JP3776229B2 - Chemiluminescent reagent and method for producing the same - Google Patents

Description

（式中のＲ¹及びＲ²は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（２）Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンである第(１)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（３）一般式［２］
【化７】

（式中のＲ¹及びＲ²は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘ^n-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を溶媒中において、還元剤を用いて還元処理することにより得られた反応混合物から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（４）Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートである第(３)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（５）溶媒中において、一般式［２］
【化８】

（式中のＲ¹及びＲ²は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘ^n-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素又は水素化ナトリウムホウ素を還元剤として用いて還元処理することを特徴とする、一般式［１］
【化９】

（式中のＲ¹〜Ｒ⁶は、前記と同じ意味をもつ）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
（６）溶媒中において、一般式［２］
【化１０】

（式中のＲ¹及びＲ²は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘ^n-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素又は水素化ナトリウムホウ素を還元剤として用いて還元処理したのち、残存する還元剤を分解し、次いで分解生成物を除去することを特徴とする反応混合物から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
（７）Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートである第(５)又は(６)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
（８）還元剤が水素化リチウムアルミニウムである第(５)、(６)又は(７)項記載のペルオ キシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、及び、
（９）溶媒が環状エーテル類である第(５)〜(８)項のいずれかに記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の化学発光試薬［１］であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体（以下、本発明のビスジヒドロアクリジン誘導体と略称することがある）は、一般式［１］
【化１１】

で表される構造を有するものである。
この一般式［１］において、Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基である。ここで、炭素数１〜１４のアルキル基としては、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基などが挙げられる。アリール基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、ハロゲン化アリール基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、特にフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のハロゲン原子が、環上に１個又は２個以上導入されたフェニル基が好ましく挙げられる。このハロゲン化アリール基におけるハロゲン原子の結合位置については特に制限はない。また、Ｒ¹及びＲ²は、たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【０００６】
一方、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基である。ここで、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。アルキル基としては、炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のアルキル基が好ましく、例えば、前記Ｒ¹及びＲ²のうちの炭素数１〜１４のアルキル基の説明において例示したものと同じものを挙げることができる。アリール基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、例えばフェニル基、トリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基などが挙げられ、アルコキシ基としては、炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基が好ましく、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペントキシ基、ヘキソキシ基、オクトキシ基などが挙げられる。アリーロキシ基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、例えばフェニルオキシ基、トリルオキシ基などが挙げられる。このＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
このような一般式［１］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体の例としては、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン、Ｎ,Ｎ'−ジエチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン、Ｎ,Ｎ'−ジフェニル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン、Ｎ,Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンなどが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらの中で、特にＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンが好適である。
一方、化学発光試薬［２］は、一般式［２］
【化１２】

