JP3770941B2

JP3770941B2 - Protein having activity of glycosylating flavonoid, DNA encoding the protein, recombinant vector containing the DNA, and method for producing the DNA

Info

Publication number: JP3770941B2
Application number: JP23894395A
Authority: JP
Inventors: 敏博戸栗
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2006-04-26
Anticipated expiration: 2015-08-25
Also published as: JPH0956385A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の花弁等に存在する主要な色素であるフラボノイド系化合物を修飾するグルコース転移酵素、該酵素をコードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、および該ＤＮＡの製法に関し、より詳細には、フラボノイド系化合物の３位にグルコースを転移する活性を有する酵素、該酵素をコードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、および該ＤＮＡの製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物の花・茎等に存在するフラボノイド系化合物のうちアントシアンは、植物に黄、赤、青系統の色をもたらすため、特に花卉の育種上、大きな関心を集めてきた。また、他のフラボノイド系の無色の化合物もまた、幾つかの生理的役割を持つことが知られており、例えば、紫外線吸収するすることにより植物のUV障害を軽減することや、植物病原菌からの防護物質（ファイトアレキシン）として働くことが知られている[ハールブルックら(Hahlbrock) Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology 40, 347-369頁(1989)]。それらの合成経路については詳細に研究されているが[モルら(Mol) Plant Molecular Biology Reporter 6, 274-279頁 (1988)]、生合成産物は植物種によって、更に様々の修飾酵素の作用を受けて変化している[フォークマン(Forkmann) Plant Breeding 106, 1-26頁 (1991)]。例えば、メチル化[ジョンソンら(Jonsson) Theoretical and Applied Genetics 68, 459-466頁 (1984)]、アシル化[ハールブルック(Hahlbrock) FEBS Letters 28, 65-68頁(1972)]、及び配糖化等があり、その中でも配糖化は様々の２次代謝産物の物性を変える点で重要とされている。
【０００３】
フラボノイドの一種であるフラボノールは、ジヒドロフラボノールがジオキシゲナーゼの１種のフラボノール合成酵素の作用により酸化した物であるが[フォークマンら(Forkmann) Zeitschrift fur Naturforschung 41c, 179-186頁 (1986)]、フラボノールに変換した後、配糖化の他、メチル化、亜硫酸化[バリンら(Varin)Plant Physiology 95, 1254-1258頁(1991)]等の修飾を受けることが知られている。また、フラボノールの顕著な働きとして、それが植物ホルモンであるオーキシンの輸送に影響するので[ジャコブら(Jacobs) Science 241, 346-349 頁(1988)]、花粉管の成長が制御を受け、結果的に稔性を制御するのに有用と言われている[WO 93/18142]。即ち、フラボノールは花粉管の成長を促進するが、その配糖化物は成長促進活性がないため、配糖化活性が高い植物では花粉管の成長が悪く、稔性も著しく低下すると想像される[ポラックら(Pollak) Plant Physiology 102, 925-932 頁(1993)]。また、植物から抽出したフラボノイド、特にフラボノール類は、前述のようにUV光等の蛍光からの防護物質としての役割を果たすことから、色素の退色防止、有効成分の酸化防止を目的とした食品添加物として広範に使用されている[高屋幾夫 New Food Industry 35, 7-16頁 (1993)]。しかし、天然のフラボノールは疎水性が高く水に解けにくいため利用しにくく、精製物質を微生物由来の酵素で配糖化させて使用しているのが現状である〔特開平０２−１７９８３９〕。これを避けて、フラボノールの配糖化が進んだ物質を植物体で生産するため、交雑育種によってこれらの需用に答えることも原理的には不可能でない。しかしながら、このような古典的な植物育種法は、交雑育種に用いる様々な植物種の組合せに依存した交配に関わる相性の良さ、目的形質以外の望まざる形質が導入されることなど多くの問題を内在している。
【０００４】
一方、アントシアンは、言うまでもなく赤、青等の様ざまの天然色素の主成分であるが、無色のアントシアニジンが配糖化し、その後有色の安定な化合物になる。その生合成の間、配糖化前のアントシアニジンは非常に不安定な化合物とされ、配糖化のステップは色素の形成上、重要な反応と考えられている。
ところで、近年の植物遺伝子工学の発展により、遺伝子組換えの手法を用いて植物に種々の有用形質を与えることが可能になりつつある。その一例として、マイヤーら〔特開平２−２３０５〕は、ペチュニア(Petunia hybrida)に遺伝子組換えをおこない、シアニジン及びデルフィニジン型色素の形成ができず、Ｂ環で４’位のみが水酸化された合成中間体であるジヒドロケンフェロールが蓄積する変異体に対して、トウモロコシ(Zea mays)由来のＤＦＲ（ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ）を導入することにより、新規なレンガ色の花色のペチュニアを作ることに成功した。このような手法を用いれば、フラボノールの３位にグルコースを転移する酵素を種々の植物に導入し、配糖化したフラボノールを持った植物を作れる可能性がある。このような植物では配糖化されたフラボノールが主体と成るので、花粉管の伸張は阻害され、稔性も低下している可能性がある。また、クロールらは[(van der Krol) Nature 333, 866-869頁 (1988)]、カルコン合成酵素(Chalcone synthase; CHS)遺伝子のmRNAが逆向きに転写されるように（アンチセンス）植物に導入し、CHS活性を著しく低下させ、フラボノイドの生成量を下げることに成功した。この技術を応用すれば、フラボノイドの糖転移酵素遺伝子をアンチセンスで植物に導入し、配糖化が進んでいないフラボノイドを主として生産する植物を作出することも可能であろう[クルーンら(Kroon) Plant Journal 5, 69-90頁 (1994)]。
【０００５】
さて、フラボノイドの３位への配糖化についてはトウモロコシの種子(E. C. 2.4.1.91)、キンギョソウの花等を用いて詳細な研究が進められてきた。酵素学的には、UDPglucoseをグルコースの供与体として、フラボノイドのA環の３位に１分子のグルコースが転移されると言われている（図１）。また、赤キャベツの実生[サンら(Sun) Plant Physiology 95, 570-576 頁(1991)]やペチュニアの花[ジョンソンら(Jonsson) Planta 160, 341-347頁 (1984)]由来の糖転移酵素について、主として受容体の選択性に関する酵素学的な知見が得られてきた。しかしながら、受容体フラボノイドについてフラボノールとアントシアンのどちらか、又は両方を配糖化するかどうかについて、精製酵素を用いて厳密に調べた例は少なく、多くの場合、複数の配糖化酵素が共存する状態で測定したため、厳密な意味での基質の決定は明確になっていないと思われる[ヘーゼル(Hosel) The Biochemistry of Plants 7, 725-753頁(1981)]。また、前述のキャベツ及びペチュニア由来の酵素共、サブユニットが２７−３０kDaの２量体とされており、トウモロコシ等の５０kDa型のものとは相当構造が異なっていると思われる。フラボノイドへの配糖化酵素遺伝子の構造に関しては、３位へのグルコース転移についてトウモロコシ種子[ラルストンら(Ralston) Genetics 119, 185-197 ページ(1988)]及びキンギョソウ[C.マーチン (Cathie Martin)英国、ジョンイネス研究所；私信 ]で、並びに３位へのラムノース転移についてペチュニア[クルーンら(Kroon) Plant Journal 5, 69-80 ページ(1994)]で突然変異体の解析からコードしている遺伝子の機能が推定されているが、この場合も遺伝子がコードする酵素の活性は直接測定されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する酵素を発現しうる遺伝子を提供することを目的とする。
