JP3774146B2

JP3774146B2 - Bacterial defense

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Publication number: JP3774146B2
Application number: JP2001503631A
Authority: JP
Inventors: シュミット、ガトラン; ジンク、ラルフ
Original assignee: ソシエテデプロデユイネツスルソシエテアノニム
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2020-06-09
Also published as: JP2003502037A; AU6262900A; EP1190038A2; CN1330748C; WO2000077186A3; WO2000077186A2; CN1378591A; AU771519B2; BR0011742A; ZA200109670B; NZ515765A

Description

【０００１】
本発明は、極端な温度変化及び浸透圧ショックの影響を含むストレスに対する防御を有する細菌細胞；防御された細菌細胞を含む栄養組成物又は医薬組成物；及びストレスに対して細菌を防御する方法に関する。
【０００２】
本明細書において「〜を含む」という用語は、「他にもあるが、〜を含む」という意味である。これは「〜のみからなる」という意味ではない。さらに「ストレス」という用語は、「有害な状態」と交換できるように用いられる。これは、特に限定されないが、温度（熱ショック、冷ショック）、塩（浸透圧ショック）、ｐＨ（ｐＨショック）、化学的ストレス（抗生物質、アルコール、Ｈ₂Ｏ₂など）、栄養ストレス、ＵＶストレス、冷ストレス及び酸素濃度（酸化ストレス）の有害な状態を含む。
【０００３】
本明細書中の標準的アミノ酸、ＲＮＡ及びＤＮＡコードは、ＩＵＢ生化学命名委員会（IUB Biochemical Nomenclature Commission）の規定に従って使用される。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）のような細菌は、環境中に普遍的に存在し、主に発酵製品の製造に利用されていることは公知である。例えば食品工業において細菌は、乳製品の発酵やスターター培養物の製造に利用されている。スターター培養物の製造、食品の発酵、製造及び保存中に利用される細菌は、一般的にその生存性、安定性、及び活性を劇的に低下させる作用を有する、異なる種類の有害な状態を処理しなければならない。これらの有害な状態は、製造条件により変化し、熱ショック（凍結乾燥又は噴霧乾燥）、浸透圧ショック（乾燥）及びｐＨショック（発酵）がある。これらのストレスに対処する細菌の感受性又は無能力は、細菌を大量に使用する場合に問題となることは、理解されるであろう。
【０００５】
ヒトの腸（主に、小腸と大腸）中のビフィズス菌（Bifidobacteria）又は乳酸菌（lactobacilli）の存在は、一般に健康に寄与する因子であると認められている。さらにビフィズス菌と乳酸菌は、消化器感染症を含む疾患の予防又は治療に有用であると考えられている。この点で、小腸中のビフィズス菌と乳酸菌の大きな集団を維持し、これらの細菌を含む製品を与えるべきである。これらの製品はしばしば、異なる種のビフィズス菌又は乳酸菌を含む。しかし、製品の製造や保存中にビフィズス菌や乳酸菌が受けるストレスは、その生存性及び／又は生理活性を大きく低下させることがある。
【０００６】
亜致死的（sublethal）温度変化又は他の亜致死的ストレス（酸素ショックや浸透圧ショックへの暴露を含む）に対する細菌培養物の自然の応答には、「ストレスタンパク質」と呼ぶ明確なポリペプチドのセットの迅速な発現がある。これらのタンパク質により、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）、及びラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）のようなグラム陽性細菌が、本来は増殖制限の条件に適合することを可能になることが証明されている。
【０００７】
最も研究されているストレスタンパク質の１つは、熱ショックタンパク質又はシャペロンである。これらのタンパク質は一般に、新たに合成されたタンパク質の成熟に関与し、これらは、変性タンパク質の再折り畳みを助ける。ＬＡＢにおいて無数のストレス応答遺伝子が性状解析されており、これには、新たに合成されたタンパク質の正しい折り畳みと変性タンパク質の修復に関与する、２つの主要なシャペロン装置（ｇｒｏＥＳ／ｇｒｏＥＬ及びｈｒｃＡ／ｇｒｐＥ／ｄｎａＫ／ｄｎａＪ）をコードするものが含まれる。
【０００８】
顕著なことに、ビフィズス菌と乳酸菌を包含する細菌は、未保護細菌では致死的なストレスのレベルに対して、保護されることができることがわかった。驚くべきことにこれは、細菌を亜致死レベルのストレス処理に付すことにより行われる。驚くべきことに、この初期ストレス処理後には、細菌に悪影響を与えるには、より高レベルのストレスが必要であることがわかった。ストレスにより傷害される細胞は、追加のストレスにはより対応しにくいと考えられていたため、これは予想外である。実際、逆の事実が見つかっており、前ストレス処理細胞は、前ストレス処理しない対照細胞と比較して、より高いストレスレベルに耐えることができる。
【０００９】
異種の型のストレスで処理することにより得られる１つの型のストレスに対する防御は、「交差防御（cross-protection）」と呼ばれる。１つのストレスで処理して傷害された細胞は、さらなる亜致死的又は致死的ストレスに対してより感受性になると考えられていたため、これは予想外である。
【００１０】
従って第１の面において本発明は、未防御細菌細胞に対しては致死的である条件に対する防御を有する細菌細胞を提供し、防御細胞は、細菌細胞を亜致死レベルのストレスによる処理に付すことにより得られる。
【００１１】
第２の面において本発明は、未防御細菌に対しては致死的である条件に対する防御を有する細菌を含む栄養組成物を提供し、防御細菌は、細菌を亜致死レベルのストレスによる処理に付し、これらを回復させることにより得られる。
【００１２】
さらなる面において本発明は、熱ショック、浸透圧ショック、ｐＨショック、酸化ストレス、化学的ストレス、栄養ストレス、ＵＶストレス、冷ストレスからなる群から選択される亜致死レベルのストレスで、細菌細胞を処理する工程を含む、ストレスに対して細菌細胞を防御する方法を提供する。
【００１３】
好ましくは本方法は、細胞が回復することを可能にする追加の工程を含む。
好ましくは化学的ストレスは、抗生物質、アルコール又はＨ₂Ｏ₂で処理することにより提供される。
好ましくは細菌細胞は、ビフィズス菌、乳酸菌、腸球菌、ストレプトミセス（Streptomyces）及び桿菌を含む群から選択される。
【００１４】
さらに好ましくは細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、又はラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）である。これらの細菌が与える利点は、これらはその基質を急速に酸性にする能力を有し、従って微生物学的に安全な製品を製造することである。さらにこれらは、ヒトや動物の健康に寄与する。さらにこれらは、腸の病原菌による攻撃に対して防御的役割を示し、抗癌性、抗突然変異誘発性、及び抗腫瘍形成性に関係している。理論に拘泥されるつもりはないが、最近の報告は、これらが、抗微生物活性により直接腸管中で、腸の細胞を介する免疫調節により間接的に、又は正常な常在微生物叢の機能を修飾することにより、作用する可能性を示唆している。
【００１５】
