JP3759748B2

JP3759748B2 - 成長ホルモン放出性を有する化合物

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Publication number: JP3759748B2
Application number: JP51711095A
Authority: JP
Inventors: ランゲランヨハンセン，ニルス; ロー，イェスパー; マズセン，クエルド; フリードリッヒラント，ベレント; セーゲルセン，ヘニング; セヘステズハンセン，ビーギット
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2006-03-29
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: CN1138334A; TW438810B; UA45962C2; CN1052730C; HU221092B1; IL112111A; CZ291382B6; NO962664L; EP0736038B1; WO1995017422A1; FI962591L; DE69427650T2; CZ183396A3; PL181286B1; FI962591A0; AU683121B2; HUT74820A; FI962591A7; US5854211A; EP0736038A1

Description

発明の分野
本発明は、新規ペプチド誘導体、該ペプチド誘導体を含有する組成物および成長ホルモンの欠損から生じる医療疾患を治療するためのそれらの使用に関する。
発明の背景
成長ホルモンは、成長し得る全ての組織の成長を刺激するホルモンである。加えて、成長ホルモンは例えばタンパク質合成の刺激および遊離脂肪酸代謝の代謝プロセスに関する多くの効果を有すること並びに炭水化物から脂肪酸代謝へのエネルギー代謝におけるスイッチをもたらすことが知られている。成長ホルモンの欠損は多くのきびしい医療疾患、例えば小人症をもたらし得る。
成長ホルモンは、下垂体から放出される。放出は、直接に又は間接に多数のホルモンおよび神経伝達物質の厳しい制御下にある。成長ホルモン放出は、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）により刺激され得そしてソマトスタチンにより阻害される。両方の場合において、視床下部から放出されるがしかしそれらの作用は下垂体に位置する特異的レセプターを介して主に介在される。下垂体から成長ホルモンの放出を刺激する他の化合物もまた記載されている。例えば、アルギニン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドパ）、グルカゴン、バソプレシン、PACAP(下垂体アデニルイルシクラーゼ活性化ペプチド）、ムスカリン様のレセプターアゴニストおよび合成ヘキサペプチド、GHRP（成長ホルモン放出ペプチド）は、下垂体に対する直接の作用により又はGHRHおよび／又は視床下部からのソマトスタチンに影響することのいずれかにより内因性成長ホルモンを放出する。
成長ホルモンの増加したレベルが望まれる疾患又は状態において、成長ホルモンのタンパク質の性質は、非経口投与以外の他のものを実行不能にする。更に、他の直接作用する天然の分泌促進薬、例えばGHRHおよびPACAPはより長いポリペプチドでありこの理由によりそれらの経口投与は実用的でない。
哺乳動物における成長ホルモンのレベルを増加するより短いペプチドの使用がすでに提案されている、例えばヨーロッパ特許(EP）18072，EP 83864、国際公開(WO)89／07110，(WO)89／07111，(WO)89／10933，(WO)88／9780，(WO)83／02272，(WO)91／18016，(WO)92／01711 and (WO)93／04081において提案されている。
成長ホルモン放出ペプチド又はペプチド誘導体の組成は、それらの成長ホルモン放出性能力並びにそれらの生物適合性に対して重要である。従って、本発明の目的は、このタイプの公知のペプチドに関して改善された性質を有する成長ホルモン放出性を有するペプチドを提供することにある。
発明の要約
従って、本発明は一般式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ（−Ｆ）_P （Ｉ）
（式中、ｐは０又は１であり；
Ａはイミダゾリル−Ｃ_1-6アルカン酸、イミダゾリル−Ｃ_1-6アルケン酸、アミノ−Ｃ_1-6アルカン酸又はアミノ−Ｃ_1-6アルケン酸又はＨ−His，Ｈ−Ala，Ｈ−Ｄ−Ala，Ｈ−（β−アラニン）、Ｈ−Aib、サルコシンおよびGlyから成る群から選ばれるＬ−もしくはＤ−α−アミノ酸であり；
ＢはＤ−Trp，Ｄ−２Nal又はＤ−Pheであり；
ＣはAla，Ser又はGlyであり；
ＤはTrp，Phe，β−（２−チエニル）−アラニン、又はＮ−アラルキルグリシンであり；
Ｅはｐが１であるとき、Ｄ−Pheであるか、又はｐが０であるときＥは-NH-CH(CH₂-R³)-CO-R⁴又は-NH-CH(CH₂-R³)-CH₂-R⁴であり、ここでＲ₃はフェニルであり、そしてＲ⁴はピペラジノ、モルホリノ、ピペリジノ、−OH又は−N(R⁵)R⁶であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶の各々は独立に水素又は低級アルキルであり；
Ｆはｐが１であるとき-NH-CH(R¹⁰)-(CH₂)_v-R⁷)-であり、ここで
ｖは０又は１〜８の整数であり、そして
Ｒ⁷はイミダゾリル、ピペラジノ、モルホリノ、ピペリジノ又は-N(R⁸)-R⁹(ここで、Ｒ⁸およびＲ⁹の各々は独立に水素又は低級アルキルである）、又はアミノ基およびヘキサピラノース又は次式

