JP3796271B2 - 試料中の標的物質の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、検出対象としての標的物質の存在下で、該標的物質を介在する相互作用に基づく変化を起す反応系を形成し得る複数の試薬を用いて標的物質を検出する方法に関し、例えば、ウイルス、微生物、動植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の所望の塩基配列の検出、同定、もしくは各種塩基配列における変異の有無の検出に有用な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の分析技術の発達により種々の変異遺伝子が数多く見つけ出され、遺伝子の変異に基づく各種遺伝病の解明も進みつつある。そのなかには、遺伝子中の塩基が部分的に欠失したものや、塩基が点突然変異を起したものがあり、それによって蛋白質に変異が生じ、さまざまな症状を引き起こすものがあることが明かにされてきている。現在のところ、これらの遺伝病は、症状が現れてから、酵素によるアッセイや、抗体を用いた免疫的な方法により発見されることが主流であるが、早期治療という観点から、重篤な症状が現れる前に遺伝子上で変異の有無を早期に発見することの重要性が指摘されている。
【０００３】
また、ＤＮＡ診断は、必ずしもヒトの遺伝子に用いられるだけでなく、感染した細菌の同定においても利用できる。
【０００４】
従来は、分離した細菌の形態学的性状および生化学的性状から、類似性に基づいて菌種を同定する方法が取られていた。この方法では、培養に時間がかかる上に、検査法の違いによって性状の判定が異なったり、どの性状に重点を置くかによって同定の結果が異なる等の問題があった。
【０００５】
そこで近年、特に、細菌感染症における原因細菌の検出や同定の分野において、、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション法を用いる試みがなされている。この方法は、細菌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出し、細菌由来の核酸のうち特定部分に着目して、その部分の塩基配列とホモロジーの高い塩基配列が、対象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイブリダイゼーション法によって調べ、サンプル中に問題となる細菌が存在するか否かを判定する方法である。
【０００６】
また、近年、核酸の特定配列の新しい検出方法として、ＰＣＲ法も用いられるようになってきている。この方法は、検出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅された特定配列の有無を検出することで、標的核酸の検出が可能となる。ＰＣＲ法を用いることで核酸の検出感度は向上し、ハイブリダイゼーション法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の検出に利用されている。
【０００７】
しかし、ＰＣＲ法では調べたい特定塩基配列が明かな場合に、その増幅に最適なプライマーを選定することにより、初めて特定配列の有無を調べることができるもので、プライマーが非特異的に標的核酸に結合したり、本来なら増幅されない配列が形成されることが多々ある。また、ある標的核酸中の欠損のような遺伝子異常は、その長さを解析することにより情報を得ることができるが、点突然変異のような長さに変化が現れないような異常に対しては知る術もないという欠点を持つ。
【０００８】
したがって、ハイブリダイゼーション法が完全にＰＣＲ法に置き換えられるというわけではなく、ハイブリダイゼーション法による簡便な遺伝子検出法もやはり必要とされる。
【０００９】
ハイブリダイゼーション反応では、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとがお互いの相補的な配列部分で水素結合によりハイブリッド体を形成する。ハイブリダイゼーション反応において、相補的な配列間で正確にハイブリッド体を形成させるためには、反応の温度、イオン強度を最適に選ぶ必要がある。つまり、温度が高すぎると、プローブと相補的配列をもつ核酸とが結合できず、逆に低すぎると、プローブが非特異的に核酸に結合してしまう。さらに、より正確さを期すために、溶液の塩濃度を下げて、あるいは、溶液の温度を上げて、不安定な水素結合を除き、非特異的に結合したプローブやミスマッチしているプローブを洗い流すことが重要となる。従って、適当な反応条件、洗浄条件の設定には、かなりの試行錯誤が必要になる。
【００１０】
遺伝子診断では、ハイブリッド体形成反応、及び、洗いの条件設定に、一塩基対レベルのミスマッチをも除去する精度が更に要求される。
【００１１】
ハイブリダイゼーション反応は、従来は標的核酸をニトロセルロースのような担体に固定させた状態で行われてきた。しかし、この方法は極めて操作が煩雑であるため、溶液中でのハイブリダイゼーションのような簡便な方法の開発が期待されてきた。従来のような核酸の固定化を行わない方法における最大の課題は、標的核酸に結合しているプローブと、結合していない過剰なプローブをどのようにして区別するか（Ｂ／Ｆ分離）というところにある。さらに、この場合にも、上述の固定化核酸を用いたハイブリダイゼーション反応と同様に、プローブの非特異的吸着やミスマッチを除くための適当な反応条件、洗浄条件設定が重要な課題となる。
【００１２】
Ｂ／Ｆ分離を行わずに標的核酸とプローブとのハイブリッド体を検出するための方法としては、蛍光偏光解消法を用いた検出方法がいくつか提案されている（特開平２−２９５４９６号公報、特開平２−７５９５８号公報等参照）。これらの方法は、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡプローブを、分析検体中のＤＮＡと接触させて二本鎖ＤＮＡを形成させ、二本鎖形成前の蛍光偏光と二本鎖形成後の蛍光偏光との変異を測定して検体中のＤＮＡに、プローブの塩基配列に対応する塩基配列が存在するかどうかを検出する方法である。この方法は、一本鎖のプローブに結合させた蛍光物質が、二本鎖になったことによって動きにくくなり、蛍光異方性が増大することがその検出の原理となっている。
【００１３】
ところが、これらの方法では、検体中に蛋白質等の夾雑物が含まれていて、それがプローブＤＮＡに非特異的に吸着すると、ハイブリッド体検出のバックグランドを上昇させる原因となるため、あらかじめこれらの夾雑物を完全に除去するという煩雑な作業が必要となる。また、プローブＤＮＡの非特異的吸着、及び、塩基のミスマッチによる擬ハイブリッド体は他の溶液系の場合、それをあらかじめ除去する操作が必要である。さらに、確かにＢ／Ｆ分離は必要ないもののプローブ濃度が標的ＤＮＡ濃度と同程度であることが蛍光の変異を測定する上で必要となる。
【００１４】
エネルギー移動を利用したハイブリッド体検出方法として、Ｇａｒｄｕｌｌｏらは３通りの方法を提案している（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８７９０−８７９４）。これらはいずれもエネルギー供与体としてフルオレセイン、アクリジンオレンジ、エネルギー受容体としてローダミンを用いたもので、（ｉ）５’をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドとそれに相補的で５’をローダミンで標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、（ｉｉ）５’をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドのそれぞれ相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、（ｉｉｉ）５’をローダミンで標識したオリゴヌクレオチドのアクリジンオレンジ存在下での相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションである。この方法は、近接する蛍光発色団の励起光と蛍光が重なり合っている場合に、供与体の励起状態エネルギーが近接する受容体に転移される現象であり、その結果として供与体の寿命の減少、供与体の蛍光のクエンチング及び受容体の蛍光強度の増強などが見られる。ハイブリダイゼーションの有無を溶液のまま判定できるという点では一連の煩雑な操作を一挙に省ける点で画期的な方法といえるが、感度的に既存のハイブリダイゼーンに比べて数オーダー低く、実用化のためには蛍光団の改良や検出系の飛躍的な進歩が望まれていた。