好ましくは細菌、さらに好ましくはビフィズス菌と乳酸菌は、本来は致死的塩濃度に対して防御するために亜致死的塩濃度で処理されるか、又は本来は致死的温度に対して防御するために亜致死的熱ストレスで処理される。さらに結果は、塩（例えば、ＮａＣｌ）による処理が、致死的熱ストレスに対して、又は凍結−融解の致死的サイクルに対して、これらの細菌を防御することを示している。従って本発明は代替的に、熱ストレスに対して防御するために塩で細胞を処理する工程、又は塩ストレスに対して防御するために有害な温度条件で細胞を処理する工程を含む。
【００１６】
好ましくは細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）又は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）から選択される。さらに好ましくは、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１又は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１から選択される。
【００１７】
好ましくは致死的塩濃度（例えば、０．１％〜０．４％）に対する防御は、約０．０１〜約０．１％の塩で約１５〜約６０分処理することにより行われる。好ましくは塩は、胆汁酸塩である。
【００１８】
好ましくは致死的熱ストレス（例えば、約５０℃〜約６０℃）に対する防御は、約３７℃〜約５０℃で約１５〜６０分処理するか、又は約１％〜約４％の塩濃度で約３０〜約６０分処理することにより行われる。
【００１９】
好ましくは凍結−融解（例えば、１〜１０サイクル）に対する防御は、１％〜４％の塩濃度で細胞を処理することにより行われる。
【００２０】
好ましくはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１細胞が防御される。さらに好ましくはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、致死的刺激の前に、約０．１％の胆汁酸塩に細胞を約３０分付すことにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．２％〜約０．３％で３０分）に対して行われる。
【００２１】
好ましくはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、致死的刺激の前に、約０．０５％の胆汁酸塩で細胞を約３０分処理することにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．０７５％〜約０．１５％で約３０分）に対して行われる。
【００２２】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞が防御される。さらに好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、致死的刺激の前に、約０．１％の胆汁酸塩に細胞を約３０分付すことにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．３％〜約０．４％で約３０分）に対して行われる。
【００２３】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、致死的刺激の前に、約０．１％の胆汁酸塩に細胞を約３０分付すことにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．１５％で約３０分）に対して行われる。
【００２４】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、約２％のＮａＣｌに細胞を約１時間付すことにより、本来は致死的作用の（例えば、約３〜約４サイクル）の凍結−融解（約−８０℃〜ほぼ室温（好ましくは約２０℃〜約３０℃、さらに好ましくは２５℃））に対して行われる。
【００２５】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、約４５℃で約３０分、約４７℃で約１５分、又は１％もしくは２％のＮａＣｌで約１時間、細胞を処理することにより、本来は致死的となる２０分間の５５℃の温度に対して行われる。
【００２６】
好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１細胞が防御される。さらに好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、約３．５％のＮａＣｌで約１５分、又は約４８℃で約１５分、細胞を処理することにより、本来は致死的となる１時間までの５５℃の温度に対して行われる。
【００２７】
好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、約４８℃で約１５分、又は約３．５％のＮａＣｌで約１５分、細胞を処理することにより、本来は致死的となる１時間までの５５℃の温度に対して行われる。
【００２８】
株と増殖条件
ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４９０、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ５８５、及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＮＣＣ２９８を、０．５g/l システインを補足したＭＲＳ培地中で、３７℃で嫌気的条件（９８％窒素と２％水素）下で培養した。ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３を、ＭＲＳ培地中で３０℃で増殖させた。大腸菌（Escherichia coli）ＴＧ１（アマシャム（Amersham））を、ルリア−ベルタニ（Luria-Bertani）培地中で３７℃で培養した。ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１をＭＲＳ中で３７℃で増殖させた。
【００２９】
ストレス処理
細胞をＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させたか、又は静止期で取って、異なる時期に種々のストレス条件に付した。凍結−融解実験に使用した細胞を、食塩水中で濃縮後、−８０℃に付した。塩化ナトリウムを試料に加えて塩ストレスを与え、一方、胆汁酸塩ストレスのためにはオキシガル（OXGALL）（商標）（ディフコ（Difco））を使用した。
【００３０】
ビフィズス菌のストレス処理を、嫌気的条件下で行い、生存細胞の測定は好気的条件下で行った。乳酸菌細胞を、微好気性条件下で増殖させ、ストレス処理と生存細胞数の測定は、好気的条件下で行った。
【００３１】

【００３２】
前誘導と致死的刺激の時間は、株とストレス条件に依存して、５分〜２時間の間で変動する。
【００３３】

【００３４】
前誘導と致死的刺激の時間は、株とストレス条件に依存して、５分〜２時間の間で変動する。
【００３５】
ＤＮＡ技術
染色体ＤＮＡの単離は、標準的方法に従って行った。
【００３６】
ｍＲＮＡの分析
