JP3753938B2 - Method for point mutation of base using photoligating nucleoside-containing DNA - Google Patents

Description

【０００９】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有するヌクレオシドを用いる方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、前記した本発明の方法において、核酸類中の変換したい塩基として炭素−炭素二重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を有する塩基、例えばシトシンを点変異させる方法に関する。
本発明の方法を核酸類中の変換したい塩基としてシトシンを例にして具体的に説明する。図１は本発明の方法によりシトシンをウラシルに変換する方法を例示したものである。
まず、ステップ１においてシトシンを含有する核酸類のシトシンの直前までをテンプレートにハイブリダイズさせて固定し、ビニル基含有の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡを同様にテンプレートに固定する。ステップ２においてこれに光（例えば、波長３６６ｎｍの光）を照射してシトシンと光連結性ヌクレオシドのビニル基とでシクロブタン環を形成させる。ステップ３において、水などの酸素を含有する物質の存在下に加熱処理してシトシンの脱アミノ化を行う。脱アミノ化が終了したら、ステップ４においてシクロブタン環を解裂させるための光（例えば、波長３０２ｎｍの光）を照射して両者を切り放すとシトシンがウラシルに変換された核酸類を得ることができる。
【００１１】
本発明の方法をシトシンからウラシルへの変異を例としてさらに具体的に説明する。
シトシンを含有するＴＧＴＧＣの部分配列を有する核酸（ＯＤＮ １）を、その相補配列であるＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ ２）に配置する。次にビニル基含有の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡとして５−カルボキシビニルウラシルを塩基（下記化学式中ではＸで示されている。）を有するＸＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有するＤＮＡ（ＯＤＮ３）を配置する（ステップ１）。このときの各ＤＮＡの配置を次の化学式、
【００１２】
【化３】

【００１３】
に示す。式中のＯＤＮ１、ＯＤＮ２及びＯＤＮ３は前記したＤＮＡである。
このようにして、対象遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレート（ＯＤＮ ２）に固定化し、当該シトシンに隣接して光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡ（ＯＤＮ３）を配置して光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結する（ステップ２）。この連結した状態のときに、シトシンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結した状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水酸基に置換される（ステップ３）。そして、再度光を照射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変換されることになる（ステップ４）。
【００１４】
図２はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図２の横軸はリテンション時間（分）であり、図２の最上段は光照射前のステップ１の段階のチャートであり、図２の最上段の左からＯＤＮ３、ＯＤＮ２、ＯＤＮ１の各ピークが示されている。図２の上から２段目は波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャートである。光を照射した後も図２の最上段の左から２番目のＯＤＮ２のピーク（テンプレートのピーク）は光照射前と後で変化は無い。しかし図２の最上段の左側のＯＤＮ３のピーク及び右側のＯＤＮ１のピークは消失して新たにより右側にピークが出現してきている。この新たに出現したピークはＯＤＮ１とＯＤＮ３が連結した１７量体のものであり、このピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳによる測定値が５２４８．７４（計算値５２４９．５５（Ｍ−Ｈ））であったことにより確認された。
【００１５】
得られた１７量体をテンプレートから分離し、９０℃で２時間加熱した後のチャートが図２の上から３段目のものである。最も左のピークは内部標準として用いたチミンのピークであり、右側のピークがデアミネーションされた１７量体のものである。このものはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳによる測定値が５２５２．１（計算値５２５０．５（Ｍ−Ｈ））であったことにより確認された。
得られたデアミネーションされた１７量体に波長３０２ｎｍの光を１時間照射し、ポリＡを含む断片を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートが図２の最下段に示されている。左側にｄＵのピークを確認することができた。ｄＣのピークは消失し、ｄＵ：ｄＧ：ｄＴ：ｄＡ＝１：２：２：６であった。
【００１６】
シトシンがウラシルに変換されたＤＮＡを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、このウラシルの位置で特異的に切断することができる。したがって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置での特異的に切断することも可能となる。
前記の実験結果をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理により、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を図３に、図面に代わる写真で示す。
図３のＡの位置はウラシルの位置で切断された断片を示している。レーン１は反応前のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を１時間行った後のものである。レーン３はレーン２の後に９０度加熱を２時間行ったものである。レーン４はレーン３の後に３０２ｎｍの光照射を１時間行ったものである。レーン５はレーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものである。
レーン６はレーン２の後に９０度加熱を行わずに、３０２ｎｍの光照射を１時間行ったものであり、シトシンはウラシルに変換されていないものである。レーン７はレーン６の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものであり、ウラシルに変換されていないために切断された断片は得られていない。
レーン８は対照として５'−^３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものである。
【００１７】
この結果、コントロールのレーン８と、光反応実験で得られたレーン５のバンド（ウラシルでの切断）が一致した。レーン６、７のように９０度加熱を行わないと酵素で切断されないので、加熱によって、シトシンがウラシルに変換されていることがわかった。
このように９０℃での加熱を行わないとデアミネーションが進行せず、シトシンがウラシルに変換されないことがわかった。
【００１８】
そこで、デアミネーションの条件について検討した。
その結果のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析を図４に、図面に代わる写真で示す。レーン１は反応前のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を１時間行った後のものである。
レーン３はレーン２の後に９０度加熱を行わず、３０２ｎｍ光照射１時間、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理（３７度・１時間）、ピペリジン処理（９０度加熱・３０分）を行ったものである。
レーン４はレーン２の後に９０度加熱を１５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン５はレーン２の後に９０度加熱を３０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン６はレーン２の後に９０℃加熱を４５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン７はレーン２の後に９０度加熱を６０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン８はレーン２の後に９０度加熱を７５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン９はレーン２の後に９０度加熱を９０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン１０はレーン２の後に９０度加熱を１０５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン１１はレーン２の後に９０度加熱を１２０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。
レーン１２は対照として５'−^３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７度・１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものである。
【００１９】
この結果を定量化して示したものが図５である。図５の横軸は時間（分）であり、縦軸はデアミネーションされていないシトシンタイプの残量を％で示している。このデアミネーションされていないシトシンタイプの半減期は４０分（９０℃）であることがわかった。
このように、本発明の方法によれば、光連結性ヌクレオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに対するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成させ、加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシンの脱アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導が可能になる。この技術はフォトブランチング技術との組み合わせにより、ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）光誘導型変異蛋白の生産等への利用が期待される。
【００２０】
本発明の方法は、後処理の必要な化学活性化剤や使用条件に制限がかかる酵素を全く用いずに、光をトリガーとして用いるシトシンからウラシルへの点変異技術であり、環境にやさしい２１世紀型のバイオテクノロジー技術である。任意の位置のシトシンをウラシルへと点変異させる技術としても有用である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の光連結性ヌクレオシドは、塩基部分に次式、
【００２２】
【化４】