また、本発明は、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子によりコードされている酵素および該遺伝子の製法を提供することも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者は、フラボノイドの合成を誘導したナス(Solanum melongena)から、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子をクローニングし、該遺伝子を組み込んだ組換えベクターで大腸菌を形質転換して該遺伝子を発現させたところ、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質が産生されることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているＤＮＡまたはその断片を提供する。また、本発明は、前記ＤＮＡまたはその断片を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその断片、およびそれらの融合タンパク質を提供する。さらにまた、本発明は、フラボノイドの合成を誘導した植物からｍＲＮＡを分離し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ｃＤＮＡライブラリーから、フラボノイドの合成を誘導しなかった植物に由来するＤＮＡまたはその断片と反応するクローンを除くことにより、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているｃＤＮＡを選択することを含む、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡの製法を提供する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１）フラボノイド系色素の誘導方法
本発明の主題である配糖化酵素遺伝子は、一般的にその含量が少なくかつ不安定であるため、そのタンパク質を精製するには、多大の労力を要すると思われた。そのため、タンパク質の精製を行わずに遺伝子をクローニングする系が必須である。高等植物に適用できる方法の中で最も確かな方法の一つは、トランスポゾンによる突然変異を誘起して、色素の合成の変異体を単離し、次にその挿入された遺伝子の機能を解析する方法であり、そのような方法でトウモロコシとキンギョソウの糖転移酵素遺伝子が単離されている（ラルストンら(Ralston), Genetics 119, 185-197頁(1988)) 。また、それをプローブとしてキンギョソウの相同遺伝子も単離された (マーチンら(Martin), Plant J. 1, 37-49 頁(1991)) 。本発明の配糖化酵素遺伝子はこれらの方法により単離することもできる。
【０００９】
また、それとは別に、色素の誘導を明確に起こし、誘導のかかる遺伝子に対応するクローンとそうでないものをハイブリダイゼーションにより区別する事により選別する方法もある。そのような手法はトランスポゾンが使われていない植物でも可能であり、一般的には、誘導前および誘導後の組織から別々にｍＲＮＡをとり、それぞれに対応する放射能標識したプローブを用いたディファレンシャル・ハイブリダイゼーション、あるいは、それを更に改良したサブトラクト・ハイブリダイゼーションと呼ばれ、いくつかの成功例が報告されている〔サンブルックら(Sambrook) ; Molecular Cloning, second edition, 10.38-10.43頁 ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)〕。何れの手法を取るにしても、目的の遺伝子が誘導前の組織で存在しないかあるいは誘導後に比べて極めて少ない事が重要である。本発明では、先に、本発明者らがフラボノイド水酸化酵素遺伝子を単離するのに開発した方法を適用すると有効である〔特開平５−１８４３７０〕。以下、本発明の配糖化酵素遺伝子を特開平５−１８４３７０に準じて単離する方法を簡単に記すが、上述した他の方法によって単離してもよい。
【００１０】
フラボノイド系遺伝子の誘導が明確にかかる系を探索し、デルフィニジン系の色素を生産するナス(Solanum melongena)の種子を赤色光の下で約２週間栽培し、次に白色とＵＶ光を混合したもの（以下では白色光と呼ぶ）２日以上照射し栽培することにより、非常に明確にフラボノイドの合成が誘導されることが見いだされた。白色光での誘導後５日間のアントシアン含量の変化を見たところ約４８時間後に最大値の半分に達していた（図略）。この場合、従来、植物を生化学的に研究する際に頻用された、暗所から白色光の下へ移す操作では、誘導される遺伝子の大部分が光合性に関係したものであり、その中からフラボノイドに関するものを選ぶことは極めて効率が悪いと考えられた。本発明の方法の場合、ナスに限らず白色光下で栽培した時、実生にフラボノイド化合物を蓄積する作物、例えばペチュニア、トウモロコシ等で行うことも可能である。
【００１１】
この間の既知の遺伝子のｍＲＮＡの変化を調べてみると、フラボノイド色素の合成系でフラボノイドの水酸化反応の前後に位置するＣＨＳ（カルコン合成酵素）および、ＤＦＲ（デヒドロフラボノール−４−レダクターゼ）は、誘導前には検出できず、誘導後７時間めから徐々に増えて行くことがわかった。また、ＣＨＳ及びＤＦＲのｍＲＮＡは実生の中でも、胚軸に色素が強く誘導されたので、その部分を用いる事が望ましい。更に、光合成系の代表的な酵素であるＲｕＢｉｓＣＯ（リブロース−１、５、−２リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ）のｍＲＮＡは、白色光の誘導の前と後でその量がほとんど変わらなかったので、フラボノイド系よりはるかに多量に存在すると思われる光合成系の遺伝子のｍＲＮＡに対応するクローンが、本方法のナスの実生を使った系を利用することにより、それらが効率よく除去できる事を意味する（データ略）。
【００１２】
更に、フラボノイド−３−配糖化酵素（UDPglucose依存型）については、酵素活性を測ることもできる。たとえば、フラボノールを受容体とする場合、Ｓｅｒｖａ社から発売されているケルセチンをエチレングリコール−モノメチルエーテルに溶解したものを基質として用いることができる。これとは別に、植物材料として例えば、光誘導後のナス胚軸の抽出液と反応させ、その生成物を酢酸エチル層に分配後、減圧濃縮する。これを８０％メタノールに溶かし、セルロース系の薄層クロマトグラフィー（溶媒組成；１５％酢酸等）で展開する。本発明者らは、このような手法により、酵素反応生成物であるケルセチン−３−グルコシドがナス実生由来酵素から生成されることを確かめた。
【００１３】
２）ｃＤＮＡライブラリーの作製と光誘同性クローンの選抜
誘導をかけたナス胚軸からのＲＮＡ抽出及びその中からのｍＲＮＡの濃縮は常法に従って行うことができる。２本鎖のｃＤＮＡ合成は確立した技術であり、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から発売されているキットを使用すればよい。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の場合、業者の勧めに従って２本鎖ｃＤＮＡを合成しＥｃｏＲＩアダプターをつけ、制限酵素ＸｈｏＩで切断し、両末端が接着性となったこの２本鎖ｃＤＮＡの中からアガロースゲル電気泳動等の公知手段によって１千から４千塩基対のＤＮＡ断片を分離することができる。ついで、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が販売していλZAP IIなどのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位がクローニングしやすくなっているベクターに導入した後ファージにパッケイジングし（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ｃＤＮＡライブラリーを作ることができる。パッケイジングしたファージの感染に用いる宿主大腸菌は、ファージが増殖できる任意の細胞を使いうる。λZAP IIの場合には、ＰＬＫＦ’等が好ましい。以上のようなライブラリーの作製法は一例であり、ｃＤＮＡ合成キット・アダプター・ベクター等は公知のものを適宜選択できる。ｃＤＮＡライブラリーを作製した後、ファージ・クローンに宿主大腸菌で溶菌斑（プラーク）を形成させ、このプラーク中のＤＮＡを、公知の方法にしたがってそれぞれ２または３枚ずつのナイロン・メンブレンへ転写し、それぞれ別個のプローブとハイブリッド形成させて比較することにより目的のクローンを選抜する。例えば、ナスを赤色光および白色光の下で育て、それぞれの組織から得たｍＲＮＡに対応する³²ＰでラベルしたｃＤＮＡプローブを使って、後者のプローブと強力にハイブリッド形成を行うが、誘導前の組織に由来する前者のプローブとは反応しないことが判明したクローンを選ぶことができる（ディファレンシャル・スクリーニング）。また、さらに効率の良いスクリーニングを行なうためには、誘導後の組織に存在するｍＲＮＡに対応する合成ｃＤＮＡプローブを、予め誘導前の組織に存在するｍＲＮＡとハイブリッド形成させ、両組織に共通して存在するため２本鎖となったプローブを選択的に除去する（サブトラクト・プローブ）。２本鎖ＤＮＡの除去方法としては、リン酸塩濃度勾配によるヒドロキシ・アパタイト・カラム・クロマトグラフィー（例えばＢｉｏ・Ｒａｄ社）により１本鎖と２本鎖のＤＮＡを分離すること、あるいは誘導前の組織に由来するｍＲＮＡを予めビオチン化し、ハイブリッド形成後ビオチン化したｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ・ｃＤＮＡのハイブリッド体にアビジンを更に結合させ、その重合体をフェノール層に分配することにより、ハイブリッド形成しなかったｃＤＮＡを水層に回収する（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキットを使用する）ことによって実施できる。このようにして得たサブトラクト・プローブとディファレンシャル・スクリーニングを同一プレートに由来する３枚のコピーのナイロン膜に対して並行して行う事により、誘導のかかったクローンを高い精度で得ることができる。以上のようにして得たクローンに対してはこのようなプローブを用いたスクリーニングを２度以上行うと精度が飛躍的に高まり、白色光誘導性のクローンに富むライブラリー・サブセットが得られる。このサブセットを、既知の遺伝子ＣＨＳおよびＤＦＲでスクリーニングしたところ、何れも、濃縮前の１０倍以上に頻度が増加していた。