で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を溶媒中において、還元剤を用いて還元処理することにより得られた反応混合物から成るものである。
前記一般式［２］において、Ｒ¹〜Ｒ⁶は、前記一般式［１］におけるＲ¹〜Ｒ⁶と同じである。また、Ｘ^n-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。Ｘ^n-の例としては、各種ハロゲンイオン（Ｆ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-）、ＮＯ₃ ^-、ＣｌＯ₄ ^-、ＳＯ₄ ^2-、ＣＯ₃ ^2-などの無機陰イオン、ＣＨ₃ＣＯＯ^-、ＣＨ₃ＳＯ₄ ^-、Ｃ₂Ｈ₅ＳＯ₄ ^-、ｐ−トルエンスルホン酸イオンなどの有機イオンが挙げられる。
このような一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類の例としては、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジエチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらの中で、特にＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
【０００７】
次に、本発明の化学発光試薬［１］であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体の製造方法について説明する。
本発明のビスジヒドロアクリジン誘導体は、任意の方法によって製造することができるが、以下に示す本発明方法によれば、効率よく製造することができる。本発明の製造方法においては、溶媒中において、前記一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ビス置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、還元剤を用いて還元処理することにより、対応する前記一般式［１］で表されるＮ,Ｎ'−ビス置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体が効率よく得られる。
前記一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類の例としては、前記と同様に、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジエチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらの中で、特にＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
一方、本発明の化学発光試薬［２］は、本発明方法によれば、前記一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、還元剤を用いて還元処理したのち、残存する還元剤を分解し、次いで分解生成物を除去して反応混合物を得ることにより、製造される。なお、一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類については、前記と同様である。
本発明の化学発光試薬［１］及び［２］の製造方法において用いられる還元剤としては、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素、水素化ナトリウムホウ素などが挙げられるが、これらの中で、特に水素化リチウムアルミニウムが好適である。これらの還元剤は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、反応溶媒としては、反応試薬に対して実質上不活性であり、かつ反応試薬に対する溶解性又は分散性を有するものであればよく、特に制限はないが、例えばテトラヒドロフランやジオキサン類などの環状エーテル類が好適である。この反応溶媒は１種用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０００８】
反応温度は特に制限はなく、用いる原料、還元剤及び溶媒の種類などに応じて、適宜選定されるが、一般的には、−１０〜１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲である。反応時間は、用いる原料、還元剤及び溶媒の種類や反応温度などにより異なり、一概に定めることはできないが、通常は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に好ましくは３０分〜５時間の範囲である。
このようにして、原料のＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類に対応するＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体が生成する。反応終了後、反応混合液中の過剰の還元剤を加水分解し、固形物をろ別したのち、ろ液のpHを所望の値に調整し、このＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体溶液を、そのまま化学発光試薬として用いてもよいし、また、固形物をろ別したのち、ろ液から目的のＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体を常法に従って単離し、化学発光試薬として用いてもよい。
本発明の化学発光試薬［１］及び［２］は、塩基性条件下に、過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在で反応して発光するので、この反応により過酸化水素の検出及びペルオキシダーゼの定量などに利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、さらに、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【０００９】
本発明の化学発光試薬［１］及び［２］は、pH７.５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物などの発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、例えばｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリンなどが挙げられる。これらの中で、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾールが好適である。これらのフェノール性化合物は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明の化学発光試薬［１］を使用する場合には、Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体として、また化学発光試薬［２］を使用する場合には、製造の出発原料であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類に換算して、好ましくは１０^-6〜１モル／リットル、より好ましくは１０^-4〜１０^-2モル／リットルの範囲の濃度で用いられ、またその使用量は、通常１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が有利である。さらに、前記発光増強剤の使用量は、本発明の化学発光試薬に対して、通常０.０１〜１００倍モル、好ましくは０.１〜１０倍モルの範囲で選ぶのがよい。また、その濃度としては、１０^-6〜１モル／リットルの範囲が好ましく、特に１０^-4〜１０^-2モル／リットルの範囲が好ましい。
この化学発光反応に用いる過酸化水素の量は、本発明の化学発光試薬に対して、充分に過剰な量であればよく、特に制限はないが、化学発光試薬に対して、通常３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で選ぶのが有利である。また、ペルオキシダーゼを標識物質として、抗体や核酸などを標識して種々の物質を定量する場合には、このペルオキシダーゼとしては、特に限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
この化学発光反応は塩基性条件下で行われるので、通常塩基性緩衝液が用いられる。この塩基性緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液などの中から、任意に選択して用いることができる。また、所望により、反応時に界面活性剤やキレート剤などの添加剤を用いることができる。
本発明の化学発光試薬においては、その成分であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体が、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する発生期の酸素により酸化されて、Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジニウム化合物となり、さらに過剰に存在する過酸化水素と反応して励起状態のジオキセタン構造を形成したのち、アルカリで分解されてアクリドンを生成し、基底状態に戻り発光するものと考えられる。
【００１０】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１mgを試験管に採り、これにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させたのち、撹拌下にテトラヒドロフラン１ml中へ加えてルシゲニンをテトラヒドロフラン中に微分散させた。次いで、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０mgを添加して、室温下に６時間撹拌して還元処理したのち、反応混合液を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウムなどの沈殿をろ別してから、ろ液のpHを１Ｎ塩酸で７.０に調整することにより、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン溶液から成る化学発光試薬２.５ｇを得た。
この溶液について、高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン０.０１８重量％溶液であることが確認された。収率６２％。
実施例２
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１mgを試験管に採り、これにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させたのち、撹拌下に１,４−ジオキサン１ml中へ加えてルシゲニンを１,４−ジオキサン中に微分散させた。次いで、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０mgを添加して、８０℃で２時間撹拌して還元処理したのち、反応混合液を氷冷下にメタノール中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した沈殿をろ別してから、ろ液より溶媒を減圧下に留去することにより、固形物から成る化学発光試薬０.７mgを得た。
この固形物について、高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン６５重量％のものであることが確認された。収率６２％。
【００１１】
実施例３
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１mgを試験管に採り、これにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させたのち、撹拌下に１,４−ジオキサン１ml中へ加えてルシゲニンを１,４−ジオキサン中に微分散させた。次いで、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０mgを添加して、８０℃で２時間撹拌して還元処理したのち、反応混合液を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウムなどの沈殿をろ別してから、ろ液のpHを１Ｎ塩酸で７.０に調整することにより、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン溶液から成る化学発光試薬２.５ｇを得た。
この溶液について、高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン０.０２重量％溶液であることが確認された。収率６８％。
実施例４
ペルオキシダーゼ活性の測定
Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン（実施例１で得られたもの）４.０×１０^-6モル／リットル、ｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液５０μｌを混合し、これに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算したところ、ＨＲＰを５×１０^-19モル／ａｓｓａｙまで測定可能であった。
実施例５
ペルオキシダーゼ活性の測定
実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ、及びｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌの混合液に、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合し、これに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、第１表に示すようにＨＲＰを５×１０^-19モル／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００１２】
【表１】

【００１３】
実施例６
ペルオキシダーゼ活性の測定
Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン（実施例１で得られたもの）を４.０×１０^-5モル／リットル及びｐ−フェニルフェノールを１０^-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合し、これに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加えルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、第２表に示すようにＨＲＰを５×１０^-19モル／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００１４】
【表２】

【００１５】
比較例１
ルミノール（３−アミノフタル酸ヒドラジド）５.６×１０^-5モル／リットル及びｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合したのちこれに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、第３表に示すようにＨＲＰを１０^-17モル／ａｓｓａｙまで測定できることが認められた。
【００１６】
【表３】