【００２３】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有することが好ましい。
置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したものに限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。
置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
【００２４】
本発明の核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ましい。
また、本発明の核酸類は、変換させる塩基だけを有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と共にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドになっているものが好ましい。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましくは１から１００００、より好ましくは１から３０００、さらに好ましくは１から１０００程度である。
また、本発明の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、またＰＮＡであってもよいが、その鎖中に少なくとも１個の光連結性ヌクレオシドを含有するものである。光連結性ヌクレオシドを含有する位置としては反応性に影響が無ければ特に制限は無いが、通常は５’又は３’末端が好ましい。本発明の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの長さも特に制限はないが、入手のし易さや取扱いの簡便さから、余り長くないのが好ましい。好ましい長さとしては、例えば、塩基数で１〜５０、１〜２５、５〜１５程度である。
【００２５】
本発明の光連結性ヌクレオシドは、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例えば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオチドとすることができる。
５−置換ビニルシトシン誘導体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造することができる。
【００２６】
本発明の方法における、変換させる塩基としては、炭素−炭素二重結合を有する塩基であるが、縮合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくなく、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよい。
【００２７】
本発明の方法における光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ましい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍで、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法は、溶液中のように自由に流動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げるためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプレートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好ましくは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる長さのものが好ましい。
テンプレートは１本鎖のものであってよいが、前述してきたようにテンプレートとして二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
【００２９】
本発明の方法における、変換させる塩基を含有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定化できるものであればどのようなものであってもよい。目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を有するものをテンプレートとして使用することができる。
本発明の化学的に変性する方法としては、加水分解、酸化反応、還元反応、アミノ化反応などの各種の化学反応が挙げられる。例えば、シトシンのアミノ基を加水分解して水酸基にする方法などが挙げられる。
この方法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空気中の酸素や加水分解のための水などを使用することができる。
この方法によって得られたウラシル化されたＤＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理をすることができる。
【００３０】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００３１】
【化５】

【００３２】
実施例１ ５−シアノビニルデオキシウリジン（４）の製造
（１） 化合物（２）の製造
５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロマト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：
0.04-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.93(s,9H,t-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),
3.74 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.87 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-3'), 6.25 (t,1H,H-1'),
8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,NH)
【００３３】
（２） 化合物（３）の製造
Ｐｄ（ＯＡｃ）_２（０．０１９ｇ，０．０８５ｍｍｏｌ），ＰＰｈ_３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた後、さらにＮＥｔ_３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液として加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，５３．７％）として単離した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：
0.03-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.91 (s,9H,t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),
3.76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-4'),
4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),
6.67 (dd,J=16.4Hz,1H,vinylic H-1''),
6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,vinylic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),
7.98 (br,1H,NH)
【００３４】
（３） 化合物（４）の製造
前記の（２）で得られた化合物（３）（０．２３３ｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in ＴＨＦ，１ｍｍｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ５％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ_３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．１２８ｇ，７５％）として単離した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：
2.15 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-5'),
3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1H,OH-5'),
5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),
7.22 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,H-6),
11.72 (br,1H,NH)
【００３５】
実施例２ ５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸（７）の製造
（１） 化合物（５）の製造
前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここへＮＥｔ_３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ_３）により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，４７．９％）として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：
2.38 (m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),
3.43 (dd,J=10.4Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),
4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,1H,H-3'),
6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-2''),
6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m,9H,phenyl),
7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
【００３６】
（２） 化合物（７）の製造
前記の（１）で得られた化合物（５）をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を用いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行った。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取り付けオリゴマー合成を行った。
ＤＮＡ合成機を用いてオリゴマー（５’−^ＣＮＵＧＣ ＧＴＧ）を合成し、ＨＰＬＣを用いて精製を行った。

【００３７】
前記した実施例２と同様の方法により、次の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製造した。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００３８】
【化６】

【００３９】
実施例３ 化合物（９）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着しフォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−^ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。

【００４０】
実施例４ 化合物（１０）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−^ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。

【００４１】
実施例５ 化合物（１１）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡを修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−^ＶＡＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。

【００４２】
実施例６ 枝分かれ構造の調製
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ １）及び、２０μＭの５’−^ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ ３）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ ２）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで同定を行った。

