JP3715348B2 - 修飾アポペルオキシダーゼを用いる分析要素、組成物および方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬を用いて被分析物を検出するための分析要素、組成物およびそれらの使用方法に関する。詳細には、本発明は、そのような被分析物の検出におけるヘモグロビンによる偏りを低減することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学的研究および調査、ならびに分析および診断方法において、種々の流体、例えば、生物学的流体中に存在する化学的および生物学的物質の迅速かつ正確な測定が必要とされ続けている。例えば、タンパク質、ホルモン、薬物、ウイルス、微生物、麻薬およびステロイドの存在は、有効な調査、診断または治療のために正確かつ迅速に検出されねばならない。
【０００３】
前記物質を検出するための多種多様な分析方法がこの10年間で開発されてきた。これらの方法は信頼性が高くなってきており、そしてあるときには、自動化に適するするようになり、同様にキットの形状で使用する際に適するようになってきた。そのような方法のほとんどが、検出しようとする物質（以下本明細書では「特異的結合リガンド」もしくは「リガンド」と示される）と、リガンドを特異的に認識して反応する対応する「レセプター」との間の「特異的結合反応」として当該技術分野で既知であるものに頼っている。最もよく知られている特異的結合反応は、（イムノアッセイにおいて）免疫反応体、例えば、抗体とハプテンもしくは抗原の間で起こるが、しかしまた別のもの（例えば、アビジンとビオチン、および糖とレクチン）も知られている。
【０００４】
一般的には、特異的結合アッセイにより、目的の被分析物の存在または不在（あるいは量）の定性的もしくは定量的測定（または両方）ができる。「競合的結合イムノアッセイ」として知られているある型のアッセイでは、測定しようとするリガンドの標識化類似体が、リガンドおよびリガンド類似体の両方と反応できる固定量の適当な抗体との競争状態に置かれる。類似体上の標識は、その「遊離」または複合した（すなわち、反応した）形状で適当に検出できる。次いで信号のレベルは、どのくらいのリガンドが試験した試料中に存在するのか使用者に示唆するだろう。
【０００５】
「サンドイッチ」イムノアッセイもしくはイムノメトリックアッセイとして知られている別のイムノアッセイ・フォーマットでは、リガンドが、異なるエピトープ部位でリガンドと結合する２種以上のレセプター分子と接触せしめられる。一方のレセプターは、典型的には適当に標識され、そして他のものは固形支持体上に固定化されるか、またはその上に固定化されうるものである。リガンドの量は、リガンドと２種のレセプターとの間で結合した複合体の量に正比例する。
イムノアッセイは、伝統的には、溶液でか、または流体が何らかの形でアッセイに関与する試薬から除去される試験装置で実施されてきた。乾式分析要素およびそれらのイムノアッセイにおける用途は、米国特許第 4,258,001号明細書（Pierce他）、米国特許第 4,670,381号明細書（Frickey 他）、WO 82/2601（1992年 8月 5日出版）、EP-A-0 051 183（1982年 5月12日出版）およびEP-A-0 066 648（1982年12月15日出版）を包含する多数の刊行物に記載されている。
【０００６】
改良された乾式分析要素およびイムノアッセイにおけるそれらの用途は、米国特許出願番号第 938,460号明細書（1992年 8月31日出願）に記載されている。前記明細書では、酵素標識が検出に利用されている。ペルオキシダーゼは好ましい酵素標識である。そのような要素により、非常に低濃度で存在する被分析物を検出することができる。
標識としてペルオキシダーゼを用いて乾式分析要素で実施されるイムノアッセイでは、酵素の活性に影響を及ぼす試験試料中の物質の存在により、結果が変わるかもしれない。これらの干渉作用は、干渉体の作用を遮断する物質をアッセイ系に含めることにより解決できる。
【０００７】
WO 86/07462 （1986年12月18日出版）は、所定の修飾された形状のペルオキシダーゼを用いて溶液アッセイにおける干渉体の作用を低減することを記載している。これらの形状は、アポ西洋ワサビペルオキシダーゼ、カルボキシメチル化アポ西洋ワサビペルオキシダーゼおよび酸性型の西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。
しかしながら、干渉体の作用を縮小するためにイムノアッセイ用の塗布要素にアポ西洋ワサビペルオキシダーゼを過剰に（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の 100倍過剰）添加した場合、ヘモグロビンによる偏りが著しく増加することが認められた。この作用は、ヘモグロビンによるアポ西洋ワサビペルオキシダーゼの再活性化によるものであったと信じられている。アポ西洋ワサビペルオキシダーゼは、実質的に高濃度で存在するので、この物質の活性化がかなりの信号を発生してアッセイに大きな誤差を導入する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、試験試料中のヘモグロビンによる偏りを生じることなく、標識としてペルオキシダーゼを用いて塗布イムノアッセイにおける干渉を低減する方法が必要とされている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、多孔質展開層を含み、かつ前記多孔質展開層と同一もしくは異なる層に、別個に、
ａ）ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬、および
ｂ）修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポペルオキシダーゼ、
を含む、被分析物を測定するための分析要素により解決された。
【００１０】
また、本発明は、
Ａ）特異的結合リガンドおよびヘモグロビンを含むと推測される流体試料を、
多孔質展開層、および
前記多孔質展開層と流体接触状態である１つ以上の追加の層、
を含む分析要素であって、
前記層の少なくとも１つに、
前記特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体、または
前記特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、標識されていない免疫反応体、
を含有し、かつ
前記層の少なくとも１つに、別個に、
修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポペルオキシダーゼ、
をさらに含有する分析要素と接触させて、
反応した形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体から反応していない形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体を分離させること、そして
Ｂ）前記反応していないまたは反応した形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体のいずれかを、前記目的の特異的結合リガンドの尺度として検出すること、
を含む被分析物の測定方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明の分析組成物は、