【００１７】
参考例１
不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有する兎由来のポリクローナル抗体を１０ミリモル／リットルリン酸緩衝生理食塩水（pH７.４）（ＰＢＳ）に１０mg／mlの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社製）の各ウェルに０.１mlずつ加え、３７℃の温度で１時間放置したのち、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を０.３mlずつ加えて３７℃の温度で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
参考例２
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有するマウス由来のモノクローナル抗体を１０ミリモル／リットルリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（pH７.４）に１.０mg／mlの濃度で溶解した溶液１mlに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０mg／ml濃度のジメチルホルムアルミド溶液０.１mlを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０.１モル／リットルリン酸緩衝液（pH６.０）でゲルろ過を行い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１.０mg／mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０mg／ml濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ミリモル／リットル酢酸緩衝液（pH４.５）でゲルろ過して精製し、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取したのち、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これに０.１モル／リットルジチオスレイトールを含有する０.１モル／リットル酢酸緩衝生理食塩水（pH４.５）１mlを添加して、２５℃の温度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元したのち、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲルろ過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４mg／mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置したのち、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲルろ過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
【００１８】
実施例７
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ng／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去したのち、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ、及びｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）２４０μｌを加え、これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０.０５ng／mlの濃度まで測定することが可能であった。
実施例８
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（ＰＲＬ）の測定
兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜２００ng／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ及びｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットル含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）２４０μｌを加えた。これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量を発光測定装置ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを０.１ng／mlの濃度まで測定することが可能であった。
実施例９
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖(βｈＣＧ)の測定
兎抗ヒトβｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０〜２００mIU／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去したのち、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ及びｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットル含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）２４０μｌを加え、これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させた。この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０.１mIU／mlの濃度まで測定することが可能であった。
【００１９】
比較例２
ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ng／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去したのち、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルミノールを５.６×１０^-5モル／リットル、ｐ−ヨードフェノールを１０^-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌを加え、これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させた。この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを２.０ng／mlの濃度まで測定することが可能であった。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の化学発光試薬は、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有することを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸などを標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原などを、ウェスタンプロット法により蛋白質を、そしてサザーン及びノーザンプロット法により酵素標識核酸プローブを用いてＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を、それぞれ特異的に、かつ高感度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例７記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトＡＦＰ測定用の検量線である。
【図２】図２は、実施例８記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトＰＲＬ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトＰＲＬ測定用の検量線である。
【図３】図３は、実施例９記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線である。
【図４】図４は、比較例２記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトＡＦＰ測定用の検量線である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel chemiluminescent reagent and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a chemiluminescent reagent used for detection and quantification of various substances by chemiluminescence analysis as a chemiluminescent reagent capable of controlled chemiluminescence and a method for efficiently producing the same. It is.
[0002]
[Prior art]
In chemiluminescence analysis, the chemiluminescent substance becomes excited through an intermediate due to the catalytic activity of the enzyme, and the amount of luminescence emitted when returning from this state to the ground state is measured to quantify the enzyme activity. Analytical method for quantifying the amount of substances that have a correlation with the light source. Since the chemiluminescent substance emits light by a chemical reaction, no light source is required, and there is no increase in the background caused by the light source, so the measurement is highly sensitive. Is possible. Therefore, a substance that can specifically bind to the substance to be measured is enzyme-labeled, a complex of this enzyme-labeled substance and the substance to be measured is formed, and then the activity of the labeled enzyme in this complex is measured. Various analytical methods for measuring a substance to be measured have been developed.
Thus, analysis methods using an enzyme as a labeling substance include, for example, an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction, a nucleic acid hybridization assay method using nucleic acid complementation, and avidin-biotin, hormone-hormone A method using a specific affinity such as a receptor or sugar-lectin is known. Examples of the enzyme used for chemiluminescence analysis include peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucosoxidase, dehydrogenase and the like. Peroxidase is preferably used in terms of ease of handling and availability. A chemiluminescent system using luminol as a chemiluminescent substance and p-iodophenol as a luminescence enhancer has been developed. However, in this chemiluminescent system, the measurement sensitivity of peroxidase activity in a low concentration region is not always sufficient. Absent.
Also, lucigenin (N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate), which has been used for a long time as a chemiluminescent reagent, exhibits faint light in an alkaline aqueous solution, It is known that when added, it emits intensely and is used for various microanalysis. However, since this lucigenin emits light quantitatively in the presence of hydrogen peroxide and alkali, it can be used for the determination of hydrogen peroxide, but the enzyme activity is measured by the amount of light emitted by controlling the light emission by this reaction. There is a problem that it is difficult to use the chemiluminescence analysis method. As a means to solve this problem, chemiluminescence depending on the concentration of the substance to be measured by using glucose oxidase as the labeling enzyme and allowing hydrogen peroxide produced by the glucose oxidation reaction to act on lucigenin in the presence of alkali. The method of performing is carried out.
However, the chemiluminescence analysis method using glucose oxidase as the labeling enzyme requires complicated preparation of the reagent and the operation of the luminescence system. Therefore, it should be used for chemiluminescence analysis using peroxidase with hydrogen peroxide as the labeling enzyme. Therefore, development of an inexpensive and highly sensitive chemiluminescent material that can be used has been desired.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Under such circumstances, the present invention provides a novel chemiluminescence reagent that is inexpensive and sensitive, which emits light depending on the amount of peroxidase in the presence of hydrogen peroxide and can be used for measurement of peroxidase activity. It was made for the purpose of providing.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
  As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have determined that N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivatives having a specific structure and N, N′-disubstituted The reaction mixture obtained by reducing -9,9'-bisacridinium salts does not react with hydrogen peroxide under certain alkaline pH conditions, but in the presence of hydrogen peroxide and peroxidase It has been found that the object can be achieved by chemiluminescence depending on the amount of the compound, and using these as chemiluminescence reagents, and the present invention has been completed based on this finding.
  That is, the present invention
(1) General formula [1]
[Chemical 6]