【００４３】
実施例７ ＤＮＡ鎖内部のシトシンをウラシルに変換（ＨＰＬＣ）
２０μＭ ＯＤＮ−１、２０μＭ ＯＤＮ−２、２０μＭ ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石英チューブに加え、氷上で３６６ｎｍの光照射を１時間行った後、ＨＰＬＣで、新しく現れた連結体のピークを分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８ ＭＳ column）。次に、この連結体８μＭ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む水溶液５０μＬを９０℃で２時間加熱し、新しく現れた、デアミネーション生成物を分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８−ＭＳ column）。このデアミネーションした連結体７μＭ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む水溶液２０μＬを石英チューブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行った後、ＨＰＬＣでウラシルを含んだピークを分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー）。単離したウラシルを含むＤＮＡ ７μＭを５μＬとって、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（snake venom phosphodiesterase）とアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）をそれぞれ１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温し、ＨＰＬＣで分析した（３−２０％ アセトニトリル、２０分、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８−ＭＳ column）。
【００４４】
結果を図２に示す。図２の最上段は反応前のチャートであり、上から２段目は波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャートであり、上から３段目は連結した１７量体を分離して９０℃で２時間加熱した後のものであり、最下段は波長３０２ｎｍの光を１時間照射し酵素分解した後のチャートである。
【００４５】
実施例８ ＤＮＡ鎖内部のシトシンをウラシルに変換（ゲル電気泳動）
１μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブに移し、９０℃で２時間加熱した後、再度、石英チューブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行った。さらに、反応液にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温した後、ピペリジンを５μＬ加えて９０℃で３０分加熱した。反応溶液をスピードバックで留去し、ローディングバッファーを加えて、７Ｍ 尿素（urea）を含んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動結果をＸ線フィルムで視覚化するため、−８０℃で一晩保存した。
【００４６】
結果を図３に示す。図３中の各レーンは次のとおりである。
レーン１：反応前
レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン３：レーン２の後に９０度加熱を２時間行った。
レーン４：レーン３の後に３０２ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン５：レーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行った。
レーン６：レーン２の後に９０度加熱を行わずに、３０２ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン７：レーン６の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行った。
レーン８：５'−^３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラー ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分 間行った。
この結果、コントロールのレーン８と、光反応実験で得られたレーン５のバンド（ウラシルでの切断）が一致した。レーン６、７のように９０度加熱を行わないと酵素で切断されないので、加熱によって、シトシンがウラシルに変換されていることがわかる。
【００４７】
実施例９ デアミネーションの時間変化の実験
１μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブに移し、９０℃で１５分間隔で２時間まで加熱した後、それぞれの時間の反応液を、石英チューブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行い、反応液にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温し、ピペリジンを５μＬ加えて９０℃で３０分加熱した。反応溶液をスピードバックで留去し、ローディングバッファーを加えて、７Ｍ ureaを含んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動結果をＸ線フィルムで視覚化するため、−８０℃で一晩保存し、デンシトメーターを用いてバンドを定量化した。
結果を図４及び図５に示す。図４の各レーンは次のとおりである。
レーン１：反応前
レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン３：レーン２の後に９０度加熱を行わず、３０２ｎｍ光照射１時間、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理（３７℃で１時間）、ピペリジン処理（９０度加熱・３０分）を行った。
レーン４：レーン２の後に９０度加熱を１５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン５：レーン２の後に９０度加熱を３０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン６：レーン２の後に９０℃加熱を４５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン７：レーン２の後に９０度加熱を６０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン８：レーン２の後に９０度加熱を７５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン９：レーン２の後に９０度加熱を９０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン１０：レーン２の後に９０度加熱を１０５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン１１：レーン２の後に９０度加熱を１２０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン１２：５'−^３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラ ーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３ ０分間行った。
【００４８】
【発明の効果】
本発明は、光による可逆的な核酸類の連結・解裂を利用した新規な点変異法を提供するものであり、本発明の方法は特定の位置の塩基を簡便な方法により特異的に点変異させることができる。本発明の方法は、酵素反応を使用する必要が無く、光を用いたユニークな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい方法である。
また、本発明の方法によれば、光連結性ヌクレオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに対するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成させ、加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシンの脱アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導することが可能になる。本発明の方法により得られたウラシル体は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行うことで任意の位置で特異的に切断することができる。このような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を特異的に変更することができる。さらに、本発明の方法は、フォトブランチング技術との組み合わせにより、ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）光誘導型変異蛋白の生産等への利用が期待される。
このように本発明の方法は、後処理の必要な化学活性化剤や使用条件に制限がかかる酵素を全く用いずに、光をトリガーとして用いるシトシンからウラシルへの点変異技術であり、環境にやさしい２１世紀型のバイオテクノロジー技術である。任意の位置のシトシンをウラシルへと点変異させる技術としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法によりシトシンをウラシルに変換する方法を化学反応式により具体的に説明するものである。
【図２】図２は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換したときの各ステップにおけるＨＰＬＣのチャートを示したものである。図２の上から、反応前のチャート、波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャート、連結した１７量体を分離して９０℃で２時間加熱した後のチャート、最下段は波長３０２ｎｍの光を１時間照射し酵素分解した後のチャートである。
【図３】図３は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換したときの各ステップにおける電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応を種々の反応時間で行った場合の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。レーン３は０分、レーン４からレーン１１はそれぞれ反応時間を１５分ずつ長くしたものである。
【図５】図５は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応におけるシトシン体の減少率（％）とウラシル体の生成率（％）を時間（分）に対してプロットしたグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for point-mutating a base at a specific position in nucleic acids such as DNA, RNA and PNA to another base, and a method for producing nucleic acids point-mutated by the method. More specifically, the present invention converts a base at a specific position in nucleic acids into another base in the absence of an enzyme using a photochemical reaction in the presence of DNA containing a photoligating nucleoside. The present invention relates to a method for point-mutating a base at a specific position in nucleic acids, and a method for producing nucleic acids point-mutated by the method.
[0002]
[Prior art]
The method of converting a base at a specific position in nucleic acids such as DNA and PNA (peptide nucleic acid) to other bases is to prepare mutated nucleic acids as point mutations or to analyze the functions of nucleic acids. It has been regarded as important for the technology.
However, since conventional point mutation techniques use enzyme reactions, they are not sufficient in terms of specificity and certainty, and their efficiency is not always sufficient. In addition, in the method using an enzyme reaction, a chemical activator that requires post-treatment must be used, which is costly and difficult to optimize and control reaction conditions, making it difficult to put it to practical use. .
In addition, it has not been possible to point-mutate only cytosine at any position to uracil. Although the conversion from cytosine to uracil is not at an arbitrary position, there is an example in which cytosine is mutated to uracil by pyrimidine dimer formation, deamination, and photocleavage by photolyase within the same chain. However, there was room for improvement in terms of using enzymes, competitive reaction with other sites, and low efficiency.
[0003]
On the other hand, the present inventors previously ligated and cleaved DNA containing a photoligating nucleoside and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond (DNA, PNA, etc.) by photochemical reaction. It has been found that this can be done specifically (see Japanese Patent Application No. 2000-67519).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a point mutation method that is simple, reliable, specific, low-cost and pollution-free, and uses a new technology that combines low-cost, pollution-free, simplicity, and correctness. We are aiming to develop a practical genetic manipulation method.
That is, the present invention provides a novel point mutation technique using a photochemical reaction.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors ligated DNA containing a photoligating nucleoside and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond (DNA, PNA, etc.) by photochemical reaction. In particular, it was found that specific point mutation can be performed by photochemical reaction without using an enzyme reaction. More specifically, light irradiation is performed on a nucleic acid having a pyridimine introduced with a vinyl derivative substituent at the 5-position to form a branched nucleic acid structure by photoligating the target DNA and any cytosine on the RNA. In order to fractionate with other cytosines, promote deamination using heat treatment, and finally to make specific and highly efficient point mutations to uracil by cleavage by short wavelength light irradiation. Successful.
[0006]
That is, the present invention irradiates a nucleic acid having a base to be converted in the presence of DNA containing a photoligating nucleoside by irradiating the nucleic acid with the base to be converted and the photoligating nucleoside, thereby chemically converting the base to be converted. A method for point mutation of a specific base in nucleic acids consisting of cleaving a base to be converted by photoirradiation and photoligation nucleoside after light denaturation, and nucleic acids that have been point-mutated by the method It relates to a method of manufacturing.
Furthermore, the present invention converts a base at a specific position in nucleic acids into another base in the absence of an enzyme using a photochemical reaction in the presence of DNA containing a photoligating nucleoside. The present invention relates to a method for point-mutating a base at a specific position in a nucleic acid, and a method for producing a nucleic acid point-mutated by the method.
[0007]
More specifically, the present invention provides a nucleic acid having a pyridimine introduced with a vinyl group, preferably a nucleic acid having a pyridimine introduced with a vinyl derivative substituent at the 5-position, as a photoligable nucleoside in the method of the present invention described above. The present invention relates to a method of using what is contained. More specifically, the present invention relates to a photolinkable nucleoside in the above-described method of the present invention.
[0008]
[Chemical 2]