【００１５】
また、最近、ＤＮＡの二本鎖に二種類の色素を遊離の状態で混合した時に、これらの色素間でＤＮＡを介した電荷移動が検出されたという報告がある（Ｊ．Ａｍｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．，１９９２，１１４，３６５６−３６６０）。それは、蛍光を持つ電子供与体（エチジウムブロマイドあるいはアクリジンオレンジ）にそれぞれの励起波長に対応する波長の光を照射すると、もうひとつの色素（電子受容体：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，７−ｄｉａｚａｐｙｒｅｎｉｕｍ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）存在下では、その蛍光強度が減少するというもので、両色素がインターカレーターと考えられていることから電子がＤＮＡの二重らせんを介して電子供与体から電子受容体の方へ流れているというものである。しかし、その変化の程度は非常に小さいものであり、ハイブリッド体の検出に利用しうるほどの感度ではない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来のような標的核酸を固定したハイブリダイゼーション法はもちろん、Ｂ／Ｆ分離を必要としない蛍光偏光解消のような方法においても、プローブの非特異的吸着やミスマッチの発生を防止する、あるいは発生した非特異的吸着やミスマッチを除去するための煩雑な処理が必要である場合が多い。しかも、これらの操作の最適条件はプローブの長さ、あるいはそれぞれの塩基配列によって異なるため、それぞれの場合で条件を検討し、設定していく必要がある。特に、ミスマッチしている塩基のプローブ上の位置もハイブリッド体の安定性に影響を与える重要な因子となり、その位置によってはミスマッチしているハイブリッド体を除去できない場合も生じるため、ミスマッチの可能性を考慮して、ハイブリダイゼーション反応の条件を個々のケースに応じて設定するという更に煩雑な作業が必要となる。
【００１７】
電荷移動、エネルギー移動を利用する溶液中の検出系は、標的核酸を固定する場合や、Ｂ／Ｆ分離を必要とする系に比べて簡便な方法ではあるものの、その感度は非常に低く、実用に供せられるほどのものではない。さらに、従来例で用いられている色素は遊離の状態でも蛍光を有し、蛍光強度の変化を検出しても、それがエネルギー供与体とエネルギー受容体（または、電子供与体と電子受容体）とのＤＮＡを介した相互作用なのか、溶液による単なるクエンチングなのか、あるいは夾雑物の存在による影響なのか判定することは困難である。
【００１８】
本発明は、以上のような従来技術における問題に鑑みなされたものであり、ハイブリッド体の検出においてＢ／Ｆ分離の必要がなく、より簡易化された工程からなり、良好な測定感度を得ることができる標的核酸の検出に好適な方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ミスマッチしているハイブリッド体が存在する場合でも所望のハイブリッド体のみを正確に検出できる標的核酸の検出に好適な方法を提供することにある。
【００１９】
本発明は、更に、イムノアッセイ等の免疫反応を利用した各種物質の検出に有用な検出系を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明の標的物質の検出方法は、標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬を、試料と反応させ、試料中に前記標的物質が存在する場合に生じる前記相互作用に基づく変化を測定することによって該試料中の標的物質を検出する方法において、前記反応系を構成する試薬の少なくとも１つがピリリウム化合物及びピリリウム類似化合物から選ばれたものであることを特徴とする。
【００２１】
本発明で利用する相互作用とは、標的物質を含む反応系を介して２つの物質が起す相互作用をいう。この相互作用としては、例えば、電荷の授受（電荷移動）やエネルギーの授受（エネルギー移動）が利用できる。電荷移動の場合は、相互作用を起す２つの物質の一方は電子供与体であり、他方は電子受容体となる。また、エネルギー移動の場合は、一方がエネルギー供与体で、他方がエネルギー受容体となる。本発明においては、このような相互作用を起す２つの物質を含む試薬群を用いて、標的物質の存在下で相互作用を起させ、それによって生じる変化を測定して標的物質を検出するものであり、この相互作用を行う反応系を構成する試薬の少なくとも１つにピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物（以下ピリリウム系化合物と総称する）を用いるものである。
【００２２】
更に、本発明における試薬間の相互作用を、イムノアッセイ等の免疫反応における検出対象物質への第１次反応体と第２次反応体の反応の際のこれらの複合体の生成に伴って生じるようにすれば、上記の試薬による反応系を免疫反応の検出に利用できる。例えば、イムノアッセイにおいて、第１次反応体及び第２次反応体の一方がエネルギー供与体あるいは電子供与体であるような試薬で標識されており、他方がこれと相補的なアクセプター（例えばエネルギー受容体あるいは電子受容体）のような試薬で標識されており、これらの免疫反応が起り、第１次反応体と第２次反応体とが結合した結果生じるドナーとアクセプターとの近接によるエネルギーの転移や電荷の移動が検出可能なシグナルを生じ、このシグナルを検出することで、免疫反応の有無を検出できる。この標識試薬の少なくとも一方としてピリリウム系化合物を用いることができる。
【００２３】
以下、標的物質として核酸二重らせん構造を検出する場合を代表例として本発明を説明するが、同様の作用により検出できるものであれば、本願発明はこれに限定されない。
【００２４】
図１及び２に、本発明で利用する相互作用を起こす反応系のモデルを電荷移動の場合を例として模式的に示す。図１のものは、標的物質３（核酸二重らせん構造）と相互作用を起す２つの試薬１、２から構成される最も単純な反応系であり、この反応系では電子供与体となる試薬１から標的物質３を介して電子受容体となる試薬２まで矢印方向に電荷移動が行われる。図２の反応系は、相互作用を起す試薬４、５に加えて、反応経路中で電荷移動を媒体する試薬６、７が更に追加されいるもので、矢印方向に電荷の移動が行われる。図示した場合を例にとれば、試薬１、２、４〜７の少なくとも１つにピリリウム系化合物が使用される。なお、試薬の数は少なくとも２種とされるが、検出における操作効率や検出感度などを考慮してその数を設定することができる。試薬６、７はいわゆるメディエーターまたはセンシタイザー等として機能するものが利用できる。更に、図２で示される反応経路の各反応物質間、例えば試薬４と６の間、試薬６と標的物質３の間などに、反応を仲介する１以上の物質が必要に応じて更に関与しても良い。従って、ピリリウム系化合物は、相互作用の反応経路を構成する試薬の少なくとも１つとして利用され、その利用する反応系での役割に応じた機能を有するものが選択され、例えば電子供与体、電子受容体、メディエーターまたはセンシタイザー等として利用される。
【００２５】