即ち、濃縮前のライブラリー１０、０００クローン中のＣＨＳ及びＤＦＲをスクリーニングするとそれぞれ２、及び０クローン選抜できたのに対し、濃縮後では、１、０００クローンからそれぞれ４、及び１クローン得られた。上記のようにして得たファージ・クローンをプラスミドにサブクローニングするためには、一般的には、ファージＤＮＡを常法に従って精製した後、２本鎖ｃＤＮＡのクローニングに用いた制限酵素と同じ酵素で挿入ｃＤＮＡを切り出し、同一の酵素で切ったプラスミド（例えばブルースクリプトＩＩ）にクローニングすることもできる。λZAP IIの場合には、業者の勧めに従ってヘルパーファージを用いる事により、直接サブクローニングすることもできる。また、ｃＤＮＡをより簡便に得るためにはクローニング・サイトの外側に存在するベクターＤＮＡに対応するプライマー、例えばユニバーサル及びリバース・プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応による事もできる。ＰＣＲの反応方法は業者（Ｃｅｔｕｓ社）の勧めに従って良い。このようにして得たＤＮＡは、常法に従って電気泳動による挿入ＤＮＡの大きさの分析、及び目的のＤＮＡ断片に対しては電気溶出することができる。ついで、上記のようにして得たＤＮＡの相互関係については、クローン同志の交差ハイブリッド検定または適当な制限酵素の切断パターンを比較することによって知る事ができる。また、このようにして別々の遺伝子に由来すると推定されたＤＮＡ断片が植物体中でどのように発現しているかを知るために、誘導前後のナスの胚軸から得たｍＲＮＡを、常法に従って電気泳動した後ナイロン膜に転写し、³²Ｐでラベルした検定用ｃＤＮＡとハイブリッド形成させる、いわゆるノーザン分析に供することができる。塩基配列の解析は常法に従って行う。その際、前記プラスミド挿入体の制限酵素断片を適当なベクターにサブクローニングし、得られたクローンをサンガー法［サンブルックら(Sambrook);前出］のような公知の手法により塩基配列分析にかける。サブクローニングに好適なベクターは、不要なｃＤＮＡ断片を除いたものを再び結合させるセルフ・アニーリングによって得られた２本鎖ＤＮＡ、あるいはＭ１３系の１本鎖ＤＮＡでも行える。推定された塩基配列は、そのまま、あるいはタンパク質に読みかえることができるものはそれに変換した後、ＧＥＮＥＴＹＸ等の解析ソフトを用いてEMBL等のデータ・ベースに登録された公知の配列との比較を行うことができる。
【００１４】
３）クローンのフラボノイド−３−グルコース転移酵素活性の同定
上記のような手段で得たクローンをランダムにシーケンスすることにより種々の遺伝子情報が得られる。例えば、クローン名A４８はその推測されるアミノ酸配列が前出のトウモロコシ種子由来のフラボノイド−３位−糖転移酵素遺伝子と有意な相同性を示した。A４８の全塩基配列を配列番号２に、それから予想されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１５】
次に、A４８のコードするタンパク質の活性については、大腸菌でタンパク質を生産させ、その産物の活性を測ることができる。この場合の宿主としては、そのほかの頻用される生物、例えば酵母あるいはタバコなどの植物でもよいことは言うまでもない。その場合、タンパク質はA４８に由来する配列以外の余計な配列を含まない構成の他、別の蛋白との結合物であってもいい。A４８の発現については大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ由来タンパク（２８アミノ酸）をアミノ末端側に含むタンパクとして大腸菌ＪＭ１０９株で発現させ、可溶性タンパク質を抽出し、受容体としてケルセチンまたはシアニジンを用いて、糖転移酵素の測定を行なった。反応精製物は薄層セルロース板（ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィーにより推定することができる。この際、標準品として例えばケルセチン−３−グルコシド又はシアニジン−３−グルコシドを同時に分析して、比較すると良い。ＴＬＣの場合３種類の溶媒系、例えば１５％酢酸、水飽和フェノール及び蒸留水（以上フラボノールを受容体とする場合）、又は、１％塩酸、酢酸：塩酸：水＝１５：３：８２の混液、及びn-ブタノール：酢酸：水＝４：１：５の混液（シアニジンを受容体とする場合）で同時に比較検討することにより他の糖転移酵素の産物と区別できる。このA４８のｍＲＮＡの発現パターンについては、ナスの実生では常法に従ってｍＲＮＡを取得し、A４８をプローブとするノーザン解析をすると、図３に示すように約、１、６００塩基のｍＲＮＡが光誘導後初めて検出されることがわかる。この光誘導性は、先に述べたようにＣＨＳおよびＤＦＲなどでも顕著であり、同時にクローニングした他の３種類の遺伝子（A1, A54, CYP75）でも顕著に認められた。なお、これらのクローンのうち、CYP75はフラボノイドＢ環水酸化酵素をコードしていることが推定されている。また、A４８と類似の遺伝子がナスの染色体DNA中にあるかどうかを調べるため、染色体DNAを適当な制限酵素で切断した後、アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜などのDNAを吸着しやすい性質を持つ膜に転写し、放射性のリン等で標識したA４８の断片との反応性を調べた（サザンハイブリダイゼーション；図４）。Hind III（図４のレーン１）, Eco RV（レーン２）のいずれの場合も１本の、また Bam HI（レーン３）ではA４８のcDNA中に１つ切断点が存在するので２本のバンドが検出され、その他のバンドは検出できなかった。
【００１６】
以上の事をまとめると、
１．A４８に対応するｍＲＮＡは、ナスを材料とした時、フラボノイド系のＣＨＳ，ＣＦＩ及びＤＦＲと同様に白色光により胚軸で強く誘導され、誘導前には存在しなかった。これは、フラボノイド系の遺伝子である事を強く示唆する。
２．A４８は、配列番号２に示すような塩基配列を持っており、そこから推定されるアミノ酸配列（配列番号１）はトウモロコシ及びキンギョソウのフラボノイド−３−グルコース転移酵素と類似し、糖転移酵素をコードしていると推定される。
【００１７】
３．A４８を大腸菌でタンパクとして発現させ酵素活性を測定すると、ケルセチン及びシアニジンの３位にグルコースを転移させる活性を有しており、フラボノイド−３−グルコース転移酵素であることが証明された。
４．従って、A４８遺伝子を利用すると、配糖化が進んだフラボノイドが合成され、花粉稔性、水への溶解性、色素の安定性が変化した物質が蓄積した植物の創出に大きく役立つと思われる。
【００１８】
本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素は、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。「実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に加えて、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列に幾つかのアミノ酸の欠失、置換、付加などがあってもよいことを意味する。ここで、アミノ酸の欠失、置換または付加は、周知の技術である部位特異的突然変異誘発（例えば、サンブルックら, 前出, 15.1-15.113 頁を参照のこと) により実施することができる。また、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する限りにおいて、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質の断片も含む。さらに、本発明は、上記のようなフラボノイド−３−グルコシル転移酵素およびその断片と他のタンパク質との融合タンパク質も包含する。他のタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ由来タンパク質、マルトース結合性タンパク等を挙げることができる。上記の融合タンパク質は公知の方法に従って生産することができる。例えば、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片の読み枠を融合させる他のタンパク質のそれにあわせてから、他のタンパク質をコードする遺伝子に結合することにより作製した融合遺伝子を宿主に導入し、この宿主を適当な培地で培養すれば、他のタンパク質に結合したフラボノイド−３−グルコシル転移酵素またはその断片を発現させることができる。
【００１９】
また、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子およびその断片は、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡであり、これには、自然界に存在するフラボノイド配糖化酵素コードするＤＮＡ配列だけでなく、上記のような変異配糖化酵素をコードするＤＮＡ配列をも包含される。また、一般に、ＤＮＡ鎖があるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする場合、一つのアミノ酸に対応する遺伝コード（コドン）が複数個存在する（縮重異性体）。本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子およびその断片においても、任意の遺伝コードを用いることができることは言うまでもない。また、ＤＮＡ鎖またはその断片を発現させてそれがコードするタンパク質もしくはポリペプチドを産生させるためには、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列（コーディング領域）以外に、発現調節配列が必要である。従って、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子およびその断片は、このような発現調節配列を含んでもよい。この発現調節領域の中で特に重要なのがコーディング領域の上流のプロモーター配列、及び下流のポリＡ付加シグナルである。植物で発現させる場合のプロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーターなどを使用することができ、ポリＡ付加シグナルとしては、ノパリン合成酵素などを使用することができる。取得したＤＮＡがゲノム遺伝子である場合には、ＤＮＡ配列に発現調節領域が含まれていれば、それをそのまま用いることもできる。本発明は、また、上述のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片を含有する組換えベクターを包含する。この組換えベクターは上述のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片をベクターに連結した物であり、ベクターとしては、ｐＢＩＮ１９、ｐＵＣ１９、λｇｔ１１などのプラスミド、ファージ等公知の物が使用できる。この組換えベクターＤＮＡを、タバコ、ジャガイモ、イネなどの適当な植物、あるいは微生物細胞に導入して発現させる事により、宿主においてフラボノイド−３−グルコシル転移酵素が産生される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。また、色素の誘導関係の詳細は、戸栗ら Plant Molecular Biology 23, 933-946頁(1993)及び特開平５−１８４３７０に記述してある。