[0009]
(In the formula, Z represents O or NH, at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group, and the remaining groups of X and Y represent a hydrogen atom.)
The present invention relates to a method using a nucleoside having a group represented by:
[0010]
The present invention also relates to a base having a carbon-carbon double bond, preferably a non-condensed ring-type carbon-carbon double bond, such as cytosine as a base to be converted in the nucleic acid in the above-described method of the present invention. It relates to a method of mutating.
The method of the present invention will be specifically described using cytosine as an example of a base to be converted in nucleic acids. FIG. 1 illustrates a method for converting cytosine to uracil by the method of the present invention.
First, in step 1, the nucleic acid containing cytosine is immobilized by hybridizing to the template until immediately before cytosine, and DNA containing a vinyl group-containing photoligating nucleoside is similarly immobilized on the template. In Step 2, this is irradiated with light (for example, light having a wavelength of 366 nm) to form a cyclobutane ring with cytosine and the vinyl group of the photoligating nucleoside. In step 3, deamination of cytosine is performed by heat treatment in the presence of an oxygen-containing substance such as water. When deamination is completed, in step 4, irradiation with light for cleaving the cyclobutane ring (for example, light with a wavelength of 302 nm) is performed, and both are cleaved to obtain nucleic acids in which cytosine is converted to uracil. .
[0011]
The method of the present invention will be described more specifically with an example of cytosine to uracil mutation.
A nucleic acid (ODN 1) having a TGTGC partial sequence containing cytosine is placed in a template (ODN 2) having a base sequence of ACACG and ACGCAC which are complementary sequences thereof. Next, DNA having a base sequence of XGCCGTG... (ODN3) having a base of 5-carboxyvinyluracil (shown as X in the following chemical formula) as a DNA containing a photolinkable nucleoside containing a vinyl group. (Step 1). The arrangement of each DNA at this time is represented by the following chemical formula:
[0012]
[Chemical 3]

[0013]
Shown in ODN1, ODN2 and ODN3 in the formula are the DNAs described above.
In this way, when up to the cytosine (C) base of the target gene is immobilized on the template (ODN 2), DNA (ODN3) containing a photoligating nucleoside is placed adjacent to the cytosine and irradiated with light. The target gene and the nucleic acid of the present invention are linked (step 2). In this linked state, the amino group at the 4-position of cytosine can be substituted with a hydroxyl group in the presence of an oxygen-containing substance such as oxygen or water. For example, when the temperature is raised gently in the air in the connected state, it is oxidized by air and the amino group at the 4-position of the pyrimidine ring of cytosine is substituted with a hydroxyl group (step 3). When light is irradiated again to cleave the connection, cytosine is converted to uracil (step 4).
[0014]
FIG. 2 is a HPLC chart showing the results. The horizontal axis in FIG. 2 is the retention time (minutes), the top row in FIG. 2 is a chart of the step 1 before light irradiation, and the peaks of ODN3, ODN2, ODN1 are shown from the left in the top row in FIG. It is shown. The second row from the top in FIG. 2 is a chart after irradiating light with a wavelength of 366 nm for 1 hour. Even after the light irradiation, the second ODN2 peak from the left in the uppermost stage of FIG. 2 (the peak of the template) does not change before and after the light irradiation. However, the ODN3 peak on the left side and the ODN1 peak on the right side in the uppermost stage in FIG. 2 have disappeared, and a new peak appears on the right side. This newly appearing peak was a 17-mer linked ODN1 and ODN3, and the measured value of this peak by MALDI-TOF MASS was 5248.74 (calculated value 5249.55 (M−H)). It was confirmed by this.
[0015]
The obtained 17-mer is separated from the template, and the chart after heating at 90 ° C. for 2 hours is the third row from the top of FIG. The leftmost peak is a thymine peak used as an internal standard, and the right peak is a deaminated 17-mer. This was confirmed by the fact that the measured value by MALDI-TOF MASS was 5252.1 (calculated value 5250.5 (M−H)).
The resulting deaminated 17-mer is irradiated with light having a wavelength of 302 nm for 1 hour, and the HPLC chart of the result of enzymatic treatment of the fragment containing poly A is shown at the bottom of FIG. A dU peak could be confirmed on the left side. The peak of dC disappeared and dU: dG: dT: dA = 1: 2: 2: 6.
[0016]
When DNA in which cytosine is converted to uracil is treated with uracil DNA glycosylase, it can be cleaved specifically at the position of this uracil. Therefore, DNA can be cleaved specifically at any position by uracilizing the position of any cytosine in the DNA according to the method of the present invention.
FIG. 3 shows a photograph replacing the drawing with the results of analyzing the experimental results treated with uracil DNA glycosylase and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis.
The position A in FIG. 3 shows a fragment cut at the position of uracil. Lane 1 is before the reaction. Lane 2 is after irradiating with 366 nm light for 1 hour. Lane 3 is obtained by heating 90 degrees after Lane 2 for 2 hours. Lane 4 is obtained by performing 302 nm light irradiation after lane 3 for 1 hour. Lane 5 is obtained by treating lane 4 with uracil DNA glycosylase (1 hour at 37 ° C.) and heating with piperidine at 90 ° C. for 30 minutes.
Lane 6 is obtained by performing light irradiation at 302 nm for 1 hour without heating at 90 degrees after Lane 2 and cytosine is not converted to uracil. Lane 7 was obtained by treating lane 6 with uracil DNA glycosylase (37 ° C. for 1 hour) and heating with piperidine at 90 ° C. for 30 minutes, so that a fragment cleaved because it was not converted to uracil was obtained. It is not done.
Lane 8 is 5'- as a control. ³² P-TGTGUAAAAAAA was treated with uracil DNA glycosylase (1 hour at 37 ° C.) and heated with piperidine at 90 ° C. for 30 minutes.
[0017]
As a result, the band of control lane 8 and the band of lane 5 obtained by the photoreaction experiment (cutting with uracil) coincided. As shown in lanes 6 and 7, since it was not cleaved by the enzyme unless it was heated at 90 degrees, it was found that cytosine was converted to uracil by heating.
Thus, it was found that deamination does not proceed unless heating at 90 ° C., and cytosine is not converted to uracil.
[0018]
Therefore, deamination conditions were examined.
The analysis by the resulting polyacrylamide gel electrophoresis is shown in FIG. 4 with a photograph replacing the drawing. Lane 1 is before the reaction. Lane 2 is after irradiating with 366 nm light for 1 hour.
Lane 3 is obtained by performing uracil DNA glycosylase treatment (37 degrees, 1 hour) and piperidine treatment (90 degrees heating, 30 minutes) after lane 2 without heating at 90 degrees, irradiation with 302 nm light for 1 hour.
Lane 4 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed for 15 minutes after Lane 2. Lane 5 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed for 30 minutes after Lane 2. Lane 6 is the same as Lane 3 except that 90 ° C. heating is performed after Lane 2 for 45 minutes. Lane 7 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed after Lane 2 for 60 minutes. Lane 8 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed for 75 minutes after Lane 2. Lane 9 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed after Lane 2 for 90 minutes. Lane 10 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed for 105 minutes after Lane 2. Lane 11 is the same as Lane 3 except that 90 ° heating is performed for 120 minutes after Lane 2.
Lane 12 is 5'- as a control. ³² P-TGGTGUAAAAAA was treated with uracil DNA glycosylase (37 degrees, 1 hour), and heated with piperidine at 90 degrees for 30 minutes.
[0019]
FIG. 5 shows the results quantified. The horizontal axis in FIG. 5 represents time (minutes), and the vertical axis represents the remaining amount of cytosine type that has not been deaminated in%. This deaminated cytosine type was found to have a half-life of 40 minutes (90 ° C.).
Thus, according to the method of the present invention, by photoirradiation of photoligated nucleoside-containing DNA, a cyclobutane reaction on the target cytosine is performed to form a branched nucleic acid, and heat treatment and chemical reaction treatment are performed to remove cytosine. It promotes amination and finally photocleavage, allowing DNA and any cytosine on RNA to be induced to uracil. This technology is expected to be used for i) phototranscription control, ii) phototranslation control, iii) production of light-induced mutant proteins, etc. in combination with photobranching technology.
[0020]
The method of the present invention is a point mutation technology from cytosine to uracil that uses light as a trigger without using any chemical activator that requires post-treatment or an enzyme that restricts the use conditions, and is an environmentally friendly 21st century. A type of biotechnology. It is also useful as a technique for point-mutating cytosine at any position to uracil.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The photolinkable nucleoside of the present invention contains
[0022]
[Formula 4]