ａ）ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬、
ｂ）修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポペルオキシダーゼ、
ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で反応して比色もしくは化学ルミネセンス信号を提供する１つ以上の試薬、および
ｄ）ｃ）のためのフェノールもしくはアニリン補助試薬、
を含む。
【００１２】
本発明は、ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬を用いて被分析物を正確に検出するための方法を提供する。本発明は、アッセイにおいて乾式分析要素を用いる際に、特に有利である。ペルオキシダーゼ標識に対する既知干渉体の作用は予期したとおり最低であり、そしてヘモグロビンの存在による偏りは思いがけないことに回避される。
これらの利点は、アッセイで、酵素がヘモグロビンにより再活性化されないように、タンパク質のヒスチジンアミノ酸を遮断するように修飾された形状のアポペルオキシダーゼを用いることにより達成される。以下により詳細に記載されているように、ヒスチジンイミダゾリル基の少なくとも１つの窒素原子における置換により、遮断は達成できる。
【００１３】
修飾アポペルオキシダーゼは、別の普通の血清タンパク質干渉体による干渉作用を有効に低減する作用が残っている。この技術は、修飾アポペルオキシダーゼが、修飾された形状の酵素、タンパク質カルボキシメチル化アポペルオキシダーゼと同様に、溶液アッセイにおいて干渉体を取り除くのに有用であることを教示している。けれども、乾式アッセイ・フォーマットにおいて、修飾していないアポペルオキシダーゼは、ヘモグロビンの存在の結果として得られるアッセイの偏りをさらに生じる。本発明は、この問題に取り組み、さらなる改良を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、ペルオキシダーゼの存在に応じて比色、蛍光または化学ルミネセンス信号を発生するように設計されたいずれかの分析方法で有利に実施できる。そのようなアッセイは、有機もしくは無機過酸化物（例えば、過酸化水素）またはペルオキシダーゼ（その遊離型）の検出、あるいはペルオキシダーゼの反応を含む反応機構を用いるペルオキシダーゼ以外の非免疫学的被分析物の検出を含むことができる。好ましい態様では、本発明は、特異的結合アッセイの実施に向けられている。
アッセイは、定性的、定量的または半定量的に、水性液体、例えば、ヒトおよび動物の生物学的流体、廃液、食物、環境廃棄物、化学処理液および当業者に容易に明らかな別の種中の１つ以上の多種多様な被分析物を検出することができる。好ましくは、生物学的流体、例えば、ヒトもしくは動物の血清、血漿または尿が、本発明でアッセイされる。
【００１５】
過酸化水素（もしくは別の過酸化物）は、過酸化物を生成できる被分析物と同様に本発明で測定できる。すなわち、被分析物が、過酸化水素を生成する１つ以上の反応に関与し、次いで適当な信号生成性試薬およびペルオキシダーゼを用いて検出されるだろう。
本発明は、ペルオキシダーゼが速度制限型（rate limiting fashion ）で用いられるアッセイで特に都合がよい。ほとんどの場合で、そのようなアッセイは、ペルオキシダーゼが、特異的結合リガンドを検出するのに必要とされる免疫反応体の一方における標識として用いられる特異的結合アッセイである。しかしながら、ペルオキシダーゼが速度制限型で用いられる、中間代謝物、酵素もしくは別の非免疫反応性被分析物のアッセイが存在するであろうことは、当該臨床化学者に容易に理解されるだろう。従って、本発明は、特異的結合アッセイに限定されるものではない。
【００１６】
溶液アッセイに有用である本発明の分析組成物としては、ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識特異的結合試薬、修飾アポペルオキシダーゼ（下記）、信号を生成するための１つ以上の試薬（下記）、ならびに場合によって、それらの信号生成性試薬のフェノールもしくはアニリン「補助試薬（coreagent ）」を含めることができる。
本方法で使用できる補助試薬は、例えば、米国特許第 4,828,983号明細書（McClune ）に記載されたフェノール類およびアニリン類を初めとする、色素信号を生成する際に「電子移動剤」として様々に知られている化合物、ならびに例えば、米国特許第 4,729,950号明細書（Kricka他）および米国特許第 4,598,044号明細書（Kricka他）に記載された、化学ルミネセンス信号を生成するための「エンハンサー」として様々に知られている化合物を含む。これら３つの特許すべてが、引用することにより本明細書に組み入れられる。別の有用な補助試薬が、同時係属出願されて最近許可された米国特許出願番号第07/995,608号明細書（Friedman他により1992年12月22日に出願）に記載されている。これもまた、引用することにより本明細書に組み入れられる。３つの好ましい補助試薬は、４′−ヒドロキシアセトアニリド、３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび３′，５′−ジクロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドである。
【００１７】
前記分析組成物では、ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識特異的結合試薬および信号発生性試薬は、当業者に容易に明らかないずれか適当な濃度で存在させることができる。修飾アポペルオキシダーゼは、通常約10^-9〜約10^-3の量で存在し、約10^-7〜約10^-5の量が好ましい。フェノールもしくはアニリン補助試薬は、約 0.001〜約150 ミリモル濃度の量で存在することができるが、約0.01〜約50ミリモル濃度の量が好ましい。所定の被分析物用の所定の組成物について変わる量をどのようにして調節すべきであるのかは、当業者に容易に明らかであるだろう。
【００１８】
好ましい態様では、本発明は、リガンドについてのレセプター分子が入手可能であるかまたは製造可能であるような、標的特異的結合リガンド（以下本明細書ではリガンドと示される）を検出ための要素および方法に向けられている。リガンド−レセプター複合体の具体例（すなわち、リガンドと対応するレセプターとの反応生成物）は、限定されるものではないが、抗体−抗原、抗体−ハプテン、アビジン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィブロネクチンおよびプロテインＡ−ＩｇＧの複合体を含む。本発明のために、また相補的核酸（すなわち、相補鎖のハイブリッド生成物）がリガンド−レセプター複合体として考えられる。
【００１９】
