JP3774602B2

JP3774602B2 - Quality evaluation method of royal jelly

Info

Publication number: JP3774602B2
Application number: JP30534999A
Authority: JP
Inventors: 昌樹鎌倉; 寿之福田; 信三谷; 信福島
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2006-05-17
Anticipated expiration: 2019-10-27
Also published as: JP2000199753A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ローヤルゼリーの品質評価法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現代はストレスの時代であり現代社会に暮らすものは、大なり小なりストレスと共に生活している。その為に人々の栄養のバランスが崩れ、ひどくなると過食症や拒食症等の疾患にかかる。そして現状として、それらの患者が、年々増加傾向にあるので問題となっている。一方、そこまで至らない人たちは、栄養のバランスを考え、個人個人が食事療法を考えている人は決して少なくはない。この様に生活に於ける栄養摂取が重要になっている中、栄養環境を整える簡便な方法として健康食品で栄養のバランスをとる人が増えており、健康食品ブームとなっている。
【０００３】
この様な、健康食品の成分として使用されている原料には、漢方生薬剤、ビタミン剤、カルシウム、ローヤルゼリーなどが用いられ、その含量は重量によってコントロールされているが、これらの多くは天然成分であるため、内容成分の構成にバラツキがある場合があり、その有効成分が正確に配合されているかどうかが問題となっている。特に、ローヤルゼリーの様に、その有効性が如実に認められ、それ自身が複数の成分からなるものは、どの物質を標準として有効性や品質を分析・評価するかを決めるのが困難である。従って、製剤や品質の安定性の面で特に、健康食品などに配合されるローヤルゼリーについて、ロット毎の有効性の度合いやローヤルゼリー自体の劣化の基準となる分析手段の開発が望まれている。
【０００４】
一方、ローヤルゼリー中の有効成分が蛋白質であることも、該蛋白質が、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量５７キロダルトンであり、このものを指標として、その分解によりローヤルゼリーの鮮度やロット毎の有効性を測定・評価できるということは全く知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況をふまえて為されたものであり、ローヤルゼリーの品質の評価の手段を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリー中の有効成分が蛋白質であり、該蛋白質の含有量や分解の度合いを指標とすることにより、ローヤルゼリーの品質の評価や効果の推定が可能であり、この蛋白を指標とするローヤルゼリーの品質評価法を見いだし、発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）ローヤルゼリー中の下記の性質を有する蛋白質の分解を指標とする、ローヤルゼリーの品質評価法。
還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量：約５７キロダルトン。
（２）前記蛋白質が、トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（７．５×３０ｃｍ）をカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出する、高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持時間２５分〜３０分にピークを有する蛋白質である、（１）のローヤルゼリーの品質評価法。
（３）前記蛋白質が、配列番号１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含むものである（１）又は（２）のローヤルゼリーの品質評価法。
（４）品質評価が、ローヤルゼリーの鮮度である、（１）〜（３）の何れかのローヤルゼリーの品質評価法。
（５）前記鮮度が、抗疲労活性又は疲労回復活性の残存度である（４）のローヤルゼリーの品質評価法。
（６）（２）のローヤルゼリーの品質評価法に於いて、前記蛋白質のピーク面積が、クロマトグラムに於ける全ピーク面積の９％以上を有するローヤルゼリーを、良品とすることを特徴とする、ローヤルゼリーの品質評価法。
（７）（１）〜（６）の何れかのローヤルゼリーの品質評価法により決定される、ローヤルゼリーの保存に適した条件で保存することを特徴とするローヤルゼリーの保存方法。
（８）（１）〜（６）の何れかのローヤルゼリーの品質評価法によりローヤルゼリーを評価し、良品であると評価されたローヤルゼリーを食品用組成物に配合することを特徴とするローヤルゼリーを含有する食品用組成物の製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、実施の形態を中心に説明を加える。
【０００９】
（１）電気泳動によるローヤルゼリー中の指標蛋白質の分析
本発明のローヤルゼリーの品質評価法は、ローヤルゼリー中の蛋白質分解を指標とする。本発明において蛋白質分解は、例えば、電気泳動又はクロマトグラフィー等の手段により蛋白質の構成を分析し、有効成分であると推定される蛋白質の含有量を測定することにより調べることができる。
【００１０】
電気泳動の方法としては、前記有効蛋白質が特定できれば特段の限定は受けないが、前記有効成分であると推定される蛋白質は、下記の性質を有しており、該性質を利用して特定することができる。
（ａ）ローヤルゼリー中の蛋白質の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを形成する。
（ｂ）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量：約５７キロダルトン。
【００１１】
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の方法としては、特に制限されないが、例えば、ポリアクリルアミドゲル（１０％均一）を用い、電流２０ｍＡで電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーにより染色して、蛋白質を特定する。
【００１２】
上記の条件でローヤルゼリー中のタンパク質の電気泳動を行うと、前記有効成分蛋白質は、単一のバンドを形成する。この点で、電気泳動により有効成分蛋白質の分解を調べるには、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。この蛋白の含有量が多くなれば、ローヤルゼリーの効果、即ち、抗疲労作用や疲労回復作用がそれに比例して大きくなる。即ち、この蛋白質が効果の指標であり、この含有量の減少が劣化の指標である。分子量マーカーとしてLMW Kit E（ファルマシアバイオテク社）を用いた場合、本発明の評価法の指標となる蛋白質の分子量は約５１キロダルトンである。
【００１３】
また、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Laemmliらの方法（Laemmli, U. K. et al., J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 (1977)）の方法によって行うことができる。分子量マーカーとしてLMW Kit E（ファルマシアバイオテク社）を用いた場合、本発明の評価法の指標となる蛋白質の分子量は約５７キロダルトンである。
【００１４】
（２）クロマトグラフィーによるローヤルゼリー中の劣化指標蛋白質分析
【００１５】
上記の劣化の指標となる蛋白質は、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーによっても、識別・定量することが出来る。従って、この様な分析結果をもって、品質管理や効果の鑑別・評価に使用することもできる。クロマトグラフィーとしては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、クロマトグラフィーは、オープンカラムを用いることもできるが、高速液体クロマトグラフィーが好ましい。
【００１６】
例えば、ゲル濾過分析は、通常に知られている方法に従って行えば良く、好ましい例としては、例えば、トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（７．５×３０ｃｍ）をカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出する、高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。この分析条件下で、上記指標蛋白質は、保持時間約２５分〜３０分にピークとして現れる。また、分子量マーカーとしてゲル濾過用LMW Kit及びHMW Kit（ファルマシアバイオテク社）を用いた上記と同様のゲル濾過分析により、上記指標蛋白質の分子量は、約５７キロダルトンと推定された。この蛋白質は、（１）と同様の還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳分析において、分子量約５７キロダルトンを示した。以下、上記のようにして電気泳動またはゲル濾過クロマトグラフィーで特定されるローヤルゼリー中の蛋白質を、「５７ｋＤａ蛋白質」ということがある。