(R in the formula¹And R²Are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶Are the same or different hydrogen atoms, halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, alkoxy groups or aryloxy groups.
A chemiluminescent reagent for measuring peroxidase, comprising an N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative represented by the formula:
(2) The chemiluminescence for peroxidase measurement according to (1), wherein the N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative is N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine. reagent,
(3) General formula [2]
[Chemical 7]

(R in the formula¹And R²Are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶Are the same or different hydrogen atoms, halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, alkoxy groups or aryloxy groups, X^n-Is an n-valent anion, n is 1 or 2)
And a reaction mixture obtained by reducing a N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the following formula using a reducing agent in a solvent:For peroxidase measurementChemiluminescent reagents,
(4) The N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt is N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate as described in (3) Chemiluminescent reagent for peroxidase measurement,
(5) In the solvent, the general formula [2]
[Chemical 8]

(R in the formula¹And R²Are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶Are the same or different hydrogen atoms, halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, alkoxy groups or aryloxy groups, X^n-Is an n-valent anion, n is 1 or 2)
The N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the formula is reduced using lithium aluminum hydride, lithium boron hydride or sodium boron hydride as a reducing agent. The general formula [1]
[Chemical 9]

(R in the formula¹~ R⁶Has the same meaning as above)
N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivatives represented byFor peroxidase measurementProduction method of chemiluminescent reagent,
(6) In the solvent, the general formula [2]
Embedded image

(R in the formula¹And R²Are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶Are the same or different hydrogen atoms, halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, alkoxy groups or aryloxy groups, X^n-Is an n-valent anion, n is 1 or 2)
The N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the following formula is reduced using lithium aluminum hydride, lithium boron hydride or sodium boron hydride as a reducing agent, and then remains. Comprising a reaction mixture characterized in that the reducing agent is decomposed and then the decomposition products are removedFor peroxidase measurementProduction method of chemiluminescent reagent,
(7) No. (5) or (6) wherein the N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt is N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate )Of chemiluminescent reagent for peroxidase measurementProduction method,
(8) Item (5), (6) or (7), wherein the reducing agent is lithium aluminum hydridePeru Of chemiluminescent reagent for xidase measurementManufacturing method, and
(9) The solvent according to any one of (5) to (8), wherein the solvent is a cyclic etherOf chemiluminescent reagent for peroxidase measurementProduction method,
Is to provide.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The chemiluminescent reagent [1] of the present invention, N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative (hereinafter sometimes abbreviated as bisdihydroacridine derivative of the present invention), has the general formula [ 1]
Embedded image

It has the structure represented by these.
In this general formula [1], R¹And R²Are each an alkyl group having 1 to 14 carbon atoms, an aryl group or a halogenated aryl group. Here, the alkyl group having 1 to 14 carbon atoms may be linear or branched, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group. , Sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group and the like. As the aryl group, those having 6 to 14 carbon atoms are preferable, and a phenyl group is particularly preferable. Moreover, as a halogenated aryl group, a C6-C14 thing is preferable, and especially the phenyl group by which the halogen atom of the fluorine atom, the chlorine atom, the bromine atom, and the iodine atom was introduce | transduced on the ring 1 or 2 or more. Is preferred. There is no restriction | limiting in particular about the bonding position of the halogen atom in this halogenated aryl group. R¹And R²May be the same or different.
[0006]
On the other hand, R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶Are a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group or an aryloxy group, respectively. Here, examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom. As the alkyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 14 carbon atoms is preferable.¹And R²The same thing as what was illustrated in description of a C1-C14 alkyl group of these can be mentioned. As the aryl group, those having 6 to 14 carbon atoms are preferable, and examples thereof include a phenyl group, a tolyl group, a biphenyl group, a naphthyl group, and an anthryl group, and the alkoxy group is a straight chain having 1 to 14 carbon atoms or A branched alkoxy group is preferable, and examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, a butoxy group, a pentoxy group, a hexoxy group, and an octoxy group. As the aryloxy group, those having 6 to 14 carbon atoms are preferable, and examples thereof include a phenyloxy group and a tolyloxy group. This R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶May be the same or different.
Examples of such N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivatives represented by the general formula [1] include N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine, N, N′-diethyl-9,9′-bisdihydroacridine, N, N′-diphenyl-9,9′-bisdihydroacridine, N, N′-di-m-chlorophenyl-9,9′-bisdihydro Although acridine etc. are mentioned, of course, it is not limited to these. Among these, N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine is particularly preferable.
On the other hand, the chemiluminescent reagent [2] has the general formula [2].
Embedded image