リガンドは、限定されるものではないが、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類（酵素類、抗体類、抗原性タンパク質類、糖タンパク質類、リポタンパク質類およびアビジンを包含する）、ホルモン類（例えば、チロキシン、トリヨードチロキシン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エストロゲン、ＡＣＴＨおよびサブスタンスＰ）、ビタミン類、ヒト免疫系モジュレーター類（例えば、インターロイキン−６）、ステロイド類、炭水化物類（例えば、多糖類）、糖脂質類、薬物類（例えば、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール、モルフィネ、カルバマゼピンおよびテオフィリン）、抗生物質類（例えば、ゲンタマイシン）、細菌細胞およびウイルスの成分（例えば、レンサ球菌種、ヘルペスウイルス類、淋菌種、クラミジア種、レトロウイルス類、インフルエンザウイルス類、プレボテラ種、ポルフィロモナス種、アクチノバチルス種およびマイコバクテリウム種）、核酸類（一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドを包含する）、医薬品製剤類、ハプテン類、レクチン類、ビオチン、ならびに当業者に容易に明らかである別の物質を含む。
【００２０】
しかしながら、本発明は、ペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬が速度制限量で要素中に存在する、被分析物を検出するための乾式分析要素を用いる際に特に有用である。
好ましい特異的結合アッセイでは、速度制限反応でペルオキシダーゼを用いて溶液または乾式フォーマットで検出できる被分析物は、限定されるものではないが、ジフェニルヒダントイン（もしくはフェニトイン）、カルバマゼピン、フェノバルビタール、Ｃ反応性タンパク質、ジゴキシン、チロニン誘導体（例えば、チロキシンおよびトリヨードチロニン）、モルヒネ、テオフィリン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、ＴＳＨ、ｈＣＧ、種々タンパク質（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＡタンパク質）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、トロポニンＴおよびＩ、ならびにアポタンパク質Ａ、Ａ１およびＢを含む。そのようなアッセイで被分析物を検出するために必要とされるだろう種々の別の試薬は、通常の臨床化学分野で周知である。従って、例えば、１つ以上の従来の試薬がペルオキシダーゼと共に用いられ、１つ以上の反応の後に、比色、蛍光もしくは化学ルミネセンス信号が生成されるだろう。
【００２１】
本明細書中で用いられている「抗体」なる語は、当該技術分野で一般的であるように、単一の特異性を有する完全な免疫グロブリン分子を包含する。加えて、この語は、そのような分子の化学的に調製された断片〔例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）′、Ｆ（ａｂ）₂ 断片〕および遺伝学的に調製されたそれらの等価体（例えば、「一本鎖抗体断片」もしくはＳｃＦｖ断片）を包含することを意味する。抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルでありうる。
好ましくは本発明は、希釈されたまたは希釈されていない試験試料に適応する適当な多孔性を有する、多孔質展開層（一般に塗布層）を含む分析要素を用いて実施される。好ましくは多孔質展開層が、等方性多孔質である。等方性多孔質とは、相互に連結した繊維、粒子もしくは層の別の成分により提供される、すべての次元で流体が均一に展開することを意味する。そのような要素を調製するのに有用な材料は周知である。多孔質層は、セルロース、ガラスもしくはポリマー繊維、ポリマーもしくは無機粒状物質、またはそのような物質の組合せからなることもできる。従来の展開層についての詳細は、例えば、米国特許第 3,992,158号明細書（Przybylowicz他）、米国特許第 4,258,001号明細書（Pierce他）、米国特許第 4,292,272号明細書（Kitajima他）および米国特許第 4,430,436号明細書（Koyama他）（これらは引用することにより本明細書中に組み入れられる）に記載されている。好ましい多孔質展開層は、Pierce他の特許に記載されるようなポリマー粒子およびポリマー接着剤から調製されるビーズ展開層である。
【００２２】
要素は、すべての層が流体接触状態である限り、多孔質展開層のほかに追加の層を含むことができる。流体接触状態であるとは、そのような試薬はある層から別の層へ容易に移動しないが、流体はある層から別の層へ容易に移動できることを意味する。一般的には、そのような追加の層は、種々のバインダー物質およびアッセイに有用な１つ以上の試薬を塗布した層であり、それらには、下塗り層、試薬層、記録層、および輻射線遮断性層として当該技術分野で既知であるものを含む。そのような層のバインダーとして有用な物質は、先の段落に記載された特許に記載されているように周知であり、好ましくはゼラチン（硬化または未硬化）、親水性アクリルアミドおよびビニルピロリドンポリマー類を含む。幾つかの層が水不溶性であり、一方別の層はアッセイ中に溶解するかまたは膨張するような水溶性であるかまたは水膨張性であってもよい。また、塗布中にいくつかの層を一緒に配合して、異なる塗布処方から単一乾燥層に水平な帯域を形成することもあるかもしれない。
【００２３】
要素の層は、自立式でありうるが、しかし好ましくはそれらが適当な寸法安定性で非孔質の化学的に不活性な支持体上に配置される。有用な支持体材料には、ポリマーフィルム、金属ホイル、紙および当該技術分野で周知の別の材料を含む。透明なポリエステル支持体が好ましい。
本発明の実施に際して用いられるペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬は、要素の１つ以上の層に含まれる。この試薬は、目的の特異的結合リガンドまたはそれの対応するレセプターのいずれかに結合できる。競合的結合イムノアッセイでは、標識化試薬は一般的には特異的結合リガンドの標識化類似体（例えば、リガンドの標識化ハプテン性誘導体）である。サンドイッチアッセイでは、標識化免疫反応体がリガンドについての標識化レセプターであってもよく、またはレセプター（例えば、抗体）に結合する標識化分子（例えば、標識化抗抗体）であってもよい。
【００２４】
標識化特異的結合試薬は、数多くの既知方法のいずれかを用いて調製でき、そして多数のそのような試薬が数多くの供給所から市販されている。調製方法は、Yoshitake 他，Eur.J.Biochem. 101, 395, 1979 および米国特許第 5,106,732号明細書（Kondo 他）に記載されたものを含む。
本出願明細書中の「ペルオキシダーゼ」とは、過酸化水素もしくは別の酸化体の存在下で基質、例えば、ロイコ色素の酸化を触媒して適当な信号を生成する過酸化的物質（酵素的など）のいずれかを意味する。細菌、真菌もしくは植物のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最も好ましい。
【００２５】
本発明の要素中のペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬の量は、反応に使用される別の成分の量および試験試料中の予測される被分析物の量により、幅広く変化できる。一般的には、要素中に存在する量は、少なくとも約２μg/m²であり、約４〜約25μg/m²が好ましい。