【００２１】
〔実施例１〕フラボノイド系色素の誘導
ナス種子（東北種苗社の品種 ’新佐土原茄子’）をバーミキュライトに播種し２５℃の下、３００ルックスの赤色光（赤色のアクリル板；メイバン社製、厚さ１mm）を連続照射し２週間栽培した。次に、８０００ルックスの白色の蛍光灯（東芝社、実生の位置で６Ｗ/ｍ2））およびＵＶ光（東芝社、ＦＬ−２０ＳＥ、ＦＬ−２０ＳＢＬＢ；０.５Ｗ/ｍ2）［この条件を本発明では白色光と呼ぶ］を５日間照射した。植物体から、光源までの距離は、１５から２５ｃｍであった。光質を変換したのち、アントシアン含量を測定するため、0.2 gの実生を１％のメタノール塩酸で抽出し、５３０ｎｍの吸光度を測定したところ、５日目の色素量を最大とした時２日目で既に最大値の半分に達していた。また、並行してログマン［（J.Logemann) Analytical Biochemistry 163,16-20頁(1987)〕が記載した方法に従って、実生等の各部分からｍＲＮＡ抽出を行い、ホルムアルデヒド入りの変性下でのアガロース電気泳動後、Hybond N(Amersham社)に業者の指示どうりに転写した。公知の配列であるペチュニア花弁のＣＨＳおよびＤＦＲ、ならびにタバコの葉のリブロース-1,5-2-リン酸カルボキシラーゼ（小サブユニット）の全構造遺伝子を、それぞれ公知の塩基配列を基にＤＮＡプライマーを合成し、業者の指示どうりにＰＣＲ法によりクローニングし、それをプローブとして〔ファインバーグら（A. P. Feinberg）Analytical Biochemistry 132, 6-13頁(1983)および137, 266-267頁(1983)〕、ナスのｍＲＮＡとハイブリダイズさせることにより行うノーザン・ハイブリダイゼーションで観察した。ＣＨＳおよびＤＦＲは、白色光による誘導が顕著に観察されたが、リブロース-1,5-2-リン酸カルボキシラーゼでは誘導は２倍以下であった。
【００２２】
〔実施例２〕フラボノイド系色素が濃縮されたｃＤＮＡライブラリーの作製
ナス種子を、実施例１に従って赤色光のもとで２週間栽培し、白色光による誘導を７２時間かけたものを材料として使用した。前記の方法に従ってｍＲＮＡを調整し、Invirogen社のｃＤＮＡ合成キット（The Librarian II)を用いて２本鎖ｃＤＮＡを得て、ラムダ・ザップII(Stratagene社)のEcoRI/XhoIサイトに業者の説明書に従ってクローニングしｃＤＮＡライブラリーを作製した。誘導されたクローンの濃縮にあたっては、誘導をかけた組織由来のｍＲＮＡから³²PでラベルしたｃＤＮＡプローブを作り［20 uM dCTP,各200 uM のdGTP/dATP/dTTP, 20mM DTT, 50mM Tris HCl(pH 7.5), 75mM KCl, 3mM MgCl, 100 ng ナス実生mRNA, 300 ug/ml oligo(dT)プライマー, 300 uCi 32P-dCTP(Amarsham社, 3000Ci/mmol),及び1 ul MMLV逆転写酵素（ＢＲＬ社、100U/ul); 37℃、１時間反応］、このｃＤＮＡとあらかじめInvitrogen社の勧めに従ってビオチン化した２０倍量の誘導前の組織由来のｍＲＮＡを, ２０ ulの0.2％SDS, 50mM Hepes (pH7.6), 0.5M NaCl, 2 mM EDTA, 50％(V/V)ホルムアミドの液［(D.N.Crowell) Proceedings of National Academy of Science, 87, 8815-8819頁(1990)］中で４０℃、４０時間ハイブリダイズさせた。反応終了後この液に８０ulの50mM Hepes( pH7.6), 0.5M NaCl, 2 mM EDTA及び 10ug ストレプトアビジン（Vector社)の混合液を加え、室温で１０分間反応後、１００ul のフェノール・クロロホルム混液で抽出し上層を回収した。この液を、常法に従って寒天培地上にはやしたファージ・ライブラリーをＨｙｂｏｎｄ−Ｎに移したものをスクリーニングする際のサブトラクトプローブとして使用し、陽性クローンを選抜した。このプローブを用いるとディファレンシャルスクリーニングより、はるかにシグナル／ノイズ比が高くなることがわかった。
【００２３】
〔実施例３〕フラボノイド配糖化酵素遺伝子のクローニング、構造解析及びmRNAの発現パターンの分析
上記実施例２の方法により３０, ０００クローンを繰り返しスクリーニングすることにより７０クローンの誘導性クローンから成るライブラリー・サブセットを得た。これらをランダムに蛍光シーケンサー（アプライドバイオシステム社）にてシーケンスしたところ、トウモロコシの糖転移酵素等と有為な相同性を持つタンパク質をコードしているクローンA４８があった（図２）。このクローンの全塩基配列は、適当な制限酵素で切断した後、再結合することによる欠失処理により得た短いDNA断片の構造を両側から読んだ情報を集約することによって決定し、１５７８ｂｐからなるDNAであることを明らかにした（配列番号２）。また、このcDNAはアミノ酸４３３残基から成るタンパク質をコードしていることが明らかになった（配列番号１）。本クローンをプローブとして用いて、光誘導前後のナス胚軸由来のｍＲＮＡと、常法に従いハイブリダイゼーションを行った結果、ナスの白色光誘導をかけた組織で1.６kbの強いシグナルが観察された（図３）。同時にクローニングされた他の３種類の遺伝子（A1, A54 およびCYP75)をプローブとして用いた場合でも、同様に強いシグナルが観察された（図３）。図３中、Ｒは赤色光下で２週間発芽させた実生から抽出したｍＲＮＡを、Ｗはその後更に４８時間白色光で栽培した実生から抽出したｍＲＮＡを示す。また、染色体DNAはムライの方法[Murray, Nucleic Acid Research 8, 4321-4325頁 (1980)]に従って２０ｇの実生から調整した。得られたDNAから各１０μｇを制限酵素（宝酒造）Bam HI, Eco RV, Hind III （50 U、３７℃、１６時間）で夫々切断した後、０、８％アガロースゲルで分離した。ゲルからDNAをナイロン膜（ハイボンドＮ+）に０、４Ｍ NaOHで移した。A４８をプローブとするハイブリダイゼーションの結果を示す（図４）。なおここでは、洗浄の条件を、２×ＳＳＣ（緩い条件、図４のａ）および0.１×ＳＳＣ（厳しい条件、図４のｂ）の強弱２種類設定した。図４中、レーン１、２および３は、それぞれ、Hind III, Eco RVおよびBam HIで切断されたナスのゲノムＤＮＡである。
【００２４】
〔実施例４〕クローンの大腸菌での発現
上記クローンA４８はプラスミドBluescript SK(-)のポリリンカー部位に、5' 側のEcoRI部位から3'側のXhoI部位にかけてクローニングされているが、5'側のポリリンカー中の SacIとEcoRIにより切断した後、Klenow酵素（室温１０分； 1U）処理した後セルフライゲーションをし、読み枠を上流にある大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼにあわせた。これにより、β−ガラクトシダーゼ由来の短いペプチド配列（２８残基）に結合したA４８の配列がタンパク質に読まれることになる。
【００２５】
そのようにして得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、目的とするプラスミドの塩基配列を確認した後、５ｍｌのＬＢ培地（５０ｍＭのアンピシリンを含む）で６００ｎｍでの濁度が０、３になるまで培養した後（３７℃）、１ｍＭのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)でタンパク質の生産を３時間誘導した。集菌後、菌体を100 mM Tris HCl(pH 8.0), 0.15 M NaCl, 15 % Glycerolからなる液で懸濁し、超音波処理（トミー精工、ハンディソニックUR-20P：最大出力で３０秒を５回）し、１万×ｇで３０分遠心分離して得た上清を酵素液とした。測定条件は、基質として1.6 mM UDPglucose（糖の供与体; SIGMA社）及び1 mM ケルセチン（糖の受容体；フナコシ社）を用い、0.4M リン酸緩衝液に、大腸菌で発現させた酵素液を0.5 μl加え全量を３０μlとし、３０℃でｐＨ6.4 と7.4で１０分間反応させた。反応生成物の分析はＴＬＣで行なった。展開溶媒は１５％酢酸、水飽和フェノール、及び蒸留水の３種類で行ない、標準品としてケルセチン−３−O−グルコシド（イソケルシトリン)を用いた。その結果、下記の表１に示すように、A４８に由来する酵素液を含む反応液でイソケルシトリンと同一の移動度の生成物が検出された。
【００２６】