ドットブロットハイブリダイゼーションのために、標準的方法に従って総ＲＮＡを単離し、変性させ、非荷電ナイロン膜（ジーンスクリーン（GeneScreen）、ＮＥＮ）に移行させた。膜をプレハイブリダイズ（１時間、４０℃）し、次に１００pmolのＤＩＧ標識プローブ（ベーリンガー（Boehringer））で４時間ハイブリダイズさせた。０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で４０℃で５分で２回膜を洗浄し、プローブ依存性温度（これは、２つのｄｎａＫ特異的プローブＧＳＲ５（５’−ＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＡＣ−３’）とＧＳＲ８（５’−ＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧ−３’）についてそれぞれ４６℃と４８℃、及び普遍的プローブ１０２８Ｒ（５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧ−３’）について５１℃である）で１回洗浄した。検出は、製造業者の説明書に従って行った。
【００３７】
ＰＣＲ増幅
縮重プライマーＨＳ１（５’−ＡＴＩＡＣＩＧＴＩＣＣＩＧＣＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ−３’）とＨＳ２（５’−ＣＡＴＩＧＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＩＡＴＩＣＣＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＧＡＩＡ（Ｇ／Ａ）ＩＧＧ−３’）と、鋳型として１μｇの染色体ＤＮＡを使用して、コアｄｎａＫ領域を増幅した。増幅反応は、総量１００μｌ（各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５０pmolの各プライマー、２．５ＵのＳｕｐｔｅｒ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＨＴバイオテクノロジー（HT Biotechnology））及び対応する１×ＰＣＲ緩衝液を含有する）で行った。反応は、パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）サーマルサイクラーを用いて行った：最初の変性を９５℃で５分行った後、９５℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で１分を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分伸長を行った。
【００３８】
ｄｎａＫ遺伝子の同定
バリル（Barril）ら（１９９４）の整列に基づき、我々は、同一のアミノ酸配列を有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、大腸菌（Escherichia coli）、及びバシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）のＤｎａＫの２つの領域を選択し、それぞれラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＤｎａＫの１１４〜１２２位と３６６〜３７４位のアミノ酸に対応する２つの縮重プライマーＨＳ１とＨＳ２を設計した。このプライマー対を、鋳型としてＮＣＣ４８１、ＮＣＣ４９０、ＮＣＣ５８５、ＮＣＣ２５１、及びＮＣＣ２９８の染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅のために使用した。各株について２つの断片を得た。すべての株について、サイズが２つの陽性対照大腸菌（Escherichia coli）とラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の断片に対応する断片を、アガロースゲルから単離し、精製し、配列決定した。各断片で、既知のＤｎａＫタンパク質のコア領域と高い配列類似性を示す読みとり枠を同定した。ストレプトミセス（Streptomyces）とマイコバクテリア（mycobacteria）ならびにラクトバシルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、杆菌、及びストレプトコッカス（Streptocossus）と、特に高い同一性が観察された。
【００３９】
ｄｎａＫ遺伝子発現のｍＲＮＡ分析
ｄｎａＫの転写誘導を、熱ショックと追加の一般的ストレス条件に暴露した細胞で調べた。対数期のビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１とビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞を、０．１％胆汁酸塩、１．５％ＮａＣｌ、又は４２℃と４５℃で１０分の熱ショックに付した。ＮＣＣ４８１とＮＣＣ２５１について、それぞれ４７℃と５０℃の最高温度を試験した。対数期と静止期の非誘導細胞を、いつも対照として使用した。総ＲＮＡを単離し、ドットブロットハイブリダイゼーションに付した。ｄｎａＫ特異的プローブＧＳＲ８とＧＳＲ５を、それぞれＮＣＣ４８１とＮＣＣ２５１について使用した。普遍的プローブ１０２８Ｒを選択して、膜上のＲＮＡの量と質を証明した。細胞を高温に付すと、ｄｎａＫ特異的ｍＲＮＡの濃度の上昇が観察された（図１）。ＮＣＣ２５１に対して、ＮＣＣ４８１のｄｎａＫは、静止期に入る細胞でほんのわずかに誘導された。さらにＮＣＣ２５１では胆汁酸塩とＮａＣｌ処理後に、ｄｎａＫのわずかな誘導が観察された。ＮＣＣ４８１には、同一条件下で有意な誘導は得られなかった。
【００４０】
生存と交差防御
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１、及びビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の増殖と生存を、異なる温度、胆汁酸塩及び塩条件下で試験した。
【００４１】
注目すべきことに、対数期のＮＣＣ２５１は、亜致死的熱ストレスで処理した後に、５５℃の一般的な致死的温度に対して耐性の上昇を示した。細胞を４７℃に１５分付した後、１０分と２０分熱ショックを与えると、それぞれほとんど２４倍と１２８倍の高温耐性が観察された（図２）。これらの数字は、細胞の前誘導が、本来は致死的な刺激に対して細胞を防御するのにどの程度予想外に有効となるかを示しているため、注目される。１．５％ＮａＣｌで１時間前処理することにより、５５℃に対する細胞の９倍と１５倍の交差防御が達成された。熱ストレスに対する同等の防御はまた、４５℃で３０分又は２％ＮａＣｌで１時間前誘導することにより、観察することができた（図２）。
【００４２】
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の増殖サイクルの対数期の細胞は、３．５％ＮａＣｌ又は４８℃で１５分前処理すると、５５℃で３０分に対して、４００倍の高い防御を示した。３．５％ＮａＣｌと４８℃で１５分前処理した試料では、５５℃で１時間後、５５℃に対してそれぞれ１０倍と５倍の高い防御が観察された（図８）。
【００４３】
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の静止期の細胞は、３．５％ＮａＣｌと４８℃で１５分前処理後に、５５℃で１時間に対して注目すべき２０倍の高い防御を示した（図９）。
【００４４】
静止期のビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の細胞は、２％ＮａＣｌで１時間前ストレスを行うと、凍結−融解の連続的サイクル後１４倍高い生存を示した（図３）。４サイクルの凍結−融解後、１０倍高い生存が観察された。
【００４５】
ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１とビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の対数期ならびに静止期に、致死的胆汁酸塩濃度に対して防御が観察された。対数期の細胞を０．１％胆汁酸塩で事前条件に付す（例えば、３０分）と、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の対数期の細胞で、０．３％と０．４％の胆汁酸塩に対してそれぞれ３００倍と２１倍の防御を示した（図６）。０．１５％の胆汁酸塩の致死的濃度下で、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の静止期の細胞（０．１％胆汁酸塩で前誘導した）の生存の８１倍の上昇が観察された（図７）。ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１について、同様の結果が得られた。０．１％オキシガルで前誘導した対数期の細胞は、致死的濃度の０．２％、０．２５％、及び０．３％のオキシガルに対して、それぞれ４００倍、１８００倍、及び５８０倍優れた生存を示した（図４）。静止期の細胞は、０．０５％オキシガルで３０分前誘導すると、０．０７５％、０．１％、及び０．１５％のオキシガル３０分に対して、３倍、２９倍、及び１５０倍優れた生存を示した（図５）。
【００４６】
フラハウト（Flahaut）ら（１９９６）が発表した結果（０．３％胆汁酸塩に対してエンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）の防御が３０秒のみ達成された）に対して、注目すべきことに、細胞は、致死的胆汁酸塩濃度に対して３０分防御されることができた。これは、予測できることではなかった。
【００４７】
ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４９０、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ５８５、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＮＣＣ２９８のｄｎａＫのコア領域を、ＰＣＲ増幅し、同定した。以後のｍＲＮＡ分析は、ＮＣＣ２５１とＮＣＣ４８１において、ｄｎａＫの誘導は、転写レベルで制御されることを示した。転写は、一般的に熱により誘導され、ＮＣＣ２５１についてはまた、塩と胆汁酸塩を用いる処理によっても誘導される。
【００４８】
これらの知見を考慮すると、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌のストレス前処置により、本来は致死的な同種又は異種のストレス条件下の生存の確率が顕著に上昇すると結論された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、異なる種類のストレスに１０分間暴露した後の、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１とビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の細胞のＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。ハイブリダイゼーションは、ＮＣＣ４８１とＮＣＣ２５１についてそれぞれ特異的なプローブＧＳＲ８とＧＳＲ５を使用して行った。
【図２】図２は、対数期における異なる前誘導後の、５５℃でのビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。細胞をＭＲＳとシステイン中で３７℃で、ＯＤ６００が０．４〜０．７まで増殖させた。アリコートを取って、４７℃に１５分、４５℃に３０分、又は１．５％ＮａＣｌもしくは２％ＮａＣｌに１時間付した；対照は３７℃に維持した。試料を５５℃に移行させ、１０分及び２０分後、生存細胞数を測定した。
【図３】図３は、３サイクル及び４サイクルの凍結−融解後のビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。静止期の細胞を取り、２％ＮａＣｌに１時間付し、対照は塩を無添加で維持した。試料を−８０℃に移行させ、室温で融解した。このサイクルを３回と４回繰り返してから、生存細胞数を測定した。
【図４】図４は、対数期における致死的胆汁酸塩条件下のビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の生存のグラフを示す。細胞を、ＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させ、３０分間０．１％オキシガルに付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．２％、０．２５％、及び０．３％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図５】図５は、致死的胆汁酸塩条件下の静止期のビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の生存のグラフを示す。細胞を、３０分間０．０５％オキシガル処理に付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．０７５％、０．１％、及び０．１５％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図６】図６は、致死的胆汁酸塩条件下の対数期のビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。細胞を、ＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させ、３０分間０．１％オキシガル処置に付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．３％、及び０．４％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図７】図７は、致死的胆汁酸塩条件下の静止期ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。細胞を、３０分間０．１％オキシガル処理に付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．１５％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図８】図８は、致死的熱条件下でのラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の生存のグラフを示す。細胞を、ＭＲＳ中で３７℃でＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させた。試料を取り、３．５％ＮａＣｌ又は４８℃に１５分間付した。対照は３７℃に維持した。次に試料を５５℃に移行させ、３０分と６０分後、生存細胞数を測定した。
【図９】図９は、致死的熱条件下での増殖サイクルの静止期のラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の生存のグラフを示す。試料を取り、３．５％ＮａＣｌ又は４８℃に１５分間付した。対照は３７℃に維持した。次に試料を５５℃に移行させ、６０分後、生存細胞数を測定した。[0001]
The present invention relates to bacterial cells having protection against stress including the effects of extreme temperature changes and osmotic shock; nutritional or pharmaceutical compositions comprising protected bacterial cells; and methods of protecting bacteria against stress .
