除去して赤血球を分離した。この分離した赤血球に３／２容量の生理食塩水を加えて混合し、これを再び遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、生理食塩水を除去した。この生理食塩水による洗浄操作を８回繰り返した（８回目の遠心時間は１０分間）。このようにして、洗浄赤血球２００mlを調製した。得られた洗浄赤血球に等量の氷冷した精製水を加え、激しく振盪して赤血球を溶血させて溶血液４００mlを調製した。
【００４６】
次に、上記の溶血液に対して、１／４容量のトルエンを加えて激しく振盪し、遠心分離（１８００×ｇ，３０min ，４℃）にかけ、３層に分離したうちの下層部分を回収した。回収した画分を再び遠心分離（１８００×ｇ，１５min ，４℃）にかけ、上層に浮くか又は底に沈澱した不溶解物を除き、透明な部分のみを回収して、これを精製溶血液とした〔この精製溶血液のうち１５０mlを取り，安定剤（サッカロースの５０重量％水溶液）を，１６．７ml加え均一になるまで混合して、これを「原料血液そのままのＨｂＡ1C濃度の溶液」とした。
【００４７】
（２）ゲルの調製
内径５０mmのカラムに、ｍ−アミノフェニルボロン酸アガロースゲル（シグマ社製）を約２５０ml充填した。
ゲル調整液として水酸化ナトリウム０．０８重量％溶液を流速約５０ml／min で約１０００ml流した後、同じくゲル調整液として酢酸０．３重量％溶液を流速約５０ml／min で約１２５０ml流した。次いで、精製水を流速約５０ml／min で約２５００ml流した。なお、このゲルの調整工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。
【００４８】
このようにして調整したゲルに、平衡化液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要量），塩化ナトリウム（０．８７７重量％），塩化マグネシウム・６水塩（０．２０３重量％），精製水（残量）〕を流速約５０ml／min で約２５００ml流してゲルを平衡化した。なお、このゲルの平衡化工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。
【００４９】
（３）ＨｂＡ1Cのゲル吸着
上記（２）において平衡化したゲルに上記（１）で調製した精製溶血液を３０００ml混合し、垂直に立てたカラム内で２〜８℃で遮光し、１６〜２４時間静置した。
次に、ゲルベットの上に溜まった精製溶血液を駒込ピペットでカラム上から排出した。なお、この排出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。
【００５０】
（４）ＨｂＡ1C低値溶液の溶出
上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／min で１０００ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。
０．５g ／dlのヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそこの対照よりも濃い分画をビーカーにプールした。
【００５１】
（５）ＨｂＡ1C高値溶液の溶出
上記（４）に引続き、上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／min で１５００ml流した（この工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した）。なお、この工程の間に溶出した液は廃棄した。
【００５２】
次に、分離液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要量），Ｄ−ソルビトール（１．８２２重量％），精製水（残量）〕を流速約２５ml／min で１５００〜２０００ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。 ０．５g ／dlのヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそこの対照よりも特に濃い分画から約１００mlまでプールした。
【００５３】
（６）透析及び濃縮
上記（４）（５）により得られたＨｂＡ1C低値溶液及び同高値溶液をそれぞれ透析チューブに詰め（低値溶液約180 ml/ チューブ，高値溶液約100ml/ チューブ ）
、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約２時間スターラーで精製水を攪拌した〔低値溶液の精製水約２０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。この透析の終了後、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約１６時間静置した〔低値溶液の精製水約２０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。