【００２７】
またシアニジンを受容体とする反応は以下のように行なった。0.2 M リン酸緩衝液、0.1 mM シアニジン、16 μM UDPglucose、酵素液５μlとし全量500μlで30℃１０分間反応を行なった。反応生成物の分析はＴＬＣで行い、展開溶媒としては、酢酸：塩酸：水＝15：3：82、１％塩酸およびn-ブタノール：酢酸：水＝4：1：5を用い、標準品として、シアニジン−３−グルコシド(C-3-G)を用いた。その結果、下記の表２に示すように、A４８に由来する酵素液を含む反応液でシアニジン−３−グルコシドと同一の移動度の生成物が検出された。
【００２８】

【００２９】
【発明の効果】
本発明により、植物の主要な色素であるフラボノイドの修飾酵素である、フラボノイド−３−グルコシル転移酵素をコードするDNAが提供された。フラボノールの配糖化はオーキシンの輸送活性を変え、花粉管伸張を制御するので、この遺伝子を操作する事によって、植物の自殖稔性を変える事ができ、植物の種子生産上に大いに役立つ。また、アントシアニンを配糖化することにより、有色色素が安定化される。
【００３０】
【配列表】

【００３１】

【図面の簡単な説明】
【図１】ケルセチンからケルセチン３−O−グルコシド（イソケルシトリン）への配糖化反応図である。
【図２】クローンA４８のコードするアミノ酸配列とトウモロコシ及びキンギョソウのフラボノイド−３−糖転移酵素のアミノ酸配列の一致性を示す。
【図３】 A４８をプローブとして、光誘導前後のナス胚軸由来のｍＲＮＡをハイブリダイゼーションにかけた結果を示す電気泳動写真である。Rは赤色光下で２週間発芽させた実生、Wはその後、更に４８時間白色光下で育てた実生から、夫々抽出したｍＲＮＡを示す。
【図４】 A４８をプローブとするナスのゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション分析の結果を示す電気泳動写真である。洗浄条件は、2×SSC（緩い条件、ａ）と 0.1×SSC（厳しい条件、ｂ）の２種類設定し、制限酵素としては、レーン１から３で、夫々、Hind III, Eco RV, BamHIを用いた。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a glucose transferase that modifies flavonoid compounds, which are main pigments present in plant petals and the like, a DNA encoding the enzyme, a recombinant vector containing the DNA, and a method for producing the DNA, More specifically, the present invention relates to an enzyme having an activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid compound, a DNA encoding the enzyme, a recombinant vector containing the DNA, and a method for producing the DNA.
[0002]
[Prior art]
Of the flavonoid compounds present in plant flowers, stems, etc., anthocyan has attracted great interest, especially in breeding florets, because it provides plants with yellow, red, and blue colors. In addition, other flavonoid colorless compounds are also known to have several physiological roles, such as reducing UV damage to plants by absorbing ultraviolet light, It is known to act as a protective substance (phytoalexin) [Hahlbrock et al. (Hahlbrock) Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology 40, 347-369 (1989)]. Although their synthetic pathways have been studied in detail [Mol et al. (Mol) Plant Molecular Biology Reporter 6, pp. 274-279 (1988)], biosynthetic products are further affected by various types of modifying enzymes depending on the plant species. It has changed in response [Forkmann Plant Breeding 106, pp. 1-26 (1991)]. For example, methylation [Jonsson Theoretical and Applied Genetics 68, 459-466 (1984)], acylation [Hahlbrock FEBS Letters 28, 65-68 (1972)], glycosylation, etc. Among them, glycosylation is considered important in terms of changing the physical properties of various secondary metabolites.
[0003]
Flavonol, a kind of flavonoid, is a product of dihydroflavonol oxidized by the action of one flavonol synthase of dioxygenase [Forkmann et al. It is known that after conversion to flavonol, in addition to glycosylation, it is modified by methylation, sulfation [Varin Plant Physiology 95, pages 1254-1258 (1991)] and the like. Also, as a significant function of flavonols, it affects the transport of the plant hormone auxin [Jacobs et al. (Jacobs Science 241, 346-349 (1988)], and the growth of pollen tubes is controlled. It is said to be useful for controlling fertility [WO 93/18142]. That is, flavonol promotes the growth of pollen tubes, but its glycosylated product has no growth promoting activity. Therefore, it is assumed that pollen tube growth is poor in plants with high glycosylation activity, and fertility is significantly reduced. (Pollak) Plant Physiology 102, 925-932 (1993)]. In addition, flavonoids extracted from plants, especially flavonols, play a role as a protective substance against fluorescence such as UV light as described above, so food addition for the purpose of preventing discoloration of pigments and oxidation of active ingredients Widely used as a product [Ikuo Takaya, New Food Industry 35, 7-16 (1993)]. However, natural flavonols are difficult to use because they are highly hydrophobic and difficult to dissolve in water, and the present situation is that purified substances are used after being glycosylated with an enzyme derived from a microorganism [Japanese Patent Laid-Open No. 02-179839]. In order to avoid this and produce a substance with advanced glucoside glycosylation in plants, it is not impossible in principle to respond to these demands by cross breeding. However, such classic plant breeding methods have many problems such as good compatibility with crossing depending on the combination of various plant species used for cross breeding, introduction of unwanted traits other than the target trait. Is inherent.
[0004]
On the other hand, it goes without saying that anthocyan is a main component of various natural pigments such as red and blue, but colorless anthocyanidins are glycosylated and then become colored stable compounds. During the biosynthesis, anthocyanidins before glycosylation are considered to be very unstable compounds, and the glycosylation step is considered to be an important reaction for pigment formation.
By the way, with the development of plant genetic engineering in recent years, it has become possible to give plants various useful traits using genetic recombination techniques. As an example, Meyer et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 2-2305) carried out gene recombination in Petunia hybrida, failed to form cyanidin and delphinidin-type pigments, and only the 4 ′ position was hydroxylated in the B ring. Introducing DFR (dihydroflavonol-4-reductase) derived from maize (Zea mays) to a mutant that accumulates dihydrokaempferol, a synthetic intermediate, to create a novel brick-colored petunia succeeded in. If such a method is used, there is a possibility that a plant having a glycosylated flavonol can be produced by introducing an enzyme that transfers glucose to the 3-position of flavonol into various plants. In such a plant, since gluconylated flavonol is mainly used, the extension of the pollen tube is inhibited and the fertility may be reduced. In addition, Kroll et al. [(Van der Krol) Nature 333, 866-869 (1988)] found that the chalcone synthase (CHS) gene mRNA was transcribed in the reverse direction (antisense). It was successfully introduced to significantly reduce CHS activity and reduce the amount of flavonoids produced. If this technology is applied, it would be possible to introduce a flavonoid glycosyltransferase gene into a plant with antisense to produce a plant that mainly produces flavonoids that have not undergone glycosylation [Kroon et al. Journal 5, pages 69-90 (1994)].
[0005]
Detailed research on glycosylation of flavonoids to position 3 has been carried out using corn seeds (E. C. 2.4.1.91), snapdragon flowers, and the like. Enzymatically, it is said that one molecule of glucose is transferred to position 3 of the A ring of flavonoids using UDPglucose as a donor of glucose (FIG. 1). Also, glycosyltransferases from red cabbage seedlings [Sun et al. (Sun) Plant Physiology 95, 570-576 (1991)] and petunia flowers [Jonsson Planta 160, 341-347 (1984)]. Enzymological findings have mainly been obtained on the selectivity of receptors. However, there are few examples of saccharification of flavonols, anthocyans, or both of the receptor flavonoids using a purified enzyme. In many cases, multiple glycosidases coexist. The determination of the substrate in the strict sense does not appear to be clear due to the measurements [Hosel The Biochemistry of Plants 7, 725-753 (1981)]. In addition, both the aforementioned cabbage and petunia-derived enzymes are dimers having a subunit of 27-30 kDa, and it seems that the corresponding structure is different from that of the 50 kDa type such as corn. Concerning the structure of the gluconase gene for flavonoids, corn seeds [Ralston et al., 119, 185-197 (1988)] and snapdragons [C. Cathie Martin, UK] John Ines Institute; personal communication] and about the rhamnose transfer to position 3 in Petunia [Kroon et al. (Kroon Plant Journal 5, pp. 69-80 (1994)]) In this case as well, the activity of the enzyme encoded by the gene has not been directly measured.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a gene capable of expressing an enzyme having an activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid.
Another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing the gene, an enzyme encoded by the gene, and a method for producing the gene.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors have used eggplant (Solanum melongena), A gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 3rd position of the flavonoid was cloned, and Escherichia coli was transformed with a recombinant vector incorporating the gene to express the gene. The present inventors have found that a protein having an activity of transferring glucose to the 3rd position is produced and completed the present invention. That is, the present invention provides a DNA or fragment thereof encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 3rd position of a flavonoid and substantially comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The present invention also provides a recombinant vector comprising the DNA or a fragment thereof. Furthermore, the present invention provides a protein having an activity of transferring glucose to position 3 of a flavonoid, substantially comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof, and a fusion protein thereof. Furthermore, the present invention provides a method for isolating mRNA from a plant in which flavonoid synthesis has been induced, preparing a cDNA library from the mRNA, and from the cDNA library, DNA derived from a plant that has not induced flavonoid synthesis or A protein having the activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid, comprising selecting a cDNA encoding a protein having the activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid by removing a clone that reacts with the fragment A method for producing DNA encoding is provided.
[0008]
The present invention will be described in detail below.
1) Method for inducing flavonoid pigments
Since the glycosidase gene which is the subject of the present invention is generally low in content and unstable, it seems that it takes a lot of labor to purify the protein. Therefore, a system for cloning genes without protein purification is essential. One of the most reliable methods that can be applied to higher plants is to induce mutations by transposon, isolate the pigment synthesis mutant, and then analyze the function of the inserted gene Thus, the glycosyltransferase genes of corn and snapdragon have been isolated by such a method (Ralston et al., Genetics 119, pages 185-197 (1988)). In addition, a snapdragon homologous gene was isolated using this as a probe (Martin et al., Plant J. 1, pp. 37-49 (1991)). The glucosidase gene of the present invention can also be isolated by these methods.
[0009]
In addition, there is also a method in which pigment induction is clearly induced and a clone corresponding to the gene to which the induction is induced is distinguished from another clone by hybridization. Such a technique is also possible for plants that do not use transposons, and in general, differential mRNAs using radiolabeled probes corresponding to the respective mRNAs taken from tissues before and after induction are used. Some successes have been reported, referred to as hybridization, or a further refined subtract hybridization [Sambrook; Molecular Cloning, second edition, 10.38-10.43; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]. Regardless of which method is used, it is important that the target gene does not exist in the tissue before induction or is extremely small as compared with that after induction. In the present invention, it is effective to apply the method previously developed by the present inventors to isolate the flavonoid hydroxylase gene [Japanese Patent Laid-Open No. 5-184370]. Hereinafter, a method for isolating the glycoside enzyme gene of the present invention in accordance with Japanese Patent Laid-Open No. 5-184370 will be briefly described, but it may be isolated by the other methods described above.