And a reaction mixture obtained by reducing the N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the following formula in a solvent using a reducing agent.
In the general formula [2], R¹~ R⁶Is R in the general formula [1]¹~ R⁶Is the same. X^n-Is an n-valent anion, and n is 1 or 2. X^n-Examples of these are various halogen ions (F^-, Cl^-, Br^-, I^-), NO_Three ^-, ClO_Four ^-, SO_Four ^2-, CO_Three ^2-Inorganic anions such as CH_ThreeCOO^-, CH_ThreeSO_Four ^-, C₂H_FiveSO_Four ^-And organic ions such as p-toluenesulfonic acid ion.
Examples of N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the general formula [2] include N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridyl Nium salt, N, N′-diethyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N′-diphenyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N′-di-m-chlorophenyl- Although 9,9'-bisacridinium salt etc. are mentioned, of course, it is not limited to these. Of these, N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate is particularly preferred.
[0007]
Next, a method for producing an N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative that is the chemiluminescent reagent [1] of the present invention will be described.
The bisdihydroacridine derivative of the present invention can be produced by any method, but according to the method of the present invention shown below, it can be produced efficiently. In the production method of the present invention, the N, N′-bis-substituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the general formula [2] is reduced in a solvent using a reducing agent. Thus, the corresponding N, N′-bis-substituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative represented by the general formula [1] can be obtained efficiently.
Examples of N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the general formula [2] are N, N′-dimethyl-9,9′- Bisacridinium salt, N, N′-diethyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N′-diphenyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N′-di-m -Chlorophenyl-9,9'-bisacridinium salt and the like may be mentioned, but of course not limited thereto. Of these, N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate is particularly preferred.
On the other hand, according to the method of the present invention, the chemiluminescent reagent [2] of the present invention comprises N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the general formula [2], After the reduction treatment using a reducing agent, the remaining reducing agent is decomposed, and then the decomposition product is removed to obtain a reaction mixture. The N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the general formula [2] are the same as described above.
Examples of the reducing agent used in the method for producing the chemiluminescent reagents [1] and [2] of the present invention include lithium aluminum hydride, lithium boron hydride, sodium boron hydride and the like. Among these, In particular, lithium aluminum hydride is suitable. These reducing agents may be used alone or in combination of two or more. The reaction solvent is not particularly limited as long as it is substantially inert to the reaction reagent and has solubility or dispersibility in the reaction reagent. For example, cyclic solvents such as tetrahydrofuran and dioxane are used. Ethers are preferred. This reaction solvent may be used alone or in combination of two or more.
[0008]
The reaction temperature is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the raw materials to be used, the reducing agent and the type of solvent, etc., but is generally −10 to 150 ° C., preferably 0 to 120 ° C., particularly preferably 20 It is the range of -90 degreeC. The reaction time varies depending on the types of raw materials, reducing agents and solvents used, reaction temperature, and the like, and cannot be determined generally, but is usually 1 minute to 1 day, preferably 10 minutes to 12 hours, particularly preferably 30 minutes to 5 minutes. It is a range of time.
In this way, N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivatives corresponding to the starting N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are produced. After completion of the reaction, excess reducing agent in the reaction mixture is hydrolyzed and solids are filtered off. The pH of the filtrate is adjusted to a desired value, and this N, N′-disubstituted-9,9 is obtained. The '-bisdihydroacridine derivative solution may be used as a chemiluminescent reagent as it is, or after filtering the solid, the target N, N'-disubstituted-9,9'-bisdihydro The acridine derivative may be isolated according to a conventional method and used as a chemiluminescent reagent.
Since the chemiluminescent reagents [1] and [2] of the present invention react and emit light in the presence of hydrogen peroxide and peroxidase under basic conditions, this reaction can be used to detect hydrogen peroxide and quantify peroxidase. By using peroxidase as a labeling substance, it can be further used for quantification of various substances.
[0009]
The chemiluminescent reagents [1] and [2] of the present invention emit light in an amount depending on the concentration of peroxidase in the presence of excess hydrogen peroxide under basic conditions of pH 7.5 to 13. It is recognized that this luminescence is enhanced by a luminescence enhancer such as a phenolic compound. Examples of such phenolic compounds include p-hydroxycinnamic acid, p-phenylphenol, p- (4-chlorophenyl) phenol, p- (4-bromophenyl) phenol, p- (4-iodophenyl) phenol, Examples include p-iodophenol, p-bromophenol, p-chlorophenol, 6-hydroxybenzothiazole, 2-naphthol, and firefly luciferin. Of these, p-iodophenol, p-phenylphenol and 6-hydroxybenzothiazole are preferred. These phenolic compounds may be used alone or in combination of two or more.
When the chemiluminescent reagent [1] of the present invention is used, it is produced as an N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative and when the chemiluminescent reagent [2] is used. Preferably in terms of N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts which are starting materials of^-6~ 1 mol / liter, more preferably 10^-Four-10^-2It is used at a concentration in the range of mol / liter, and the amount used is generally 10 to 500 μl, preferably 50 to 300 μl. Furthermore, the usage-amount of the said luminescence enhancer is 0.01-100 times mole normally with respect to the chemiluminescent reagent of this invention, Preferably it is good to choose in the range of 0.1-10 times mole. The concentration is 10^-6The range of ˜1 mol / liter is preferred, especially 10^-Four-10^-2A range of mol / liter is preferred.
The amount of hydrogen peroxide used in this chemiluminescent reaction is not particularly limited as long as it is a sufficiently excessive amount with respect to the chemiluminescent reagent of the present invention. It is advantageous to select in the range of 10,000 times mole, preferably 10 to 1000 times mole. In addition, when peroxidase is used as a labeling substance and various substances are quantified by labeling antibodies, nucleic acids, etc., this peroxidase is not particularly limited, but horseradish peroxidase (HRP) is preferably used. .
Since this chemiluminescence reaction is carried out under basic conditions, a basic buffer is usually used. As this basic buffer, it can be arbitrarily selected from, for example, Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, glycine-sodium hydroxide buffer, and the like. If desired, additives such as surfactants and chelating agents can be used during the reaction.
In the chemiluminescent reagent of the present invention, its component N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative is oxidized by nascent oxygen generated by the decomposition reaction of hydrogen peroxide with peroxidase. The N, N'-disubstituted-9,9'-bisdihydroacridinium compound reacts with excess hydrogen peroxide to form an excited dioxetane structure, which is then decomposed with alkali. It is considered that acridone is generated and returns to the ground state to emit light.
[0010]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by these examples.
Example 1
Preparation of chemiluminescent reagents
1 mg of lucigenin was placed in a test tube, and 150 μl of N, N-dimethylformamide was added thereto and dissolved, and then added to 1 ml of tetrahydrofuran with stirring to finely disperse lucigenin in tetrahydrofuran. Next, 150 mg of lithium aluminum hydride powder was added thereto and stirred at room temperature for 6 hours for reduction treatment, and then the reaction mixture was poured into deionized water little by little under ice-cooling to excess hydrogenation. Lithium aluminum was decomposed. Next, the produced precipitate such as aluminum hydroxide is filtered off, and then the pH of the filtrate is adjusted to 7.0 with 1N hydrochloric acid to thereby remove the N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine solution. Obtained 2.5 g of the chemiluminescent reagent.
As a result of analyzing this solution by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the solution was a 0.018 wt% solution of N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine. Yield 62%.
Example 2
Preparation of chemiluminescent reagents
Take 1 mg of lucigenin in a test tube, add 150 μl of N, N-dimethylformamide to dissolve it, add to 1 ml of 1,4-dioxane with stirring, and finely disperse lucigenin in 1,4-dioxane. It was. Next, 150 mg of lithium aluminum hydride powder was added thereto and stirred at 80 ° C. for 2 hours for reduction treatment, and then the reaction mixture was poured into methanol in small portions under ice cooling to give an excess amount of lithium hydride. Aluminum was decomposed. Next, the produced precipitate was filtered off, and then the solvent was distilled off from the filtrate under reduced pressure to obtain 0.7 mg of a chemiluminescent reagent comprising a solid.
The solid was analyzed by high performance liquid chromatography. As a result, it was confirmed that the solid was 65% by weight of N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine. Yield 62%.
[0011]
Example 3
Preparation of chemiluminescent reagents
Take 1 mg of lucigenin in a test tube, add 150 μl of N, N-dimethylformamide to dissolve it, add to 1 ml of 1,4-dioxane with stirring, and finely disperse lucigenin in 1,4-dioxane. It was. Next, 150 mg of lithium aluminum hydride powder was added thereto and stirred for 2 hours at 80 ° C., followed by reduction treatment. The reaction mixture was poured into deionized water little by little under ice-cooling to excess hydrogenation. Lithium aluminum was decomposed. Next, the produced precipitate such as aluminum hydroxide is filtered off, and then the pH of the filtrate is adjusted to 7.0 with 1N hydrochloric acid to thereby remove the N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine solution. Obtained 2.5 g of the chemiluminescent reagent.
As a result of analyzing this solution by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the solution was a 0.02% by weight solution of N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine. Yield 68%.
Example 4
Measurement of peroxidase activity
N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine (obtained in Example 1) 4.0 × 10^-6Mol / liter, 10 p-iodophenol^-3100 μl of 0.1 mol / l Tris-HCl buffer (pH 8.4) contained at a concentration of mol / l is mixed with 50 μl of horseradish peroxidase (HRP) aqueous solution of various concentration levels, and 0.000034 wt% When 50 μl of an aqueous hydrogen peroxide solution was added and the amount of luminescence was integrated for 0 to 5 seconds using a luminometer (Luminus CT-9000D manufactured by Diatron), the HRP was 5 × 10^-19It was measurable to mol / assay.
Example 5
Measurement of peroxidase activity
10 μl of a solution obtained by diluting the chemiluminescence reagent prepared in Example 3 10-fold with 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4), and p-iodophenol 10^-350 μl of HRP aqueous solution of various concentration levels was mixed with 100 μl of 0.1 mol / l Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing at a concentration of mol / l, and 0.0003% by weight peroxidation was added thereto. As a result of adding 50 μl of an aqueous hydrogen solution and integrating the amount of luminescence for 0 to 5 seconds with a luminometer (Luminous CT-9000D manufactured by Diatron), the HRP was 5 × 10 5 as shown in Table 1.^-19It was possible to measure up to mol / assay.
[0012]
[Table 1]