５７ｋＤａ蛋白質をＮ−グリコシダーゼＦで消化した後の分子量は、４８ｋＤａであり、糖蛋白質であることがわかっている。
【００１７】
尚、後記実施例に示すように、５７ｋＤａ蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、ローヤルゼリー中の報告されている蛋白質ＭＲＪＰ１（Schmitzova, J., et al., Cell. Mol. Life Sci. 54 (9), 1020-1030 (1998)）及びアピシン（apisin）（Kimura, Y. et al., Biosci, Biotech. Biochem, 60(12), 2099-2102 (1996)）のアミノ酸配列と高い相同性を有していた。特に、５７ｋＤａ蛋白質のＮ末端の８アミノ酸残基は、ＭＲＪＰ１中のアミノ酸配列（Ｎ末端から２０〜２７番目のアミノ酸残基））と完全に一致している。報告されているＭＲＪＰ１をコードするＤＮＡの塩基配列及び該配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号２及び３に示す。
【００１８】
ＭＲＪＰ１は、４３２アミノ酸からなり、蜜蜂の下咽頭腺から分泌された後、Ｎ末端にあるシグナルペプチドが切断され、ローヤルゼリー中に存在する。成熟蛋白質は４１６アミノ酸からなり、その推定分子量は、４６．８ｋＤａである。しかし、ローヤルゼリー中の電気泳動で５５ｋＤａを示す蛋白質のＮ末端アミノ酸配列が、ＭＲＪＰ１のＮ末端から２０番目のアミノ酸残基以降の配列と一致したことから、ＭＲＪＰ１の成熟蛋白質の分子量は５５ｋＤａであると推定されている（前記Schmitzova, J., et al.）。そして、ＭＲＪＰ１中には３つの糖鎖付加部位が存在すると記載されていることから、上記の分子量の差異は糖鎖付加によるものと考えられる。
【００１９】
上記のように、５７ｋＤａ蛋白質とＭＲＪＰ１成熟蛋白質のＮ末端のアミノ酸配列は一致し、さらに、ローヤルゼリー中の蛋白質を非変性条件でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った場合にも、５７ｋＤａ蛋白質に相当するバンドは単一であることから、５７ｋＤａ蛋白質とＭＲＪＰ１は同一蛋白質である可能性が高い。尚、配列番号１のアミノ酸配列と配列番号３のアミノ酸番号２０以降のアミノ酸配列とで、一部異なるが、一般的に塩基配列決定に比べてアミノ酸配列決定は不正確である場合があることから、これらの相違は読み誤りである可能性がある。
また、アピシンは、ローヤルゼリー中に存在する蛋白質であり、ゲル濾過分子量は３５０ｋＤａ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は５８ｋＤａである（米倉ら、ローヤルゼリーの蛋白質の特徴と機能ミツバチ科学、第１９巻第１号、第１５−２２頁、１９９８年）。また、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、２種類の配列がみられたことから、２種の５８ｋＤａのサブユニットが３分子づつ会合したヘテロオリゴマー蛋白質である。このように、サブユニットの分子量は５７ｋＤａ蛋白質に近く、Ｎ末端アミノ酸配列も同一であることから、アピシンも５７ｋＤａ蛋白質と同一である可能性が高い。
【００２０】
一方、アピシンのサブユニットに２種類の配列がみられたこと、及び配列番号１及び配列番号３とで一部異なることから、５７ｋＤａ蛋白質は、互いに類似した複数種の蛋白質の混合物である可能性も否定できない。しかし、いずれにしても、少なくとも高温で保存中に減少が観察される電気泳動におけるバンド又はゲル濾過クロマトグラフィーにおけるピークを指標とする限りにおいては、本発明を実施するに際しては、単一の蛋白質と同等のものとして扱うことができる。
【００２１】
（３）本発明のローヤルゼリーの品質評価法及びその利用
上記のようにして５７ｋＤａ蛋白質の分解を指標とすることによってローヤルゼリーの品質を評価することができる。５７ｋＤａ蛋白質の分解は、例えば、上記（１）又は（２）に記載したのと同様にして、電気泳動又はクロマトグラフィーを行い、ゲル中のバンドの染色強度又はクロマトグラムにおけるピークの面積によって、定量することができる。
【００２２】
評価の一例では、例えばＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーにおいては、５７ｋＤａ蛋白質のピーク面積が、クロマトグラムに於ける全ピーク面積の９％以上を有するローヤルゼリーを良品とされる。
尚、ローヤルゼリー中の蛋白質の分解は、通常、同蛋白質を定量することによって行われるが、蛋白質の量の測定は、試料間又は標準品との相対的な量であってもよい。
【００２３】
本発明の方法によって評価され得るローヤルゼリーの品質として具体的には、ローヤルゼリーの鮮度が挙げられる。ローヤルゼリーの鮮度は、抗疲労活性及び／又は疲労回復活性の残存度に反映される。
【００２４】
本発明のローヤルゼリーの品質評価法は、製品の品質評価の他、例えば、ローヤルゼリーの保存法の条件の設定等に利用することできる。すなわち、本発明のローヤルゼリーの品質評価法により決定される、ローヤルゼリーの保存に適した条件でローヤルゼリーを保存することにより、保存中のローヤルゼリーの品質の低下を防止又は低減することができる。また、本発明のローヤルゼリーの評価法によりローヤルゼリーを評価し、良品であると評価されたローヤルゼリーを食品用組成物に配合することによって、品質に優れたローヤルゼリーを含有する食品用組成物を製造することができる。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明がかかる実施例にのみ限定を受けないことは、言うまでもない。
【００２６】
＜実施例１＞
種々のローヤルゼリー中の蛋白質を非変性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。結果を図１に示す。図１中のレーン１〜４は以下に示すとおりである。１：台湾産で、王台を設置してから４８時間後に回収したもの（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｗ／Ｖ；サンプル１）、２：中国杭州産で、王台を設置してから４８時間後に回収したもの（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｗ／Ｖ；サンプル２）、３：中国杭州産で、王台を設置してから７２時間後に回収したもの（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｗ／Ｖ；サンプル３）、４：サンプル３を劣化させたもの（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｗ／Ｖ；サンプル４）。尚、劣化品は、４０℃で１週間放置したものである。各サンプルの濃度は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、２０％グリセリン溶液を用いて調整した。これらのサンプル１０μｌについて８．５×７ｃｍ、厚さ１ｍｍの１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、２０ｍＡで時間、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルは、クマシーブリリアントブルーで染色した。尚、分子量マーカーとしてLMW Kit E（ファルマシアバイオテク社）を用いた。
【００２７】
結果を図１に示す。これより、サンプル１〜３には分子量約５１キロダルトンと推定される蛋白質が認められるが、劣化品にはこの蛋白質が殆ど認められないことがわかる。この蛋白の含有量は、当該バンドの染色強度を測定することにより定量することもできる。
一方、分子量マーカーとしてLMW Kit Eを用い、Laemmliらの方法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ポリアクリルアミドゲル）を行ったところ、上記蛋白質の分子量は、約５７キロダルトンと推定された。
【００２８】
＜実施例２＞
実施例１のサンプル１〜４をトーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを（７．５×３０ｃｍ）カラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に、検出を２８０ｎｍでの吸光度に設定したＧＰＣにより、分析した。結果は図２〜５に示すようなクロマトグラムとして得られた。即ち、保持時間２５分〜３０分の位置にあるピークＡが、図２に比べ図５では３５％減少している様に、強制劣化によりピークＡの蛋白質の量が変動していることが判明した。即ち、この蛋白質が劣化の指標物質であることがわかる。このピークＡの蛋白質は、分子量マーカーとしてゲル濾過用LMW Kit及びHMW Kit（ファルマシアバイオテク社）を用いた上記と同様のゲル濾過分析により、分子量５７キロダルトンと推定した。また、このピークＡの画分を電気泳動した結果、実施例１の電気泳動で減少していた推定分子量５１キロダルトンの蛋白質と同一の泳動度であることから、同一の蛋白質であると推定した。このピークＡのピーク面積の全ピークのピーク面積に対する百分率を表１に示す。
【００２９】
【表１】