二重らせん構造と直接反応させる目的で使用する試薬、例えば図１及び２の試薬１、２、６、７はこれが二重らせん構造と特異的に結合するインターカレーター等としての性質を有するものが好ましい。この場合の試薬としては、例えば、二重らせん構造を構成している核酸等の物質と反応して、それ自身が、あるいは核酸の構成成分側が化学変化や構造的変異を起すことで、あるいは反応系に加えた第３の物質と二重らせん構造の存在下で反応して変化を起すことで検出可能な相互作用に基づく変化を引き起こすものが利用できる。
【００２６】
この直接反応としては、例えば、二重らせん構造をとる核酸の構成成分と試薬物質との間の電荷移動あるいはエネルギー移動を引き起す反応などが利用できる。電荷移動を利用する場合には、試薬物質としては、二重らせん構造特異的に挿入され核酸の構成成分に対して電子供与体または電子受容体となり得る物質が利用される。
【００２７】
この電荷移動に基づく反応としては、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｏｎｄの場合とが考えられる。前者の場合には、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介して電子供与体と電子受容体が相互作用するような場合と、二重らせん構造への変化に伴う電子供与体と電子受容体の近接効果に基づくような場合とが含まれる。後者（ｔｈｏｕｇｈ ｂｏｎｄ）では核酸を構成する塩基、リン酸部分、或は、糖の部分をも含めた電荷の移動が考えられる。いずれの場合もこの直接反応が、二重らせんを形成したことに由来するものであればその形態はなんら限定されない。
【００２８】
核酸塩基対間のスタッキングを介する場合とは、二重らせん構造と反応できる位置に置かれた電子供与体と電子受容体（例えば図１の試薬１、２）の距離が本来相互作用できないほど離れている時、電子供与体から放出された電子が、核酸塩基対上に広がる電子雲を介して、電子を次々隣接する核酸塩基対に受け渡され、最終的に電子受容体にまで電子を到達させるというものである。また、逆に、電子受容体が核酸塩基対から電子を引き抜き、それが連鎖的に行われて最終的に電子供与体から電子が奪い取られるという機構も成り立つ。つまり、電荷移動におけるメディエーターが、核酸塩基対ということになる。
【００２９】
これに対し、電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく場合とは、二重らせん構造の形成によって電子供与体と電子受容体の距離がこれらの相互作用が可能な程度に近くなる場合である。例えば、電子供与体と電子受容体の両方が存在しても、溶液中でこれらの化合物の距離が十分に離れているような一本鎖の状態のときには、これらが相互作用を起さず、標的核酸とハイブリダイズして二重らせん構造を形成して電子供与体と電子受容体が近接した場合に、これらの相互作用が生じるように設定すれば、二重らせん構造の形成をこれらの相互作用が生じたかどうかによって検出できる。なお、二重らせん構造と試薬物質での電荷移動が起りにくい場合には、先に述べたように、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエーター、あるいはセンシタイザーと称させる物質を介在させてもよい。
【００３０】
このように二重らせん構造と反応する位置に用いる試薬には、これが二重らせん構造と反応できる位置に配置されて、これらの反応が生じる必要がある。このような試薬が二重らせん構造と反応可能な位置に配置される方式としては、インターカレーターのように核酸塩基対の間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋め込まれる場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で配置される場合等が利用できる。いずれの場合も、ハイブリッド体の二重らせん構造に試薬が特異的に配置されることが本発明にとって本質的に必要なことである。
【００３１】
これらの中では、インターカレーターは、スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有利である。つまり、インターカレーターは、一般には、電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じような距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例えば、電子供与体としてインターカレーターを用い、二重らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に送られ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由して、一直線に電子受容体に向って流れ得る。あるいは、この逆に、電子受容体としてインターカレーターを用い、二重らせんを挟んだ反対側に電子受容体を配置すれば、電子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基対から電子を引き抜き、この電子の引抜きが他の核酸塩基対間に次々と生じて最終的に電子供与体から電子を引き抜き、電荷移動が行われる場合もある。これらの点を考慮すると、スタッキングを介する電荷移動の場合には、電子供与体、電子受容体のうち、少なくともひとつがインターカレーターであることが好ましく、両者が共にインターカレーターである場合には、さらに電荷移動効率を上げることが可能であるのでより好ましい。インターカレーターは二重らせん構造を安定化させ、その融解温度を上昇させることが知られており、電子供与体や電子受容体がインターカレーターであることは、プローブと標的核酸間のハイブリッド体を安定化させるという点でも有利である。
【００３２】
本発明においては、標的物質を介した相互作用に基づいた変化を測定することで標的物質の検出が行われる。この変化は、標的物質及びその検出に用いられる試薬から構成される相互作用を起す反応系の種類により異なり、その変化の検出方法も反応系の構成によって個々に異なる。例えば、相互作用を行う試薬（例えば図１及び２の試薬１、２、４、５）に電荷移動に基づく相互作用を行うものを用いた場合、二重らせん構造を介したこれら試薬の相互作用を電子受容体側の変化としてとらえて、その変化に適した手段で測定することができる。例えば、電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、あるいは、変化としてとらえることができる。また、電荷移動の結果溶液が着色あるいは変色するような系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。また、電子受容体が電子移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出するという方法も利用できる。この時、変化した物質に、後から第３の物質を加え、両者の化学反応により化学発光を起し検出することも可能である。第３の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。また、標的物質自体が検出可能な変化を起す場合は、これを検出することができる。
【００３３】
検出方法として、電子受容体の変化の他に、電子供与体側での変化で反応を検出しても良い。そして、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられる方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電子供与体して用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消失のような直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさらにいくつかの反応と組み合せて可視化する方法も利用できる。
【００３４】
このように、本発明において検出される相互作用に基づく変化は、相互作用を起す反応系を構成する各試薬や標的物質のいずれにおける変化であっても良く、その変化を直接あるいは、他の検出用の試薬を用いて間接的に測定してもよい。