[0013]
Example 6
Measurement of peroxidase activity
4.0 × 10 5 N, N′-dimethyl-9,9′-bisdihydroacridine (obtained in Example 1)^-Five10 mol / liter and p-phenylphenol^-3100 μl of 0.1 mol / l Tris-HCl buffer (pH 8.4) contained at a concentration of mol / l is mixed with 50 μl of HRP aqueous solution of various concentration levels, and 50 μl of 0.0033 wt% aqueous hydrogen peroxide solution is mixed therewith. As a result of integrating the luminescence amount for 0 to 5 seconds with a luminometer (Luminus CT-9000D manufactured by Diatron), the HRP was 5 × 10 5 as shown in Table 2.^-19It was possible to measure up to mol / assay.
[0014]
[Table 2]

[0015]
Comparative Example 1
Luminol (3-aminophthalic acid hydrazide) 5.6 × 10^-Five10 mol / l and p-iodophenol^-3100 μl of 0.1 mol / l Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing at a concentration of mol / l was mixed with 50 μl of HRP aqueous solution of various concentration levels, and then mixed with 50 μl of 0.0033 wt% aqueous hydrogen peroxide solution. As a result of integrating the amount of luminescence for 0 to 5 seconds with a luminometer (Diatron Luminous CT-9000D), 10 HRP as shown in Table 3 was added.^-17It was observed that it was possible to measure up to mol / assay.
[0016]
[Table 3]