本発明に有用なペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬は、好ましくはリガンドのペルオキシダーゼ標識化ハプテン誘導体またはペルオキシダーゼ標識化抗体である。しかしながら、アビジンもしくは別の特異的結合化合物とペルオキシダーゼとのコンジュゲートが、本発明の実施に際して使用できる。標識がハプテンの上にあるとき、例えば、ペルオキシダーゼ標識化薬物、ホルモン、タンパク質、中間代謝物、キレートもしくはこれらのいずれかのハプテン性誘導体である。そのような物質の具体例は、限定されるものではないが、ジゴキシン、ジフェニルヒダントイン、フェノバルビタール、Ｃ−反応性タンパク質、チロニン誘導体、例えば、チロキシン、カルバマゼピンまたは別の前記被分析物のペルオキシダーゼ標識化ハプテン性誘導体を含む。
【００２６】
本発明の実施に際して用いられる臨界試薬は、修飾アポペルオキシダーゼである。これらのタンパク質は、タンパク質アミノ酸鎖中のヒスチジンアミノ酸分子のイミダゾリル基を遮断することにより修飾されている。イミダゾリル基は、環中の少なくとも１つの窒素原子を、ヒスチジンアミノ酸の立体配置を充分に破壊してアポペルオキシダーゼ分子中のペルオキシダーゼ活性の回復を防ぐが、しかしタンパク質の特異的免疫反応性を変えることはない、アルキル化試薬、縮合試薬もしくは付加試薬のいずれかで置換することにより遮断される。窒素原子は、適当な修飾付加、縮合もしくはアルキル化試薬を用いて、それにアルキル、アリール、アルカノイル、アロイル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニルまたはアリールアミノカルボニル基を共有結合させることにより遮断される。
【００２７】
そのような有用な修飾付加試薬の具体例は、以下のような型のいずれの活性ハロゲンアルキル化剤も包含する。
（１）ハロメチルカルボニル基含有化合物、例えば、クロロ酢酸ならびにそのアミドおよびエステル、ヨード酢酸ならびにそのアミドおよびエステル、そしてブロモ酢酸ならびにそのアミドおよびエステル、
（２）ハロエチルカルボニルおよびハロエチルスルホニル基含有化合物、例えば、３−クロロプロピオン酸およびそのエステル、３−クロロプロピオフェノンならびに３−クロロプロピオナミド、
（３）ハロゲン化アリールメチル、例えば、塩化ベンジル、１−クロロメチル−２−メチルナフタレン、１−クロロメチルナフタレン、４−クロロメチルビフェニルおよび４−クロロメチル安息香酸、ならびに
（４）酸ハロゲン化物、例えば、塩化アセチル、塩化プロピオニル、塩化ベンゾイルおよび塩化ナフトイル。
【００２８】
別の有用な修飾試薬としては、無水物類（例えば、無水酢酸、無水フタル酸、ピロ炭酸ジエチルおよび無水琥珀酸）、活性エステル類（例えば、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、Ｎ−プロプリオニルオキシスクシンイミドおよびGB 2,064,800A に記載される別のもの）、ビニルスルホニルおよびビニルカルボニル基含有化合物（例えば、ビニルスルホナミド、ビニルスルホン酸ナトリウム、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリウム、アクリル酸エチルおよび当業者に容易に明らかな別のもの）、イソシアネート類（例えば、イソシアン酸ブチル、イソシアン酸ｐ−ブロモフェニル、およびイソシアン酸フェニル）、アルデヒド類（例えば、ベンズアルデヒド、アセトアルデヒドおよびプロピオンアルデヒド）ならびにエポキシド類（例えば、グリシドール）が挙げられる。
【００２９】
この修飾を実施するための技術の１つは、実質的にMiles, Methods in Enzymology 47, 431〜442 ページ（1977）に記載された方法を用いて、アポペルオキシダーゼをピロ炭酸ジエチルと反応させることである。この方法については、下記調製１でさらに詳細に説明する。エトキシカルボニル基で置換されたヒスチジンアミノ酸を有する修飾アポペルオキシダーゼが得られた。
別の好ましい技法は、適当な試薬、例えば、ヨード酢酸、クロロ酢酸もしくはブロモ酢酸を用いてアポペルオキシダーゼをカルボキシアルキル化することを含む。そのような技法に関する詳細は、Gurd, Methods in Enzymology, 11, 532〜541 ページ（1967）に提供されている。例えば、アポペルオキシダーゼは、以下の実施例に先立つ調製２に記載されるような、カルボキシアルキル化誘導体（すなわち、カルボキシアルキル化ヒスチジンアミノ酸を有する）であってもよい。
【００３０】
修飾アポペルオキシダーゼは、約 0.1〜約100 mg/m² の量で、好ましくは約 0.5〜約20mg/m² の付着量で本発明の要素に存在する。好ましい付着量を下記実施例に示す。
ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬、および修飾アポペルオキシダーゼは、別個に、本発明の要素の同一または異なる層に存在する。さらに、それらは、別個に多孔質展開層にまたは要素の追加の層のいずれかにあるいは単一層（例えば、多孔質展開層）の別個の帯域に存在してもよい。
【００３１】
本発明のある態様では、目的の特異的結合リガンドを測定するための多層分析要素は、非孔質支持体の上に、流体接触状態で、
ｉ）第１試薬もしくは緩衝層、
ii）目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、標識されていない免疫反応体を含むレセプター層、
iii)過酸化水素およびペルオキシダーゼの存在下で比色もしくは化学ルミネセンス信号を提供する試薬を含有する多孔質展開層、ならびに
iv）前記多孔質展開層に隣接する、
目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合するペルオキシダーゼ標識化免疫反応体、および
前記修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼ、
を含む第２試薬層、
を含む。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、目的の特異的結合リガンドを測定するための多層分析要素が、非孔質支持体の上に、流体接触状態で、
第１試薬もしくは緩衝層、ならびに
過酸化水素およびペルオキシダーゼの存在下で比色もしくは化学ルミネセンス信号を提供する試薬を含有する多孔質展開層、
を含み、かつ
前記多孔質展開層が、
目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、標識されていない免疫反応体を含有する第１帯域、ならびに
目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体、および前記修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する第２帯域、
を包含する複数の帯域を有する。
【００３３】
この要素では、多孔質展開層の帯域は、層の水平な領域であってもまたは垂直な領域であってもよい。より好ましくは、それらが、多孔質展開層成分を塗布する前かまたは後に塗布された塗膜を分離することにより作られる水平な帯域である。要素を調製するための塗布処理中、別個の塗膜（例えば、別個の第２試薬およびレセプター層に用いられる処方）を多孔質展開層に溶解して、複数の帯域を有する単一乾燥層を形成してもよい。グラビア塗布技術によりこれを実施する技法の１つは、米国特許出願番号第 07/713,239 号明細書（Dappen他により、1991年 6月 7日に出願）により詳細に記載されている。