のヘキサピラノシル−ヘキサピラノースからのアマドリ転位生成物であり、そして
Ｒ¹⁰は−Ｈ，−COOH，−CO−R¹¹，CH₂−R¹¹又は-CH₂−OHであり、ここでＲ¹¹はピペラジノ、モルホリノ、ピペリジノ又は−Ｎ(R¹²)−R¹³であり、ここでＲ¹²およびＲ¹³の各々は独立に水素又は低級アルキルであり；
但し、ＡとＢ、ＢとＣ、ＣとＤ、ＤとＥ又はｐが１であるとき、ＥとＦ間の少なくとも１つのアミド結合はアミノメチレンにより置換されているか又はｐが０であるとき、Ｅは-NH-CH(CH₂-R³)-CH₂-R⁴であるか又はｐが１であるとき、Ｒ¹⁰はCH₂-R¹¹である）
で表わされる化合物又はその医薬として許容し得る塩に関する。
次のように信じられている；すなわち、式Ｉのペプチド誘導体は、アミド結合（−CONH−）をアミノメチレン（−NH₂NH)で置換することによる胃腸の又はプラスマの酵素により又はＮ−アラルキルグリシンの導入によりタンパク質分解に改善された抵抗性を示す。本発明のペプチド誘導体のタンパク質分解に対する増加せしめられた抵抗性は、従来文献で示されたペプチドのそれと比較して生物適合性を改善することが期待される。
本発明において、語句「低級アルキル」は１〜６個の炭素原子を有するアルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル又はヘキシルを示すことが意図される。
発明の詳細な記載
式Ｉの化合物の好ましい態様において、ｐは１である。式Ｉの化合物の別の好ましい態様において、ＡはHis、Ｄ−Ala又はイミダゾリルプロピオン酸である。Ｂは好ましくはＤ−Trp又はＤ−２Nalである。Ｃは好ましくはAlaである。Ｎ−アラルキルグリシンの意味におけるＤは、好ましくはＮ−ベンジルグリシンである。Ｄは好ましくはTrpである。Ｅは好ましくはＤ−Pheである。Ｆの意味内において、ｖは好ましくは３〜６でありそしてＲ⁷は好ましくは−NH₂である。Ｒ¹⁰は好ましくは−CONH₂，−CH₂OHである。
本発明の特異的化合物の例は次の通りである：
H-HisΨ(CH₂NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂
H-His-D-TrpΨ(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂
H-His-D-Trp-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys-NH₂
H-His-D-Trp-Ala-TrpΨ(CH₂NH)D-Phe-Lys-NH₂
H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
H-D-Ala-D-2Nal-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys-NH₂
H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
（3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-OH
（3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
（3-(4-イミダゾリル）アクリロイル)-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
(2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-フェニルプロピルアミン
(2S)-(H-D-Ala-D-2Nal-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-アミノヘキサノール
H-D-Ala-D-2Nal-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH₂
4-(H-D-Ala-D-2Nal-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)ブチルアミン
(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-フェニルプロピルアミン
（(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-フェニルプロピルアミノ）へキシルアミン
(2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-フェニルプロピルアミン
(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-フェニルプロピルアミン
H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
（2S)-（(3-(4-イミダゾリル）プロピオニル）Ψ(CH₂NH)D-phe-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-アミノヘキサノール
（2S)-（(3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-PheΨ(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-アミノヘキサノール
（2S)-（(3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Phe-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-アミノヘキサノール
（2S)-（(3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Phe-Ala-TrpΨ(CH₂NH)D-Phe-NH)-6-アミノヘキサノール
（2S)-(2R)-((3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-フェニルプロピルアミノ)-6-アミノヘキサノール
3-（(3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Trp-Ala-Ψ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)プロピルアミン
