JP3720779B2 - 側鎖にビニルフェニル構造を有する新規なポリヒドロキシアルカノエート型ポリエステル、およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）型のポリエステルと、微生物を利用するその製造方法に関し、より具体的には、構成ユニットとして、３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルと、ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を原料として、ＰＨＡの産生能を有する微生物を利用し、構成ユニットとして、３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物が、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産し、その菌体内に蓄積することが報告されている（「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス， Ｐ１７８−１９７ （１９９５））。これらＰＨＡなどの微生物が産生するポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、微生物が産生するポリマー、例えば、ＰＨＡなどは、生分解性を有しており、自然界の微生物により完全分解されるという利点を有している。従って、例えば、微生物が産生するＰＨＡは、廃棄した際、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境にそのまま残留し、汚染を引き起こす要因となることがない。また、微生物が産生するＰＨＡは、一般に生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
この微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類、ならびに、培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることも知られている。これまで、主にＰＨＡの物性の改良という観点から、微生物産生ＰＨＡの組成や構造の制御を試みる研究がなされてきた。
【０００４】
微生物産生ＰＨＡの組成や構造の制御を目的とする研究の一つとして、近年、ユニット中に芳香環を有するＰＨＡを微生物に生産させる研究が盛んになされている。
【０００５】
Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９１， １９５７−１９６５ （１９９０）及びＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２４， ５２５６−５２６０ （１９９１）には、５−フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００６】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２９， １７６２−１７６６ （１９９６）には、５−（ｐ−トリル）吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−（ｐ−トリル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００７】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３２， ２８８９−２８９５ （１９９９）には、５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸ユニット、及び３−ヒドロキシ−５−（ｐ−ニトロフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００８】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ．， １９５， １６６５−１６７２ （１９９４）には、１１−フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナスオレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【０００９】
特許掲載公報 第２９８９１７５号には、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐ）ユニット、あるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐ）ユニットからなるホモポリマー；少なくとも、３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐユニットあるいは３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーの産生能を有するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた、前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されている。加えて、その発明の効果として、置換基を有する長鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端に、１から２個のフッ素原子が置換したフェノキシ基をもつポリマーを合成することができ、また、かかるポリマーは、融点が高い上、良い加工性を保持しつつ、加えて、立体規則性、撥水性を与えることができる点を記載している。
【００１０】
このユニット中の芳香環上にフッ素置換を有するフッ素置換ＰＨＡ以外に、ユニット中の芳香環上にシアノ基やニトロ基が置換したＰＨＡの研究もなされている。
【００１１】
Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４１， ３２−４３ （１９９５）及びＰｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ３９， ２０５−２１３ （１９９６）には、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２９３４７株及びシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４２株を用いて、オクタン酸と６−（ｐ−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸を基質として、３−ヒドロキシ−６−（ｐ−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは３−ヒドロキシ−６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００１２】
これら環状に置換基を持つ芳香環を有するユニットを含むＰＨＡは、ガラス転移温度が高く、加工性も良いという、芳香環に由来するポリマー性状を維持しつつ、芳香環上に存在している置換基に由来する新たな機能も付与された、多機能のＰＨＡとなる。
【００１３】
また、その一方で、ユニット中にビニル基を有するＰＨＡを基に、生産ポリマーに対して、前記ビニル基を利用する化学変換により任意の官能基をポリマー側鎖に導入し、多機能のＰＨＡを得ることを目的とした研究も盛んに行われている。
【００１４】
Ｐｏｌｙｍｅｒ， ４１， １７０３−１７０９ （２０００）には、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を用いて、側鎖にビニル基を有するポリエステルを生産し、ポリエステル分子内のビニル基を酸化することにより、水酸基を側鎖に有するポリエステルを生産したことが報告されている。
【００１５】
同じく、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３１， １４８０−１４８６ （１９９８）には、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を用いて、側鎖にビニル基を有するポリエステルを生産し、ビニル基をエポキシ化することにより、エポキシ基を側鎖に有するポリエステルを生産したことが報告されている。
【００１６】
更に、Ｐｏｌｙｍｅｒ， ４０， ３７８７−３７９３ （１９９９）には、同様の方法で得られたエポキシ基を側鎖に有するポリマーを、ヘキサメチレンジアミンとともに加熱することで架橋反応を行い、その反応と、生成物についての解析が報告されている。
【００１７】
また、Ｐｏｌｙｍｅｒ， ３５， ２０９０−２０９７ （１９９４）には、ポリエステル側鎖のビニル基を利用し、ポリエステル分子内の架橋反応を行い、ポリエステルの物性を改良した研究に関する報告がなされている。
【００１８】
上に紹介した研究からも示されるように、ビニル基は、不飽和炭化水素基であるがゆえに、付加反応などにおける、反応性が高く、様々な官能基の導入や化学的変換を施すことが可能である。また、ポリマーの架橋反応の足がかり、架橋点ともなりうる。従って、ＰＨＡを構成するユニット内にビニル基を有することは、ポリマーの機能材料としての応用を考える上で、非常に有用であると言うことができる。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
従来報告されている、これらビニル基を有するポリエステルは、いずれもポリエステル骨格に直接結合した側鎖のアルキル鎖の先端にビニル基が置換した構造を有している。しかしながら、アルキル鎖からなる側鎖を有するポリエステルは、一般的に、ガラス転移温度や融点はそれ程高くなく、溶融加工する上では、熱的性質は必ずしも好ましいものでなく、フィルムや加工品等としては、優れた性状を有している材料は必ずしも多くない。一方、側鎖に芳香環を有するポリエステルは、既に述べたように、一般的に、ガラス転移温度や融点が高く加工品としての性状が良好であるという特色を有している。
【００２０】
すなわち、優れた加工性を有する、新たな機能性ポリマーを開発していく上では、芳香環とビニル基とを側鎖に併せ持つポリエステルの利用が望まれる。しかしながら、これまで、ポリエステルにおいて、芳香環とビニル基のような官能基を側鎖に導入したという報告はなされていない。
【００２１】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、側鎖上に芳香環及びビニル基を有するポリエステル、特には、生分解性を有するＰＨＡ型のポリエステルと、その製造方法を提供することにある。より具体的には、側鎖に、その環上にビニル基が置換している芳香環を有しているＰＨＡ型のポリエステルと、それを、微生物を利用して製造する方法の提供が、本発明の目的である。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を進めたところ、以下に示すような発明に至った。
【００２３】
すなわち、本発明のポリエステルは、ポリヒドロキシアルカノエート型のポリエステルであって、下記化学式（１）：
【００２４】
【化８】
【００２５】
（式中、ｎは０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルである。
【００２６】
本発明のポリエステルは、場合によっては、前記化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットユニット以外に、下記化学式（２）：
【００２７】
【化９】
【００２８】
（式中、ｍは、０〜８の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットを含んでいても良い。
【００２９】
このようなポリエステルの一例として、下記化学式（３）：
【００３０】
【化１０】
【００３１】
で示される３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルを挙げることができる。
【００３２】
上に述べた、本発明のポリエステルでは、数平均分子量は、３０００〜５０００００の範囲にあるものが好ましい。
【００３３】
加えて、本発明は、上記の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型ポリエステルを、微生物を利用して製造する方法をも提供しており、すなわち、本発明の微生物を用いたポリエステルの製造方法は、下記化学式（４）：
【００３４】
【化１１】
【００３５】
（式中、ｐは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を原料とし、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸から化学式（１）：
【００３６】
【化１２】
【００３７】
（式中、ｎは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルを生産する能力を有する微生物により、化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルを製造することを特徴とする、化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルの製造方法である。
【００３８】
更に詳しくは、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とする前記ポリエステルの製造方法である。
【００３９】
本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、ペプチド類をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることができる。その際、培地中に含める前記ペプチド類として、ポリペプトンを用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４０】
また、本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、酵母エキスをも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４１】
本発明のポリエステルの製造方法においては、（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、有機酸またはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることができる。その際、例えば、培地中に含める前記有機酸またはその塩として、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、ならびにこれら有機酸の塩からなる群より選択される１つ以上を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４２】