[0002]
As used herein, the term “comprising” means “comprising, among others”. This does not mean “consisting only of”. Furthermore, the term “stress” is used interchangeably with “harmful state”. This is not particularly limited, but temperature (heat shock, cold shock), salt (osmotic shock), pH (pH shock), chemical stress (antibiotics, alcohol, H ₂ O ₂ Etc.), harmful conditions of nutritional stress, UV stress, cold stress and oxygen concentration (oxidative stress).
[0003]
The standard amino acid, RNA and DNA codes herein are used in accordance with the provisions of the IUB Biochemical Nomenclature Commission.
[0004]
It is known that bacteria such as lactic acid bacteria (LAB) are ubiquitous in the environment and are mainly used for the production of fermentation products. For example, in the food industry, bacteria are used for fermentation of dairy products and production of starter cultures. Bacteria used during starter culture production, food fermentation, production and storage generally exhibit different types of harmful conditions that have the effect of dramatically reducing their viability, stability and activity. Must be processed. These detrimental conditions vary with manufacturing conditions and include heat shock (freeze drying or spray drying), osmotic shock (drying) and pH shock (fermentation). It will be appreciated that the susceptibility or inability of bacteria to cope with these stresses becomes a problem when using large amounts of bacteria.
[0005]
The presence of bifidobacteria or lactobacilli in the human intestine (mainly the small and large intestines) is generally recognized as a factor contributing to health. Furthermore, bifidobacteria and lactic acid bacteria are thought to be useful for the prevention or treatment of diseases including gastrointestinal infections. In this regard, a large population of bifidobacteria and lactic acid bacteria in the small intestine should be maintained and products containing these bacteria should be given. These products often contain different species of bifidobacteria or lactic acid bacteria. However, stress experienced by bifidobacteria and lactic acid bacteria during the manufacture and storage of products can greatly reduce their viability and / or physiological activity.
[0006]
The natural response of bacterial cultures to sublethal temperature changes or other sublethal stress (including exposure to oxygen shock and osmotic shock) is There is a rapid onset of the set. With these proteins, for example, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sakei, Enterococcus faecalis, and Lactobacillus faecalis John It has been proven that Gram-positive bacteria such as (Lactobacillus johnsonii) can originally meet the conditions of growth restriction.
[0007]
One of the most studied stress proteins is heat shock protein or chaperone. These proteins are generally involved in the maturation of newly synthesized proteins, which aid in the refolding of denatured proteins. A myriad of stress response genes have been characterized in LAB, including two major chaperone devices (groES / groEL and hrcA / grpE) that are involved in the correct folding of newly synthesized proteins and the repair of denatured proteins. / DnaK / dnaJ) is included.
[0008]
Remarkably, it has been found that bacteria including bifidobacteria and lactic acid bacteria can be protected against levels of lethal stress in unprotected bacteria. Surprisingly, this is done by subjecting the bacteria to sublethal levels of stress treatment. Surprisingly, it has been found that higher levels of stress are required after this initial stress treatment to adversely affect the bacteria. This is unexpected because cells damaged by stress were thought to be less able to cope with additional stress. In fact, the opposite fact has been found: prestressed cells can tolerate higher stress levels compared to non-prestressed control cells.
[0009]
The protection against one type of stress obtained by treating with different types of stress is called "cross-protection". This is unexpected because cells that were damaged by treatment with one stress were thought to be more susceptible to further sublethal or lethal stress.
[0010]
Accordingly, in a first aspect, the present invention provides bacterial cells that have protection against conditions that are lethal to unprotected bacterial cells, which subject the bacterial cells to treatment with sublethal levels of stress. Is obtained.
[0011]
In a second aspect, the present invention provides a nutritional composition comprising bacteria having protection against conditions that are lethal to unprotected bacteria, the protective bacteria subjecting the bacteria to treatment with sublethal levels of stress. It is obtained by recovering these.
[0012]
In a further aspect, the present invention treats bacterial cells with sublethal levels of stress selected from the group consisting of heat shock, osmotic shock, pH shock, oxidative stress, chemical stress, nutritional stress, UV stress, and cold stress. A method of protecting bacterial cells against stress comprising the steps of:
[0013]
Preferably, the method includes an additional step that allows the cells to recover.
Preferably the chemical stress is antibiotic, alcohol or H ₂ O ₂ Provided by processing in
Preferably, the bacterial cell is selected from the group comprising bifidobacteria, lactic acid bacteria, enterococci, streptomyces and bacilli.
[0014]
More preferably, the bacterial cell is Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, or Lactobacillus johnsonii. . The advantage that these bacteria provide is that they have the ability to rapidly acidify their substrates, thus producing a microbiologically safe product. Furthermore, they contribute to human and animal health. Furthermore, they show a protective role against intestinal pathogen attack and have been implicated in anticancer, antimutagenesis, and antitumor formation. While not intending to be bound by theory, recent reports indicate that they modify the function of normal resident microbiota directly in the intestinal tract by antimicrobial activity, indirectly by immune regulation via intestinal cells, or This suggests the possibility of acting.
[0015]
Preferably bacteria, more preferably bifidobacteria and lactic acid bacteria, are treated with sub-lethal salt concentrations to protect against lethal salt concentrations or to protect against lethal temperatures. Treated with sublethal heat stress. The results further show that treatment with salt (eg, NaCl) protects these bacteria against lethal heat stress or against a lethal cycle of freeze-thaw. Accordingly, the present invention alternatively includes the step of treating the cells with salt to protect against heat stress or treating the cells at harmful temperature conditions to protect against salt stress.