[0010]
In search of a system that clearly induces flavonoid genes, eggplant (Solanum melongena) seeds that produce delphinidin pigments are cultivated under red light for about two weeks, and then mixed with white and UV light It was found that the synthesis of flavonoids was very clearly induced by irradiating for 2 days or longer (hereinafter referred to as white light). When the change in the anthocyan content for 5 days after induction with white light was observed, it reached half of the maximum value after about 48 hours (not shown). In this case, most of the induced genes are related to photosynthesis in the operation of shifting from dark places to white light, which has been frequently used in biochemical studies of plants. It was considered extremely inefficient to choose the ones related to flavonoids. In the case of the method of the present invention, not only eggplants but also crops that accumulate flavonoid compounds in seedlings when cultivated under white light, such as petunia and corn, can be used.
[0011]
Examining the changes in mRNA of known genes during this period, CHS (chalcone synthase) and DFR (dehydroflavonol-4-reductase) located before and after the hydroxylation reaction of flavonoids in the flavonoid pigment synthesis system, It was found that it could not be detected before induction and gradually increased from the seventh hour after induction. Further, among CHS and DFR mRNAs, pigments are strongly induced in the hypocotyl among seedlings, so it is desirable to use those portions. Furthermore, the amount of mRNA of RuBisCO (ribulose-1,5, -2 phosphate carboxylase / oxygenase), which is a typical enzyme of the photosynthetic system, was almost the same before and after the induction of white light. This means that clones corresponding to mRNAs of photosynthetic genes that appear to be much larger than the system can be efficiently removed by using the system using eggplant seedlings of this method (data Abbreviation).
[0012]
Furthermore, for flavonoid-3-glycosylase (UDPglucose-dependent type), the enzyme activity can also be measured. For example, when flavonol is used as a receptor, a solution obtained by dissolving quercetin sold by Serva in ethylene glycol monomethyl ether can be used as a substrate. Separately, as a plant material, for example, it is reacted with an extract of eggplant hypocotyl after light induction, and the product is distributed to an ethyl acetate layer and concentrated under reduced pressure. This is dissolved in 80% methanol and developed by cellulose thin layer chromatography (solvent composition; 15% acetic acid, etc.). The present inventors have confirmed that quercetin-3-glucoside, which is an enzyme reaction product, is produced from an eggplant seedling-derived enzyme by such a technique.
[0013]
2) Preparation of cDNA library and selection of photo-stimulatory clone
Extraction of RNA from induced eggplant hypocotyls and concentration of mRNA therefrom can be performed according to conventional methods. Double-stranded cDNA synthesis is a well-established technique. For example, a kit sold by Pharmacia, Amersham, Invitrogen, or the like may be used. In the case of Stratagene, a double-stranded cDNA is synthesized according to the recommendation of the manufacturer, an EcoRI adapter is attached, the restriction enzyme XhoI is cleaved, and both ends of the double-stranded cDNA become adhesive. A DNA fragment of 1,000 to 4,000 base pairs can be separated by known means. Subsequently, for example, an EcoRI / XhoI site such as λZAP II sold by Stratagene is introduced into a vector which can be easily cloned, and then packaged with phages (Stratagene) to prepare a cDNA library. As the host E. coli used for infection of the packaged phage, any cell capable of growing the phage can be used. In the case of λZAP II, PLK F ′ or the like is preferable. The above library preparation method is an example, and a known cDNA synthesis kit, adapter, vector and the like can be appropriately selected. After preparing a cDNA library, a phage clone is formed with lytic plaques (plaque) in host E. coli, and the DNA in the plaque is transferred to two or three nylon membranes according to a known method, The clone of interest is selected by hybridization with each separate probe and comparison. For example, eggplants are grown under red and white light and correspond to mRNA obtained from each tissue³²A cDNA probe labeled with P can be used to select a clone that is strongly hybridized with the latter probe, but has not been reacted with the former probe derived from the tissue before induction (differential screening). ). In addition, in order to perform screening more efficiently, a synthetic cDNA probe corresponding to mRNA present in the tissue after induction is hybridized with mRNA present in the tissue before induction in advance and is commonly present in both tissues. Therefore, the double-stranded probe is selectively removed (subtract probe). As a method for removing double-stranded DNA, separation of single-stranded DNA and double-stranded DNA by hydroxyapatite column chromatography (for example, Bio Rad) using a phosphate concentration gradient, or before induction MRNA derived from tissue is biotinylated in advance, and after hybridization, biotinylated mRNA and mRNA / cDNA hybrids are further bound to avidin, and the polymer is distributed to the phenol layer, so that unhybridized cDNA can be obtained. It can be carried out by collecting in an aqueous layer (for example, using an Invitrogen kit). By performing the subtract probe and differential screening obtained in this way on three copies of nylon membranes derived from the same plate in parallel, induced clones can be obtained with high accuracy. When clones obtained as described above are screened twice or more using such a probe, the accuracy is dramatically improved, and a library subset rich in white light-inducible clones can be obtained. When this subset was screened with the known genes CHS and DFR, the frequency was increased more than 10 times before enrichment. That is, when CHS and DFR in the 10,000 clones before enrichment were screened, 2 and 0 clones were selected respectively, whereas after enrichment, 4 and 1 clones were obtained from 1,000 clones, respectively. . In order to subclone the phage clone obtained as described above into a plasmid, generally, the phage DNA is purified according to a conventional method and then inserted with the same enzyme as the restriction enzyme used for cloning the double-stranded cDNA. It is also possible to excise the cDNA and clone it into a plasmid (for example, Blue Script II) cut with the same enzyme. In the case of λZAP II, direct subcloning can be performed by using a helper phage according to the recommendation of the manufacturer. In order to obtain cDNA more easily, PCR (polymerase chain reaction) reaction can be performed by combining primers corresponding to vector DNA existing outside the cloning site, for example, universal and reverse primers. The PCR reaction method may be in accordance with the recommendations of the vendor (Cetus). The DNA thus obtained can be analyzed for the size of the inserted DNA by electrophoresis and electroeluted for the target DNA fragment according to conventional methods. Subsequently, the interrelationship between the DNAs obtained as described above can be determined by comparing the cross-hybrid assay between clones or the cleavage patterns of appropriate restriction enzymes. In addition, in order to know how DNA fragments presumed to be derived from different genes are expressed in the plant body in this way, mRNA obtained from eggplant hypocotyls before and after induction was obtained according to a conventional method. Transfer to nylon membrane after electrophoresis,³²It can be subjected to so-called Northern analysis in which it is hybridized with assay cDNA labeled with P. Analysis of the base sequence is performed according to a conventional method. At that time, the restriction enzyme fragment of the plasmid insert is subcloned into an appropriate vector, and the obtained clone is subjected to nucleotide sequence analysis by a known technique such as the Sanger method [Sambrook et al., Supra]. A vector suitable for subcloning can also be a double-stranded DNA obtained by self-annealing that re-binds those excluding unnecessary cDNA fragments, or an M13 single-stranded DNA. The estimated base sequence is converted as it is or can be read into a protein, and then converted to a protein, and then compared with a known sequence registered in a data base such as EMBL using analysis software such as GENETYX. be able to.
[0014]
3) Identification of clone flavonoid-3-glucosyltransferase activity
Various gene information can be obtained by randomly sequencing clones obtained by the above means. For example, clone name A48 showed significant homology in its deduced amino acid sequence with the corn seed flavonoid-3 position-glycosyltransferase gene. The entire base sequence of A48 is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence predicted therefrom is shown in SEQ ID NO: 1.
[0015]
Next, regarding the activity of the protein encoded by A48, the protein can be produced in E. coli, and the activity of the product can be measured. Needless to say, the host in this case may be another frequently used organism such as a plant such as yeast or tobacco. In that case, the protein may be a conjugate with another protein in addition to a configuration not including an extra sequence other than the sequence derived from A48. For the expression of A48, a protein containing β-galactosidase derived from E. coli (28 amino acids) is expressed in E. coli strain JM109 as a protein containing amino acid, and soluble protein is extracted. Was measured. The purified reaction product can be estimated by a thin-layer cellulose plate (TLC) or high performance liquid chromatography. At this time, for example, quercetin-3-glucoside or cyanidin-3-glucoside may be simultaneously analyzed and compared as a standard product. In the case of TLC, three kinds of solvent systems, for example, 15% acetic acid, water saturated phenol and distilled water (when flavonol is used as the acceptor) or 1% hydrochloric acid, acetic acid: hydrochloric acid: water = 15: 3: 82 mixed solution , And n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 (when cyanidin is used as a receptor) at the same time, it can be distinguished from other glycosyltransferase products. With regard to the expression pattern of this A48 mRNA, in the seedlings of eggplant, mRNA was obtained according to a conventional method, and when Northern analysis using A48 as a probe was performed, as shown in FIG. It turns out that it is detected for the first time. As described above, this light-inducibility is remarkable in CHS, DFR, etc., and is also recognized remarkably in the other three types of genes (A1, A54, CYP75) cloned at the same time. Of these clones, CYP75 is presumed to encode a flavonoid B-ring hydroxylase. In addition, in order to investigate whether a gene similar to A48 is present in the eggplant chromosomal DNA, the chromosomal DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then separated by agarose electrophoresis to easily adsorb DNA such as nylon membrane. The reactivity with A48 fragments labeled with radioactive phosphorus or the like was examined (Southern hybridization; FIG. 4). In Hind III (lane 1 in Fig. 4) and Eco RV (lane 2), there is one band. In Bam HI (lane 3), there is one cleavage point in the A48 cDNA, so two bands. Was detected, and other bands could not be detected.