本発明のポリエステルの製造方法においては、（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、アミノ酸またはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることができる。その際、例えば、培地中に含める前記アミノ酸またはその塩として、グルタミン酸、アスパラギン酸、ならびにこれらアミノ酸の塩からなる群より選択される１つ以上を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４３】
本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、糖類をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることもできる。その際、例えば、培地中に含める前記糖類として、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群より選択される１つ以上の糖類を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４４】
本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、炭素数４〜１２の直鎖アルカン酸またはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることもできる。
【００４５】
なお、上記する種々の構成を有する本発明のポリエステルの製造方法では、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中で、前記微生物を培養し、前記微生物が産生した前記化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むポリエステルを微生物細胞から回収する工程を有することを特徴とするポリエステルの製造方法とするのが一般的である。
【００４６】
なお、本発明のポリエステルの製造方法では、前記微生物として、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。例えば、その際、前記微生物として、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１；ＦＥＲＭＢＰ−７３７３）のいずれが１つ以上の株を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とするとより好ましいものとなる。
【００４７】
【発明の実施の形態】
本発明は、側鎖に、その環上にビニル基が置換している芳香環を有しているＰＨＡ型の新規なポリエステルとして、下で述べる微生物を利用する製造方法によって製造可能な、下記化学式（１）：
【００４８】
【化１３】
【００４９】
（式中、ｎは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むポリエステルを提供している。この３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットには、付加反応などにおける、反応性が高く、様々な官能基の導入や化学的変換を施すことが可能なビニル基が、芳香環であるフェニル基上、ｐ位に存在しており、フェニル基の存在によって、ガラス転移温度や融点が高く、加工性も良いとうい加工特性を有する上に、前記ビニル基を利用して、様々な官能基の導入や化学的変換を施すことで、新規な機能を付与する上でも有用なものとなる。
【００５０】
なお、化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルにおいて、その他のユニットを含むものであってもよく、通常、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットをも若干含有するＰＨＡ型のポリエステルであってもよい。但し、化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットの含有比率は、少なくとも、１ユニット％以上、通常は、主成分、すなわち、少なくとも５０ユニット％以上、できれば、７０ユニット％以上となるものがガラス転移温度や融点の高さ、加工性の良さを付与する上では好ましい。
【００５１】
具体的には、化学式（１）のユニットの含有比率は、その他のユニットとして、化学式（２）：
【００５２】
【化１４】
【００５３】
（式中、ｍは、０〜８の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニットのみを含むＰＨＡである場合には、７０ユニット％以上であることが望ましい。しかしながら、化学式（１）のユニット以外のユニットとして、同じくフェニル基をその側鎖に有するユニットを含む際には、化学式（１）のユニットとそれらフェニル基をその側鎖に有するユニットの含有率の総和が、７０ユニット％以上となることが望ましい。なお、ＰＨＡの用途や、化学式（１）のユニットの利用目的によっては、必ずしも、化学式（１）のユニット自体の含有比率は、高い含有比率を必要としないこともある。ただし、化学式（１）のユニットの含有比率が、１ユニット％に満たないものでは、ポリマー全体にかかるユニットが存在することによる特性が発揮されなくなる。
【００５４】
化学式（１）のユニットと類似するフェニル基をその側鎖に有するユニット以外に、その他の成分として含有される３−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、その側鎖は、炭素数１〜９の範囲の直鎖アルキル基である、上記の化学式（２）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニットであることが望ましい。この種の飽和な側鎖を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、ビニル基のような高い反応性を有していないので、様々な官能基の導入や化学的変換を施す際、不要な反応を起こさず、目的とするビニル基に選択的に反応を起こすことを可能とする。なお、本発明のＰＨＡ型のポリエステルは、溶融成形して、種々の最終製品に加工するが、その分子量が過度に大きいものであると、フェニル基によるガラス転移温度や融点の上昇作用が必要以上に働き、適度な溶融温度範囲を超えてしまうものとなる。その点をも考慮すると、数平均分子量が、３０００〜５０００００の範囲のものは、好適なものとなる。
【００５５】
以下に、本発明のポリエステルを製造する方法について、より詳細に説明する。本発明では、上記化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルを、微生物を利用して、生分解性を有するＰＨＡ型のポリエステルとして生産することができる。具体的には、原料として、下記化学式（４）：
【００５６】
【化１５】
【００５７】
（式中、ｐは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を用い、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、対応する化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットに変換させ、それを含むＰＨＡ型のポリエステルを生産・蓄積させる。
【００５８】
例えば、下記化学式（５）：
【００５９】
【化１６】
【００６０】
に示す５−（４−ビニルフェニル）吉草酸を原料として用いる場合には、化学式（３）：
【００６１】
【化１７】
【００６２】
で示される３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００６３】
また、下記化学式（６）：
【００６４】
【化１８】
【００６５】
に示す８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸を原料として用いる場合には、化学式（７）：
【００６６】
【化１９】
【００６７】
で示される３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット、ならびに化学式（８）：
【００６８】
【化２０】
【００６９】
で示される３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００７０】
また、下記化学式（９）：
【００７１】
【化２１】
【００７２】
で示される１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸を原料として用いる場合には、化学式（１０）：
【００７３】
【化２２】
【００７４】
で示される３−ヒドロキシ−１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸ユニット、化学式（７）：
【００７５】
【化２３】
【００７６】
で示される３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット、ならびに化学式（８）：
【００７７】
【化２４】
【００７８】
で示される３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００７９】
更に、下記化学式（１１）：
【００８０】
【化２５】
【００８１】
で示される１１−（４−ビニルフェニル）ウンデカン酸を原料として用いる場合には、化学式（１２）：
【００８２】
【化２６】
【００８３】
で示される３−ヒドロキシ−９−（４−ビニルフェニル）ノナン酸ユニット、化学式（１３）：
【００８４】
【化２７】
【００８５】
で示される３−ヒドロキシ−７−（４−ビニルフェニル）ヘプタン酸ユニット、ならびに化学式（３）：
【００８６】
【化２８】
【００８７】
で示される３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００８８】
以上に例示するように、本発明の製造方法を利用すると、原料に用いるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に対して、生産されるＰＨＡ型のポリエステルに含有される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットは、対応する炭素鎖長を保持するものに加えて、側鎖の炭素鎖長が、炭素数２づつ短縮されたユニットをも含むＰＨＡ型のポリエステルも得られる。
【００８９】
一般に、生産されるＰＨＡ型のポリエステルは、側鎖に、３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットの４−ビニルフェニル基など疎水性の原子団を有するので、水溶性は乏しく、ＰＨＡ産生能を有する微生物の菌体内に蓄積されるので、培養により増殖させ、目的のＰＨＡ型のポリエステルを生産・蓄積している菌体を集菌することで、培地と分離が容易になされる。集菌した培養菌体を、洗浄・乾燥した後、目的のＰＨＡ型のポリエステルを回収することができる。
【００９０】
培養された微生物細胞から目的のＰＨＡを回収する方法としては、通常行なわれている方法を適用することができる。例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトンなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、それ以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、次亜塩素酸塩、アンモニア、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理、あるいは超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法のいずれかの方法を用いて微生物細胞を物理的に破砕することによって、ＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【００９１】
本発明のポリエステルの製造方法で用いる微生物は、ＰＨＡ産生能を有する微生物、この場合、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中で培養することにより、化学式（１）で示す３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルを生産し得る微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。利用可能なＰＨＡ産生能を有する微生物の一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を挙げることができる。なかでも、ＰＨＡ産生能を有するものの、フェニル基上に置換しているビニル基に対しては、それを酸化する、あるいは、エポキシ化するなどの酵素反応性を示さない菌株がより好ましいものである。かかる微生物の一例として、シュードモナス チコリアイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓｅ）、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス ジェッセニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ）等に属するある種の微生物を挙げることができる。例えば、より好適な菌株として、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）を挙げることができる。
【００９２】
これら４種の菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所（旧 通商産業省 工業技術院） 生命工学工業技術研究所 特許微生物寄託センターに寄託されており、特開２００１−２８８２５６号公報に記載されている微生物である。
【００９３】
また、これら４種の微生物は、側鎖に、芳香環部分に置換基を有する３−ヒドロキシフェニルアルカン酸、３−ヒドロキシ−フェノキシアルカン酸、３−ヒドロキシフェニルスルファニルアルカン酸等のユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート型のポリエステルを生産する能力を有する微生物である。
【００９４】
なお、本発明のＰＨＡ型のポリエステルは、それを構成する化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニット、また、副次的に含有されるその他のユニット、例えば、化学式（２）で示される３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットは、共に、その３位の炭素原子は、不斉炭素となっている。この不斉中心に由来して、互いに絶対配置の異なる立体異性体が存在するものの、生分解性の観点では、含まれる全てのユニットにおいて、その立体異性体がR体となるものが最適である。
【００９５】
微生物を利用して、対応するアルカン酸から３−ヒドロキシ−アルカン酸へと変換しており、本発明の製造方法で得られるＰＨＡ型のポリエステルは、全てのユニットにおいてその立体異性体がR体となる特徴を有している。
【００９６】
本発明の製造方法では、上記するＰＨＡ産生能を有する微生物を、基質を含む培地中で培養するが、その際、微生物の培養条件は、下記するように選択することが望ましい。