[0016]
Preferably the bacterial cell is selected from Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis or Lactobacillus johnsonii. More preferably, the bacterial cell is selected from Bifidobacterium longum NCC481, Bifidobacterium adolescentis NCC251 or Lactobacillus johnsonii La1.
[0017]
Preferably protection against lethal salt concentrations (eg, 0.1% to 0.4%) is achieved by treatment with about 0.01 to about 0.1% salt for about 15 to about 60 minutes. Preferably the salt is a bile salt.
[0018]
Preferably, protection against lethal heat stress (eg, about 50 ° C. to about 60 ° C.) is treated at about 37 ° C. to about 50 ° C. for about 15-60 minutes, or at a salt concentration of about 1% to about 4%. The treatment is performed for about 30 to about 60 minutes.
[0019]
Preferably protection against freeze-thaw (eg 1 to 10 cycles) is performed by treating the cells with a salt concentration of 1% to 4%.
[0020]
Preferably Bifidobacterium longum NCC481 cells are protected. More preferably, the protection of Bifidobacterium longum NCC481 cells attaches cells to about 0.1% bile salt for about 30 minutes prior to lethal stimulation in the log phase of its growth cycle. To a lethal bile salt concentration (eg, about 0.2% to about 0.3% for 30 minutes).
[0021]
Preferably, protection of Bifidobacterium longum NCC481 cells treats cells with about 0.05% bile salt for about 30 minutes prior to lethal stimulation in the stationary phase of its growth cycle. To a lethal bile salt concentration (eg, about 0.075% to about 0.15% for about 30 minutes).
[0022]
Preferably Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells are protected. More preferably, protection of Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells attaches cells to about 0.1% bile salt for about 30 minutes prior to lethal stimulation in the log phase of its growth cycle. To a lethal bile salt concentration (eg, about 0.3% to about 0.4% for about 30 minutes).
[0023]
Preferably, protection of Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells involves subjecting the cells to about 0.1% bile salt for about 30 minutes prior to lethal stimulation in the stationary phase of its growth cycle. To a lethal bile salt concentration (eg, about 0.15% for about 30 minutes).
[0024]
Preferably, protection of Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells can be achieved by subjecting cells to about 2% NaCl for about 1 hour in the resting phase of their growth cycle (eg, About 3 to about 4 cycles) of freeze-thaw (about -80 ° C to about room temperature (preferably about 20 ° C to about 30 ° C, more preferably 25 ° C)).
[0025]
Preferably, protection of Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells is about 30 minutes at about 45 ° C., about 15 minutes at about 47 ° C., or 1% or 2% NaCl during the log phase of its growth cycle. By treating the cells for about 1 hour at a temperature of 55 ° C. for 20 minutes, which is essentially lethal.
[0026]
Preferably, Lactobacillus johnsonii La1 cells are protected. More preferably, the protection of Lactobacillus johnsonii La1 cells is to treat the cells for about 15 minutes at about 3.5% NaCl or about 15 minutes at about 48 ° C. in the log phase of their growth cycle. To a temperature of 55 ° C. for up to 1 hour, which is essentially lethal.
[0027]
Preferably, protection of Lactobacillus johnsonii La1 cells is achieved by treating the cells for about 15 minutes at about 48 ° C. or about 15 minutes with about 3.5% NaCl during the stationary phase of their growth cycle. , Performed at a temperature of 55 ° C. for up to 1 hour, which would be lethal.
[0028]
Strains and growth conditions
Bifidobacterium adolescentis NCC251, Bifidobacterium longum NCC481, Bifidobacterium longum NCC490, Bifidobacterium longum NCC585, and Bifidobacterium longum NCC585 Bifidobacterium breve NCC298 was cultured in MRS medium supplemented with 0.5 g / l cysteine at 37 ° C. under anaerobic conditions (98% nitrogen and 2% hydrogen). Lactococcus lactis MG1363 was grown at 30 ° C. in MRS medium. Escherichia coli TG1 (Amersham) was cultured at 37 ° C. in Luria-Bertani medium. Lactobacillus johnsonii La1 was grown at 37 ° C. in MRS.
[0029]
Stress treatment
Cells were grown to OD600 (optical density at 600 nm) of 0.4 to 0.7 or taken in stationary phase and subjected to various stress conditions at different times. Cells used for freeze-thaw experiments were concentrated in saline and then subjected to −80 ° C. Sodium chloride was added to the sample to provide salt stress, while OXGALL ™ (Difco) was used for bile salt stress.
[0030]
Bifidobacteria stress treatment was performed under anaerobic conditions, and viable cells were measured under aerobic conditions. Lactic acid bacteria cells were grown under microaerobic conditions, and stress treatment and the number of viable cells were measured under aerobic conditions.
[0031]

[0032]
The time for preinduction and lethal stimulation varies between 5 minutes and 2 hours depending on the strain and stress conditions.
[0033]

[0034]
The time for preinduction and lethal stimulation varies between 5 minutes and 2 hours depending on the strain and stress conditions.
[0035]
DNA technology
Chromosomal DNA isolation was performed according to standard methods.