（2S)-((3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Phe-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)NH)-6-アミノヘキサノール
（2S)-((3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Trp-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-アミノヘキサノール
3-（(3-(4-イミダゾリル）プロピオニル)-D-Trp-AlaΨ(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)プロピルアミン
H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheΨ(CH₂NH₂)
略記号
Ｄ−2Nal：Ｄ−２−ナフチルアミン
Ｎ−Bzl：Ｎ−ベンジルグリシン
Ｈ−Aib：Ｈ−アミノ−イソ酪酸
式Ｉの化合物は、溶液又は固相ペプチド合成の常法により製造できる。例えば、固相合成はスチュワードおよびヤング、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版ロックフォード出版、イリノイ州、米国、1976年により、実質的に記載される如く行うことができる。溶液ペプチド合成は、例えばボダンスキー等、Peptide Synthesis、第２版、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国、1976年により、実質的に記載される如く行なわれる。
アミド結合の置換としてのアミノメチレンは、Ｙ．ササキおよびP.H.コイ、Peptides ８（1），1987，119-121頁により記載される方法に従って導入できる。モノ−又はジ−ヘキサピラノース誘導化アミノ基を含有するペプチド誘導体は、Ｒ．アルバート等、Life Sciences 53，517-525頁により記載される実質的方法であるアマドリ転位により製造できる。適当なモノ−又はジ−ヘキサピラノースの例は、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース又はセロビオースである。合成において出発物質として用いられる誘導体は、商業的に得ることができそして必要により、適当な保護基を導入して得ることができる。
式Ｉの化合物の医薬として許容され得る酸付加塩には、無機酸又は有機酸例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、リン酸、乳酸、マレイン酸、フタル酸、クエン酸、ブルタル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、三フッ化酢酸、スルファミン酸およびフマル酸とペプチドとの反応により製造される酸付加塩が含まれる。
別の面において、本発明は活性成分として一般式Ｉの化合物又はその医薬として許容し得る塩並びに医薬として許容し得る担体又は希釈剤を含んでなる医薬組成物に関する。
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、例えばRemington's Pharmaceutical，1985年に記載される如き常法により製造できる。組成物は、通常の剤形、例えばカプセル剤、錠剤、エーロゾル剤、液剤、懸濁液又は局所適用の形態をとりうる。
用いられる医薬担体又は希釈剤は、通常の固体又は液体担体であってよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はセルロースの低級アルキルエーテルである。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。
同様に、担体又は希釈剤には当業者に公知の徐放性物質、例えばグリセリルモルステアラート又はグリセリルジステアラートの単独又はワックスとの混合物が含まれる。
もしも固体担体が経口投与用に用いられるとき、調製品は粉末もしくはペレット形で硬ゼラチンカプセル内に充填され錠剤化されるか又はそれはトローチ又はロゼンジの形をとることができる。固体担体の量は、広く変化できるが通常約25mg〜約１ｇであろう。
通常の錠剤化技術によって製造できる典型的錠剤は以下の成分を含有できる：
コア：
活性成分（遊離化合物又はその塩として） 100mg
コロイド二酸化ケイ素（Aerosil） 1.5mg
セルロース、微晶質（Avicel) 70mg
改質セルロースガム（Ac−Di−Sol） 7.5mg
ステアリン酸マグネシウム
コーティング：
HPMC 約9mg
^*Mywacett９-40 約0.9mg
^*フィルムコーティングのための可塑剤として用いられるアシル化モノグリセリド
もしも液体担体を用いる場合、調製品はシロップ、エマルション、軟ゼラチンカプセル又は滅菌注射可能液体例えば水性又は非水性液体懸濁液又は溶液の形であってよい。
経鼻投与に対し、調製品はエーロゾール適用のため、液体担体、特に水性担体に溶解又は懸濁された式Ｉの化合物を含有できる。担体は、添加剤例えば可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤例えば胆汁酸又はポリエチレン高級アルコールエーテル、吸収促進剤例えばレシチン（ホスファチジルコリン）又はシクロデキストリン、又は防腐剤例えばパラベンを含有してもよい。
一般に、本発明の化合物は単位用量当たり医薬として許容され得る担体と共に0.0001−100mgの活性成分を含んでなる単位剤形中に分散される。
本発明に係る化合物の用量は、患者、例えばヒトに薬として投与するとき適当には１−500mg／日、例えば用量当たり約100mgである。
以下の内容が実証された、すなわち一般式Ｉの化合物はインビボで内因性成長ホルモンを放出する能力を有する。従って、化合物は例えば成長ホルモン欠損のヒトにおいて又は年輩の患者又は家畜類において増加せしめられたプラスマ成長ホルモンレベルを要求する状態の治療において用いることができる。
従って、特定の面において、本発明は下垂体から成長ホルモンの放出を刺激するための医薬組成物、活性成分として一般式Ｉの化合物又はその医薬として許容し得る塩並びに医薬として許容し得る担体又は希釈剤を含んでなる組成物に関する。