【００９７】
目的とする化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルを生産するための基質、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を培地に含ませる際、培地中におけるその濃度は、０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは、０．０２％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。なお、化学式（１）で示す３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットの他、それ以外の３−ヒドロキシアルカン酸型のユニットをも含有するＰＨＡ型のポリエステルを生産させる際には、それ以外の３−ヒドロキシアルカン酸型のユニットに対応する基質、すなわち、対応するアルカン酸を培地に添加することができる。
【００９８】
また、培地には、微生物の増殖を促す基質として、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を添加することが可能である。すなわち、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素の形態で、ペプチド類をエネルギー源、炭素源として、添加することができる。
【００９９】
あるいは、培地には、微生物の増殖により消費されるエネルギー源、炭素源として、糖類、例えば、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、
グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、
グルコン酸等のアルドン酸、
グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、
マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等を用いることができる。
【０１００】
前記糖類に代えて、有機酸またはその塩、より具体的には、ＴＣＡサイクルに関与する脂肪酸、ならびに、ＴＣＡサイクルから１段階や２段階の少ない生化学的反応により誘導される脂肪酸、またはそれらの水溶性の塩を利用することができる。有機酸またはその塩として、例えば、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などのヒドロキシカルボン酸やオキソカルボン酸類またはその水溶性の塩を用いることが可能である。あるいは、アミノ酸またはその塩、例えば、アスパラギン酸やグルタミン酸等のアミノ酸またはその塩を用いることが可能である。有機酸またはその塩を添加する際には、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、ならびにその塩からなる群から、一種または複数種を選択し、培地に添加し、溶解させることがより好ましい。あるいは、アミノ酸またはその塩を添加する際には、アスパラギン酸、グルタミン酸ならびにそれらの塩からなる群から、一種または複数種を選択し、培地に添加し、溶解させることがより好ましい。その際、必要に応じて、全部または一部を水溶性の塩の形状で添加し、培地のｐＨに影響を与えず、均一に溶解させることもできる。
【０１０１】
微生物の増殖を促す基質として、培地に添加する、ペプチド類、糖類、有機酸またはその塩は、いずれを用いてもよく、二種以上を混用してもよい。なお、培地に対する、その添加量は、通常、０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。有機酸の塩を用いる際には、対応する有機酸に換算した添加量を意味する。二種以上を混用する際には、その添加量の合計を前記の範囲とすることが望ましい。
【０１０２】
本発明で用いる培地としては、リン酸塩、ならびにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地ならば、いかなる無機塩培地をも利用可能である。なお、培地に含有される、窒素源の濃度を調節することで、ＰＨＡの生産性を向上せしめることが可能である。
【０１０３】
培養温度は、利用する菌株に応じて、その菌株が良好に増殖可能な温度であれば、特に問題はないが、通常、１５℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。培養は、液体培地、固体培地を用いる培養など、培地中に基質を保持でき、また、用いる微生物の増殖が可能で、ＰＨＡの生産を行うことができる培養形態である限り、いかなる培養方法を用いることもできる。さらに、バッチ培養、フェド・バッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて、培地に酸素を供給する方法、ジャー・ファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法が好適に利用できる。
【０１０４】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる手法としては、上述する、所定の濃度で基質を添加した、リン酸塩、ならびにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地において、微生物を培養する、一段階培養法の他に、培養を二段階に分けて行う二段階培養法を採用することもできる。この二段階培養法では、一次培養として、所定の濃度で基質を添加した、リン酸塩、ならびにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地において、微生物を一旦十分に増殖させた後、二次培養として、培地に含まれる塩化アンモニウムのような窒素源を制限した上で、所定の濃度で基質を添加した培地に、一次培養で得られた菌体を移し、更に培養して、微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる。この二段階培養法を採用すると、目的とするＰＨＡの生産性が向上する場合がある。
【０１０５】
本発明の製造方法に利用可能な無機塩培地の一例として、後に述べる実施例において利用している無機塩培地（Ｍ９培地）の組成を以下に示す。
【０１０６】
（Ｍ９培地の組成）
Ｎａ2ＨＰＯ4 ：６．３
ＫＨ2ＰＯ4 ：３．０
ＮＨ4Ｃｌ ：１．０
ＮａＣｌ ：０．５ ｇ／Ｌ、
ｐＨ＝７．０
更には、良好な菌体の増殖、それに伴うＰＨＡの生産性の向上を図るためには、前記Ｍ９培地などの無機塩培地に対して、必須な微量金属元素などの必須微量元素を適量添加することが必要であり、以下に組成を示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加することが極めて有効である。かかる微量成分溶液の添加は、微生物の増殖に際して使用される微量金属元素などを供給するものである。
【０１０７】
（微量成分溶液の組成）
ニトリロ 三酢酸：１．５；
ＭｇＳＯ4：３．０； ＭｎＳＯ4：０．５； ＮａＣｌ：１．０；
ＦｅＳＯ4：０．１； ＣａＣｌ2：０．１； ＣｏＣｌ2：０．１；
ＺｎＳＯ4：０．１； ＣｕＳＯ4：０．１； ＡｌＫ（ＳＯ4）2：０．１；
Ｈ3ＢＯ3：０．１； Ｎａ2ＭｏＯ4：０．１； ＮｉＣｌ2：０．１ ｇ／Ｌ
【０１０８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、かかる実施例により限定を受けるものではない。
【０１０９】
（実施例１）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせた。
【０１１０】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び５−(４−ビニルフェニル)吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、４８時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄した。凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１１１】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、４０℃で２４時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１３９ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２２ ｍｇであった。
【０１１２】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝３７００，重量平均分子量 Ｍｗ＝８９００であった。
【０１１３】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。図１に、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。また、図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの各共鳴シグナルを与える水素原子の帰属を、表１（1Ｈ−ＮＭＲ）に示す。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
1Ｈ−ＮＭＲの帰属の結果、図１に示される各シグナルは、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットに由来することが確認された。また、得られたＰＨＡは、主構成ユニットとして、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを含み、その含有率は、少なくとも７３ユニット％以上であることが示された。なお、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニット以外の含まれるユニットは、芳香環（ベンゼン環）を有してなく、化学式（４）で示すことができる３−ヒドロキシアルカン酸ユニットと推定される。
【０１１６】
（実施例２）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、糖類としてグルコースを添加し、二段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせた。
【０１１７】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、グルコース０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、４８時間一次培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌した。
【０１１８】
次いで、５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、窒素源のＮＨ4Ｃｌ成分を含まないＭ９培地に対して、グルコース０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を添加して調製した培地２００ ｍＬに前記菌体を移し、３０℃、４８時間二次培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄した。凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１１９】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、４０℃で２４時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は２０３ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１７ ｍｇであった。
【０１２０】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝８１００，重量平均分子量 Ｍｗ＝１７０００であった。
【０１２１】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９７ユニット％以上であることが示された。
【０１２２】
（実施例３）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、有機酸としてピルビン酸ナトリウムを添加し、二段階培養法を適用して、微生物ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせた。
【０１２３】
実施例２で利用したグルコースに代えて、有機酸の一つであるピルビン酸ナトリウムを用い、培地に０．５％（ｗ／ｖ）添加し、この変更点以外の条件は、実施例２と同様にして、菌体を培養して、ＰＨＡを生産させた。なお、ピルビン酸は、グルコースの解糖系（または糖新生系）の経路に含まれるα−オキソカルボン酸である。また、乾燥菌体とした後、同じ手順・条件で、ポリマーを回収した。乾燥菌体の重量は１４５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２９ ｍｇであった。
【０１２４】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝７３００，重量平均分子量 Ｍｗ＝１６０００であった。
【０１２５】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１２６】
（実施例４）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１２７】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１２８】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１５５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２０ ｍｇであった。
【０１２９】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９９００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３９０００であった。
【０１３０】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１３１】
更に、得られたポリマーの示差走査熱量測定（DSC）を行った。装置はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社Ｐｙｒｉｓ１を用い、測定は−５０℃で１分保持→２０℃／分の速度で３５０℃まで昇温の条件で行った。得られたグラフを図２に示す。
【０１３２】