また別の態様では、要素は、標識されていない免疫反応体、ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体および修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼが多孔質展開層に分布されているが、好ましい要素と同様である。
【００３４】
本発明の要素は、目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかと特異的に反応できる、標識されていない免疫反応体を含むこともできる。競合的結合イムノアッセイでは、この免疫反応体は、一般的にはリガンドに対するレセプター（例えば、抗体）である。サンドイッチイムノアッセイでは、標識されていない免疫反応体は、リガンドのレセプターであるか、またはレセプターと反応性である結合分子（例えば、抗抗体）でありうる。好ましい態様では、免疫反応体がリガンドに特異的な抗体である。
標識されていない免疫反応体およびペルオキシダーゼ標識化免疫反応体は、一般的には、アッセイが開始されるまで要素中に何らかの形で個別に維持される。要素の異なる層にそれらを配置することによりそれらを分離してもよく、または同じ層にそれらを置いてもよいが、一方の成分はアッセイが始まるときに該成分を放出する物質を用いてカプセル化し、あるいはそれらを同じ層の別個の帯域に配置してもよい。
【００３５】
標識されていない免疫反応体を適当な粒子に固定化して、要素の層中に分散させることも好ましい。そのような粒子は、限定されるものではないが、ガラス、酸化鉄、セラミック、有機合成もしくは天然ポリマーを包含する適当な物質のいずれかからなるものであり、かつ約0.01〜約10μｍの平均粒子サイズを有する。好ましくは、これらの粒子は、合成ポリマーから調製され、かつ免疫反応体分子を付着または共有結合するのに適する表面基を有する。米国特許第 4,828,978号明細書（Warren III他）、米国特許第 4,997,772号明細書（Sutton他）、米国特許第 5,147,777号明細書（Sutton他）、米国特許第 5,177,023号明細書（Sutton他）に記載されているものを初めとする、多種多様なそのような材料が当該技術分野で周知である（すべて引用することにより、本明細書中に組み入れられる）。
特に有用なポリマー粒子は、先の段落で記載した特許に記載されるような、反応性カルボキシ、２−置換エチルスルホニルもしくはビニルスルホニル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーより調製されるものである。
【００３６】
本発明方法で標識としてペルオキシダーゼを用いると、ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体を、過酸化水素もしくは同類の酸化体、および比色もしくは化学ルミネセンス信号を生成する適当な試薬と接触させる必要がある。比色信号を提供するのに有用な試薬には、限定されるものではないが、イミダゾールもしくはトリアリールメタンロイコ色素、例えば、米国特許第 4,089,747号明細書（Bruschi ）およびそこに言及された文献、米国特許第 4,670,385号明細書（Babb他）、EP-A-0 122 641（1984年10月24日刊行）および特開昭58-045557 号公報（1983）に記載されるものが含まれる。別の有用な試薬は、この分野の多数の文献を考慮すると当業者に容易に明らかであるだろう。前記Bruschi 特許のトリアリールイミダゾールロイコ色素（引用することにより本明細書中に組み入れられる）は、本発明の実施に際して好ましい。そのようなロイコ色素は、市販されているかまたは既知方法および出発物質を用いて容易に調製される。
【００３７】
また、ジアゾニウムおよびテトラゾリウム塩が、ペルオキシダーゼおよび酸化体の存在下で発色団を提供できる限り有用である。一般的には、ジアゾニウム塩は、ジアゾニウム基を有する化合物の有機塩である。テトラゾリウム塩は、有機部分が、一般的には様々な部位にアリール置換基を有する１つまたは２つのテトラゾール環を含有する有機塩である。
多くの有用なジアゾニウムおよびテトラゾリウム化合物が、例えば、米国特許第 3,905,872号明細書（Forgione）、米国特許第 4,772,553号明細書（Fujii 他）、米国特許第 4,892,817号明細書（Pawlak）および米国特許第 4,892,833号明細書（Weiss 他）に記載されている。それらのうち幾つかは市販されているか、または既知方法および出発物質を用いて容易に調製される。
【００３８】
化学ルミネセンス信号は、種々の既知試薬を用いて発生させることができる。好ましい化学ルミネセンス信号発生性試薬は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体（本明細書では「ＤＰＤ」と示される）。化学ルミネセンス反応で励起状態に変換され、非励起状態に戻るときに光を放射できる遊離またはコンジュゲートＤＰＤのいずれもが、本発明の実施に際して有用である。多数のそのような化合物が当該技術分野で既知であり、それらとしては、米国特許第 4,598,044号明細書（Kricka他）およびChemiluminescence in Organic Chemistry，GundermannおよびMcCapra, Springer-Verlag, Berlin, 1987, 204-207 ページ，に記載されているものが挙げられる。そのような化合物は、一般的には「ルミノール型ヒドラジド」として知られており、それらには、フタル酸ヒドラジド、ナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、フルオレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、コロネン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドおよび当業者に容易に明らかな別のものが含まれる。ルミノールは、好ましい化学ルミネセンス信号発生性試薬である。種々のフェノールおよびアニリンが、ＤＰＤ化合物と共にエンハンサーとして用いられる。
【００３９】
また、本発明の要素は、製造、流体展開、望ましくない輻射線の吸収およびレセプター安定性を補助するための、そのような要素に共通である種々の添加剤を含むこともできる。
要素は、従来技術文献に記載されているような（グラビア、カーテン、ホッパーおよび別の塗布技法を含む）従来の塗布方法および装置を用いて調製できる。要素は、いずれか所望の幅の伸長テープ、シート、スライドもしくはチップを包含する、様々な形を取ることができる。
【００４０】
さらに、本発明方法は、適当な分析装置および方法を用いて、手動的または自動的に行うことができる。一般的には、該方法は、試験試料（例えば、１〜200 μＬ）を多孔質展開層にスポットすることにより、要素中の試薬を接触させることを含む。そして流体が要素内を移動して、反応起こるように効果的に試薬を混合する。試料塗布後、要素をいずれかの条件に暴露して、例えば、インキュベーション、加熱または別の処理にかけて、要素内の反応（ならびにイムノアッセイにおけるいずれかの特異的結合複合体の生成）を速めるかまたは促進させることは望ましいだろう。