【００３０】
＜実施例３＞
マウス抗疲労試験を指標として、上記４種のローヤルゼリーの生理活性試験を行った。即ち、実験動物としてｄｄＹマウス、５週齢、雌、１群１０匹を用いた。ローヤルゼリーの投与方法として、ローヤルゼリーの凍結乾燥物を生換算で５％になるように粉餌（ＣＥ−２）に混ぜて２週間自由摂取させた（計算上の摂取量は５ｇ/Ｋｇ）。
【００３１】
抗疲労試験として、京大松元式マウス運動量測定流水糟を用いた。水糟の水流量は８Ｌ/分で流し、マウスを遊泳させ、７秒間以上息継ぎが出来なくなった時点を遊泳時間とした。群分けとして、１群はコントロール（通常食）、２群はサンプル１のローヤルゼリー投与群、３群はサンプル２のローヤルゼリー投与群、４群はサンプル３のローヤルゼリー投与群、５群はサンプル４のローヤルゼリー投与群（サンプル３を４０℃で１週間放置したもの）とした。
【００３２】
マウスの選定に際し、、マウスは泳ぎの上手いものと下手なものがおり、下手なものは遊泳を重ねても遊泳時間がほとんど伸びなかった。従って、投与前遊泳時間において４０分以上泳いだものだけを選出し実験に供した。実験のスケジュールとして、まず、マウスを週１回遊泳させた。１週目に予備遊泳させ、２週目に投与前遊泳時間を測定した。４週目に投与開始後２週目の遊泳時間を測定した。結果を平均遊泳時間比（投与前の遊泳時間を１とした場合の投与後の遊泳時間の比を平均したもの。）として表２に示す。これより、指標蛋白質の含有量の多いものほど遊泳時間がのびていること、及び、上記投与量においてはこの蛋白質の含有量が９％以上になるとその効果が著しいことがわかる。従って、該蛋白質が抗疲労の生理活性と極めて良好な相関があることが確かめられた。
【００３３】
【表２】