【００３５】
一方、本発明では、電子供与体が光によって活性化されて電子を放出して電荷移動が開始されるものでもよく、更に、第３の物質として、電子供与体を刺激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。さらに、電子受容体の方を活性化して、それに誘起されて電子が電子供与体から引き抜かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、なんらかの開始剤であってもよい。
【００３６】
また、先に述べたように、電子供与体、電子受容体の他に、第３の物質として、電荷移動を仲介するようなメディエーター、あるいはセンシタイザーと称させる物質が仲介してもよい。そして、これらの物質が二重らせんと相互作用し、直接二重らせんとは結合していない電子供与体、電子受容体に電荷移動を促しても良い。
【００３７】
プローブ核酸とのハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出の場合には、相互作用に基づく変化は、例えば、所望のハイブリッド体形成前後における試薬を構成するピリリウム系化合物やピリリウム系化合物以外の化合物、あるいは標的物質である核酸の構成成分の化学構造や特性の変化、電子状態の変化、或いはまた、この相互作用により変化した物質に由来する信号の変化として測定、検出される。
【００３８】
電子供与体と電子受容体を用いる形態としては、例えば以下のものを挙げることができる。
（ｉ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時に反応系に存在させる。
（ｉｉ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成後に反応系に添加する。
（ｉｉｉ）これらの一方を、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時に反応系に存在させておき、その後に他方を添加する。
【００３９】
相互作用としてエネルギー移動を利用する場合には試薬には、少なくともエネルギー供与体とエネルギー受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後におけるエネルギー受容体、エネルギー供与体、または、これらの物質と相互作用しうる第３の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、あるいはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。例えば、エネルギー供与体の蛍光強度の減少、エネルギー受容体の蛍光強度の増大によりハイブリッド体を検出することができる。このような場合には、ハイブリッド体の二本鎖部分にエネルギー供与体とエネルギー受容体がインターカレート等の様式により入り込み、溶液中の場合に比べて両者が近接し、相互作用が可能になってエネルギー移動が起こると考えられる。
【００４０】
エネルギー供与体、エネルギー受容体を用いる様式としては、電子供与体、電子受容体と同様な（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の様式がそのまま利用できる。エネルギー移動開始剤としては主に光が利用される。
【００４１】
ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出に本発明の方法を利用する場合のプローブの長さは、標的核酸との良好なハイブリダイゼーションが可能で、安定した二重らせん構造が得られる長さが個々のケースにおいて適宜選択される。電子供与体、あるいは電子受容体、またはエネルギー供与体、あるいはエネルギー受容体等としての試薬（例えば図１、２における試薬１、２、６、７）が核酸塩基と直接相互作用するために必要な安定した二重らせん構造が可能な長さであれば良く、その長さは、例えば、８塩基以上、好ましくは１２塩基以上とされる。
【００４２】
しかしながら、二重らせん構造の安定化には、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列ではより安定な二重らせん構造が形成される。また、ＫＣｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。また、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与する。従って、これらの安定化因子を適宜利用することによって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能である。
【００４３】
また、電子供与体、電子受容体、あるいはエネルギー供与体、エネルギー受容体の性質もプローブ選定上考慮しなければならない因子である。これらの試薬物質が二重らせんのどの配列にも同じ確立で入り込むという保証はない。Ｇ−Ｃ塩基対を好むものと、Ａ−Ｔ塩基対を好むもの等それぞれの試薬によりその性質は異なる。したがって、プローブの配列選定にはプローブと標的核酸とで構成される二重らせんの安定性のほかに、このような試薬の性質を加味することが重要である。
【００４４】
電子供与体と電子受容体の相互作用に基づく変化は、不可逆的なものであることが好ましい。すなわち、検出に供せられる電子供与体、あるいは、電子受容体が不可逆的に変化するものであれば、変化を蓄積して検出することも可能であり、その場合感度の点で有利である。
【００４５】
ピリリウム系化合物としては、例えば、下記一般式［Ｉ］で表わされる化合物を挙げることができる。
【００４６】
【化３】
上記一般式［Ｉ］において、
【００４７】
【化４】
は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅである。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げることができる。
【００４８】
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を示す。
【００４９】
Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）を表わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることができ、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するものでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げることができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示される基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造としては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキソ基を有するものを挙げることができる。
【００５０】
−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わされる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００５１】
【化５】
（上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もしくは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙げることができる。
【００５２】
【化６】
（上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であり、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００５３】