別の面において、本発明は下垂体から成長ホルモンの放出を刺激する方法に関し、この方法は一般式Ｉの化合物又はその医薬として許容され得る塩の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる。
更に別の面において、本発明は下垂体から成長ホルモンを刺激するための医薬の製造に対する一般式Ｉの化合物又はその医薬として許容され得る塩の化合物の使用に関する。
当業者にとって、ヒトにおける成長ホルモンの今日的かつ可能性のある使用は、変更されそして多数である。以下の内容が推測される、すなわち式Ｉの化合物は下垂体から成長ホルモンの放出を刺激する目的に対し投与できそしてそれ自身成長ホルモンとして同様の効果又は使用を有する。成長ホルモンの使用は次の如く要約できる：かなり年輩の人における成長ホルモン放出の刺激；グルココルチコイドの異化副作用の防止、骨粗しょう症の治療、免疫系の刺激、創傷治ゆの促進、骨折修復の治療、成長遅延から生じる不全、成長ホルモン不全の小児を含む生理的に短い身長および慢性病に関連する短い身長の治療、肥満並びに肥満に関連した成長遅延の治療、プラデル−ビリ（Prader-willi）症候群およびターナー（Turner's）症候群に関連した成長遅延の治療；火傷患者の入院の回復および減少；子宮内の成長遅延、骨格の異形成症、高コルチコイド症およびクッシング(Cushing's）症候群の治療；拍動性成長ホルモン放出の誘発；ストレスの加わった患者における成長ホルモンの代替、変形性骨軟骨形成異常症、ノーナン（Noonan's）症候群、精神分裂病、うつ病、アルツハイマー病、遅延創傷火傷および精神社会的剥取の治療、肺性機能不全およびベンチレーター依存性の治療、主な手術後タンパク質異化応答の減衰、慢性病例えば癌又はエイズによる悪液質減少およびタンパク質損失；島細胞症を含む高インスリン症の治療、排卵誘発のためのアジュバント治療；胸腺発育の刺激および胸腺機能の年齢に関係した減少防止のため、免疫抑制患者の治療、筋内強化、運動性における改善、皮膚原の維持、代謝恒常性、虚弱老人における腎性恒常性、骨芽細胞の刺激、骨再モデル化および軟骨成長、コンパニオン動物における免疫系の刺激およびコンパニオン動物における加齢による疾患の治療、家畜における成長促進剤および羊における羊毛成長の刺激。
前記症状に対し、用量は用いられる式Ｉの化合物、投与方法および所望の治療に依存するであろう。しかし、一般に毎日体重１kg当たり0.0001〜100mgの用量レベルが患者および動物に投与され内因性成長ホルモンの有効放出が得られる。通常、経口又は経鼻投与に適した剤形は、医薬として許容され得る担体又は希釈剤と混合される式Ｉの化合物約0.001mg〜約100mg、好ましくは約0.001mg〜約50mgを含んでなる。
式Ｉの化合物は、医薬として許容され得る酸付加塩の形態で又は適当な場合アルカリ金属又はアルカリ土類金属又は低級アルキルアンモニウム塩として投与され得る。そのような塩の形態は、遊離塩基形としてほゞ同じオーダーの活性を示すものと考えられている。所望により、本発明の医薬組成物は、異なる活性を示す１以上の化合物、例えば抗生物質又は他の薬理的に活性な物質と組合わされた式Ｉの化合物を含むことができる。これは他の分泌促進薬例えばGHRP（１又は６）又はGHRH又はその類似体、成長ホルモン又はその類似体又はソマトメジン例えばIGF−１又はIGF−２であってよい。
投与方法は、適当な又は所望の活性部位に活性物質を有効に送り込むあらゆる投与方法、例えば経口、経鼻又は非経口投与方法であってよく、経口投与方法が好ましい。
式Ｉの化合物の医薬としての使用とは別に、該化合物は成長ホルモン放出の調節を研究するための有用のインビトロ用具であろう。
式Ｉの化合物はまた、下垂体の成長ホルモン放出能を評価するためのインビトロ用具において有用でもあろう。例えば、これらの化合物をヒトに投与する前および後に採取した血清サンプルは、成長ホルモンに対し分析され得る。各血清サンプルにおける成長ホルモンの比較は、成長ホルモンを放出する患者の下垂体の能力を直接測定するであろう。
式Ｉの化合物は、動物の成長速度および程度を増加させるためおよびミルク生産を増加させるため、商業的に重要な動物に投与できる。
薬理方法
式Ｉの化合物は、主ラットのソマトトロピンにおける成長ホルモンを放出するための該化合物の有効性および能力に対してインビトロで評価できる。
ラットの主要なソマトトロピンは、既に本質的に記載された如く調節できる（チュン等、Endocrinology 1991，129，3337-3342およびチェン等、Endocrinology 1989，124，2791-2798）。簡単には、ラットを断頭により殺す。下垂体を速やかに除く。下垂体を、ハンクス(Hanks）細胞培養用塩類溶液中の0.2％ヒアルリニダーゼおよび0.2％コラゲニダーゼで消化する。細胞を0.37％のNaHCO₃、10％馬血清、2.5％胎児ウシ血清、１％非必須アミノ酸、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するDulbecco's Modified Eagle's培地中に再懸濁させ次いで1.5×105個細胞／mlに調節する。この懸濁液の１mlを24個のウェルのトレーの各ウェルに装入し次いで放出実験を行う前に２−３日間放置する。
実験の１日の日に、細胞を25mMのHEPES（pH7.4）を含有する前記培地で２回洗浄する。成長ホルモン放出は、25mMのHEPESを含有する培地を添加することにより開始した。
インキュベーションは37℃で15分間行う。インキュベーション後、培地に放出された成長ホルモンを標準RIAにより測定する。
式Ｉの化合物は、既に記載した如く（ベルコ等、Endocrinology 1991，129，2592-2598）、ペントバルビタールによる麻酔された雌ラットにおいて成長ホルモン放出に関するそれらのインビボ効果に対し評価できる。簡単には、成長した雄のスプラーグードーレーラットをペントバルビタール50mg／kg i.p．で麻酔する。ラットを十分に麻酔せしめた後、気管のカニューレおよびカテーテルを頸動脈および頸静脈に埋め込む。15分の回復後、血液サンプルを０時に採取する。下垂体の分泌促進薬を静脈内投与し次いで動脈血液サンプルを15分間氷上に置き次いで12,000×ｇで２分間遠心分離した。血清をデカントし次いで成長ホルモンの量を標準RIAを用いて測定する。
本発明を更に次の実施例で説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでない。
本明細書を通じて次の略記号が用いられる：
非天然アミノ酸残基に対する略記号：