【００３４】
＜実施例４〜６＞
以下に示す処方に従って、健康食品を作成した。即ち、処方成分を１０重量部の水と共に転動相造粒し、打錠して錠剤状の健康食品を得た。これらのものは何れも優れた疲労回復効果を有していた。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。
【００３５】
【表３】

【００３６】
＜実施例７〜９＞
以下に示す処方に従って、健康食品を作成した。即ち、処方成分を撹拌可溶化しドリンク製剤の健康食品を得た。これらのものは何れも優れた疲労回復効果を有していた。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。
【００３７】
【表４】

【００３８】
＜実施例１０＞
凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ７に溶解し、遠心分離した後、上清をＵＦ１０万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００）で６倍に濃縮した後、前記緩衝液による希釈及び濃縮を計７回繰り返して脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ３０）で８倍に濃縮し、１回脱塩を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。
【００３９】
上記分子量１０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することで、５７キロダルトンタンパク質を分離できる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては通常に知られている方法に従って行えばよく、このような好ましい例として、例えばトーソー株式会社製DEAE-Toyoperal 650M (2.2×20cm)をカラムとして用いて、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH7.0）を展開液Ａ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（pH7.0）、１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジエントにより、流速５ｍｌ／分で溶出し、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンのタンパク質画分を検出することができる。
【００４０】
さらに、この画分をゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００（1.6cm×60cm）をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウムバッッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出することによって、上記サンプルを分画した。分画は、１フラクション２ｍｌとして行った。その結果、フラクションＮｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンの蛋白質を得ることが出来た。得られた蛋白質の分子量は、電気泳動により確認した。また、分子量既知のマーカーを用いたゲル濾過分析の結果、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量測定の結果より、上記蛋白質は、分子量５７キロダルトンのモノマー蛋白質であると確定された。
【００４１】
上記のようにして精製した蛋白質について決定したＮ末端のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。このアミノ酸配列は、蜜蜂の頭のｃＤＮＡライブラリー及びローヤルゼリー中の報告されている蛋白質ＭＲＪＰ１（Schmitzova, J., et al., Cell. Mol. Life Sci. 54 (9), 1020-1030 (1998)）及びアピシン（apisin）（Kimura, Y. et al., Biosci, Biotech. Biochem, 60(12), 2099-2102 (1996)）のＮ末端アミノ酸配列と高い相同性を有しており、ＭＲＪＰ１とは、８個のアミノ酸が完全に一致していた。
【００４２】
＜実施例１１＞
ローヤルゼリー中の５７ｋＤａ蛋白質の温度安定性を調べた。ローヤルゼリー（実施例１のサンプル３）を種々の温度で１〜７日間保存した後の５７ｋＤａ蛋白質の含有率を、実施例２と同様のクロマトグラフィーにより調べた。結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】