[0036]
mRNA analysis
For dot blot hybridization, total RNA was isolated, denatured and transferred to an uncharged nylon membrane (GeneScreen, NEN) according to standard methods. Membranes were prehybridized (1 hour, 40 ° C.) and then hybridized with 100 pmol DIG-labeled probe (Boehringer) for 4 hours. Membranes were washed twice in 2 × SSC containing 0.1% SDS at 40 ° C. for 5 minutes and probe-dependent temperature (this is the two dnaK specific probes GSR5 (5′-CATCGAAGGTGCCGCCAC-3 ′) And GSR8 (5′-TCGTCCACCACCGAGGTG-3 ′) at 46 ° C. and 48 ° C., respectively, and universal probe 1028R (5′-CCTCTCTCCCGAAGTTTACGG-3 ′) at 51 ° C. once. Detection was performed according to the manufacturer's instructions.
[0037]
PCR amplification
Degenerate primers HS1 (5'-ATIACITICCIGCITA (T / C) TT (T / C) AA (T / C) GA-3 ') and HS2 (5'-CATIGIT (T / C) TCIATICCIA (A / G) IGAIA The core dnaK region was amplified using (G / A) IGG-3 ′) and 1 μg of chromosomal DNA as a template. Amplification reactions consisted of 100 μl total (200 μM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 50 pmol of each primer, 2.5 U of Super-Taq DNA polymerase (HT Biotechnology)) and the corresponding 1 × PCR buffer. Contained). The reaction was performed using a Perkin-Elmer thermal cycler: first denaturation at 95 ° C for 5 minutes, then 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. 30 cycles were performed, and finally elongation was performed at 72 ° C. for 10 minutes.
[0038]
Identification of dnaK gene
Based on the alignment of Barril et al. (1994), we have two DnaKs of Lactococcus lactis, Escherichia coli, and Bacillus megaterium that have identical amino acid sequences. Regions were selected and two degenerate primers HS1 and HS2 were designed, corresponding to amino acids 114-122 and 366-374 of Lactococcus lactis DnaK, respectively. This primer pair was used for PCR amplification using NCC481, NCC490, NCC585, NCC251, and NCC298 chromosomal DNA as templates. Two fragments were obtained for each strain. For all strains, fragments corresponding to two positive control Escherichia coli and Lactococcus lactis fragments of size were isolated from agarose gels, purified and sequenced. For each fragment, an open reading frame was identified that showed high sequence similarity with the known DnaK protein core region. A particularly high identity was observed with Streptomyces and mycobacteria and Lactobacillus sakei, Neisseria gonorrhoeae, and Streptocossus.
[0039]
mRNA analysis of dnaK gene expression
Transcriptional induction of dnaK was examined in cells exposed to heat shock and additional general stress conditions. Log phase Bifidobacterium longum NCC481 and Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells at 0.1% bile salt, 1.5% NaCl, or 42 ° C and 45 ° C Subjected to a 10 minute heat shock. NCC481 and NCC251 were tested for maximum temperatures of 47 ° C and 50 ° C, respectively. Log phase and stationary phase non-induced cells were always used as controls. Total RNA was isolated and subjected to dot blot hybridization. The dnaK specific probes GSR8 and GSR5 were used for NCC481 and NCC251, respectively. Universal probe 1028R was selected to demonstrate the quantity and quality of RNA on the membrane. When the cells were subjected to high temperatures, an increase in the concentration of dnaK-specific mRNA was observed (FIG. 1). In contrast to NCC251, NCC481 dnaK was only slightly induced in cells entering stationary phase. Furthermore, in NCC251, slight induction of dnaK was observed after bile salt and NaCl treatment. NCC481 did not yield significant induction under the same conditions.
[0040]
Survival and cross defense
Growth and survival of Lactobacillus johnsonii La1, Bifidobacterium adolescentis NCC251, and Bifidobacterium longum NCC481 at different temperatures, bile salts and salt conditions Tested.
[0041]
Of note, log-phase NCC251 showed increased resistance to a common lethal temperature of 55 ° C. after treatment with sublethal heat stress. When the cells were subjected to 47 ° C. for 15 minutes and then subjected to heat shock for 10 minutes and 20 minutes, almost 24 times and 128 times high temperature resistance was observed, respectively (FIG. 2). These numbers are noteworthy because they show how unexpectedly the pre-induction of cells is unexpectedly effective in protecting the cells against inherently lethal stimuli. By pre-treatment with 1.5% NaCl for 1 hour, 9 and 15-fold cross protection of cells against 55 ° C. was achieved. Equivalent protection against heat stress could also be observed by preinducing for 30 minutes at 45 ° C. or 1 hour with 2% NaCl (FIG. 2).
[0042]
Cells in the logarithmic phase of the growth cycle of Lactobacillus johnsonii La1 showed 400 times higher protection against 30 minutes at 55 ° C. when pretreated for 15 minutes at 3.5% NaCl or 48 ° C. . Samples pretreated with 3.5% NaCl and 48 ° C. for 15 minutes showed 10-fold and 5-fold higher protection against 55 ° C. after 1 hour at 55 ° C. (FIG. 8).
[0043]
Lactobacillus johnsonii La1 stationary phase cells showed a remarkable 20-fold higher protection against 1 hour at 55 ° C. after 15 minutes pretreatment with 3.5% NaCl and 48 ° C. ( FIG. 9).
[0044]
Cells in stationary phase Bifidobacterium adolescentis NCC251 showed 14-fold higher survival after a continuous freeze-thaw cycle when pre-stressed with 2% NaCl for 1 hour (FIG. 3). Ten times higher survival was observed after 4 cycles of freeze-thaw.