[0023]
(In the formula, Z represents O or NH, at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group, and the remaining groups of X and Y represent a hydrogen atom.)
It preferably has a group represented by:
Examples of the electron-withdrawing group in the substituents X and Y include a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, a cyano group, and a nitro group, but are not limited to these examples, and are considered to be suitable for cell systems. Thus, an electron withdrawing group can be selected as appropriate. Preferred examples of the electron withdrawing group include a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, and a cyano group. Examples of the alkyl group in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl groups having 1 to 10, preferably 1 to 5 carbon atoms.
The substituents X and Y may be the same or different electron withdrawing groups at the same time, or only one of the substituents X and Y may be an electron withdrawing group and the other may be a hydrogen atom.
[0024]
The nucleic acids of the present invention may be any of DNA, RNA, PNA, etc., and those that can form base pairs with natural or synthetic DNA or RNA are preferred.
The nucleic acids of the present invention may be mononucleotides having only bases to be converted, but those that are oligonucleotides or polynucleotides together with other nucleic acids are preferred. The number of bases in the oligonucleotide or polynucleotide is not particularly limited, but is preferably 1 to 10,000, more preferably 1 to 3000, and still more preferably about 1 to 1000.
The DNA containing the photoligating nucleoside of the present invention may be DNA, RNA, or PNA, but contains at least one photoligating nucleoside in the chain. To do. The position containing the photolinkable nucleoside is not particularly limited as long as the reactivity is not affected, but the 5 ′ or 3 ′ end is usually preferred. The length of the DNA containing the photoligating nucleoside of the present invention is not particularly limited, but is preferably not too long from the viewpoint of easy availability and handling. The preferred length is, for example, about 1 to 50, 1 to 25, or 5 to 15 in terms of the number of bases.
[0025]
The photolinkable nucleoside of the present invention can be produced according to a normal method for producing nucleic acids. For example, an amidation agent is allowed to act on the DMTr body of 5-substituted vinyluridine to amidide, then the protecting group is cleaved, and this can be converted into an oligonucleotide by a usual DNA synthesis method.
The 5-substituted vinyl cytosine derivative or the 5-substituted vinyl uracil derivative may be produced by a specific method shown below, but can also be produced by other ordinary organic synthesis methods.
[0026]
In the method of the present invention, the base to be converted is a base having a carbon-carbon double bond, but a carbon-carbon double bond forming a condensed ring is not preferred, and a monocyclic carbon-carbon double bond is not preferable. A heavy bond or a carbon-carbon double bond substituted on a ring is preferred. Preferred bases having a carbon-carbon double bond include cytosine, thymine, uracil and the like in the natural form.
The nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond may be any of DNA, RNA, PNA and the like.
[0027]
The light in the method of the present invention may be light having a wavelength having energy necessary for the reaction, but ultraviolet light is preferable. In general, when they are connected, they may be on the relatively long wavelength side, and when they are cleaved, light on the relatively short wavelength side is preferred. More specifically, the wavelength when connecting is preferably 330 nm or more, preferably 350 nm or more, and more preferably 360 nm or more. The wavelength for cleavage is 320 nm or less, preferably 310 nm or less. Preferred examples of the wavelength include a case where the wavelength when coupled is 366 nm and the wavelength when cleaved is 302 nm.
[0028]
The method of the present invention can also be carried out in a state where it can flow freely as in a solution, but in order to increase the selectivity, a method of fixing to a template and reacting is preferred. Any template that can form a base pair such as DNA, RNA, or PNA may be used. The length of the template is not particularly limited, but a length of 3 bases or more, preferably 5 bases or more that can form a base pair on the template is preferable.
The template may be single-stranded, but double-stranded DNA can also be used as a template as described above.
[0029]
The nucleic acid containing the base to be converted in the method of the present invention may be any nucleic acid as long as it can be immobilized on the template. A base sequence of about 3 to 10 bases upstream or downstream from the position of the target cytosine is examined, and one having a complementary base sequence thereof can be used as a template.
Examples of the chemical modification method of the present invention include various chemical reactions such as hydrolysis, oxidation reaction, reduction reaction, and amination reaction. For example, a method of hydrolyzing the amino group of cytosine to form a hydroxyl group can be mentioned.
As the oxygen-containing material such as oxygen or water in this method, oxygen in the air, water for hydrolysis, or the like can be used.
The uracilized DNA obtained by this method can be treated with uracil DNA glycosylase by a conventional method.
[0030]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
A reaction formula of a production example of a nucleic acid containing 5-cyanovinyldeoxyuridine is shown below. In the following description, the compound number shown in this reaction formula is used.
[0031]
[Chemical formula 5]