【００４４】
上記結果から、５７ｋＤａ蛋白質は、ローヤルゼリー中で室温でも分解されるが、４℃ではほぼ安定であることがわかった。また、５７ｋＤａ蛋白質の分解は、保存日数よりも、保存温度による影響が大きいことがわかった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、ローヤルゼリーの品質の評価の手段を提供することが出来る。
【００４６】
【配列表】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【図面の簡単な説明】
【図１】ローヤルゼリーの電気泳動を表す図である。（図面代用写真）
【図２】サンプル１のクロマトグラムを示す図である。
【図３】サンプル２のクロマトグラムを示す図である。
【図４】サンプル３のクロマトグラムを示す図である。
【図５】サンプル４のクロマトグラムを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for evaluating the quality of royal jelly.
[0002]
[Prior art]
The present age is an era of stress, and those living in modern society live with greater or lesser stress. For this reason, people's nutritional balance is lost, and when it becomes severe, it causes diseases such as bulimia and anorexia. At present, these patients have a tendency to increase year by year, which is a problem. On the other hand, there are not a few people who do not reach that point, considering the nutritional balance and individuals are thinking about diet. As nutritional intake in daily life has become important in this way, the number of people who balance nutrition with health foods is increasing as a simple method for preparing a nutritional environment, which is a health food boom.
[0003]
The ingredients used as health food ingredients are herbal medicines, vitamins, calcium, royal jelly, etc., and their contents are controlled by weight, but many of these are natural ingredients. For this reason, there may be variations in the composition of the content components, and whether or not the active ingredients are blended correctly is a problem. In particular, as in the case of royal jelly, its effectiveness is clearly recognized, and it is difficult to determine which substance is used as a standard for analyzing and evaluating its effectiveness and quality when it itself consists of a plurality of components. Therefore, particularly in terms of the stability of the preparation and quality, regarding royal jelly to be blended in health foods, etc., it is desired to develop analytical means that serve as a basis for the degree of effectiveness for each lot and the degradation of the royal jelly itself.
[0004]
On the other hand, the active ingredient in the royal jelly is a protein. The protein has a molecular weight of 57 kilodaltons by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions. It has never been known that the effectiveness of each lot can be measured and evaluated.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide means for evaluating the quality of royal jelly.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In view of such a situation, as a result of intensive research efforts, the present inventors have found that the active ingredient in royal jelly is a protein, and the content of the protein and the degree of degradation are used as indicators to determine the quality of royal jelly. As a result, the inventors have found a method for evaluating the quality of royal jelly using this protein as an index, and have completed the invention.
[0007]
That is, the present invention is as follows.
(1) A method for evaluating the quality of royal jelly using the degradation of a protein having the following properties in royal jelly as an index .
Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 57 kilodaltons.
(2) Using the TSK gel G3000SW (7.5 × 30 cm) manufactured by Tosoh Corporation as a column, the protein is 0.3 M sodium chloride, 0.05 M sodium azide-containing 0.1 M phosphate buffer (pH 7. 0) is a developing solution, the flow rate is set to 0.3 ml / min, the column temperature is set to 35 ° C., and the protein having a peak at a retention time of 25 minutes to 30 minutes in high-performance liquid chromatography for detection at an absorbance of 280 nm. Yes, (1) Royal jelly quality evaluation method.
(3) The royal jelly quality evaluation method according to (1) or (2) , wherein the protein comprises the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 8 of SEQ ID NO: 1.
(4) Quality evaluation method of the royal jelly in any one of (1)-(3) whose quality evaluation is the freshness of royal jelly.
(5) The quality evaluation method for royal jelly according to (4) , wherein the freshness is a residual degree of anti-fatigue activity or fatigue recovery activity.
(6) In the royal jelly quality evaluation method according to (2), a royal jelly having a peak area of the protein of 9% or more of the total peak area in the chromatogram is regarded as a non-defective product. Quality evaluation method.
(7) A method for preserving royal jelly, characterized in that the method is preserved under conditions suitable for preserving royal jelly, which is determined by the method for evaluating the quality of royal jelly according to any one of (1) to (6) .
(8) Contains a royal jelly characterized in that the royal jelly is evaluated by the method for evaluating the quality of the royal jelly according to any one of (1) to (6), and the royal jelly evaluated as a non-defective product is blended in a food composition. A method for producing a food composition.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described with a focus on embodiments.
[0009]
(1) Analysis of indicator protein in royal jelly by electrophoresis The method for evaluating the quality of royal jelly according to the present invention uses the protein degradation in royal jelly as an indicator. In the present invention, proteolysis can be examined by, for example, analyzing the structure of the protein by means such as electrophoresis or chromatography and measuring the content of the protein presumed to be an active ingredient.
[0010]
The method of electrophoresis is not particularly limited as long as the effective protein can be specified, but the protein presumed to be the active ingredient has the following properties and is specified using the properties. be able to.
(A) A single band is formed in non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins in royal jelly.
(B) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 57 kilodaltons.
[0011]
The method of non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis is not particularly limited. For example, polyacrylamide gel (10% uniform) is used, electrophoresis is performed at a current of 20 mA, and the protein is identified by staining with Coomassie Brilliant Blue. .
[0012]
When the protein in the royal jelly is electrophoresed under the above conditions, the active ingredient protein forms a single band. In this respect, non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis is preferred for examining the degradation of the active ingredient protein by electrophoresis. If the content of this protein increases, the effect of royal jelly, that is, the anti-fatigue action and the fatigue recovery action increase in proportion thereto. That is, this protein is an index of effect, and a decrease in this content is an index of deterioration. When LMW Kit E (Pharmacia Biotech) is used as a molecular weight marker, the molecular weight of the protein serving as an index for the evaluation method of the present invention is about 51 kilodaltons.
[0013]
Moreover, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions can be performed by the method of Laemmli et al. (Laemmli, UK et al., J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 (1977)). . When LMW Kit E (Pharmacia Biotech) is used as a molecular weight marker, the molecular weight of the protein serving as an index for the evaluation method of the present invention is about 57 kilodaltons.
[0014]
(2) Analysis of degradation indicator protein in royal jelly by chromatography.
The protein that serves as an indicator of the deterioration can be identified and quantified by various types of chromatography such as gel filtration chromatography. Therefore, such analysis results can be used for quality control and discrimination / evaluation of effects. Examples of chromatography include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Moreover, although an open column can also be used for chromatography, a high performance liquid chromatography is preferable.
[0016]
For example, the gel filtration analysis may be performed according to a generally known method. As a preferable example, for example, TSK gel G3000SW (7.5 × 30 cm) manufactured by Tosoh Corporation is used as a column, and 0.3 M chloride is obtained. Sodium, 0.05% sodium azide-containing 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) is used as a developing solution, the flow rate is set to 0.3 ml / min, the column temperature is set to 35 ° C., and the absorbance is detected at 280 nm. Examples include high performance liquid chromatography. Under this analytical condition, the indicator protein appears as a peak at a retention time of about 25 to 30 minutes. Further, the molecular weight of the indicator protein was estimated to be about 57 kilodaltons by gel filtration analysis similar to the above using LMW Kit for gel filtration and HMW Kit (Pharmacia Biotech) as molecular weight markers. This protein showed a molecular weight of about 57 kilodaltons in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis under reducing conditions similar to (1). Hereinafter, the protein in the royal jelly identified by electrophoresis or gel filtration chromatography as described above may be referred to as “57 kDa protein”.