ペプチド結合置換に対して用いられる略記号：

保護基に対して用いられる略記号：

例１
H-His-D-TrpΨ(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂
ペプチド樹脂H-Ala-Trp-D-Phe-Lys-樹脂を、NMP(Ｎ−メチルピロリドン）中HBTU（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）介在カップリングおよびFmoc保護基の脱保護のUV監視を用いる製造者提供Fast Moc UVプロトコルを用い、0.25mmolスケールのアプライドバイオシステム431Aペプチド合成器を用いFmoc法に従って合成した。合成に用いられた出発樹脂は、0．53mmol／ｇの置換を有する470mgの４−（２′，４′−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（ノババイオケミ社、スイス国、カタログ番号：01−64−0013）であった。用いられた保護アミノ酸誘導体は、Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Trp-OH and Fmoc-Ala-OHであった。
−CH₂NH−ペプチド結合等電子体は、（ササキ、Ｙ．およびコイ、D.H. PEPTIDES ８（1）119-121，1987)に従って導入された。
Fmoc−Ｄ−Trp−アルデヒドを、ファーレンツ、J.-A．およびカストロB.，SYNTHESIS 676-678，1983に従い、対応するＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキサメート399mgから調製した。粗製アルデヒドをDMF(ジメチルホルムアルデヒド）に溶解した８mlの１％酢酸に溶解し次いで２つの部分に分けた。第１の部分を、室温でDMF中の８mlの１％酢酸中の400mg（約0.2mmol)のH-Ala-Trp-D-Phe-Lys(Boc)−樹脂の撹拌スラリーに加えた。次いで１mlのDMFに溶解した40mgのNaCNBH₃(85％純度）を60分にわたって加え次いで撹拌を更に60分間継続した。この後、樹脂を単離し次いでフィルター漏斗上でDMF中の１％酢酸で洗浄した。樹脂を再たびDMFに溶解した５mlの１％酢酸中に懸濁し次いでFmoc−Ala−アルデヒドの第二の部分を添加した。再たび、１mlのDMFに溶解した40mgのNaCNBH₃(85％純度）を60分にわたって室温で加え次いで混合物を18時間撹拌した。
この還元的アルキル化工程後、ペプチド樹脂を単離し次いでフィルター漏斗上でDMFに溶解した１％酢酸で洗浄し次いで鎖延長を、保護されたアミノ酸誘導体Fmoc-His(Trt)-OHを用いる前記手順に従いペプチド合成器を用い完結した。
３mlのTFA(三フッ化酢酸）、225mgのフェノール、75μｌのエタンジオール、150μｌのチオアニソールおよび150μｌのH₂Oの混合物と共に室温で240分間撹拌することにより240mgのペプチド樹脂からペプチドを切り離した。切り離された混合物を45mlのジエチルエーテルを用いこのオイルから沈澱させ次いで45mlのジエチルエーテルを用い３回洗浄した。
粗製ペプチドを、７μのＣ−18シリカで充てんした25mm×250mmカラムによる半調製用HPLCにより精製した。カラムを0.05Ｍの（NH₄)₂SO₄に溶解した21％CH₃CNを用いて平衡化し、これを４ＭのH₂SO₄でpH2.5に平衡化した。乾燥後、粗製ペプチドを水に溶解した５mlの70％CH₃CN/0.1％TFAに溶解し次いで水で50mlに希釈した。20mlのこの溶液を90mlに希釈し次いでカラムに注入し次いでこれを40℃で47分中10ml／分で0.05Ｍの（NH₄)₂SO₄（pH2.5)に溶解した21％−31％CH₃CNのグラジエントを用いて溶出させた。ペプチド含有分画を集め次いで３容量の水で希釈し次いで0.1％TFAで平衡化させたSep−Pak(商標）Ｃ18カートリッジ（Waters part.番号：51910）を通過させた。次いで0.1％TFAを含有する70％CH₃CNで溶出させ次いで精製ペプチドを、水で溶出液を希釈後凍結乾燥により単離した。収率は6.55mgであった。
得られた最終生成物を、アミノ酸分析（ペプチド含量およびアミノ酸組成）、分析RP−HPLC（保持時間）によりおよびPDMS（プラズマ脱着マススペクトセメトリー)(分子マス）により特性化した。アミノ酸分析およびPDMSは、方法の実験誤差内で予期した構造に一致した（PDMS：±0.9amu、アミノ酸分析±10％）。
RP−HPLC分析は214nmでUV検出を用いて行い次いでVydac 218TP54の4.6mm×250mmの５μＣ−18シリカ(The Separations Group，Hesperia、米国）を42℃で１ml／分で溶出させた。２つの異なる溶出条件を用いた。
Ａ１：0.1Ｍの（NH₄)₂SO₄から成る緩衝剤（これは濃H₂SO₄でpH2.5に調節）に溶解した５％CH₃CNを用いてカラムを平衡化および50分にわたり同緩衝液に溶解した５％〜60％CH₃CNのグラジエントによる溶出。
Ｂ１：５％のCH₃CN/0.1％のTFA／水を用いたカラムの平衡化および50分にわたり５％のCH₃CN/0.1％のTFA／水〜60％のCH₃CN/0.1％のTFA／水のグラジエントによる溶出。
溶出条件Ａ１およびＢ１を用いた保持時間は、それぞれ22.01分おおび23.08分であることが判明した。
例２
H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-PheΨ(CH₂NH)Lys-NH₂
Ｈ−Lys(２−Cl−２）−樹脂を、DMF中予備形成された対称無水物との単カップリングを用いる製造者提供単カップリングでロトコルを用い0.5mmolスケールのアプライドバイオシステム430Ａペプチド合成器を用いBoc法に従い、0.72mmol／ｇの置換を有する660mgの４−メチルBHA樹脂（ビセンドルフバイオケミカルス、ハノーバー、ドイツ、カタログ番号：RMIS50）およびBoc-Lys(Cl-Z)-OHから合成した。プロトコルを修正し60分のカップリング時間を得た。
−CH₂NH−ペプチド結合等電子体を、例１に記載した手順に類似の手順を用いて導入した。675mgのＨ−Lys(Cl−Ｚ）−樹脂並びに616mgの対応するＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキサメートから調製したBoc−Ｄ−Phe−アルデヒドを用いた。
この還元的アルキル化工程後、樹脂を単離し次いでフィルター漏斗上でDMFに溶解した１％酢酸で洗浄し次いで保護されたアミノ酸誘導体Boc-Trp(For)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-D-Trp(For)-OHおよびBoc-His(Bom)-OHを用い前記の手順に従いペプチド合成器を用い鎖延長を完結させた。
５mlのHFおよび500μｌのｍ−クレゾールの混合物を用い、75分間撹拌することにより391mgのペプチド樹脂からペプチドを分裂させた。HFを窒素流により０℃で蒸発させた。ペプチドを、50mlのジエチルエーテルを用い樹脂と共に残存オイルから沈殿させ次いで50mlのジエチルエーテルで２回洗浄し次いで２×２mlのTHFを用い樹脂から抽出し次いで50mlのジエチルエーテルにより一緒にしたTFA抽出物から沈殿させ次いで50mlのジエチルエーテルで２回洗浄した。
乾燥後、トリプトファン上のホルミル基を、４mlのエタノールアミンを含有する64mlの６Ｍグアニジニウム塩酸塩にペプチドを溶解し次いで０℃で５分間撹拌することにより分裂させた。この後、混合物を４mlの酢酸を添加することにより中和し次いで140mlの水で希釈した。
粗製ペプチドを、例１で記載した手順と類似の手順を用い、カラム上でこの反応混合物を直接注入することによる半調製用HPLCにより精製した。収率は、20.6mgであった。
最終生成物は、例１で記載される如く特性化された。
条件Ａ１およびＢ１を用いるRP−HPLCは、それぞれ21.28分および23.17分の保持時間を与えた。
例３−５