【００５４】
上記透析工程の終了したそれぞれの透析チューブを、約５l の濃縮剤〔ポリエチレングリコール20000 の３０重量％水溶液〕に浸漬し、２〜８℃で遮光してスターラーで濃縮剤を攪拌した。
ＨｂＡ1C低値溶液の透析チューブは、約２時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これに１／９容量の安定剤（サッカロースの５０重量％水溶液）を加え、均一になるまで混合し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。
【００５５】
また、ＨｂＡ1C高値溶液の透析チューブは、約４時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これに１／９容量の上記安定剤を加え、均一になるまで混合し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。
【００５６】
（７）ＨｂＡ1C及び総ヘモグロビン量の濃度調製
前記（１）において調製した「原料血液そのままのＨｂＡ1C濃度の溶液」並びに前記（６）において調製した「ＨｂＡ1C低値溶液」及び「ＨｂＡ1C高値溶液」の総ヘモグロビン量をアザイドメトヘモグロビン法により定量し、次にＨｂＡ1C濃度をＨＰＬＣ法〔ＨＬＣ−７２３ＨｂIII 型ＨｂＨｂＡ1C自動分析機（東ソー社製）による〕により定量した。
【００５７】
次いで、「原料血液そのままのＨｂＡ1C濃度の溶液」と「ＨｂＡ1C低値溶液」又は「ＨｂＡ1C高値溶液」を混合して、それぞれ所望のＨｂＡ1C濃度に調整した上で、安定剤（サッカロースの５重量％水溶液）を加えて総ヘモグロビン濃度を１．０g/dlに合わせた。
【００５８】
（８）凍結乾燥
上記（７）で濃度調整した「ＨｂＡ1C低値溶液」及び「ＨｂＡ1C高値溶液」を１０ml容褐色バイアルに２mlずつ分注し、これらのバイアルを凍結乾燥機に入れ、制御運転〔第１段階：−２０℃・１０時間，第２段階：−２０℃・１０時間，第３段階：−４℃・１０時間，最終制御：４℃・６０〜７０時間；到達真空度：約１０mTorr 〕を行い、凍結乾燥品を得た。凍結乾燥が終了したそれぞれのバイアルに窒素を充填し、封栓しアルミシールを施した。このように、ＨｂＡ1Cの管理試料を得た。
【００５９】
〔試験例〕本発明試料の凍結乾燥前後における経時的安定性の検討
（１）本発明試料においてＨｂＡ1Cの安定剤として配合するサッカロースの凍結乾燥前後における経時的安定性を、他の糖類を配合した場合との比較において検討した。すなわち、予め凍結乾燥前の全ヘモグロビン量を１０g/dlに調整した各試料における全ヘモグロビン量中のＨｂＡ1C量を上記製造例（７）で示したと同様の方法で測定した。
【００６０】
次に、これらの各試料を上記製造例（８）に示したと同様の方法で凍結乾燥した後、これらの凍結乾燥品に精製水０．５mlを加えて、各試料における全ヘモグロビン量中のＨｂＡ1C量を上記と同じく測定した。
この結果を第１表に示す。
【００６１】
【表１】
この第１表において、糖類を添加しなかった試料は、凍結乾燥後は、この凍結乾燥操作自体によるヘモグロビンの変性が著しく、ＨＰＬＣ分析に耐えられないものとなった。
また、アルドース系単糖類であるＤ−キシロース又はＤ−アラビノースを添加した群は、凍結乾燥操作によるヘモグロビンの変性は抑制されたが、凍結乾燥中の反応により凍結乾燥前後でＨｂＡ1C値が大きく異なるものとなった。
【００６３】
この結果より、ＨｂＡ1Cの凍結乾燥における安定性を付与するための安定剤としては、アルドース単糖類は不適当であることが明らかになった。
なお、Ｄ−ガラクトース，Ｄ−マンニトール，ラクトースはヘモグロビン溶液における溶解度が低いのでこの試験系からは除外した。
【００６４】
（２）次に、この試験系で安定性に優れていたＤ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾燥後における経時的安定性を検討した。
すなわち、Ｄ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾燥直後におけるＨｂＡ1Cの安定性を、試料の凍結乾燥直後のＨｂＡ1C値と凍結乾燥後１ヵ月後（室温）のＨｂＡ1C値をＨＰＬＣ法により比較した。
この結果を第２表に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ1C の管理試料が提供される。
Claims (2)
- ヘモグロビンＡ1C及びサッカロースを含んでなるヘモグロビンＡ1Cの管理試料。
- ヘモグロビンＡ1Cが、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得られるヘモグロビンＡ1Cである請求項１記載の管理試料。
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