【化７】
（上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００５４】
【化８】
【００５５】
【化９】
上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示したものを挙げることができる。
【００５６】
一般式［Ｉ］のＲ3におけるＡは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わす。Ｒ5の複素環としては、
【００５７】
【化１０】
（Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子または窒素原子を、Ｙ-はアニオンを表わす）等から誘導された基を挙げることができ、その置換基としては、例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げることができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例えば
【００５８】
【化１１】
等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げることができる。また、置換もしくは未置換芳香環としてはアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基等を挙げることができる。
【００５９】
Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００６０】
Ｙ-はアニオンを示し、該アニオンとしては、例えばＢＦ4 -、過塩素酸イオン、ＨＯ3ＳＣＨ2ＣＯＯ-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることができる。
【００６１】
以上挙げた各種の置換基に更に置換される基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、その炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。
【００６２】
一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員環の場合のそのような化合物としては、
（１）Ｘを含む６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（２）該６員環の３位と５位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（３）該６員環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
などを挙げることができる。このような位置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、このピリリウム系化合物を核酸の二重らせん構造の検出に利用する場合に核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００６３】
標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬の一方または両方を一般式［Ｉ］の化合物から選択して利用することができる。核酸の検出においては、一般式［Ｉ］の化合物として、インターカレーターとして核酸の二重らせん構造に挿入されるものが好ましい。
【００６４】
電荷移動による変化を検出する場合においては、例えば、一般式［Ｉ］の化合物の中で電子供与性基を有するものが電子供与体として利用できる。そのような化合物としては、ピリリウム環またはピリリウム類似環の置換基を構成するアリール基として、低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等で置換されたアリール基を有するもの等を挙げることができ、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。この置換アリール基は、ピリリウム環あるいはピリリウム類似環に直接置換されていてもよいし、例えば低級アルキル基を置換して、低級アルアルキル基を構成するものでもよい。この電子供与体として利用できる化合物の一例を、後述の表１に示す。これらの化合物の中では、特に２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩、または２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム塩を好ましいものとして挙げることができる。
【００６５】
表１の化合物に対して電子受容体となり得る化合物としては、例えば後述の表２に示す化合物を挙げることができる。
【００６６】
しかしながら、表１の化合物が電子供与体で、表２の化合物が電子受容体と規定されるものではない。電子供与体と電子受容体はそれぞれの酸化還元電位等により相対的に決まるものであり、一義的には決められない。したがって、例えば、表１の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方を、あるいは表２の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方が選ばれることも十分に有り得る。更に、表１の化合物の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを、表２の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを設定することも可能である。
【００６７】
エネルギー移動の場合は、エネルギー供与体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことが最も重要である。両者が標的物質、例えば核酸二重らせん構造に挿入される結果、エネルギー供与体とエネルギー受容体が近接することがエネルギー移動を引き起こすと考えられる。例えば、表１のピリリウム系化合物のなかで二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、励起状態が安定であると考えられるものはエネルギー供与体として利用可能である。それぞれの蛍光エネルギーレベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好ましい。また、エネルギー移動の場合も電荷移動の場合と同様、エネルギー供与体とエネルギー受容体の両方をピリリウム系化合物から選んでもよいし、ピリリウム系化合物とピリリウム系化合物以外の試薬物質のセットを選ぶこともできる。
【００６８】
ピリリウム系化合物以外のものを試薬として用いる場合、本発明で目的とする検出が行えるものであれば特に制限なく利用できるが、電荷移動を利用する場合の電子受容体としては、例えばスピンラベル化剤としての、４，４−ジメチルオキサゾリジン−Ｎ−オキシル（ＤＯＸＸＬ：4,4-Dimethyloxazolidine-N-oxyl）、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル（ＰＲＯＸＬ：2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidine-N-oxyl）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（2,2,6,6-Tetramethylpiperidine-N-oxyl）及びこれらの誘導体などを挙げることができる。また、リボフラビン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，７−ジアザピレニウム イオン（N,N-Dimethyl-2,7-diazapyrenium ion）及びこれらの誘導体も利用可能である。
【００６９】