例６
(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-フェニルプロピルアミンFmoc−Ｄ−Phe−アルデヒドを、フレンツェ，J.-A．およびカストロ．B.，SYNTHESIS 676-678，1983に従い、385mgの対応するＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキサメートから調製した。粗製アルデヒドを、DMFに溶解した20mlの１％酢酸に溶解し次いで２つの部分に分けた。
0.43mmol／ｇの置換を有する580mgの４−（２′，４′−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（ノババイオケミ社、スイス、カタログ番号：01−64−0013）を、DMF中20％ピペリジンを用い20分間脱保護し次いでDMFで洗い次いでDMFに溶解した１％酢酸で洗った。
第１の部分Fmoc−Ｄ−Phe−アルデヒド並びに１mlのDMFに溶解した58mgのNaCNBH₃(85％純度）を脱保護樹脂に加え次いでスラリーを室温で75分間撹拌した。この後、樹脂をフィルター漏斗上で単離し次いでDMFに溶解した１％酢酸で洗った。１mlのDMFに溶解した58mgのNaCNBH₃(85％純度）と共にFmoc−Ｄ−Phe−アルデヒドの第二の部分を、樹脂に添加し次いで混合物を室温で18時間撹拌し次いで樹脂をフィルター漏斗上で単離し次いでDMFに溶解した１％酢酸で洗い、DMFで洗い、DCM／メタノール６：４で洗い次いでDCM(ジクロロメタン）で洗った。
この樹脂を用い、鎖延長は例１で記載される手順に従いペプチド合成器および保護されたアミノ誘導体Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-D-2Nal-OH and Fmoc-D-Ala-OHを用いて完結せしめた。
ペプチドを600mgの生成ペプチド樹脂から切り離した。生成粗製ペプチドを50mlの水に溶解し次いでその25mlを半調製用HPLCにより精製し次いで例１に記載した手順に類似の手順を用いて特性化した。収率は10.9mgであった。
条件Ａ１およびＢ１を用いRP−HPLC分析は、それぞれ保持時間27.98分および29.45分を与えた。
例７−12