[0032]
Example 1 Production of 5-cyanovinyldeoxyuridine (4)
(1) Production of compound (2)
5-Iodo-deoxyuridine (IDU) (1) was azeotroped three times with 5 mL of pyridine, purged with nitrogen together with TBDMS-Cl (1.717 g, 11.40 mmol), and 5 mL of pyridine was added to obtain a homogeneous solution. A pyridine solution (5 mL) of imidazole (0.776 g, 11.39 mmol) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), pyridine was distilled off under reduced pressure, and the residue was extracted with ethyl acetate (20 mL × 3) and water (20 mL). The obtained organic layer was dried over magnesium sulfate, the solvent was removed, and the target compound (2) was then purified by column chromatography (silica gel, elution solvent hexane / ethyl acetate = 4: 1) as a white solid (1.661 g, 96.5%).
¹ 1 H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) Δ:
0.04-0.14 (m, 12H, CH3Six4), 0.88 (s, 9H, t-BuSi),
0.93 (s, 9H, t-BuSi), 1.96 (m, 1H, H-2β '), 2.28 (m, 1H, H-2α'),
3.74 (dd, J = 11.2Hz, J = 2.4Hz, 1H, H-5 '),
3.87 (dd, J = 11.2Hz, J = 2.4Hz, 1H, H-5 '),
3.97 (m, 1H, H-4 '), 4.38 (m, 1H, H-3'), 6.25 (t, 1H, H-1 '),
8.07 (s, 1H, H-6), 8.09 (br, 1H, NH)
[0033]
(2) Production of compound (3)
Pd (OAc) ₂ (0.019 g, 0.085 mmol), PPh ₃ (0.045 g, 0.170 mmol) was added into DMF (2.5 mL) under a nitrogen atmosphere, followed by more NEt. ₃ (0.93 mL, 6.672 mmol) was added and stirred in a 60 ° C. water bath. After the solution turned deep red, compound (2) obtained in (1) (0.498 g, 0.854 mmol) and acrylonitrile (0.7 mL, 10.63 mmol) were added as a DMF solution and stirred overnight. . After removing DMF under reduced pressure, extraction was performed with ethyl acetate (15 mL × 3) and water (15 mL), and the resulting organic layer was dried over magnesium sulfate and the solvent was removed again. The target compound (3) was isolated as a yellow solid (0.434 g, 53.7%) by column chromatography (silica gel, elution solvent hexane / ethyl acetate = 4: 1) with respect to the residue.
¹ 1 H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) Δ:
0.03-0.14 (m, 12H, CH3Six4), 0.88 (s, 9H, t-BuSi),
0.91 (s, 9H, t-BuSi), 2.00 (m, 1H, H-2'β), 2.39 (m, 1H, H-2'α),
3.76 (dd, 1H, H-5 '), 3.87 (dd, 1H, H-5'), 4.00 (m, 1H, H-4 '),
4.37 (m, 1H, H-3 '), 6.23 (t, 1H, H-1'),
6.67 (dd, J = 16.4Hz, 1H, vinylic H-1``),
6.85 (dd, J = 16.2Hz, 1H, vinylic H-2``), 7.96 (s, 1H, H-6),
7.98 (br, 1H, NH)
[0034]
(3) Production of compound (4)
To the compound (3) (0.233 g, 0.459 mmol) obtained in (2) above, 2.0 mL of TBAF (in THF, 1 mmol / l) was added and stirred at room temperature for 45 minutes, and then the solvent was removed. Column chromatography on silica gel (silica gel, elution solvent 5% MeOH in CHCl ₃ ) To isolate the desired compound (4) as a pale yellow solid (0.128 g, 75%).
¹ 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) Δ:
2.15 (m, 2H, H-2'αβ), 3.57 (m, 1H, H-5 '), 3.65 (m, 1H, H-5'),
3.80 (m, 1H, H-4 '), 4.23 (m, 1H, H-3'), 5.10 (t, 1H, OH-5 '),
5.26 (d, 1H, OH-3 '), 6.08 (t, J = 6.4Hz, 1H, H-1'),
6.50 (dd, J = 1.6Hz, J = 14Hz, 1H, vinylic H-1``),
7.22 (dd, J = 1.6Hz, J = 14Hz, 1H, vinylic H-2``), 8.33 (s, 1H, H-6),
11.72 (br, 1H, NH)
[0035]
Example 2 Production of nucleic acid (7) containing 5-cyanovinyldeoxyuridine
(1) Production of compound (5)
After boiling the compound (4) obtained in Example 1 (0.096 g, 0.344 mmol) with 2 mL of pyridine three times, DMTr-Cl (0.133 g, 0.392 mmol), Under a nitrogen atmosphere with DMAP (0.025 g, 0.203 mmol). Pyridine (1 mL) was added and stirred to obtain a homogeneous solution. Further NEt here ₃ (0.05 mL, 0.359 mmol) was added and stirred at room temperature for 20 hours. After removing pyridine under reduced pressure, extraction was performed with chloroform (10 mL × 3) and water (10 mL), and the resulting organic layer was dried over sodium sulfate to remove the solvent. Column chromatography on the residue (silica gel, elution solvent 3% MeOH in CHCl ₃ ) Gave the desired compound (5) as a yellow solid (0.096 g, 47.9%).
¹ 1 H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) Δ:
2.38 (m, 1H, H-2'β), 2.49 (m, 1H, H-2'α),
3.43 (dd, J = 10.4Hz, J = 2.4Hz, 1H, H-5 '),
3.52 (dd, J = 2.4Hz, J = 10.4Hz, 1H, H-5 '), 3.80 (s, 6H, OCH3x2),
4.11 (m, 1H, H-4 '), 4.68 (m, 1H, H-3'),
6.50 (d, J = 14Hz, 1H, vinylic H-1``), 6.08 (t, J = 6.4Hz, 1H, H-1 '),
7.22 (d, J = 14Hz, 1H, vinylic H-2``),
6.84-6.87 (m, 4H, H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m, 9H, phenyl),
7.98 (br, 1H, NH), 8.00 (s, 1H, H-6)
[0036]
(2) Production of compound (7)
The compound (5) obtained in the above (1) was transferred to a rubber shield bottle using acetonitrile, and then the pressure was reduced to remove the solvent, and an argon atmosphere was obtained. Acetonitrile (1 mL) was added to dissolve the solid, then an amidite forming agent (50 uL) and tetrazole (0.5 M, 360 uL) were added in this order, and the mixture was stirred for 90 minutes. NaHCO in advance ₃ Ethyl acetate washed with aqueous solution and saturated NaHCO 3 ₃ Extraction operation was performed using an aqueous solution, and the obtained organic layer was dried over sodium sulfate to remove the solvent. The obtained solid was transferred to a rubber shield bottle using acetonitrile, and the solvent was removed under reduced pressure. Further, the azeotropic operation with acetonitrile was performed twice. Without further purification, it was attached to a DNA synthesizer and oligomer synthesis was carried out.
Using a DNA synthesizer, an oligomer (5'- ^CN UGC GTG) was synthesized and purified using HPLC.