[0016]
To summarize the above,
1. The mRNA corresponding to A48 was strongly induced in the hypocotyl by white light as in the case of flavonoid CHS, CFI and DFR when eggplant was used as a material, and was not present before induction. This strongly suggests that it is a flavonoid gene.
2. A48 has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence deduced therefrom (SEQ ID NO: 1) is similar to corn and snapdragon flavonoid-3-glucosyltransferases and encodes glycosyltransferases. It is estimated that
[0017]
3. When A48 was expressed as a protein in E. coli and the enzyme activity was measured, it had the activity of transferring glucose to the 3-position of quercetin and cyanidin, and was proved to be a flavonoid-3-glucosyltransferase.
4). Therefore, the use of the A48 gene is expected to greatly contribute to the creation of plants in which flavonoids with advanced glycosylation have been synthesized and accumulated substances with altered pollen fertility, water solubility, and pigment stability.
[0018]
The flavonoid-3-glucosyltransferase of the present invention substantially comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The “amino acid sequence substantially represented by SEQ ID NO: 1” means the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 as long as it has an activity of transferring glucose to the 3rd position of the flavonoid in addition to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: It means that there may be several amino acid deletions, substitutions, additions, etc. in the sequence. Here, amino acid deletions, substitutions or additions can be performed by site-directed mutagenesis, which is a well-known technique (see, for example, Sunbrook et al., Supra, pages 15.1-15.113). The present invention also includes a protein fragment substantially comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as long as it has an activity of transferring glucose to the 3rd position of the flavonoid. Furthermore, the present invention also encompasses fusion proteins of the above flavonoid-3-glucosyltransferases and fragments thereof with other proteins. Examples of other proteins include β-galactosidase-derived protein, maltose-binding protein, and the like. The above fusion protein can be produced according to a known method. For example, the fusion gene prepared by combining the reading frame of the flavonoid-3-glucosyltransferase gene or fragment thereof of the present invention with that of another protein to be fused and then binding to the gene encoding the other protein is used as a host. When introduced and cultured in an appropriate medium, flavonoid-3-glucosyltransferase or a fragment thereof bound to other proteins can be expressed.
[0019]
The flavonoid-3-glucosyltransferase gene of the present invention and a fragment thereof are DNAs encoding a protein substantially comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and include flavonoid glycosylation existing in nature. Not only the DNA sequence encoding the enzyme but also the DNA sequence encoding the mutant glycosylation enzyme as described above is included. In general, when a polypeptide having a DNA chain having a certain amino acid sequence is encoded, a plurality of genetic codes (codons) corresponding to one amino acid are present (degenerate isomers). It goes without saying that any genetic code can be used in the flavonoid-3-glucosyltransferase gene and fragments thereof of the present invention. In addition, in order to express a DNA chain or a fragment thereof to produce a protein or polypeptide encoded by it, an expression regulatory sequence is required in addition to the DNA sequence (coding region) corresponding to the amino acid sequence. Therefore, the flavonoid-3-glucosyltransferase gene and fragments thereof of the present invention may contain such an expression control sequence. Of particular importance in this expression control region are the promoter sequence upstream of the coding region and the poly A addition signal downstream. As a promoter sequence for expression in plants, cauliflower mosaic virus 35S promoter, nopaline synthase promoter and the like can be used, and as a poly A addition signal, nopaline synthase and the like can be used. In the case where the obtained DNA is a genomic gene, if the DNA sequence contains an expression control region, it can be used as it is. The present invention also includes a recombinant vector containing the above-mentioned flavonoid-3-glucosyltransferase gene or a fragment thereof. This recombinant vector is a product in which the above-mentioned flavonoid-3-glucosyltransferase gene or a fragment thereof is linked to a vector, and known vectors such as plasmids such as pBIN19, pUC19, λgt11, and phages can be used as the vector. A flavonoid-3-glucosyltransferase is produced in a host by introducing the recombinant vector DNA into an appropriate plant such as tobacco, potato, rice, or a microbial cell and expressing it.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Details of the pigment induction relationship are described in Toguri et al., Plant Molecular Biology 23, 933-946 (1993) and JP-A-5-184370.
[0021]
[Example 1] Induction of flavonoid pigments
Eggplant seeds (variety 'Nagoko Sasahara' from Tohoku Seed Co., Ltd.) were sown in vermiculite and cultivated for 2 weeks under 25 ° C by continuously irradiating 300 lux red light (red acrylic board; made by Meiban Co., Ltd., 1 mm thick) did. Next, a white fluorescent lamp of 8000 looks (Toshiba, 6 W / m 2 at the seedling position) and UV light (Toshiba, FL-20S E, FL-20S BLB; 0.5 W / m 2) In the present invention, it is called white light] for 5 days. The distance from the plant body to the light source was 15 to 25 cm. After converting the light quality, 0.2 g seedlings were extracted with 1% methanolic hydrochloric acid and the absorbance at 530 nm was measured to measure the anthocyan content. Already reached half the maximum. In parallel, mRNA was extracted from each part of seedlings, etc. according to the method described by Logman [(J. Logemann) Analytical Biochemistry 163, pp. 16-20 (1987)], and agarose electrolysis under denaturation with formaldehyde was performed. After electrophoresis, it was transferred to Hybond N (Amersham) according to the manufacturer's instructions. The known sequence of petunia petals, CHS and DFR, and tobacco leaf ribulose-1,5-2-phosphate carboxylase (small subunit), all structural genes, DNA primers based on the known base sequences, respectively. Synthesized and cloned by PCR according to the manufacturer's instructions, and using it as a probe (AP Feinberg, Analytical Biochemistry 132, 6-13 (1983) and 137, 266-267 (1983)), It was observed by Northern hybridization performed by hybridizing with eggplant mRNA. Induction of white light was remarkably observed in CHS and DFR, but induction was not more than twice in ribulose-1,5-2-phosphate carboxylase.
[0022]
[Example 2] Preparation of cDNA library enriched in flavonoid pigments
Eggplant seeds were cultivated under red light for 2 weeks in accordance with Example 1 and used as a material after 72 hours of induction with white light. MRNA is prepared according to the above-mentioned method, double-stranded cDNA is obtained using Invirogen's cDNA synthesis kit (The Librarian II), and the EcoRI / XhoI site of Lambda Zap II (Stratagene) is followed according to the manufacturer's instructions. The cDNA library was prepared by cloning. In enrichment of induced clones, mRNA derived from the induced tissue should be used.³²Make a P-labeled cDNA probe [20 uM dCTP, 200 uM each dGTP / dATP / dTTP, 20 mM DTT, 50 mM Tris HCl (pH 7.5), 75 mM KCl, 3 mM MgCl, 100 ng eggplant seedling mRNA, 300 ug / ml oligo (dT) primer, 300 uCi 32P-dCTP (Amarsham, 3000 Ci / mmol), and 1 ul MMLV reverse transcriptase (BRL, 100 U / ul); reaction at 37 ° C. for 1 hour], this cDNA and Invitrogen in advance Twenty fold of mRNA from pre-induction tissue biotinylated according to the recommendations of 20 ul of 0.2% SDS, 50 mM Hepes (pH 7.6), 0.5 M NaCl, 2 mM EDTA, 50% (V / V) formamide In the solution [(DNCrowell) Proceedings of National Academy of Science, 87, 8815-8819 (1990)] at 40 ° C. for 40 hours. After completion of the reaction, 80 ul of 50 mM Hepes (pH 7.6), 0.5 M NaCl, 2 mM EDTA and 10 ug streptavidin (Vector) were added to this solution. After reacting at room temperature for 10 minutes, 100 ul of phenol / chloroform mixture was added. And the upper layer was recovered. This solution was used as a subtract probe when screening a phage library transferred to Hybond-N on an agar medium according to a conventional method, and positive clones were selected. It has been found that the signal / noise ratio is much higher with this probe than with differential screening.
[0023]
[Example 3] Cloning, structural analysis and analysis of mRNA expression pattern of flavonoid glucosidase gene
A library subset consisting of 70 inducible clones was obtained by repeatedly screening 30,000 clones by the method of Example 2 above. When these were randomly sequenced with a fluorescent sequencer (Applied Biosystems), there was clone A48 encoding a protein having significant homology with maize glycosyltransferase and the like (FIG. 2). The total nucleotide sequence of this clone was determined by aggregating information read from both sides of the structure of a short DNA fragment obtained by digestion with a suitable restriction enzyme and then rebinding, and consists of 1578 bp. It was revealed that it was DNA (SEQ ID NO: 2). It was also revealed that this cDNA encodes a protein consisting of 433 amino acid residues (SEQ ID NO: 1). Using this clone as a probe, hybridization with eggplant hypocotyl-derived mRNA before and after light induction was carried out according to a conventional method. As a result, a strong signal of 1.6 kb was observed in the tissue subjected to white light induction of eggplant. (FIG. 3). Similarly strong signals were observed when other three genes (A1, A54 and CYP75) cloned at the same time were used as probes (FIG. 3). In FIG. 3, R represents mRNA extracted from seedlings germinated for 2 weeks under red light, and W represents mRNA extracted from seedlings cultivated with white light for 48 hours thereafter. Chromosomal DNA was prepared from 20 g of seedlings according to Murai's method [Murray, Nucleic Acid Research 8, pages 4321-4325 (1980)]. 10 μg of each DNA was cleaved with restriction enzymes (Takara Shuzo) Bam HI, Eco RV, Hind III (50 U, 37 ° C., 16 hours), and then separated on a 0,8% agarose gel. DNA was transferred from the gel to a nylon membrane (High Bond N +) with 0,4M NaOH. The result of hybridization using A48 as a probe is shown (FIG. 4). In this case, two kinds of strengths of 2 × SSC (loose conditions, a in FIG. 4) and 0.1 × SSC (strict conditions, b in FIG. 4) are set as cleaning conditions. In FIG. 4,