（実施例５）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、酵母エキスを添加し、一段階培養法を適用して、Ｐ１６１株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１３３】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＰ１６１株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１３４】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１３５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１６ ｍｇであった。
【０１３５】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝８９００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３２０００であった。
【０１３６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１３７】
（実施例６）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、酵母エキスを添加し、一段階培養法を適用して、Ｈ４５株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１３８】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び５−(４−ビニルフェニル)吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＨ４５株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１３９】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１２２ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１２ ｍｇであった。
【０１４０】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝２９０００であった。
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１４１】
（実施例７）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、酵母エキスを添加し、一段階培養法を適用して、Ｐ９１株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１４２】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９６時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１４３】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１０５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１１ ｍｇであった。
【０１４４】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９２００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３１０００であった。
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１４５】
（実施例８）
Ｍ９培地に、８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１４６】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９６時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１４７】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１７０ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２６ ｍｇであった。
【０１４８】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１２０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３８０００であった。
【０１４９】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、下記化学式（７）に示す３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット及び化学式（８）に示す３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを３０：７０の割合で含むＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、前記二種のユニットの含有比率の合計は、少なくとも９５ユニット％以上であることが示された。
【０１５０】
【化２９】
【０１５１】
【化３０】
【０１５２】
（実施例９）
Ｍ９培地に、１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１５３】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９６時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１５４】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１６０ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２３ ｍｇであった。
【０１５５】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１００００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３６０００であった。
【０１５６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、下記化学式（１０）に示す３−ヒドロキシ−１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸ユニット及び化学式（７）に示す３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット及び化学式（８）に示す３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを２０：３０：５０の割合で含むＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、前記三種のユニットの含有比率の合計は、少なくとも９７ユニット％以上であることが示された。
【０１５７】
【化３１】
【０１５８】
【化３２】
【０１５９】
【化３３】
【０１６０】
（実施例１０）
Ｍ９培地に、１１−（４−ビニルフェニル）ウンデカン酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１６１】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び１１−（４−ビニルフェニル）ウンデカン酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、１２０時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１６２】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１７０ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２６ ｍｇであった。
【０１６３】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１１０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３７０００であった。
【０１６４】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、下記化学式（１２）に示す３−ヒドロキシ−９−（４−ビニルフェニル）ノナン酸ユニット及び化学式（１３）に示す３−ヒドロキシ−７−（４−ビニルフェニル）ヘプタン酸ユニット及び化学式（３）に示す３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを１０：２０：７０の割合で含むＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、前記三種のユニットの含有比率の合計は、少なくとも９５ユニット％以上であることが示された。
【０１６５】
【化３４】
【０１６６】
【化３５】
【０１６７】
【化３６】
【０１６８】
（実施例１１）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、アミノ酸類としてグルタミン酸ナトリウムを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１６９】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、グルタミン酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１７０】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１４５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１８ ｍｇであった。
【０１７１】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９８００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３７０００であった。
【０１７２】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９７ユニット％以上であることが示された。
【０１７３】
（実施例１２）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、直鎖アルカン酸類としてｎ−ノナン酸を添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１７４】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ｎ−ノナン酸０．１％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９０時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１７５】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１６５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２６ ｍｇであった。
【０１７６】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１１０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３８０００であった。
【０１７７】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも７１ユニット％以上であることが示された。
【０１７８】
【発明の効果】
本発明のポリエステルは、上記する化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルであり、かかる側鎖に、ビニル基をその環上に置換基として有するベンゼン環を有しているＰＨＡ型のポリエステルは、従来報告されていないものである。本発明では、この新規な構成を有するＰＨＡ型のポリエステルを、基質として、対応するω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を用い、微生物により生分解性のＰＨＡ型のポリエステルとして生産させることを可能としている。かかる微生物により生産される、化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルは、その他に若干含有される他の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含め、その３位の不斉炭素における立体配置は、全てＲ体のものとなっており、立体異性の乱れによる加工性の低下もなく、生分解性を有する有用な材料となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で取得されたＰＨＡポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】実施例４で取得されたＰＨＡポリマーのＤＳＣチャートを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）型のポリエステルと、微生物を利用するその製造方法に関し、より具体的には、構成ユニットとして、３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルと、ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を原料として、ＰＨＡの産生能を有する微生物を利用し、構成ユニットとして、３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物が、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産し、その菌体内に蓄積することが報告されている（「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス， Ｐ１７８−１９７ （１９９５））。これらＰＨＡなどの微生物が産生するポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、微生物が産生するポリマー、例えば、ＰＨＡなどは、生分解性を有しており、自然界の微生物により完全分解されるという利点を有している。従って、例えば、微生物が産生するＰＨＡは、廃棄した際、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境にそのまま残留し、汚染を引き起こす要因となることがない。また、微生物が産生するＰＨＡは、一般に生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