[0017]
Reference example 1
Production of polyclonal antibody immobilized on insoluble carrier
A solution prepared by dissolving a polyclonal antibody derived from sputum having specific reactivity with an antigen in 10 mmol / liter phosphate buffered saline (pH 7.4) (PBS) at a concentration of 10 mg / ml was added to a white microplate (lab system 0.1 ml to each well and left at 37 ° C. for 1 hour, washed with PBS, then added with 0.3 ml of 1% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution at 37 ° C. A post-coating treatment was performed by allowing to stand at temperature for 1 hour to obtain a polyclonal antibody-immobilized white microplate.
Reference example 2
Production of peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibodies
To a 1 ml solution of a monoclonal antibody derived from a mouse having specific reactivity to an antigen dissolved in 10 mmol / liter phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) at a concentration of 1.0 mg / ml, N- ( 0.1 ml of a 10 mg / ml dimethylformaluminum solution of m-maleimidobenzoic acid) -N-succinimide ester (MBS) was added and reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Next, this reaction mixture was subjected to gel filtration with a 0.1 mol / liter phosphate buffer (pH 6.0) using a column packed with Sephadex G-25, and the maleimidated monoclonal antibody and unreacted MBS were separated. separated.
On the other hand, to a 1.0 mg / ml PBS solution of horseradish peroxidase (HRP) as a peroxidase enzyme, an ethanol solution of 10 mg / ml concentration of N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) was added, The reaction was performed at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Then, this reaction mixture was purified by gel filtration with 10 mmol / liter acetate buffer (pH 4.5) using a column packed with Sephadex G-25, and a fraction containing pyridyl disulfide HRP was collected. After that, it was concentrated about 10 times in a collodion bag under ice cooling. Next, 1 ml of 0.1 mol / liter acetate buffered saline (pH 4.5) containing 0.1 mol / liter dithiothreitol was added thereto, and the mixture was stirred at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. After reducing the pyridyl disulfide group introduced into the molecule, the reaction mixture was subjected to gel filtration using a column packed with Sephadex G-25 to obtain a fraction containing thiolated HRP.
Next, the maleimidated monoclonal antibody and thiolated HRP were mixed, concentrated to a protein concentration of 4 mg / ml under ice-cooling using a collodion bag, and allowed to stand at 4 ° C. overnight, after which Ultrogel AcA44 (SEPRACOR) was used. Gel filtration was performed using a packed column to obtain a peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibody.
[0018]
Example 7
Measurement of α-fetoprotein (AFP) by simultaneous sandwich method CLEIA
(2) 50 μl of 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified human AFP (standard substance) in the range of 0 to 800 ng / ml on a white microplate immobilized with anti-human AFP polyclonal antibody and peroxidase enzyme labeling 100% of a 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing a mouse anti-human AFP monoclonal antibody at a concentration of about 3 μg / ml was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, after removing the solution in the well by suction, the well was washed with physiological saline, and then the chemiluminescent reagent prepared in Example 3 was added to each well with 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4). 10 μl of a 10-fold diluted solution with p-iodophenol^-3240 μl of 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing a concentration of mol / liter was added, and 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8) of 0.0033 wt% hydrogen peroxide was added thereto. .4) Inject 50 μl to emit light, measure this amount of light by integrating it with a luminometer (Diatron Luminous CT-9000D) for 0-5 seconds, and plot this value against the standard concentration. Thus, a calibration curve having a good concentration dependency shown in FIG. 1 was obtained. Using this calibration curve, it was possible to measure human AFP in serum samples up to a concentration of 0.05 ng / ml.
Example 8
Measurement of prolactin (PRL) by simultaneous sandwich method CLEIA
(2) 50 μl of 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified human PRL (standard substance) in the range of 0 to 200 ng / ml on a white microplate on which anti-human PRL polyclonal antibody is immobilized and peroxidase enzyme labeling 100% of 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing mouse anti-human PRL monoclonal antibody at a concentration of about 2 μg / ml was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, the solution in the well was removed by suction and washed with physiological saline, and then the chemiluminescent reagent prepared in Example 3 was added to each well with 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4). 10 μl of the diluted solution and 10 parts of p-iodophenol^-3240 μl of 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing mol / liter was added. 50 μl of 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer solution (pH 8.4) of 0.0033 wt% hydrogen peroxide was injected into this to emit light, and the amount of luminescence was measured by a luminometer (luminous CT manufactured by Diatron). -9000D) was integrated and measured for 0 to 5 seconds, and this value was plotted against the standard substance concentration to obtain a calibration curve with good concentration dependence shown in FIG. Using this calibration curve, it was possible to measure human prolactin in serum samples up to a concentration of 0.1 ng / ml.
Example 9
Measurement of human chorionic gonadotropin β chain (βhCG) by simultaneous sandwich method CLEIA
A white microplate immobilized with anti-human βhCG polyclonal antibody, 50 μl of 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified βhCG (standard substance) in the range of 0 to 200 mIU / ml, and peroxidase enzyme-labeled mice 100% of 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing anti-βhCG monoclonal antibody at a concentration of about 2 μg / ml was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, after removing the solution in the well by suction, the well was washed with physiological saline, and then the chemiluminescent reagent prepared in Example 3 was added to each well with 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4). 10 μl of a 10-fold diluted solution and 10% p-iodophenol.^-3240 μl of 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 0.1 mol / liter of tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 0.0033 wt% hydrogen peroxide was added. 50 μl was injected to emit light. This luminescence amount was measured by integrating for 0 to 5 seconds with a luminometer (Diatron Luminous CT-9000D), and this value was plotted against the standard substance concentration. A good calibration curve was obtained. Using this calibration curve, it was possible to measure βhCG in serum samples up to a concentration of 0.1 mIU / ml.
[0019]
Comparative Example 2
Determination of α-fetoprotein (AFP) by simultaneous sandwich method CLEIA using luminol
(2) 50 μl of 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified human AFP (standard substance) in the range of 0 to 800 ng / ml on a white microplate immobilized with anti-human AFP polyclonal antibody and peroxidase enzyme labeling 100% of a 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing a mouse anti-human AFP monoclonal antibody at a concentration of about 3 μg / ml was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, the solution in the well is removed by suction, washed with physiological saline, and luminol is added to each well at 5.6 × 10 6.^-FiveMol / liter, 10 p-iodophenol^-3100 μl of 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing at a concentration of mol / liter was added, and 0.1 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8) of 0.0033 wt% hydrogen peroxide was added thereto. .4) 50 μl was injected to emit light. This luminescence amount is measured by integrating for 0 to 5 seconds with a luminometer (Diatron Luminous CT-9000D), and this value is plotted against the standard substance concentration, whereby the concentration dependency shown in FIG. 4 is obtained. A calibration curve was obtained. Using this calibration curve, it was possible to measure human AFP in serum samples up to a concentration of 2.0 ng / ml.
[0020]
【The invention's effect】
The chemiluminescent reagent of the present invention can detect a peroxidase enzyme with high sensitivity by utilizing the property of chemiluminescence depending on the concentration of peroxidase in the presence of hydrogen peroxide and peroxidase. Furthermore, using enzyme-labeled products labeled with antigens, antibodies, nucleic acids, etc. with peroxidase as a labeling substance, antibodies, antigens, etc. are labeled by enzyme immunoassay, proteins are labeled by Western plotting, and enzymes are labeled by Southern and Northern plotting. Nucleic acids such as DNA and RNA can be measured specifically and with high sensitivity using a nucleic acid probe.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a calibration curve for human AFP measurement prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 7 as a function of the concentration of human AFP (standard substance). is there.
FIG. 2 is a calibration curve for human PRL measurement prepared by plotting the chemiluminescence amount chemiluminescent using the reaction system described in Example 8 as a function of the concentration of human PRL (standard substance). is there.
FIG. 3 is a calibration curve for βhCG measurement prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 9 as a function of the concentration of βhCG (standard substance).
FIG. 4 is a calibration curve for measuring human AFP prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Comparative Example 2 as a function of the concentration of human AFP (standard substance). is there.