lanes

1, 2 and 3 are eggplant genomic DNAs cut with Hind III, Eco RV and Bam HI, respectively.
[0024]
[Example 4] Expression of clone in E. coli
The clone A48 is cloned from the 5 'EcoRI site to the 3' XhoI site in the polylinker site of the plasmid Bluescript SK (-), but cleaved with SacI and EcoRI in the 5 'polylinker. Thereafter, after Klenow enzyme treatment (room temperature 10 minutes; 1 U), self-ligation was performed, and the reading frame was adjusted to β-galactosidase derived from E. coli upstream. As a result, the protein reads the sequence of A48 bound to a short peptide sequence (28 residues) derived from β-galactosidase.
[0025]
The plasmid thus obtained was transformed into Escherichia coli JM109 strain, and the nucleotide sequence of the target plasmid was confirmed. Then, the turbidity at 600 nm was 0, 3 in 5 ml of LB medium (containing 50 mM ampicillin). After culturing until (37 ° C.), protein production was induced with 1 mM isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) for 3 hours. After collection, the cells are suspended in a solution of 100 mM Tris HCl (pH 8.0), 0.15 M NaCl, 15% Glycerol, and sonicated (Tomy Seiko, Handy Sonic UR-20P: 5 seconds at maximum output for 5 seconds) And the supernatant obtained by centrifugation at 10,000 × g for 30 minutes was used as an enzyme solution. The measurement conditions were 1.6 mM UDPglucose (sugar donor; SIGMA) and 1 mM quercetin (sugar acceptor; Funakoshi) as substrates, and an enzyme solution expressed in E. coli in 0.4 M phosphate buffer. 0.5 μl was added to make a total volume of 30 μl, and the mixture was reacted at 30 ° C. at pH 6.4 and 7.4 for 10 minutes. Analysis of the reaction product was performed by TLC. The developing solvent was three kinds of 15% acetic acid, water saturated phenol and distilled water, and quercetin-3-O-glucoside (isoquercitrin) was used as a standard product. As a result, as shown in Table 1 below, a product having the same mobility as isoquercitrin was detected in the reaction solution containing the enzyme solution derived from A48.
[0026]

[0027]
The reaction using cyanidin as a receptor was carried out as follows. A 0.2 M phosphate buffer solution, 0.1 mM cyanidin, 16 μM UDPglucose, and 5 μl enzyme solution were reacted at 30 ° C. for 10 minutes in a total volume of 500 μl. The reaction product was analyzed by TLC. Acetic acid: hydrochloric acid: water = 15: 3: 82, 1% hydrochloric acid and n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 were used as developing solvents. Cyanidin-3-glucoside (C-3-G) was used. As a result, as shown in Table 2 below, a product having the same mobility as cyanidin-3-glucoside was detected in the reaction solution containing the enzyme solution derived from A48.
[0028]

[0029]
【The invention's effect】
According to the present invention, a DNA encoding a flavonoid-3-glucosyltransferase, which is a flavonoid-modifying enzyme that is a major plant pigment, is provided. Flavonol glycosylation alters auxin transport activity and regulates pollen tube elongation. By manipulating this gene, plant self-fertility can be altered, greatly helping plant seed production. In addition, colored pigments are stabilized by glycosylation of anthocyanins.
[0030]
[Sequence Listing]

[0031]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a glycosylation reaction diagram from quercetin to quercetin 3-O-glucoside (isoquercitrin).
FIG. 2 shows the consistency between the amino acid sequence encoded by clone A48 and the amino acid sequences of corn and snapdragon flavonoid-3-glycosylase.
FIG. 3 is an electrophoretogram showing the results of subjecting eggplant hypocotyl-derived mRNA before and after light induction to hybridization using A48 as a probe. R shows the mRNA extracted from the seedlings germinated for 2 weeks under red light, and W shows the mRNA extracted from the seedlings grown under the white light for 48 hours thereafter.
FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of Southern hybridization analysis for eggplant genomic DNA using A48 as a probe. Two washing conditions are set: 2 × SSC (loose condition, a) and 0.1 × SSC (harsh condition, b). As restriction enzymes, lanes 1 to 3, respectively, Hind III, Eco RV, and BamHI are used. Using.

Claims

A DNA encoding the following protein (a) or (b), which has an activity of transferring glucose to the 3rd position of a flavonoid.
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid

A DNA encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 3rd position of a flavonoid, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

A recombinant vector comprising the DNA according to claim 1 or 2.

A protein encoded by the DNA according to claim 1 or 2.

A fusion protein comprising the protein according to claim 4.

By isolating mRNA from the plant that induced flavonoid synthesis, creating a cDNA library from the mRNA, and removing clones that react with DNA from plants that did not induce flavonoid synthesis from the cDNA library A method for producing a DNA encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid, comprising selecting a cDNA encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 3-position of a flavonoid.

A host into which the DNA according to claim 1 or 2 has been introduced.

A flavonoid-3-glucosyltransferase obtained by introducing the DNA according to claim 1 or 2 into a host and culturing the host in a medium.