電子供与体として利用できるピリリウム化合物以外の化合物としては、例えば蛍光性インターカレーターとしての、アクリジン、アントラセン、ピレン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポリフィリン、チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾールイエロー（ＹＯＹＯ）、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール ジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ：4,6-Diamino-2-phenylindole dihydrochloride）、プロピジウム アイオダイド（ＰＩ：Propidium iodide）等を挙げることができる。
【００７０】
また、一般的な試薬として用いられている、シアニン、アズレン、ダンシル、フルオレセイン、エオシン、ローダミン及びこれらの誘導体等の蛍光色素も利用できる。
【００７１】
以上挙げたピリリウム系化合物以外の化合物も、電子供与体、電子受容体等として規定されるものではなく、同時に用いられる他の試薬との相対的関係から、例えば酸化還元電位等を相対的に評価して、電子供与体、電子受容体、メディエーター、センシタイザー等として適宜使用することができる。
これらの点から、本発明においては、後述する実施例１における化合物ａとｂの組合せか、または、実施例４における化合物ｂとＦＩＴＣの組合せが用いられる。
【００７２】
【実施例】
以下参考例及び実施例により本発明を更に詳細に説明する。
参考例１
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）で再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイド（表１の化合物１（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。
得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２５４〜２５７℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４４４ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．３７３７（１Ｈ、ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、３．１３４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１２００、１１６０
更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムの過塩素酸塩（化合物１（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
【００７３】
参考例２
硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交換水に溶解させ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸水素ナトリウム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０ｍｌのエタノールを更に加えてから、室温で３０分間攪拌した。析出した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌのエタノールで洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍｌの水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液を得た。
【００７４】
次に、参考例１で得た２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジクロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エタノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶させて、０．７ｇの２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム アイオダイドの結晶（表１の化合物２（ただし、ＹはＩである））を得た。
得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２４６〜２４８℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４９５ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．５６７９（１Ｈ、ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、３．１１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６００（ｓ）、１５６０（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ）
更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウムの過塩素酸塩（化合物２（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
参考例３
表１に示す化合物３〜５５をそれぞれ用意した。表１において、Φはｐ−フェニレン基：
【００７５】
【化１２】
またはフェニル基を表わす。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
【表８】
【００８４】
【表９】
【００８５】
【表１０】
【００８６】
【表１１】
【００８７】
【表１２】
【００８８】
【表１３】
【００８９】
【表１４】
【００９０】
【表１５】
【００９１】
【表１６】
【００９２】
【表１７】
【００９３】
【表１８】
【００９４】
【表１９】
なお、これらの化合物は以下の公知の方法により合成した。なお、具体的な反応操作は常法に従った。
【００９５】
化合物７は、W.Foerstらの「New Methods of Preparative Organic Chemistry」、Acad. Press（1964）に記載の方法に従って、化合物［ｉ］
【００９６】
【化１３】
を合成した後、これと
【００９７】
【化１４】
（ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）とを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物１７は、化合物［ｉ］と
【００９８】
【化１５】
（ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒド）とを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。また、化合物［ｉ］を水硫化ナトリウムと反応させることにより化合物［ｉｉ］
【００９９】
【化１６】
を得た後、この化合物［ｉｉ］を化合物７、１７と同様にして化合物８、１８を合成した。
【０１００】
R. WizingerらのHelv. chim. Acta、39、217 (1956)に記載の方法に従い、アセトフェノンとアセトアルデヒドから以下に示すルート
【０１０１】
【化１７】
を経て、化合物［ｉｉｉ］
【０１０２】
【化１８】