例13
（２Ｓ）−（（３−（４−イミダゾリル）プロピオニル）Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−NH）−６−アミノヘキサノール
ペプチド樹脂３−（１−Adoc−４−イミダゾリル）プロピオニル−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−Lys(Boc)−Sasrin樹脂（Adocは１−アダマンチン−オキシカルボニルの略記号である）を、例１で記載した手順に類似の手順を用い１mmolスケールで合成した；但し0.87mmol／ｇの置換能を有する1020mg Sarin樹脂（２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂)(Bachem、ブーバンドルフ、スイス、カタログ番号Ｄ−1295）を用いそして樹脂に対し第一のアミノ酸樹脂のカップリングのために用いられるプロトコルは、予備形成された対称無水物の製造者提供の４−ジメチルアミノピリジン触媒化カップリング次いで無水安息香酸を用い樹脂上で残留−OH基のカップリングであった。
保護されたペプチド（２Ｓ）−（（３−（１−Adoc−４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−NH）−６−(Boc−アミノ）ヘキサノールを10.8mlのTHF(テトラヒドロフラン）、1.8mlのエタノール、211mlのLiBrおよび92mgのNaBH₄の混合物と共に室温で24時間ペプチド樹脂を撹拌することにより、1800mgの３−（１−Adoc−４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−Lys(Boc)-Sasrin樹脂から切り離した。次いで、２mlの水および２mlの酢酸を滴下した。樹脂ビーズを濾過により除去し次いで25mlのエタノールで洗った。濾液を真空下で濃縮し次いで残存オイルを50mlの水で希釈し次いで凍結乾燥した。生成粉末を例１で記載した如くTFA分裂に委ねた。生成粗製ペプチドの１／５を例１で記載した如く精製した。収率は28.54mgであった。
最終生成物は例１で記載される如く特性化された。溶出条件Ａ１を用いた保持時間は、20.4分であった。
例14
３−（（３−（４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−NH）プロピルアミン
ペプチド樹脂（３−（１−Adoc−４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−Sasrin樹脂を、例１で記載した手順と類似の手順を用い１mmolスケールで合成した、但し0.87mmol／ｇの置換能を有する1000mgのSasrin樹脂（２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂)(Bachem、ベーベンドルフ、スイス、カタログ番号Ｄ−1295）を用いそして樹脂に対する遊離アミノ酸樹脂のカップリングに対して用いられるプロトコルは、予備形成された対称無水物の製造者提供４−ジメチルアミノピリジン触媒化カップリング、その後引き続き無水安息香酸を用い樹脂上で残留−OH基のカップリングであった。
ペプチド３−（（３−（１−Adoc−４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−NH）プロピルアミンを、1000mgの３−（１−Adoc−４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−Sasrinから、10mlの１，３−ジアミノプロパンと共に室温で20時間撹拌することにより切り離した。消費された樹脂を濾別し次いで５mlのDMFで抽出した。一緒にした濾液および抽出物を撹拌下、240mlの１Ｍ塩酸にゆっくり加えた。次いで混合物を水で500mlに希釈し次いで濾過した。
例１で記載した手順を類似の手順を用い、この濾液の９×１／９カラムに直接注入することにより９回半調製用HPLCにより粗製ペプチドを粗製した。
最終生成物は例１で記載した如く特性化された。溶出条件Ａ１およびＢ１を用いる保持時間は、それぞれ21.5分および22.7分であった。
例15−18

本発明の代表的化合物の製造は下記に示される：
３−（（３−（４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Trp−AlaΨ(CH₂NH)Trp−Ｄ−Phe−NH）プロピルアミン

（２Ｓ）−（（２Ｒ）−（（３−（４−イミダゾリル）プロピオニル）−Ｄ−Phe−Ala−Trp−NH）−３フェニルプロピルアミノ）−６−アミノヘキサノール

H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheΨ(CH₂NH₂)