[0045]
Protection was observed against lethal bile salt concentrations in the logarithmic and stationary phases of Bifidobacterium adolescentis NCC251 and Bifidobacterium longum NCC481. When log phase cells are preconditioned with 0.1% bile salt (eg, 30 minutes), the log phase cells of Bifidobacterium adolescentis NCC251 are 0.3% and 0.1%. They showed 300-fold and 21-fold protection against 4% bile salts, respectively (FIG. 6). 81 times the survival of Bifidobacterium adolescentis NCC251 stationary phase cells (pre-induced with 0.1% bile salt) under a lethal concentration of 0.15% bile salt An increase was observed (Figure 7). Similar results were obtained for Bifidobacterium longum NCC481. Log phase cells pre-induced with 0.1% oxygal are 400, 1800, and 580 times the lethal concentrations of 0.2%, 0.25%, and 0.3% oxygal, respectively. Excellent survival was shown (Figure 4). Resting phase cells were induced 30 minutes before with 0.05% Oxygal for 3-, 29-, and 150-fold over 0.075%, 0.1%, and 0.15% Oxygal for 30 minutes. Excellent survival was shown (Figure 5).
[0046]
Notably, the results published by Flahaut et al. (1996) (Enterococcus faecalis protection against 0.3% bile salt was achieved for only 30 seconds) Cells could be protected for 30 minutes against lethal bile salt concentrations. This was not predictable.
[0047]
Bifidobacterium longum NCC481, Bifidobacterium longum NCC490, Bifidobacterium longum NCC585, Bifidobacterium adolescentis NCC251 and Bifido The core region of dnaK of Bifidobacterium breve NCC298 was PCR amplified and identified. Subsequent mRNA analysis showed that in NCC251 and NCC481, the induction of dnaK is regulated at the transcriptional level. Transcription is generally induced by heat, and for NCC251 it is also induced by treatment with salts and bile salts.
[0048]
In view of these findings, it was concluded that pre-stress treatment with bifidobacteria and / or lactic acid bacteria significantly increased the probability of survival under originally lethal allogeneic or heterogeneous stress conditions.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a dot blot of RNA of Bifidobacterium longum NCC481 and Bifidobacterium adolescentis NCC251 cells after 10 minutes exposure to different types of stress. The result of hybridization is shown. Hybridization was performed using probes GSR8 and GSR5 specific for NCC481 and NCC251, respectively.
FIG. 2 shows a graph of survival of Bifidobacterium adolescentis NCC251 at 55 ° C. after different pre-inductions in log phase. Cells were grown in MRS and cysteine at 37 ° C. to an OD600 of 0.4-0.7. Aliquots were taken and subjected to 47 ° C. for 15 minutes, 45 ° C. for 30 minutes, or 1.5% NaCl or 2% NaCl for 1 hour; controls were maintained at 37 ° C. Samples were transferred to 55 ° C. and viable cell counts were measured after 10 and 20 minutes.
FIG. 3 shows a graph of survival of Bifidobacterium adolescentis NCC251 after 3 and 4 cycles of freeze-thaw. Stationary cells were removed and subjected to 2% NaCl for 1 hour, and controls were maintained without addition of salt. The sample was transferred to −80 ° C. and melted at room temperature. This cycle was repeated 3 and 4 times before the number of viable cells was measured.
FIG. 4 shows a graph of survival of Bifidobacterium longum NCC481 under lethal bile salt conditions in log phase. Cells were grown to OD600 (optical density at 600 nm) 0.4-0.7 and subjected to 0.1% oxygal for 30 minutes. The control was maintained without oxygal. An aliquot of the sample was taken and transferred to 0.2%, 0.25%, and 0.3% oxygal for 30 minutes and the number of viable cells was measured.
FIG. 5 shows a graph of survival of stationary phase Bifidobacterium longum NCC481 under lethal bile salt conditions. Cells were subjected to 0.05% oxygal treatment for 30 minutes. The control was maintained without oxygal. An aliquot of the sample was taken and transferred to 0.075%, 0.1%, and 0.15% oxygal for 30 minutes and the number of viable cells was measured.
FIG. 6 shows a graph of survival of log phase Bifidobacterium adolescentis NCC251 under lethal bile salt conditions. Cells were grown to OD600 (optical density at 600 nm) 0.4-0.7 and subjected to 0.1% oxygal treatment for 30 minutes. The control was maintained without oxygal. An aliquot of the sample was taken and transferred to 0.3% and 0.4% oxygal for 30 minutes and the number of viable cells was measured.
FIG. 7 shows a graph of survival of stationary Bifidobacterium adolescentis NCC251 under lethal bile salt conditions. Cells were subjected to 0.1% oxygal treatment for 30 minutes. The control was maintained without oxygal. An aliquot of the sample was taken and transferred to 0.15% oxygal for 30 minutes and the number of viable cells was measured.
FIG. 8 shows a graph of survival of Lactobacillus johnsonii La1 under lethal heat conditions. Cells were grown in MRS at 37 ° C. to an OD600 (optical density at 600 nm) of 0.4 to 0.7. Samples were taken and subjected to 3.5% NaCl or 48 ° C. for 15 minutes. The control was maintained at 37 ° C. The sample was then transferred to 55 ° C. and after 30 and 60 minutes, the number of viable cells was measured.
FIG. 9 shows a graph of survival of Lactobacillus johnsonii La1 during the stationary phase of the growth cycle under lethal heat conditions. Samples were taken and subjected to 3.5% NaCl or 48 ° C. for 15 minutes. The control was maintained at 37 ° C. The sample was then transferred to 55 ° C. and after 60 minutes, the number of viable cells was measured.

Claims

A method for protecting Lactobacillus johnsonii La1 against stress, comprising:
Treating the microorganism with about 3.5% NaCl for about 15 minutes.

A method for protecting Lactobacillus johnsonii La1 against stress, comprising:
The method as described above, comprising treating the microorganism at a temperature of about 48 ° C. for about 15 minutes.