この微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類、ならびに、培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることも知られている。これまで、主にＰＨＡの物性の改良という観点から、微生物産生ＰＨＡの組成や構造の制御を試みる研究がなされてきた。
【０００４】
微生物産生ＰＨＡの組成や構造の制御を目的とする研究の一つとして、近年、ユニット中に芳香環を有するＰＨＡを微生物に生産させる研究が盛んになされている。
【０００５】
Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９１， １９５７−１９６５ （１９９０）及びＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２４， ５２５６−５２６０ （１９９１）には、５−フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００６】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２９， １７６２−１７６６ （１９９６）には、５−（ｐ−トリル）吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−（ｐ−トリル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００７】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３２， ２８８９−２８９５ （１９９９）には、５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸ユニット、及び３−ヒドロキシ−５−（ｐ−ニトロフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００８】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ．， １９５， １６６５−１６７２ （１９９４）には、１１−フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナスオレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【０００９】
特許掲載公報 第２９８９１７５号には、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐ）ユニット、あるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐ）ユニットからなるホモポリマー；少なくとも、３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐユニットあるいは３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーの産生能を有するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた、前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されている。加えて、その発明の効果として、置換基を有する長鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端に、１から２個のフッ素原子が置換したフェノキシ基をもつポリマーを合成することができ、また、かかるポリマーは、融点が高い上、良い加工性を保持しつつ、加えて、立体規則性、撥水性を与えることができる点を記載している。
【００１０】
このユニット中の芳香環上にフッ素置換を有するフッ素置換ＰＨＡ以外に、ユニット中の芳香環上にシアノ基やニトロ基が置換したＰＨＡの研究もなされている。
【００１１】
Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４１， ３２−４３ （１９９５）及びＰｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ３９， ２０５−２１３ （１９９６）には、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２９３４７株及びシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４２株を用いて、オクタン酸と６−（ｐ−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸を基質として、３−ヒドロキシ−６−（ｐ−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは３−ヒドロキシ−６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００１２】
これら環状に置換基を持つ芳香環を有するユニットを含むＰＨＡは、ガラス転移温度が高く、加工性も良いという、芳香環に由来するポリマー性状を維持しつつ、芳香環上に存在している置換基に由来する新たな機能も付与された、多機能のＰＨＡとなる。
【００１３】
また、その一方で、ユニット中にビニル基を有するＰＨＡを基に、生産ポリマーに対して、前記ビニル基を利用する化学変換により任意の官能基をポリマー側鎖に導入し、多機能のＰＨＡを得ることを目的とした研究も盛んに行われている。
【００１４】
Ｐｏｌｙｍｅｒ， ４１， １７０３−１７０９ （２０００）には、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を用いて、側鎖にビニル基を有するポリエステルを生産し、ポリエステル分子内のビニル基を酸化することにより、水酸基を側鎖に有するポリエステルを生産したことが報告されている。
【００１５】
同じく、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３１， １４８０−１４８６ （１９９８）には、シュードモナス オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を用いて、側鎖にビニル基を有するポリエステルを生産し、ビニル基をエポキシ化することにより、エポキシ基を側鎖に有するポリエステルを生産したことが報告されている。
【００１６】
更に、Ｐｏｌｙｍｅｒ， ４０， ３７８７−３７９３ （１９９９）には、同様の方法で得られたエポキシ基を側鎖に有するポリマーを、ヘキサメチレンジアミンとともに加熱することで架橋反応を行い、その反応と、生成物についての解析が報告されている。
【００１７】
また、Ｐｏｌｙｍｅｒ， ３５， ２０９０−２０９７ （１９９４）には、ポリエステル側鎖のビニル基を利用し、ポリエステル分子内の架橋反応を行い、ポリエステルの物性を改良した研究に関する報告がなされている。
【００１８】
上に紹介した研究からも示されるように、ビニル基は、不飽和炭化水素基であるがゆえに、付加反応などにおける、反応性が高く、様々な官能基の導入や化学的変換を施すことが可能である。また、ポリマーの架橋反応の足がかり、架橋点ともなりうる。従って、ＰＨＡを構成するユニット内にビニル基を有することは、ポリマーの機能材料としての応用を考える上で、非常に有用であると言うことができる。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
従来報告されている、これらビニル基を有するポリエステルは、いずれもポリエステル骨格に直接結合した側鎖のアルキル鎖の先端にビニル基が置換した構造を有している。しかしながら、アルキル鎖からなる側鎖を有するポリエステルは、一般的に、ガラス転移温度や融点はそれ程高くなく、溶融加工する上では、熱的性質は必ずしも好ましいものでなく、フィルムや加工品等としては、優れた性状を有している材料は必ずしも多くない。一方、側鎖に芳香環を有するポリエステルは、既に述べたように、一般的に、ガラス転移温度や融点が高く加工品としての性状が良好であるという特色を有している。
【００２０】
すなわち、優れた加工性を有する、新たな機能性ポリマーを開発していく上では、芳香環とビニル基とを側鎖に併せ持つポリエステルの利用が望まれる。しかしながら、これまで、ポリエステルにおいて、芳香環とビニル基のような官能基を側鎖に導入したという報告はなされていない。
【００２１】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、側鎖上に芳香環及びビニル基を有するポリエステル、特には、生分解性を有するＰＨＡ型のポリエステルと、その製造方法を提供することにある。より具体的には、側鎖に、その環上にビニル基が置換している芳香環を有しているＰＨＡ型のポリエステルと、それを、微生物を利用して製造する方法の提供が、本発明の目的である。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を進めたところ、以下に示すような発明に至った。
【００２３】
すなわち、本発明のポリエステルは、ポリヒドロキシアルカノエート型のポリエステルであって、下記化学式（１）：
【００２４】
【化８】
（式中、ｎは０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルである。
【００２６】
本発明のポリエステルは、場合によっては、前記化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットユニット以外に、下記化学式（２）：
【００２７】
【化９】
（式中、ｍは、０〜８の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットを含んでいても良い。
【００２９】
このようなポリエステルの一例として、下記化学式（３）：
【００３０】
【化１０】
で示される３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルを挙げることができる。
【００３２】
上に述べた、本発明のポリエステルでは、数平均分子量は、３０００〜５０００００の範囲にあるものが好ましい。
【００３３】
加えて、本発明は、上記の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型ポリエステルを、微生物を利用して製造する方法をも提供しており、すなわち、本発明の微生物を用いたポリエステルの製造方法は、下記化学式（４）：
【００３４】
【化１１】
（式中、ｐは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を原料とし、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸から化学式（１）：
【００３６】
【化１２】
（式中、ｎは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルを生産する能力を有する微生物により、化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルを製造することを特徴とする、化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステルの製造方法である。
【００３８】
更に詳しくは、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とする前記ポリエステルの製造方法である。
【００３９】
本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、ペプチド類をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることができる。その際、培地中に含める前記ペプチド類として、ポリペプトンを用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４０】
また、本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、酵母エキスをも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４１】
本発明のポリエステルの製造方法においては、（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、有機酸またはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることができる。その際、例えば、培地中に含める前記有機酸またはその塩として、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、ならびにこれら有機酸の塩からなる群より選択される１つ以上を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４２】
本発明のポリエステルの製造方法においては、（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、アミノ酸またはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることができる。その際、例えば、培地中に含める前記アミノ酸またはその塩として、グルタミン酸、アスパラギン酸、ならびにこれらアミノ酸の塩からなる群より選択される１つ以上を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４３】
本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、糖類をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることもできる。その際、例えば、培地中に含める前記糖類として、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群より選択される１つ以上の糖類を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。
【００４４】
本発明のポリエステルの製造方法においては、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に加えて、炭素数４〜１２の直鎖アルカン酸またはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリエステルの製造方法とすることもできる。
【００４５】
なお、上記する種々の構成を有する本発明のポリエステルの製造方法では、前記化学式（４）で示すω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中で、前記微生物を培養し、前記微生物が産生した前記化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むポリエステルを微生物細胞から回収する工程を有することを特徴とするポリエステルの製造方法とするのが一般的である。
【００４６】