例19
ラットの下垂体細胞を用いるインビトロ分析を確立させ種々のGH分泌促進薬の効果を研究した。混合された下垂体細胞培養物を、雄ラットの腹側下垂体から単離し次いで３日間培養した。洗浄後、細胞を15分間刺激し次いで分泌GHの量を培養上澄み内で測定した。
ラット下垂体細胞の単離は、ザルトル、Ｏ等、Endocrinology 116，1985，952-957頁の修正であった。断頭後250mgの雄のスプラーグードーレ系ラットから下垂体をすてた。神経介在葉を除去し次いで残りを、0.25％のグルコース、マメの非必須アミノ酸および１％ BSA（単離緩衝剤）を加えられたゲイ(Gey's）培地内に置いた。腺を小片に切断し次いで３mlの単離緩衝剤および11.5mgのトリプシンおよび1000μｇのDNaseを含有するフラスコに移し次いで37℃，95％Ｏ₂で、および毎分70回転で35分間インキュベートした。断片を単離溶液中沈降により３回洗い次いでパスツールピペットを用い単細胞に吸引した。分散後、細胞をナイロンフィルター(160μｍ）を通して濾過し未消化組織を除去した。トリプシン阻害剤（0.75mg／ml）を加えた単離緩衝液で細胞を３回洗い次いで２×10⁵個の細胞／mlの密度に培地（25mMのHEPES、４mMのグルタミン、0.75％の炭酸水素ナトリウム、2.5％のFCS、３％の馬血清、10％のラット血清、１ｎのMT₃および40μｇ／Ｌのデキサメタゾンを加えたDMEM）中で再懸濁させた。細胞をマイクロタイタープレート、200μｌ／ウェル内に播種し次いで37℃でかつ８％CO₂で３日間培養した。
培養期間後、細胞を刺激緩衝液（１％BSA、0.25％Ｄ−グルコースおよび25mMのHEPESを加えたHBSS）で２回洗浄し次いで１時間予備インキュベートした。次いで緩衝剤を除去し次いで本発明の化合物を含有する新しい刺激緩衝剤を加え次いでプレートを37℃および５％CO₂で15分間インキュベートした。緩衝剤を集め次いで次の如く(SPA、米国特許4,568,649，Hart and Greenwalt，Mol．Immuninol．16，1979．265-269頁、又はウデンフレンド等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82，1985，8672−8676頁に記載のものと本質的に同じ）シンチレーション接近分析(SPA）においてラット成長ホルモン(rGH）について分析した。
rGH分析を、パッカードトップコート（β−シンチレーションカウター）において直接計測に適したオプティプレート（96−ウェルプレート）で行った。
分析プロトコル：
40μｌの緩衝液
10μｌのサンプル（刺激された刺激緩衝液）
50μｌの¹²⁵Ｉ−rGH
50μｌの家兎抗−rGH
50μｌのSPA試剤（フルオ微小球に結合させた抗−家兎抗体）
プレートを封止し次いでプレート振とう機上に30分間置き、次いで10時間インキュベーションし、10−15℃に設定し次いで計測する。
SPAにおいて、抗−GH家兎（一次抗体）に結合したrGHを、フルオ微小球（fluomicropheres）（Amershamから入手可能なSPAタイプIIRIA)に結合した二次抗体と反応させる。一次抗体に結合した任意の放能性標識したrGHは、フルロ微小球上で固定化され、そしてこれは光を生じるであろう。β−シンチレーション計測器による測定により、放射性標識したrGHの量の計算が可能となる。フルオ微小球に結合した放射性標識rGHの量は、サンプル中のrGHの含量の増加と共に減少する。

Claims

下記の一般式（Ｉ）：
Ａ−Ｂ−Ala−Trp−D-Phe−Ψ(CH₂NH)−Lys （Ｉ）
（式中、ＡはHis、D-Ala、イミダゾリル−C_1-6−アルカン酸、又はイミダゾリル−C_1-6−アルケン酸であり；そして
ＢはD-Trp、D-Phe又はD-2Nalである）
により表される化合物又はその医薬として許容される塩。
下記の化合物：
His−D-Trp−Ala−Trp−D-Phe−Ψ(CH₂NH)−Lys
D-Ala−D-2Nal−Ala−Trp−D-Phe−Ψ(CH₂NH)−Lys
D-Ala−D-Phe−Ala−Trp−D-Phe−Ψ(CH₂NH)−Lys
３−（４−イミダゾリル）プロピオニル−D-2Nal−Ala−Trp−D-Phe−Ψ(CH₂NH)−Lys
３−（４−イミダゾリル）アクリロイル−D-2Nal−Ala−Trp−D-Phe−Ψ(CH₂NH)−Lys
のいずれかである、請求項１に記載の化合物又はその医薬として許容される塩。
活性成分として前記一般式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容され得る塩並びに医薬として許容され得る担体又は希釈剤を含んでなる、下垂体からの成長ホルモンの放出を刺激するための医薬組成物。
10mg〜200mgの前記一般式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容され得る塩を含んでなる、単位剤形にある請求項３に記載の医薬組成物。
下垂体から成長ホルモンの放出を刺激するための医薬の製造のための前記一般式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容され得る塩の使用。