The molecular weight after digesting the 57 kDa protein with N-glycosidase F is 48 kDa, which is known to be a glycoprotein.
[0017]
As shown in Examples below, the N-terminal amino acid sequence of the 57 kDa protein was determined, and the protein MRJP1 reported in royal jelly (Schmitzova, J., et al., Cell. Mol. Life Sci. 54 ( 9), 1020-1030 (1998)) and apicin (Kimura, Y. et al., Biosci, Biotech. Biochem, 60 (12), 2099-2102 (1996)) Had. In particular, the N-terminal 8 amino acid residues of the 57 kDa protein completely match the amino acid sequence in MRJP1 (the 20th to 27th amino acid residues from the N-terminal). The reported nucleotide sequence of DNA encoding MRJP1 and the amino acid sequence encoded by the sequence are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
[0018]
MRJP1 consists of 432 amino acids, and after being secreted from the hypopharyngeal gland of bees, the signal peptide at the N-terminus is cleaved and present in royal jelly. The mature protein consists of 416 amino acids and its estimated molecular weight is 46.8 kDa. However, since the N-terminal amino acid sequence of a protein showing 55 kDa by electrophoresis in royal jelly matches the sequence after the 20th amino acid residue from the N-terminus of MRJP1, the molecular weight of the mature protein of MRJP1 is 55 kDa. Has been estimated (Schmitzova, J., et al., Supra). And since it is described that there are three glycosylation sites in MRJP1, the above difference in molecular weight is considered to be due to glycosylation.
[0019]
As described above, the N-terminal amino acid sequences of the 57 kDa protein and the MRJP1 mature protein are identical, and a band corresponding to the 57 kDa protein is also obtained when the protein in royal jelly is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions. Is a single protein, it is highly likely that the 57 kDa protein and MRJP1 are the same protein. Although the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is partially different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 after amino acid number 20, the amino acid sequence determination may generally be inaccurate compared to the base sequence determination. These differences can be misread.
Apisin is a protein present in royal jelly, the molecular weight of gel filtration is 350 kDa, and the molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is 58 kDa (Yonekura et al., Protein Characteristics and Functions of Royal Jelly, Bee Science, Vol. 19) No. 1, pp. 15-22, 1998). In addition, as a result of N-terminal amino acid sequence analysis, two types of sequences were found, and thus, it was a hetero-oligomeric protein in which two types of 58 kDa subunits were associated with each other in three molecules. Thus, since the molecular weight of the subunit is close to that of the 57 kDa protein and the N-terminal amino acid sequence is the same, it is highly likely that apicin is also identical to the 57 kDa protein.
[0020]
On the other hand, since the two types of sequences were found in the subunit of apicin, and partly different between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, the 57 kDa protein may be a mixture of multiple types of proteins similar to each other Cannot be denied. However, in any case, as long as the band in electrophoresis at which a decrease is observed during storage at high temperature or the peak in gel filtration chromatography is used as an index, a single protein and Can be treated as equivalent.
[0021]
(3) Method for evaluating quality of royal jelly of the present invention and its use As described above, the quality of royal jelly can be evaluated by using the degradation of 57 kDa protein as an index. The degradation of the 57 kDa protein is determined, for example, by electrophoresis or chromatography in the same manner as described in (1) or (2) above, and is determined by the staining intensity of the band in the gel or the peak area in the chromatogram. can do.
[0022]
In an example of evaluation, for example, in HPLC gel filtration chromatography, a royal jelly having a peak area of 57 kDa protein of 9% or more of the total peak area in the chromatogram is regarded as a non-defective product.
The protein in the royal jelly is usually decomposed by quantifying the protein, but the amount of protein may be measured between samples or relative to a standard product.
[0023]
Specific examples of the quality of royal jelly that can be evaluated by the method of the present invention include the freshness of royal jelly. The freshness of royal jelly is reflected in the remaining degree of anti-fatigue activity and / or fatigue recovery activity.
[0024]
The method for evaluating the quality of the royal jelly of the present invention can be used, for example, for setting the conditions for the preservation method of the royal jelly in addition to the quality evaluation of the product. That is, by storing the royal jelly under conditions suitable for the storage of the royal jelly determined by the method for evaluating the quality of the royal jelly of the present invention, it is possible to prevent or reduce the deterioration of the quality of the royal jelly during storage. In addition, the royal jelly is evaluated by the royal jelly evaluation method of the present invention, and the composition for food containing the royal jelly having excellent quality is manufactured by blending the royal jelly evaluated as a non-defective product into the food composition. Can do.
[0025]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, it is needless to say that the present invention is not limited to such examples.
[0026]
<Example 1>
Proteins in various royal jelly were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions. The results are shown in FIG. Lanes 1 to 4 in FIG. 1 are as shown below. 1: Made in Taiwan, collected 48 hours after the installation of the royal palace (10 mg / ml, W / V; sample 1) 2: Made in Hangzhou, China, collected 48 hours after the installation of the royal palace (10 mg / ml, W / V; sample 2), 3: collected in Hangzhou, China, and collected 72 hours after installing the royal table (10 mg / ml, W / V; sample 3), 4: Sample 3 deteriorated (10 mg / ml, W / V; sample 4). The deteriorated product was left at 40 ° C. for 1 week. The concentration of each sample was adjusted using 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) and 20% glycerin solution. 10 μl of these samples were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions at 20 mA for 10 hours using a 10% polyacrylamide gel of 8.5 × 7 cm and a thickness of 1 mm. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue. LMW Kit E (Pharmacia Biotech) was used as a molecular weight marker.
[0027]
The results are shown in FIG. From this, it can be seen that in samples 1 to 3, a protein estimated to have a molecular weight of about 51 kilodaltons is observed, but this protein is hardly observed in the degraded product. The protein content can also be quantified by measuring the staining intensity of the band.
On the other hand, when LMW Kit E was used as a molecular weight marker and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (10% polyacrylamide gel) was performed by the method of Laemmli et al., The molecular weight of the protein was estimated to be about 57 kilodaltons.
[0028]
<Example 2>
Samples 1 to 4 of Example 1 were used as a (7.5 × 30 cm) column using TSK gel G3000SW manufactured by Tosoh Corporation, and 0.1M phosphate buffer solution containing 0.3M sodium chloride and 0.05% sodium azide ( Analysis was performed by GPC using pH 7.0) as a developing solution, a flow rate of 0.3 ml / min, a column temperature of 35 ° C., and detection at an absorbance of 280 nm. The results were obtained as chromatograms as shown in FIGS. That is, it was found that the amount of protein in peak A fluctuated due to forced degradation, as peak A at a retention time of 25-30 minutes decreased by 35% in FIG. 5 compared to FIG. did. That is, it can be seen that this protein is an indicator substance for deterioration. The protein of peak A was estimated to have a molecular weight of 57 kilodaltons by gel filtration analysis similar to the above using LMW Kit for gel filtration and HMW Kit (Pharmacia Biotech) as molecular weight markers. Further, as a result of electrophoresis of the peak A fraction, it was estimated that it was the same protein because it had the same mobility as the protein having an estimated molecular weight of 51 kilodalton which had been reduced by the electrophoresis of Example 1. . Table 1 shows the percentage of the peak area of peak A with respect to the peak area of all peaks.
[0029]
[Table 1]