なお、本発明のポリエステルの製造方法では、前記微生物として、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とすることが好ましい。例えば、その際、前記微生物として、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１；ＦＥＲＭＢＰ−７３７３）のいずれが１つ以上の株を用いることを特徴とするポリエステルの製造方法とするとより好ましいものとなる。
【００４７】
【発明の実施の形態】
本発明は、側鎖に、その環上にビニル基が置換している芳香環を有しているＰＨＡ型の新規なポリエステルとして、下で述べる微生物を利用する製造方法によって製造可能な、下記化学式（１）：
【００４８】
【化１３】
（式中、ｎは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むポリエステルを提供している。この３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットには、付加反応などにおける、反応性が高く、様々な官能基の導入や化学的変換を施すことが可能なビニル基が、芳香環であるフェニル基上、ｐ位に存在しており、フェニル基の存在によって、ガラス転移温度や融点が高く、加工性も良いとうい加工特性を有する上に、前記ビニル基を利用して、様々な官能基の導入や化学的変換を施すことで、新規な機能を付与する上でも有用なものとなる。
【００５０】
なお、化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルにおいて、その他のユニットを含むものであってもよく、通常、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットをも若干含有するＰＨＡ型のポリエステルであってもよい。但し、化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットの含有比率は、少なくとも、１ユニット％以上、通常は、主成分、すなわち、少なくとも５０ユニット％以上、できれば、７０ユニット％以上となるものがガラス転移温度や融点の高さ、加工性の良さを付与する上では好ましい。
【００５１】
具体的には、化学式（１）のユニットの含有比率は、その他のユニットとして、化学式（２）：
【００５２】
【化１４】
（式中、ｍは、０〜８の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニットのみを含むＰＨＡである場合には、７０ユニット％以上であることが望ましい。しかしながら、化学式（１）のユニット以外のユニットとして、同じくフェニル基をその側鎖に有するユニットを含む際には、化学式（１）のユニットとそれらフェニル基をその側鎖に有するユニットの含有率の総和が、７０ユニット％以上となることが望ましい。なお、ＰＨＡの用途や、化学式（１）のユニットの利用目的によっては、必ずしも、化学式（１）のユニット自体の含有比率は、高い含有比率を必要としないこともある。ただし、化学式（１）のユニットの含有比率が、１ユニット％に満たないものでは、ポリマー全体にかかるユニットが存在することによる特性が発揮されなくなる。
【００５４】
化学式（１）のユニットと類似するフェニル基をその側鎖に有するユニット以外に、その他の成分として含有される３−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、その側鎖は、炭素数１〜９の範囲の直鎖アルキル基である、上記の化学式（２）で示される３−ヒドロキシアルカン酸ユニットであることが望ましい。この種の飽和な側鎖を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、ビニル基のような高い反応性を有していないので、様々な官能基の導入や化学的変換を施す際、不要な反応を起こさず、目的とするビニル基に選択的に反応を起こすことを可能とする。なお、本発明のＰＨＡ型のポリエステルは、溶融成形して、種々の最終製品に加工するが、その分子量が過度に大きいものであると、フェニル基によるガラス転移温度や融点の上昇作用が必要以上に働き、適度な溶融温度範囲を超えてしまうものとなる。その点をも考慮すると、数平均分子量が、３０００〜５０００００の範囲のものは、好適なものとなる。
【００５５】
以下に、本発明のポリエステルを製造する方法について、より詳細に説明する。本発明では、上記化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルを、微生物を利用して、生分解性を有するＰＨＡ型のポリエステルとして生産することができる。具体的には、原料として、下記化学式（４）：
【００５６】
【化１５】
（式中、ｐは、０〜７の範囲から任意に選ばれる１つ以上の整数である）
で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を用い、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、対応する化学式（１）の３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットに変換させ、それを含むＰＨＡ型のポリエステルを生産・蓄積させる。
【００５８】
例えば、下記化学式（５）：
【００５９】
【化１６】
に示す５−（４−ビニルフェニル）吉草酸を原料として用いる場合には、化学式（３）：
【００６１】
【化１７】
で示される３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００６３】
また、下記化学式（６）：
【００６４】
【化１８】
に示す８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸を原料として用いる場合には、化学式（７）：
【００６６】
【化１９】
で示される３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット、ならびに化学式（８）：
【００６８】
【化２０】
で示される３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００７０】
また、下記化学式（９）：
【００７１】
【化２１】
で示される１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸を原料として用いる場合には、化学式（１０）：
【００７３】
【化２２】
で示される３−ヒドロキシ−１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸ユニット、化学式（７）：
【００７５】
【化２３】
で示される３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット、ならびに化学式（８）：
【００７７】
【化２４】
で示される３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００７９】
更に、下記化学式（１１）：
【００８０】
【化２５】
で示される１１−（４−ビニルフェニル）ウンデカン酸を原料として用いる場合には、化学式（１２）：
【００８２】
【化２６】
で示される３−ヒドロキシ−９−（４−ビニルフェニル）ノナン酸ユニット、化学式（１３）：
【００８４】
【化２７】
で示される３−ヒドロキシ−７−（４−ビニルフェニル）ヘプタン酸ユニット、ならびに化学式（３）：
【００８６】
【化２８】
で示される３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルが、ＰＨＡ産生能を有する微生物により、生産・蓄積される。
【００８８】
以上に例示するように、本発明の製造方法を利用すると、原料に用いるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸に対して、生産されるＰＨＡ型のポリエステルに含有される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットは、対応する炭素鎖長を保持するものに加えて、側鎖の炭素鎖長が、炭素数２づつ短縮されたユニットをも含むＰＨＡ型のポリエステルも得られる。
【００８９】
一般に、生産されるＰＨＡ型のポリエステルは、側鎖に、３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットの４−ビニルフェニル基など疎水性の原子団を有するので、水溶性は乏しく、ＰＨＡ産生能を有する微生物の菌体内に蓄積されるので、培養により増殖させ、目的のＰＨＡ型のポリエステルを生産・蓄積している菌体を集菌することで、培地と分離が容易になされる。集菌した培養菌体を、洗浄・乾燥した後、目的のＰＨＡ型のポリエステルを回収することができる。
【００９０】
培養された微生物細胞から目的のＰＨＡを回収する方法としては、通常行なわれている方法を適用することができる。例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトンなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、それ以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、次亜塩素酸塩、アンモニア、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理、あるいは超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法のいずれかの方法を用いて微生物細胞を物理的に破砕することによって、ＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【００９１】
本発明のポリエステルの製造方法で用いる微生物は、ＰＨＡ産生能を有する微生物、この場合、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中で培養することにより、化学式（１）で示す３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルを生産し得る微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。利用可能なＰＨＡ産生能を有する微生物の一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を挙げることができる。なかでも、ＰＨＡ産生能を有するものの、フェニル基上に置換しているビニル基に対しては、それを酸化する、あるいは、エポキシ化するなどの酵素反応性を示さない菌株がより好ましいものである。かかる微生物の一例として、シュードモナス チコリアイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓｅ）、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス ジェッセニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ）等に属するある種の微生物を挙げることができる。例えば、より好適な菌株として、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）を挙げることができる。
【００９２】
これら４種の菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所（旧 通商産業省 工業技術院） 生命工学工業技術研究所 特許微生物寄託センターに寄託されており、特開２００１−２８８２５６号公報に記載されている微生物である。
【００９３】
また、これら４種の微生物は、側鎖に、芳香環部分に置換基を有する３−ヒドロキシフェニルアルカン酸、３−ヒドロキシ−フェノキシアルカン酸、３−ヒドロキシフェニルスルファニルアルカン酸等のユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート型のポリエステルを生産する能力を有する微生物である。
【００９４】
なお、本発明のＰＨＡ型のポリエステルは、それを構成する化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニット、また、副次的に含有されるその他のユニット、例えば、化学式（２）で示される３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットは、共に、その３位の炭素原子は、不斉炭素となっている。この不斉中心に由来して、互いに絶対配置の異なる立体異性体が存在するものの、生分解性の観点では、含まれる全てのユニットにおいて、その立体異性体がR体となるものが最適である。
【００９５】
微生物を利用して、対応するアルカン酸から３−ヒドロキシ−アルカン酸へと変換しており、本発明の製造方法で得られるＰＨＡ型のポリエステルは、全てのユニットにおいてその立体異性体がR体となる特徴を有している。
【００９６】
本発明の製造方法では、上記するＰＨＡ産生能を有する微生物を、基質を含む培地中で培養するが、その際、微生物の培養条件は、下記するように選択することが望ましい。
【００９７】
目的とする化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルを生産するための基質、化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を培地に含ませる際、培地中におけるその濃度は、０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは、０．０２％〜０．２％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。なお、化学式（１）で示す３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットの他、それ以外の３−ヒドロキシアルカン酸型のユニットをも含有するＰＨＡ型のポリエステルを生産させる際には、それ以外の３−ヒドロキシアルカン酸型のユニットに対応する基質、すなわち、対応するアルカン酸を培地に添加することができる。
【００９８】
また、培地には、微生物の増殖を促す基質として、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を添加することが可能である。すなわち、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素の形態で、ペプチド類をエネルギー源、炭素源として、添加することができる。
【００９９】
あるいは、培地には、微生物の増殖により消費されるエネルギー源、炭素源として、糖類、例えば、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、
グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、
グルコン酸等のアルドン酸、
グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、
マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等を用いることができる。
【０１００】
前記糖類に代えて、有機酸またはその塩、より具体的には、ＴＣＡサイクルに関与する脂肪酸、ならびに、ＴＣＡサイクルから１段階や２段階の少ない生化学的反応により誘導される脂肪酸、またはそれらの水溶性の塩を利用することができる。有機酸またはその塩として、例えば、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などのヒドロキシカルボン酸やオキソカルボン酸類またはその水溶性の塩を用いることが可能である。あるいは、アミノ酸またはその塩、例えば、アスパラギン酸やグルタミン酸等のアミノ酸またはその塩を用いることが可能である。有機酸またはその塩を添加する際には、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、ならびにその塩からなる群から、一種または複数種を選択し、培地に添加し、溶解させることがより好ましい。あるいは、アミノ酸またはその塩を添加する際には、アスパラギン酸、グルタミン酸ならびにそれらの塩からなる群から、一種または複数種を選択し、培地に添加し、溶解させることがより好ましい。その際、必要に応じて、全部または一部を水溶性の塩の形状で添加し、培地のｐＨに影響を与えず、均一に溶解させることもできる。
【０１０１】
微生物の増殖を促す基質として、培地に添加する、ペプチド類、糖類、有機酸またはその塩は、いずれを用いてもよく、二種以上を混用してもよい。なお、培地に対する、その添加量は、通常、０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。有機酸の塩を用いる際には、対応する有機酸に換算した添加量を意味する。二種以上を混用する際には、その添加量の合計を前記の範囲とすることが望ましい。
【０１０２】
本発明で用いる培地としては、リン酸塩、ならびにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地ならば、いかなる無機塩培地をも利用可能である。なお、培地に含有される、窒素源の濃度を調節することで、ＰＨＡの生産性を向上せしめることが可能である。
【０１０３】
培養温度は、利用する菌株に応じて、その菌株が良好に増殖可能な温度であれば、特に問題はないが、通常、１５℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。培養は、液体培地、固体培地を用いる培養など、培地中に基質を保持でき、また、用いる微生物の増殖が可能で、ＰＨＡの生産を行うことができる培養形態である限り、いかなる培養方法を用いることもできる。さらに、バッチ培養、フェド・バッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて、培地に酸素を供給する方法、ジャー・ファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法が好適に利用できる。
【０１０４】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる手法としては、上述する、所定の濃度で基質を添加した、リン酸塩、ならびにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地において、微生物を培養する、一段階培養法の他に、培養を二段階に分けて行う二段階培養法を採用することもできる。この二段階培養法では、一次培養として、所定の濃度で基質を添加した、リン酸塩、ならびにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地において、微生物を一旦十分に増殖させた後、二次培養として、培地に含まれる塩化アンモニウムのような窒素源を制限した上で、所定の濃度で基質を添加した培地に、一次培養で得られた菌体を移し、更に培養して、微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる。この二段階培養法を採用すると、目的とするＰＨＡの生産性が向上する場合がある。
【０１０５】
本発明の製造方法に利用可能な無機塩培地の一例として、後に述べる実施例において利用している無機塩培地（Ｍ９培地）の組成を以下に示す。
【０１０６】
（Ｍ９培地の組成）
Ｎａ2ＨＰＯ4 ：６．３
ＫＨ2ＰＯ4 ：３．０
ＮＨ4Ｃｌ ：１．０
ＮａＣｌ ：０．５ ｇ／Ｌ、
ｐＨ＝７．０
更には、良好な菌体の増殖、それに伴うＰＨＡの生産性の向上を図るためには、前記Ｍ９培地などの無機塩培地に対して、必須な微量金属元素などの必須微量元素を適量添加することが必要であり、以下に組成を示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加することが極めて有効である。かかる微量成分溶液の添加は、微生物の増殖に際して使用される微量金属元素などを供給するものである。
【０１０７】
（微量成分溶液の組成）
ニトリロ 三酢酸：１．５；
ＭｇＳＯ4：３．０； ＭｎＳＯ4：０．５； ＮａＣｌ：１．０；
ＦｅＳＯ4：０．１； ＣａＣｌ2：０．１； ＣｏＣｌ2：０．１；
ＺｎＳＯ4：０．１； ＣｕＳＯ4：０．１； ＡｌＫ（ＳＯ4）2：０．１；
Ｈ3ＢＯ3：０．１； Ｎａ2ＭｏＯ4：０．１； ＮｉＣｌ2：０．１ ｇ／Ｌ
【０１０８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、かかる実施例により限定を受けるものではない。
【０１０９】
（実施例１）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせた。
【０１１０】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び５−(４−ビニルフェニル)吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、４８時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄した。凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１１１】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、４０℃で２４時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１３９ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２２ ｍｇであった。
【０１１２】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝３７００，重量平均分子量 Ｍｗ＝８９００であった。
【０１１３】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。図１に、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを示す。また、図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの各共鳴シグナルを与える水素原子の帰属を、表１（1Ｈ−ＮＭＲ）に示す。
【０１１４】
【表１】
1Ｈ−ＮＭＲの帰属の結果、図１に示される各シグナルは、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットに由来することが確認された。また、得られたＰＨＡは、主構成ユニットとして、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを含み、その含有率は、少なくとも７３ユニット％以上であることが示された。なお、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニット以外の含まれるユニットは、芳香環（ベンゼン環）を有してなく、化学式（４）で示すことができる３−ヒドロキシアルカン酸ユニットと推定される。
【０１１６】
（実施例２）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、糖類としてグルコースを添加し、二段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせた。
【０１１７】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、グルコース０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、４８時間一次培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌した。
【０１１８】
次いで、５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、窒素源のＮＨ4Ｃｌ成分を含まないＭ９培地に対して、グルコース０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を添加して調製した培地２００ ｍＬに前記菌体を移し、３０℃、４８時間二次培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄した。凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１１９】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、４０℃で２４時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は２０３ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１７ ｍｇであった。
【０１２０】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝８１００，重量平均分子量 Ｍｗ＝１７０００であった。
【０１２１】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９７ユニット％以上であることが示された。
【０１２２】
（実施例３）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、有機酸としてピルビン酸ナトリウムを添加し、二段階培養法を適用して、微生物ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせた。
【０１２３】
実施例２で利用したグルコースに代えて、有機酸の一つであるピルビン酸ナトリウムを用い、培地に０．５％（ｗ／ｖ）添加し、この変更点以外の条件は、実施例２と同様にして、菌体を培養して、ＰＨＡを生産させた。なお、ピルビン酸は、グルコースの解糖系（または糖新生系）の経路に含まれるα−オキソカルボン酸である。また、乾燥菌体とした後、同じ手順・条件で、ポリマーを回収した。乾燥菌体の重量は１４５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２９ ｍｇであった。
【０１２４】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝７３００，重量平均分子量 Ｍｗ＝１６０００であった。
【０１２５】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１２６】
（実施例４）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１２７】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１２８】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１５５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２０ ｍｇであった。
【０１２９】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９９００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３９０００であった。
【０１３０】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１３１】
更に、得られたポリマーの示差走査熱量測定（DSC）を行った。装置はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社Ｐｙｒｉｓ１を用い、測定は−５０℃で１分保持→２０℃／分の速度で３５０℃まで昇温の条件で行った。得られたグラフを図２に示す。
【０１３２】
（実施例５）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、酵母エキスを添加し、一段階培養法を適用して、Ｐ１６１株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１３３】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＰ１６１株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１３４】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１３５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１６ ｍｇであった。
【０１３５】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝８９００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３２０００であった。
【０１３６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１３７】
（実施例６）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、酵母エキスを添加し、一段階培養法を適用して、Ｈ４５株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１３８】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び５−(４−ビニルフェニル)吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＨ４５株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１３９】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１２２ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１２ ｍｇであった。