を合成した。この化合物［ｉｉｉ］を原料として、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応から得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物５を、ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒドとの反応から同様にして化合物１５を、ｐ−ジメチルアミノ桂皮アルデヒドとの反応から同様にして化合物９を、
【０１０３】
【化１９】
との反応から同様にして化合物１１をそれぞれ得た。また、化合物［ｉｉｉ］を水硫化ナトリウムと反応させることにより化合物［ｉｖ］
【０１０４】
【化２０】
を得た後、化合物［ｉｉｉ］に代えて化合物［ｉｖ］を用いる以外は、化合物５、１５、９及び１１の合成の場合と同様の方法で、化合物６、１６、１０及び１２をそれぞれ得た。
【０１０５】
更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチオン部分を得た後、これに硫化ナトリウムを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデヒとアセトフェノンから化合物［ｖ］
【０１０６】
【化２１】
を得た後、それを水硫化ナトリウムと反応させて化合物［ｖｉ］
【０１０７】
【化２２】
を得た。更に、化合物［ｖ］及び［ｖｉ］をそれぞれｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物１３及び１４を得た。
【０１０８】
化合物１９、２０及び２１は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン部分とを
【０１０９】
【化２３】
と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物２２、２３及び２４は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部分とを、
【０１１０】
【化２４】
と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物２５及び２６は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］を
【０１１１】
【化２５】
と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物２７、２８及び２９は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部分とを、トリエトキシメタン［ＨＣ（ＯＣ2Ｈ5）3］と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させることにより合成した。化合物３０、３１及び３２は化合物［ｉｉｉ］または［ｉｖ］と、［ｉｉｉ］と［ｉｖ］と同様の方法によりｐ−ジメチルアミノアセトフェノンから合成した化合物［ｉｉｉ］と［ｉｖ］のジメチルアミノ誘導体と、トリエトキシメタンとを反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させることにより合成した。
【０１１２】
化合物３３〜５５は以下の各反応によりそれぞれ合成した。
化合物３３の合成
【０１１３】
【化２６】
化合物３４の合成
【０１１４】
【化２７】
化合物３５の合成
【０１１５】
【化２８】
化合物３６の合成
【０１１６】
【化２９】
化合物３７の合成
【０１１７】
【化３０】
化合物３８の合成
【０１１８】
【化３１】
化合物３９の合成
【０１１９】
【化３２】
化合物４０は、化合物３６の合成で原料を
【０１２０】
【化３３】
から
【０１２１】
【化３４】
に変更して合成した。
【０１２２】
化合物４１は、化合物３７の合成で原料を
【０１２３】
【化３５】
から
【０１２４】
【化３６】
に変更して合成した。
【０１２５】
化合物４２は、化合物３８の合成で原料を
【０１２６】
【化３７】
から
【０１２７】
【化３８】
に変更して合成した。
【０１２８】
化合物４３は、化合物３９の合成で原料を
【０１２９】
【化３９】
から
【０１３０】
【化４０】
に変更して合成した。
化合物４４の合成
【０１３１】
【化４１】
化合物４５の合成
【０１３２】
【化４２】
化合物４６の合成
【０１３３】
【化４３】
化合物４７の合成
【０１３４】
【化４４】
化合物４８は、化合物４４の合成で原料を
【０１３５】
【化４５】
から
【０１３６】
【化４６】
に変更して合成した。
【０１３７】
化合物４９は、化合物４５の合成で原料を
【０１３８】
【化４７】
から
【０１３９】
【化４８】
に変更して合成した。
【０１４０】
化合物５０は、化合物４６の合成で原料を
【０１４１】
【化４９】
から
【０１４２】
【化５０】
に変更して合成した。
【０１４３】
化合物５１は、化合物４７の合成で原料を
【０１４４】
【化５１】
から
【０１４５】
【化５２】
に変更して合成した。
化合物５２の合成
【０１４６】
【化５３】
化合物５３の合成
【０１４７】
【化５４】
化合物５４の合成
【０１４８】
【化５５】
化合物５５の合成
【０１４９】
【化５６】
更に置換基導入用の化合物を種々変更して、表２に示す化合物を得た。
【０１５０】
【表２０】
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
【表２２】
【０１５３】
【表２３】
【０１５４】
【表２４】
【０１５５】
【表２５】
【０１５６】
【表２６】
【０１５７】
【表２７】
【０１５８】
【表２８】
【０１５９】
【表２９】
【０１６０】
【表３０】
【０１６１】
【表３１】
【０１６２】
【表３２】
【０１６３】
【表３３】
【０１６４】
【表３４】
【０１６５】
【表３５】
【０１６６】
【表３６】
実施例１（２種のピリリウム色素によるＤＮＡハイブリッド体の検出）
［１］２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム パークロレート（化合物ａ）の合成
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを
室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更に７０％過塩素酸水溶液を加えると、粗結晶が析出した。この粗結晶を瀘過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）から再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム パークロレート（化合物ａ）を得た。
【０１６７】
［２］４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレートの合成
Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレート（化合物ｂ）を合成した。
【０１６８】
［３］オリゴヌクレオチドの合成
標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）と部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。５’末端ジメトキシトリチル基は自動合成機上で除去した。その塩基配列は以下のとおりである。
【０１６９】
５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：１）
［４］プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応
上記［３］項で作製されたオリゴヌクレオチドプローブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）の０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。
【０１７０】
［５］二種のピリリウム色素の特性