[0030]
<Example 3>
Using the mouse anti-fatigue test as an index, the physiological activity test of the above four kinds of royal jelly was conducted. That is, ddY mice, 5 weeks old, females, 10 mice per group were used as experimental animals. As a method of administering royal jelly, royal jelly freeze-dried product was mixed with flour (CE-2) so as to be 5% in terms of raw equivalent and allowed to freely ingest for 2 weeks (calculated intake was 5 g / Kg).
[0031]
As an anti-fatigue test, a Kyodai Matsumoto style mouse momentum measuring water tank was used. The water flow rate of the chickenpox was 8 L / min, the mouse was allowed to swim, and the time when breathing was impossible for 7 seconds or more was defined as the swimming time. As a group, 1 group is a control (normal diet), 2 is a sample 1 royal jelly administration group, 3 is a sample 2 royal jelly administration group, 4 is a sample 3 royal jelly administration group, 5 is a sample 4 royal jelly The administration group (sample 3 was left at 40 ° C. for 1 week) was used.
[0032]
When selecting mice, there were mice that were good at swimming and those who were not good at swimming. Therefore, only those swimming for 40 minutes or more in the pre-dose swimming time were selected and used for the experiment. As an experiment schedule, first, mice were allowed to swim once a week. Preliminary swimming was performed in the first week, and swimming time before administration was measured in the second week. The swimming time at the second week after the start of administration at the fourth week was measured. The results are shown in Table 2 as the average swimming time ratio (average ratio of swimming time after administration when the swimming time before administration is 1). From this, it can be seen that the larger the content of the indicator protein, the longer the swimming time, and that the effect is remarkable when the content of the protein is 9% or more at the above dose. Therefore, it was confirmed that the protein has a very good correlation with the physiological activity of anti-fatigue.
[0033]
[Table 2]