イムノアッセイでは、幾つかの場合では、定量的結果を得るのに適する信号を、反応した（結合）と反応していない（未結合）形のペルオキシダーゼ標識化免疫反応体とを実質的に分離することなく得ることができる。しかしながら、要素の帯域内でそれらの形態が分離されることは好ましく、それは不均質イムノアッセイとして知られている典型的なものである。従って、信号は、帯域の限定領域で評価できる。
【００４１】
基質溶液（例えば、５〜200 μＬ）を要素の帯域に塗布することは、この分離を行いかつ適当な信号を得るための好ましい方法である。いずれか所望の基質溶液塗布速度および方法が使用できる。この溶液は、ペルオキシダーゼもしくは別の信号生成性試薬の基質を含むであろうが、単に緩衝洗浄溶液であるかもしれない。好ましいロイコ色素（前記）もしくはルミノール型化合物を要素に用いるとき、好ましくは基質溶液は、フェノール系信号エンハンサーもしくは電子移動剤を含む。その多くは当該技術分野で知られている。好ましい化合物は４′−ヒドロキシアセトアニリドである。基質溶液中の試薬の量は、当業者に容易に明らかであるだろう。
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、限定することを意図するものではない。すべてのパーセンテージは、特に断らない限り重量パーセントである。
【００４２】
実施例の材料および方法：
調製１：
アポ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ 1.1ｇ）を水（７mL）に溶解させ、ピロ炭酸ジエチル（0.94ｇ）を攪拌しながら添加し、そして得られた混合物を24℃で２時間混合させながらインキュベーションすることにより、修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを調製した。攪拌しながら４度でさらに18時間インキュベーションを続けた。得られた生成物混合物（21.5mL）をリン酸緩衝液（３リットル，10ミリモル濃度，pH７）に対して２回緩衝液を変えて透析した。透析混合物は、ヒスチジンアミノ酸のイミダゾリル基にエトキシカルボニル基を有するアポ西洋ワサビペルオキシダーゼ（40mg/mL ）を含んでいた。
【００４３】
調製２：
アポ西洋ワサビペルオキシダーゼ（３％）をヨード酢酸（３％，pH5.5 ）の緩衝溶液に添加し、そして24℃で24時間混合することにより、別の修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを調製した。得られた生成物溶液を水（３リットル）に対して２回緩衝液を変えて24℃で24時間透析した。透析混合物を分析して、カルボキシメチル基で置換されたイミダゾリル基を有するアポ西洋ワサビペルオキシダーゼが収率約85％で存在することを確認した。
【００４４】
ジゴキシンとペルオキシダーゼとのコンジュゲートの調製：
Detty およびDanielson により1990年 7月27日に出願された米国特許出願番号第 558,919号明細書（1992年 1月29日に発行されたEP-A-0 468 590に対応する）ならびにDanielson およびDetty により1990年 7月27日に出願された米国特許出願番号第 564,940号明細書（1992年 1月29日に発行されたEP-A-0 468 591に対応する）に記載されている方法および試薬から、要素に用いられたペルオキシダーゼ標識化ジゴキシン類似体を調製した。
【００４５】
ジフェニルヒダントインとペルオキシダーゼとのコンジュゲートの調製：
ジフェニルヒダントイン・ハプテンとアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼとの水溶性コンジュゲートを以下のように調製した。この調製法は単に代表的なものである。別の調製方法も存在する。
ハプテン、５，５−ジフェニル−３−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝−２，４−イミダゾリジンジオンを、EP-A-0 517 327（1993年 5月 5日発行）に記載される方法により調製した。それは、その刊行物では「HD-2」と明記されている。米国特許第 5,162,219号明細書（引用することにより本明細書に組み入れられる）の実施例１の一般法を用いてアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼを調製した。
【００４６】
４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃度）を含有する乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ 1.031mL）に「HD-2」（15.5mg）を溶解することにより、ハプテンをアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（３−プロパンスルホン酸）緩衝液（pH８， 0.1モル濃度）中にアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（１mL，10mg/mL ）を含む溶液を、４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃度）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ 500μＬ）と渦巻混合しながら合わせ、次いで42℃の水浴に入れた。「HD-2」溶液（ 500μＬ）を酵素溶液に渦巻混合しながら滴下して、モル比を50:1にした。反応混合物を穏やかに攪拌しながら42℃で１時間インキュベートした。
【００４７】
反応生成物を以下のように透析した。
ａ）４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃度）を含有する乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）と前記緩衝液（pH８， 0.1モル濃度）との比率 1:1の混合物に対して42℃で１時間。
ｂ）透析条件ａ）を繰り返した。
ｃ）ウシ血清アルブミン（ 0.1％）を含有する前記緩衝液（ 1.5Ｌ， 0.1モル濃度，pH８）に対して８℃で 1.5時間。
ｄ）前記緩衝液（ 1.5Ｌ， 0.1モル濃度，pH８）に対して８℃で18時間。
ｅ）塩化ナトリウム（0.15モル濃度）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（ 1.5Ｌ，0.04モル濃度，pH7.5 ）に対して８℃で２時間。
ｆ）透析条件ｅ）を４時間繰り返した。
生成物溶液は、分光光度計で測定するとジフェニルヒダントイン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート1.48mg/mL を含有していた。
【００４８】
米国特許第 5,177,023号明細書（Sutton他）に記載される方法を用いて、抗ジゴキシン・モノクローナル抗体を、ポリ〔スチレン−コ−ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕（重量比95:5，平均直径 1.0μｍ）ビーズに付着させた。同様に、以下の実施例３で使用するために、抗ジフェニルヒダントイン・モノクローナル抗体をポリマー粒子に付着させた。