[0037]
By the same method as in Example 2, the compounds (9) to (11) shown in the following reaction formula were produced. In the following description, the compound number shown in this reaction formula is used.
[0038]
[Chemical 6]

[0039]
Example 3 Production of Compound (9)
A commercially available amidite (7) was attached to an automatic DNA synthesizer, and DNA was synthesized by the phosphoramidite method. The DNA was excised and deprotected by performing ammonia treatment from the solid phase carrier at 65 ° C. for 4 hours. After the ammonia is distilled off, purification is performed by HPLC, and the target DNA (5′- ^VC UGCGTG-3 ′) was obtained.

[0040]
Example 4 Production of Compound (10)
A commercially available amidite (7) was attached to an automatic DNA synthesizer, and DNA was synthesized by the phosphoramidite method using an amidite that can be deprotected under mild conditions. The DNA was excised and deprotected by performing ammonia treatment from the solid phase carrier at 37 ° C. for 1 hour. After the ammonia is distilled off, purification is performed by HPLC, and the target DNA (5′- ^VM UGCGTG-3 ′) was obtained.

[0041]
Example 5 Production of Compound (11)
A commercially available amidite (7) was mounted on an automatic DNA synthesizer, and DNA was synthesized by the phosphoramidite method. The DNA was modified, excised and deprotected by heating from a solid phase carrier with a 2N solution of trimellylenediamine in a sealed condition at 65 ° C. for 4 hours. After neutralization with 1N acetic acid, methanol and water were distilled off, purification was performed by HPLC, and the target DNA (5′- ^VA UGCGTG-3 ′) was obtained.

[0042]
Example 6 Preparation of a branched structure
20 μM 5′-TGTGCAAAAA-3 ′ (ODN 1) and 20 μM 5′- ^VC UGCGTG-3 ′ (ODN 3) was irradiated with light at 366 nm for 1 hour at 0 ° C. in the presence of 20 μM template DNA 5′-CACGCAGGCACA-3 ′ (ODN 2), and 98% of the DNA having the desired branched structure was obtained. % Yield. Identification was performed by measuring branched DNA isolated by HPLC.