【０１４０】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝２９０００であった。
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１４１】
（実施例７）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、酵母エキスを添加し、一段階培養法を適用して、Ｐ９１株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１４２】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９６時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１４３】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１０５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１１ ｍｇであった。
【０１４４】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９２００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３１０００であった。
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９９ユニット％以上であることが示された。
【０１４５】
（実施例８）
Ｍ９培地に、８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１４６】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９６時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１４７】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１７０ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２６ ｍｇであった。
【０１４８】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１２０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３８０００であった。
【０１４９】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、下記化学式（７）に示す３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット及び化学式（８）に示す３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを３０：７０の割合で含むＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、前記二種のユニットの含有比率の合計は、少なくとも９５ユニット％以上であることが示された。
【０１５０】
【化２９】
【化３０】
（実施例９）
Ｍ９培地に、１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１５３】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９６時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１５４】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１６０ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２３ ｍｇであった。
【０１５５】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１００００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３６０００であった。
【０１５６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、下記化学式（１０）に示す３−ヒドロキシ−１０−（４−ビニルフェニル）デカン酸ユニット及び化学式（７）に示す３−ヒドロキシ−８−（４−ビニルフェニル）オクタン酸ユニット及び化学式（８）に示す３−ヒドロキシ−６−（４−ビニルフェニル）ヘキサン酸ユニットを２０：３０：５０の割合で含むＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、前記三種のユニットの含有比率の合計は、少なくとも９７ユニット％以上であることが示された。
【０１５７】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
（実施例１０）
Ｍ９培地に、１１−（４−ビニルフェニル）ウンデカン酸と、ペプチド類としてポリペプトンを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１６１】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）及び１１−（４−ビニルフェニル）ウンデカン酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、１２０時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１６２】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１７０ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２６ ｍｇであった。
【０１６３】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１１０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３７０００であった。
【０１６４】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、下記化学式（１２）に示す３−ヒドロキシ−９−（４−ビニルフェニル）ノナン酸ユニット及び化学式（１３）に示す３−ヒドロキシ−７−（４−ビニルフェニル）ヘプタン酸ユニット及び化学式（３）に示す３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを１０：２０：７０の割合で含むＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、前記三種のユニットの含有比率の合計は、少なくとも９５ユニット％以上であることが示された。
【０１６５】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
（実施例１１）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、アミノ酸類としてグルタミン酸ナトリウムを添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１６９】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、グルタミン酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．０５％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、７２時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１７０】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１４５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は１８ ｍｇであった。
【０１７１】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝９８００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３７０００であった。
【０１７２】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも９７ユニット％以上であることが示された。
【０１７３】
（実施例１２）
Ｍ９培地に、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸と、直鎖アルカン酸類としてｎ−ノナン酸を添加し、一段階培養法を適用して、ＹＮ２株を培養して、ＰＨＡの生産を行わせたのち、クロロホルム抽出、アセトン抽出を行った。
【０１７４】
５００ ｍＬ容振とうフラスコを用いて、ｎ−ノナン酸０．１％（ｗ／ｖ）及び５−（４−ビニルフェニル）吉草酸０．１％（ｗ／ｖ）を含むＭ９培地２００ｍＬに、予め寒天プレート上で種菌培養したＹＮ２株のコロニーを植菌し、３０℃、９０時間培養を行った。培養後、遠心分離により培養菌体を集菌し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥した後、乾燥菌体重量を秤量した。
【０１７５】
乾燥菌体に、クロロホルムを加え、２５℃で７２時間ポリマーを抽出した。抽出後の破砕菌体を除去するため、ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過した。ポリマーの溶解するクロロホルム層を、エバポレーターにより濃縮した後、更にアセトンに溶解させ、不溶部分をろ過で除去し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈澱固化した部分を回収した。回収された沈澱物を減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は１６５ ｍｇ、得られたポリマーの重量（回収量）は２６ ｍｇであった。
【０１７６】
得られたポリマーの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。その結果、得られたポリマーは、数平均分子量 Ｍｎ＝１１０００，重量平均分子量 Ｍｗ＝３８０００であった。
【０１７７】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ−ＮＭＲ（FT−NMR：Bruker DPX400； 共鳴周波数：400MHz； 測定核種：1Ｈ； 使用溶媒：ＣＤＣｌ3； reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ3； 測定温度：室温）によって行った。その結果、上記実施例１に記載する1Ｈ−ＮＭＲシグナルに相当するスペクトルが観測され、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットを主構成ユニットとするＰＨＡであることが判明した。また、その強度から、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニットの含有比率は、少なくとも７１ユニット％以上であることが示された。
【０１７８】
【発明の効果】
本発明のポリエステルは、上記する化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルであり、かかる側鎖に、ビニル基をその環上に置換基として有するベンゼン環を有しているＰＨＡ型のポリエステルは、従来報告されていないものである。本発明では、この新規な構成を有するＰＨＡ型のポリエステルを、基質として、対応するω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を用い、微生物により生分解性のＰＨＡ型のポリエステルとして生産させることを可能としている。かかる微生物により生産される、化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むＰＨＡ型のポリエステルは、その他に若干含有される他の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含め、その３位の不斉炭素における立体配置は、全てＲ体のものとなっており、立体異性の乱れによる加工性の低下もなく、生分解性を有する有用な材料となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で取得されたＰＨＡポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】実施例４で取得されたＰＨＡポリマーのＤＳＣチャートを示す。
Claims (5)
- ポリヒドロキシアルカノエート型のポリエステルであって、
下記化学式（１）：
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含み、その含有比率の総和は、１ユニット％以上であることを特徴とするポリエステル。 - 化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニット以外に、下記化学式（２）：
で示される３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットを含むことを特徴とする請求項１に記載のポリエステル。 - 下記化学式（４）：
で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸を含む培地中において、
化学式（４）で示されるω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸から化学式（１）：
で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを分子中に含むポリエステルを生産する能力を有する微生物を培養する工程と、
前記微生物が産生する前記化学式（１）で示される３−ヒドロキシ−ω−（４−ビニルフェニル）アルカン酸ユニットを含むポリエステルを前記微生物から回収する工程とを有する
ことを特徴とするポリエステルの製造方法。 - 前記微生物として、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を用いる
ことを特徴とする請求項３に記載のポリエステルの製造方法。 - 前記微生物として、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１;ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１;ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）のいずれが１つ以上の株を用いる
ことを特徴とする請求項４に記載のポリエステルの製造方法。
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