トリトン（TRITON，商標）X-100 非イオン界面活性剤は、Union Carbide から市販されている。テトロニック（TETRONIC，商標）T908非イオン界面活性剤はBASFから市販されており、そしてオリン（Olin）10G 非イオン界面活性剤は、Olin Corporationから市販されている。要素および方法に用いられるすべての他の試薬および成分は、市販されているか、または従来の出発物質を用いて既知方法を用いて容易に調製される。
【００４９】
実施例１および２：ジゴキシンを検出するための分析要素
ジゴキシンの検出に有用な本発明の乾式分析要素を、従来の方法および以下の塗布処方を用いて調製した。グラビアおよびレセプター塗膜を、多孔質展開塗膜中に拡散させて、乾燥多孔質展開層の境界の近くに別個の帯域を形成した。

【００５０】
実施例１で示した要素は、グラビア塗膜にカルボキシメチル化ヒスチジンアミノ酸を有する修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含むものであった。実施例２で示した要素は、異なる製造バッチ由来の同じ修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含むものであった。
対照要素は、グラビア塗膜中の修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼの代わりに修飾されていない（未修飾）アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを用いたことを除いて、どの点においても全く同じである。
【００５１】
信号生成速度は、ヒト血清ベース・マトリックスにジゴキシンを含有する試験試料（11μＬ）を塗布し、そして要素を５分間37℃でインキュベーションすることにより測定した。次いでリン酸ナトリウム緩衝化界面活性剤溶液（0.01モル濃度，pH 6.8）中に、過酸化水素（0.04％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸（10マイクロモル濃度）を含む基質溶液（12μＬ）を塗布した。
基質溶液の塗布直後に、要素を37℃に維持し、同時に色素生成速度の測定を、従来の反射率濃度計を用いて 670nmで約 2.5分間かけて測定した。
【００５２】
各試験試料に、下記第Ｉ表に示されるヘモグロビンの量を提供するために全血を超音波処理することにより生成した溶血血液およびとジゴキシン（２ng/mL ）の両方を添加した。従来のラジオイムノアッセイ方法〔Bayse 他，「ラジオイムノアッセイによるジゴキシンについての参照方法，標準案（Reference Method for Digoxin by Radioimmunoassay, Proposed Standard ）(1985)」National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Document I/LA9-P, NCCLS: Villanova, PA, 1986 〕を用いて、ヘモグロビン８mg/dL を有する試験試料をアッセイして、ジゴキシンの基準尺度（1.87ng/mL ）を得た。
下記第Ｉ表に示される結果は、対照要素を用いると、修飾されていないアポ西洋ワサビペルオキシダーゼが再活性化されて（すなわち、酵素活性が復活して）、ヘモグロビンの存在下で望ましくない信号を生成したことにより、ジゴキシン測定でかなりの偏りが生じることを示している。アッセイ中に発生した信号は試験試料中の被分析物の量に反比例するので、偏った場合の結果は負である。この偏りは、本発明の要素を用いて著しく減少された。すなわち、結果は、ほんのわずかに負であるかまたはわずかに正である。
【００５３】
【表１】

【００５４】
実施例３：ジフェニルヒダントイン（フェニトイン）を検出するための分析要素
分析要素がジフェニルヒダントインの検出に適する試薬を有していたことを除いて、前記実施例１および２に記載のものと同様に分析要素を調製した。従来の方法および装置を用いて要素を塗布した。要素は、以下の基本的な塗布組成物および構造を有するものであった。
【００５５】

【００５６】
これらの要素を用いて、Jackson Memorial Hospital (Miami, Florida)より入手したジフェニルヒダントインについての２人の患者の試験試料をアッセイした。これらの試料は、様々な量の被分析物、ならびに修飾していないアポ西洋ワサビペルオキシダーゼの不存在下において試験結果を正の方へ偏らせることが知られている血液タンパク質干渉体を含むことが知られている。試験試料は、本明細書では「患者１」および「患者２」と示した。「患者３」として示される第３の試験試料は、Eastman Kodak Company の従業員から入手したものであり、その試料は既知量の被分析物を全く含んでいなかった。しかしながら、この第３の試験試料に、20μg/mLの被分析物を添加した。
ＨＰＬＣを用いて試験試料の参照アッセイを実施し、次いで前記要素を用いた。エクタケム（EKTACHEM，商標）E-250 分析器（Eastman Kodak Company ）を用いて結果を測定し、そして分析器で得られた結果をＨＰＬＣにより得られた結果と比較することにより偏りを求めた。アッセイの結果は、ｙ軸に偏りを示し、そしてｘ軸に個別の試験についての様々な塗布レベル（mg/m² ）の修飾もしくは未修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを示した図１に要約する。
【００５７】
図１の棒グラフの第１セットのデータは、未修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する別の要素とは異なる製造方法で調製されたものであるが、グラビア塗膜に10mg/m² の未修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する分析要素を用いて得られた。図１の棒グラフの最後の２セット（シリーズＢ）のデータは、カルボキシメチル化ヒスチジンアミノ酸を有する修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する本発明の要素を用いて得られた。
棒グラフの各セットの第１棒グラフは「患者１」の試験試料から得られた結果を示し、第２棒グラフは「患者２」の試験試料から得られた結果を示し、そして第３棒グラフは「患者３」の試験試料から得られた結果を示す。図１のデータは、別のアッセイよりも著しい偏りを示すいかなる型のアポ西洋ワサビペルオキシダーゼを用いることなく、アッセイが実施されたことを示す。未修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼのレベルが上昇すると、偏りの量は減少するが、しかしほとんどの患者の試料についての究極の改良は、修飾アポ酵素を含有する本発明の要素を用いて得られた。
本発明をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載してきたが、しかし変更および修正が本発明の精神および範囲内で可能であることは理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３に詳細に記載されているように、３人の患者の試料について種々の分析要素を用いて得られたアッセイ・データを表すグラフ（偏り対塗布レベル）である。

Claims (20)

1. 多孔質展開層を含み、かつ前記多孔質展開層と同一もしくは異なる層に、別個に、
   ａ）ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬、および