[0043]
Example 7 Conversion of cytosine in DNA strand to uracil (HPLC)
After adding 50 μL of an aqueous solution containing 20 μM ODN-1, 20 μM ODN-2, 20 μM ODN-3, 50 mM sodium cacodylate (pH 7.0), 100 mM NaCl to a quartz tube and performing light irradiation at 366 nm on ice for 1 hour, The newly appeared peak of the conjugate was separated and purified by HPLC (6-14% acetonitrile, 60 min, 50 mM ammonium formate buffer, 5C18 MS column). Next, 50 μL of an aqueous solution containing 8 μM of this conjugate and 50 mM sodium cacodylate (pH 7.0) was heated at 90 ° C. for 2 hours, and a deamination product that newly appeared was separated and purified (6-14% acetonitrile, 60 min, 50 mM ammonium formate buffer, 5C18-MS column). A 20 μL aqueous solution containing 7 μM of this deaminated conjugate and 50 mM sodium cacodylate (pH 7.0) was irradiated with light at 302 nm at room temperature for 1 hour using a quartz tube, and then a peak containing uracil was obtained by HPLC. Separated and purified (6-14% acetonitrile, 60 min, 50 mM ammonium formate buffer). Take 5 μL of 7 μM of DNA containing isolated uracil, add 1 μL (1 unit) each of snake venom phosphodiesterase and alkaline phosphatase, heat at 37 ° C. for 1 hour, and analyze by HPLC. (3-20% acetonitrile, 20 min, 50 mM ammonium formate buffer, 5C18-MS column).
[0044]
The results are shown in FIG. The top row in FIG. 2 is a chart before the reaction, the second row from the top is a chart after irradiating light with a wavelength of 366 nm for 1 hour, and the third row from the top is 90% after separating the connected 17-mer. The chart is after 2 hours of heating at 0 ° C., and the lowermost chart is a chart after enzymatic degradation by irradiating light with a wavelength of 302 nm for 1 hour.
[0045]
Example 8 Conversion of cytosine in DNA strand to uracil (gel electrophoresis)
50 μL of an aqueous solution containing 1 μM ODN-1, 7 μM ODN-2, 7 μM ODN-3, 50 mM sodium cacodylate (pH 7.0), 100 mM NaCl was added to a quartz tube, and irradiation with light at 366 nm was performed for 1 hour on ice. Next, this reaction solution was transferred to an Eppendorf tube, heated at 90 ° C. for 2 hours, and then again irradiated with 302 nm light at room temperature for 1 hour using a quartz tube. Further, 1 μL (1 unit) of uracil DNA glycosylase was added to the reaction solution and heated at 37 ° C. for 1 hour, and then 5 μL of piperidine was added and heated at 90 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was distilled off by speedback, loading buffer was added and analyzed by 15% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7M urea (urea). In order to visualize the electrophoresis results on X-ray film, it was stored at −80 ° C. overnight.
[0046]
The results are shown in FIG. Each lane in FIG. 3 is as follows.
Lane 1: Before reaction
Lane 2: 366 nm light irradiation was performed for 1 hour.
Lane 3: 90 degree heating was performed for 2 hours after Lane 2.
Lane 4: After lane 3, irradiation with 302 nm light was performed for 1 hour.
Lane 5: Lane 4 was treated with uracil DNA glycosylase after lane 4 (1 hour at 37 ° C.), and heated at 90 ° C. with piperidine for 30 minutes.
Lane 6: Light irradiation at 302 nm was performed for 1 hour without heating at 90 degrees after Lane 2.
Lane 7: Lane 6 was treated with uracil DNA glycosylase after lane 6 (1 hour at 37 ° C.), and heated at 90 ° C. with piperidine for 30 minutes.
Lane 8: 5'- ³² P-TGGTGUAAAAAA was treated with uracil DNA glycosylase (1 hour at 37 ° C.), and heated at 90 ° C. with piperidine for 30 minutes.
As a result, the band of control lane 8 and the band of lane 5 obtained by the photoreaction experiment (cutting with uracil) coincided. As shown in lanes 6 and 7, since the enzyme is not cleaved unless it is heated at 90 degrees, it can be seen that the cytosine is converted to uracil by heating.
[0047]
Example 9 Experiment of time variation of deamination
50 μL of an aqueous solution containing 1 μM ODN-1, 7 μM ODN-2, 7 μM ODN-3, 50 mM sodium cacodylate (pH 7.0), 100 mM NaCl was added to a quartz tube, and irradiation with light at 366 nm was performed for 1 hour on ice. Next, this reaction solution was transferred to an Eppendorf tube, heated at 90 ° C. at 15-minute intervals for 2 hours, and then each reaction solution was irradiated with 302 nm light at room temperature for 1 hour using a quartz tube. Then, 1 μL (1 unit) of uracil DNA glycosylase was added to the reaction solution, heated at 37 ° C. for 1 hour, 5 μL of piperidine was added, and the mixture was heated at 90 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was distilled off by speedback, loading buffer was added, and analysis was performed by 15% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7M urea. In order to visualize the electrophoretic results on X-ray film, it was stored overnight at -80 ° C, and the band was quantified using a densitometer.
The results are shown in FIGS. Each lane in FIG. 4 is as follows.
Lane 1: Before reaction
Lane 2: 366 nm light irradiation was performed for 1 hour.
Lane 3: After lane 2, heating at 90 ° C. was not performed, and irradiation with 302 nm light was performed for 1 hour, uracil DNA glycosylase treatment (1 hour at 37 ° C.) and piperidine treatment (heating at 90 ° C. for 30 minutes).
Lane 4: 90 degree heating was performed for 15 minutes after Lane 2. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 5: 90 degree heating was performed for 30 minutes after Lane 2. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 6: After Lane 2, heating at 90 ° C. was performed for 45 minutes. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 7: 90 degree heating was performed after Lane 2 for 60 minutes. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 8: 90 degree heating was performed after Lane 2 for 75 minutes. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 9: 90 degree heating was performed after Lane 2 for 90 minutes. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 10: 90 degree heating was performed for 105 minutes after Lane 2. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 11: 90 degree heating was performed for 120 minutes after Lane 2. Other than that, it is the same as Lane 3.
Lane 12: 5'- ³² P-TGTGUAAAAAAA was treated with uracil DNA glycosylase (1 hour at 37 ° C.) and heated with piperidine at 90 ° C. for 30 minutes.
[0048]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel point mutation method utilizing reversible ligation / cleavage of nucleic acids by light, and the method of the present invention specifically points a base at a specific position by a simple method. Can be mutated. Since the method of the present invention does not require the use of an enzyme reaction and synthesizes a nucleic acid having a unique structure using light, it is an environmentally friendly method.
In addition, according to the method of the present invention, deamination of cytosine is performed by light irradiation of photoligated nucleoside-containing DNA to form a branched nucleic acid by performing a cyclobutane reaction on the target cytosine, followed by heat treatment and chemical reaction treatment. , And finally photocleavage, allowing DNA and any cytosine on RNA to be directed to uracil. The uracil obtained by the method of the present invention can be specifically cleaved at an arbitrary position by performing uracil DNA glycosylase treatment. Such conversion can specifically change cytosine on mRNA as well as DNA to uracil and specifically change the genetic information of mRNA. Furthermore, the method of the present invention is expected to be used for i) optical transcription control, ii) optical translation control, iii) production of light-induced mutant proteins, etc. in combination with photobranching technology.
As described above, the method of the present invention is a point mutation technique from cytosine to uracil using light as a trigger without using any chemical activator that requires post-treatment or an enzyme that restricts the use conditions. It is a gentle 21st century biotechnology. It is also useful as a technique for point-mutating cytosine at any position to uracil.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 specifically explains a method for converting cytosine to uracil by the method of the present invention, using a chemical reaction formula.
FIG. 2 shows a HPLC chart at each step when cytosine in DNA is converted to uracil by the method of the present invention. From the top of FIG. 2, the chart before the reaction, the chart after irradiation with light of wavelength 366 nm for 1 hour, the chart after separating the connected 17-mer and heating at 90 ° C. for 2 hours, the bottom row is at a wavelength of 302 nm It is the chart after irradiating light for 1 hour and carrying out an enzymatic decomposition.
FIG. 3 is a photograph replacing a drawing, showing the result of electrophoresis in each step when cytosine in DNA was converted to uracil by the method of the present invention.
FIG. 4 is a photograph replacing a drawing, showing the results of electrophoresis when deamination reaction was carried out at various reaction times when cytosine in DNA was converted to uracil by the method of the present invention. It is. Lane 3 has a longer reaction time of 0 minutes, and Lanes 4 to 11 have a longer reaction time of 15 minutes.
FIG. 5 is a graph showing the reduction rate (%) of cytosine bodies and the production rate (%) of uracil bodies in the deamination reaction when cytosine in DNA is converted to uracil by the method of the present invention. It is a graph plotted against (min).

Claims (6)

Nucleic acids having cytosine as the base to be converted
Formula I:

(In the formula, Z represents O or NH, at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group, and the remaining groups of X and Y represent a hydrogen atom.)
In the presence of DNA containing a photoligating nucleoside having the group represented by A method for producing a nucleic acid in which a base in a nucleic acid is point-mutated, which comprises cleaving a base to be converted by light irradiation and a photoligating nucleoside.   The method according to claim 1, wherein the electron-withdrawing group is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group or a cyano group.   The method according to claim 1 or 2, wherein Z is O, X is a hydrogen atom, and Y is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group or a cyano group.   The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the chemically modifying method is deamination.   The method according to claim 1, wherein a template for immobilizing a part of the nucleic acids is used.   The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the nucleic acids are DNA, RNA, or PNA.

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