[0034]
<Examples 4 to 6>
A health food was prepared according to the prescription shown below. That is, the prescription ingredients were granulated in a tumbling phase together with 10 parts by weight of water, and tableted to obtain a tablet-like health food. All of these had an excellent fatigue recovery effect. In addition, the unit of the numerical value in a table | surface represents a weight part.
[0035]
[Table 3]

[0036]
<Examples 7 to 9>
A health food was prepared according to the prescription shown below. That is, the prescription ingredients were solubilized with stirring to obtain a health food as a drink preparation. All of these had an excellent fatigue recovery effect. In addition, the unit of the numerical value in a table | surface represents a weight part.
[0037]
[Table 4]

[0038]
<Example 10>
The lyophilized royal jelly is dissolved in 0.7% by weight in 10 mM Tris-HCl buffer solution pH 7, centrifuged, and the supernatant is concentrated 6-fold with UF 100,000 (Miniplate 100), and then diluted and concentrated with the buffer solution. Was repeated for a total of 7 times, and the filtrate was further concentrated 8 times with UF30,000 (Miniplate 30) and desalted once to obtain a fraction having a molecular weight of 100,000 to 30,000.
[0039]
The sample having the molecular weight of 100,000 to 30,000 can be separated by 57-kilodalton protein by fractionation by anion exchange chromatography and gel filtration chromatography. Anion exchange chromatography may be carried out in accordance with a generally known method. As such a preferable example, 20 mM Tris-HCl is used, for example, using DEAE-Toyoperal 650M (2.2 × 20 cm) manufactured by Tosoh Corporation as a column. The buffer (pH 7.0) is eluted with a developing solution A, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and 1M NaCl as a developing solution B, and is eluted at a flow rate of 5 ml / min. / Fraction No. fractionated by tube A protein fraction having a molecular weight of 57 kilodaltons can be detected at 119 to 127.
[0040]
Further, this fraction was fractionated by gel filtration chromatography. Using PharmaLoad Co., Ltd. HiLoad16 / 60 Superdex600 (1.6 cm × 60 cm) as a column, 0.15 M sodium chloride-containing 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 as a developing solution, a flow rate of 1.0 ml / min, column temperature Was set to 35 ° C., and the sample was fractionated by detecting the absorbance at 280 nm. Fractionation was performed as 2 fractions of 1 fraction. As a result, fraction no. A protein having a molecular weight of 57 kilodaltons at 35 to 43 could be obtained. The molecular weight of the obtained protein was confirmed by electrophoresis. The protein was determined to be a monomer protein having a molecular weight of 57 kilodalton from the results of gel filtration analysis using a marker with a known molecular weight and the results of molecular weight measurement by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
[0041]
The N-terminal amino acid sequence determined for the protein purified as described above is shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing. This amino acid sequence is represented by the protein MRJP1 (Schmitzova, J., et al., Cell. Mol. Life Sci. 54 (9), 1020-1030 (1998). ) And apicin (Kimura, Y. et al., Biosci, Biotech. Biochem, 60 (12), 2099-2102 (1996)) have high homology with MRJP1 The 8 amino acids were perfectly matched.
[0042]
<Example 11>
The temperature stability of the 57 kDa protein in royal jelly was examined. After the royal jelly (Sample 3 of Example 1) was stored at various temperatures for 1 to 7 days, the content of the 57 kDa protein was examined by the same chromatography as in Example 2. The results are shown in Table 5.
[0043]
[Table 5]

[0044]
From the above results, it was found that the 57 kDa protein is decomposed at room temperature in royal jelly, but is almost stable at 4 ° C. Further, it was found that the degradation of the 57 kDa protein is more affected by the storage temperature than the storage days.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, a means for evaluating the quality of royal jelly can be provided.
[0046]
[Sequence Listing]

[0047]

[0048]

[0049]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing electrophoresis of royal jelly. (Drawing substitute photo)
FIG. 2 is a diagram showing a chromatogram of sample 1. FIG.
FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram of sample 2. FIG.
4 is a diagram showing a chromatogram of sample 3. FIG.
5 is a diagram showing a chromatogram of sample 4. FIG.

Claims

A method for evaluating the quality of royal jelly, using as an index the degradation of a protein having the following properties in the royal jelly.
Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions: about 57 kilodaltons.

Using the TSK gel G3000SW (7.5 × 30 cm) manufactured by Tosoh Corporation as a column, the protein is 0.3 M sodium chloride, 0.05 M sodium azide-containing 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). as a developing solution, to set the flow rate of 0.3 ml / min, the column temperature 35 ° C., detected by absorbance at 280nm, in high-performance liquid chromatography, a protein having a peak at retention time 25 minutes to 30 minutes, wherein Item 2. A method for evaluating the quality of royal jelly according to item 1 .

The method for evaluating the quality of royal jelly according to claim 1 or 2 , wherein the protein comprises the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 8 of SEQ ID NO: 1.

The quality evaluation method of the royal jelly as described in any one of Claims 1-3 whose quality evaluation is the freshness of a royal jelly.

The quality evaluation method for royal jelly according to claim 4, wherein the freshness is a residual degree of anti-fatigue activity or fatigue recovery activity.

The method for evaluating the quality of royal jelly according to claim 2 , wherein the royal jelly having a peak area of the protein of 9% or more of the total peak area in the chromatogram is regarded as a non-defective product. Quality evaluation method.

A method for preserving a royal jelly, characterized in that the method is preserved under conditions suitable for preserving royal jelly, which is determined by the method for evaluating the quality of royal jelly according to any one of claims 1 to 6 .

A royal jelly-containing food characterized in that the royal jelly is evaluated by the royal jelly quality evaluation method according to any one of claims 1 to 6, and the royal jelly evaluated as a non-defective product is blended in a food composition. A method for producing a composition.