   ｂ）試験試料中のヘモグロビンによる偏りを防止するために修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポペルオキシダーゼ、
   を含む、ヘモグロビンを伴うと推測される被分析物を測定するための分析要素。
2. 前記修飾アポペルオキシダーゼが、カルボキシアルキル化ヒスチジンアミノ酸を有する、請求項１に記載の要素。
3. 前記修飾アポペルオキシダーゼが、エトキシカルボニル基で置換されたヒスチジンアミノ酸を有する、請求項１に記載の要素。
4. 前記多孔質展開層と流体接触状態にある１つ以上の追加の層をさらに含み、かつ前記ａ）およびｂ）が、別個に、前記多孔質展開層の１つ以上の帯域に置かれた、請求項１に記載の要素。
5. 前記ペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬が、ペルオキシダーゼ標識化抗体である、請求項１に記載の要素。
6. 前記ペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬が、ペルオキシダーゼ標識化薬物、ホルモン、タンパク質、中間代謝物、キレート、または薬物、ホルモン、タンパク質、中間代謝物もしくはキレートのハプテン性誘導体である、請求項１に記載の要素。
7. 前記ペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬が、ジゴキシン、ジフェニルヒダントイン、フェノバルビタール、Ｃ反応性タンパク質、チロニン誘導体、カルバマゼピン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、甲状腺刺激ホルモンもしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンのペルオキシダーゼ標識化ハプテン性誘導体である、請求項６に記載の要素。
8. 非孔質支持体の上に、流体接触状態で、
   第１試薬もしくは緩衝層、ならびに
   過酸化水素およびペルオキシダーゼの存在下で比色もしくは化学ルミネセンス信号を提供する試薬を含有する多孔質展開層、
   を有する要素であって、
   前記多孔質展開層が、
   目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、標識されていない免疫反応体を含有する第１帯域、ならびに
   目的の特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体、および試験試料中のヘモグロビンによる偏りを防止するために修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポ西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する第２帯域、
   を包含する複数の帯域を有する、ヘモグロビンを伴うと推測される目的の特異的結合リガンドを測定するための多層分析要素。
9. 前記修飾アポ西洋ワサビペルオキシダーゼが、カルボキシアルキル化ヒスチジンアミノ酸またはエトキシカルボニル基で置換されたヒスチジンアミノ酸を有し、かつそれが、0.1〜100 mg/m^２の乾燥付着量で存在する、請求項８に記載の要素。
10. 前記標識されていない免疫反応体が、ジゴキシン、ジフェニルヒダントイン、フェノバルビタール、Ｃ反応性タンパク質、チロニン誘導体、カルバマゼピン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、甲状腺刺激ホルモンもしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的な抗体である、請求項８に記載の要素。
11. 前記多孔質展開層が、ビーズ製展開層である、請求項８に記載の要素。
12. Ａ）特異的結合リガンドおよびヘモグロビンを含むと推測される流体試料を、
    多孔質展開層、および
    前記多孔質展開層と流体接触状態である１つ以上の追加の層、
    を含む分析要素であって、
    前記層の少なくとも１つに、
    前記特異的結合リガンドもしくはそれのレセプターのいずれかに特異的に結合する、ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体、
    を含有し、かつ
    前記層の少なくとも１つに、別個に、
    試験試料中のヘモグロビンによる偏りを防止するために修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポペルオキシダーゼ、
    をさらに含有する分析要素と接触させて、
    反応した形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体から反応していない形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体を分離させること、そして
    Ｂ）前記反応していないまたは反応した形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体のいずれかを、前記目的の特異的結合リガンドの尺度として検出すること、
    を含む被分析物の測定方法。
13. 前記反応していないまたは反応した形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体が、ペルオキシダーゼの基質を含有する基質溶液を前記要素の帯域に塗布することにより分離される、請求項12に記載の方法。
14. 前記基質溶液が、さらに４′−ヒドロキシアセトアニリドを含有する、請求項13に記載の方法。
15. 前記反応した形状の前記ペルオキシダーゼ標識化免疫反応体が、イミダゾールロイコ色素の存在下で反応して、比色信号を生成する、請求項13に記載の方法。
16. 前記流体試料が、ヒトもしくは動物の血清、血漿または尿試料である、請求項13に記載の方法。
17. 前記要素が、前記目的の特異的結合リガンドのペルオキシダーゼ標識化ハプテン性誘導体であるペルオキシダーゼ標識化免疫反応体を含む、競合的結合イムノアッセイである請求項13に記載の方法。
18. 前記要素が、前記目的の特異的結合リガンドと特異的反応性である標識していない免疫反応体を、前記要素内に固定化させて含む、サンドイッチアッセイである請求項13に記載の方法。
19. ａ）ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ標識化特異的結合試薬、
    ｂ）試験試料中のヘモグロビンによる偏りを防止するために修飾ヒスチジンアミノ酸を含むアポペルオキシダーゼ、
    ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で反応して比色もしくは化学ルミネセンス信号を提供する１つ以上の試薬、および
    ｄ）上記ｃ）のためのフェノールもしくはアニリン補助試薬、
    を含む、ヘモグロビンを含むと推測される試料を分析するための分析組成物。
20. 前記修飾アポペルオキシダーゼが、カルボキシアルキル化ヒスチジンアミノ酸またはエトキシカルボニル基で置換されたヒスチジンアミノ酸を有する、請求項19に記載の組成物。

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