Claims (9)

General formula [1]

(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are the same or different hydrogens, respectively. An atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group or an aryloxy group)
A chemiluminescent reagent for measuring peroxidase, which comprises a N, N′-disubstituted-9,9′-bisdihydroacridine derivative represented by the formula:   The chemiluminescent reagent for measuring peroxidase according to claim 1, wherein the N, N'-disubstituted-9,9'-bisdihydroacridine derivative is N, N'-dimethyl-9,9'-bisdihydroacridine. General formula [2]

(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are the same or different hydrogens, respectively. An atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group or an aryloxy group, X ⁿ⁻ is an n-valent anion, and n is 1 or 2)
A chemiluminescent reagent for measuring peroxidase comprising a reaction mixture obtained by reducing a N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by formula (1) in a solvent using a reducing agent .   The chemiluminescence for peroxidase measurement according to claim 3, wherein the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt is N, N'-dimethyl-9,9'-bisacridinium dinitrate. reagent. In the solvent, the general formula [2]

(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are the same or different hydrogens, respectively. An atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group or an aryloxy group, X ⁿ⁻ is an n-valent anion, and n is 1 or 2)
The N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the formula is reduced using lithium aluminum hydride, lithium boron hydride or sodium boron hydride as a reducing agent. The general formula [1]

(Wherein R ^{1 to} R ⁶ have the same meaning as described above)
The manufacturing method of the chemiluminescent reagent for a peroxidase measurement which consists of a N, N'- disubstituted 9,9'-bis dihydroacridine derivative represented by these. In the solvent, the general formula [2]

(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different alkyl groups having 1 to 14 carbon atoms, aryl groups or halogenated aryl groups, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are the same or different hydrogens, respectively. An atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group or an aryloxy group, X ⁿ⁻ is an n-valent anion, and n is 1 or 2)
The N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the following formula is reduced using lithium aluminum hydride, lithium boron hydride or sodium boron hydride as a reducing agent, and then remains. A method for producing a chemiluminescent reagent for measuring peroxidase comprising a reaction mixture, wherein the reducing agent is decomposed and then the decomposition product is removed. 7. The peroxidase measurement according to claim 5, wherein the N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt is N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate . A method for producing a chemiluminescent reagent . The method for producing a chemiluminescence reagent for peroxidase measurement according to claim 5, 6 or 7, wherein the reducing agent is lithium aluminum hydride. The method for producing a chemiluminescent reagent for measuring peroxidase according to any one of claims 5 to 8, wherein the solvent is a cyclic ether.

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