化合物ａ及び化合物ｂの核酸との相互作用を知るために、それぞれの化合物を市販のＤＮＡ溶液に加えて、その特性を調べた。化合物ａそのものは、水溶液中で無蛍光であるのが、ＤＮＡ溶液中では６４０ｎｍ（５８０ｎｍで励起）に強い蛍光を持つものであった。また、その吸収ピークはＤＮＡ添加時に約４０ｎｍ長波長シフトし、蛍光性のインターカレーターである。化合物ｂは、化合物ａとは逆に遊離の状態で強い蛍光があるが、ＤＮＡ共存下では蛍光が消失するものであった。
【０１７１】
［６］二種のピリリウム色素を用いた電荷移動によるハイブリッド体の検出
上記［４］項で作製したプローブとＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体に化合物ａを最終濃度が５μＭになるように加え、更に、各種濃度の化合物ｂを加えた。この溶液に化合物ａの吸収波長である５８０ｎｍの可視光を照射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観測した。その結果、化合物ｂを加える前に観測された６４０ｎｍの蛍光は消失し、かわりに４５０ｎｍに新たに蛍光が現れた。このことは、ハイブリッド体に挿入された化合物ａと化合物ｂとの間で核酸の二重らせん構造を介した電荷移動が起こり、４５０ｎｍに蛍光が出現したものと考えられる。また、４５０ｎｍの蛍光は化合物ｂが５μＭの時が最大であった。
【０１７２】
実施例２（ミスマッチの検出）
下記の塩基配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた以外は、実施例１と同様にして、プローブ・標的ＤＮＡハイブリッド体を調製した。
【０１７３】
５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：２）
なお、この塩基配列は、実施例１で用いたプローブ用塩基配列の５’末端から１０番目のＣをＧに変換したものであり、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとミスマッチするように設計されたものである。
【０１７４】
このハイブリッド体に実施例１と同様に２種類のピリリウム色素を加え、５８０ｎｍの光を励起光として、その蛍光増大、蛍光消失を観測した。実施例１とは異なり、化合物ａ及び化合物ｂのいずれの蛍光もその強度に変化は見られなかった。この結果は、ミスマッチしているハイブリッド体ではこれらの色素間の相互作用が起きなかったためと考えられる。
【０１７５】
実施例３（２種のピリリウム色素によるＤＮＡハイブリッド体の検出）
実施例１と同様な方法によりプローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。これに、化合物ａを加え、その後、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−４−フェニルピリリウム アイオダイド（化合物ｃ）を加えた。
【０１７６】
あらかじめ化合物ｃとＤＮＡとの相互作用を調べた。その結果、化合物ｃは６００ｎｍ付近に吸収があり、化合物ａと同様、ＤＮＡ添加に伴って吸収スペクトルのシフトが見られ（６４０ｎｍ）、インターカレーターと思われるが、その蛍光はＤＮＡ溶液中でも小さかった。
【０１７７】
プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体にこれら２種類のピリリウム色素を加え、化合物ａの励起波長である５８０ｎｍの光を照射したところ、本来、化合物ｃがなかった時にＤＮＡ共存下で観測された化合物ａの強い吸収は消失し、代わりに７２０ｎｍにあらたに蛍光が出現した。このことは、化合物ａから化合物ｃへエネルギー移動が起きたためと考えられる。化合物ｃの量をいろいろ変えて実験したところ、供与体の蛍光の減少と受容体の蛍光の増大はそれぞれが同じモル数の時に最も効果的であった。
【０１７８】
実施例４（標識抗体と電荷移動によるハイブリッド体の検出）
［１］標識抗体の作製
（１）４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレートの合成
Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート（化合物ｂ）を合成した。
【０１７９】
（２）抗体の標識
化合物ｂの４．３ｇ、カルボキシベンツアルヒド２ｇ、７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還流した後、析出した沈澱を集め、上記エタノール／エーテルの混合系から再結晶させて、４−（４−カルボキシスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレート（化合物ｄ）を得た。
【０１８０】
化合物ｄの１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌した。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈澱を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥させた。得られた活性エステル体［化合物ｅ］を抗体のアミノ基と反応させて、標識抗体を作製した。
【０１８１】
［２］ＦＩＴＣ標識２次抗体による検出
抗原と、上記［２］項で作製した一次抗体を常法により反応させて、その後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を反応させた。
【０１８２】
このサンプルに４８０ｎｍの可視光を照射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観測した。その結果、標識抗体を反応させる前に観測されたＦＩＴＣの５２０ｎｍの蛍光は消失し、かわりに４５０ｎｍに新たに蛍光が現われた。このことは、一次抗体と二次抗体とが反応した結果、標識抗体上の化合物ｂとＦＩＴＣとの間で電荷移動が起ったものと考えられる。
【０１８３】
【発明の効果】
本発明の検出方法によれば、標的物質の検出をより高精度で行うことが可能となる。例えば、プローブを用いたハイブリダイゼーションによって得られたハイブリッド体を標的物質とした場合、Ｂ／Ｆ分離が必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で不可決であった過剰なプローブの除去、非特異吸着を除くための煩雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が不要となった。更に、正確なハイブリッド体でのみ信号変化が観測されるように試薬物質を選択することで、反応系中にミスマッチが発生している場合でも、正確な二重らせん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出することが可能となる。
【０１８４】
更に、本発明の方法においてピリリウム系化合物を電子供与体として用いる場合、遊離時にはほとんど蛍光がなく、核酸の二重らせん構造に結合した際にその蛍光特性が大きく変化するものを利用すれば、検出時におけるＳ／Ｎ比を上昇させることが可能になる。また、ピリリウム系化合物は他の縮合環タイプのインターカレーターに比べ、より二重らせん構造特異的に挿入され、一本鎖ＤＮＡの部分的二本鎖構造には挿入されにくいことが特徴である。その結果、少なくとも２種の試薬の少なくとも一つにピリリウム系化合物を用いることにより部分的二本鎖構造による擬ハイブリッド体由来の信号を除外することができる。
【０１８５】
【配列表】
【０１８６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の検出方法で利用する標的物質を介する相互作用を行う反応系のモデルを示す図である。
【図２】本発明の検出方法で利用する標的物質を介する相互作用を行う反応系のモデルを示す図である。
【符号の説明】
１、２、４、５、６、７ 試薬
３ 標的物質
【産業上の利用分野】
本発明は、検出対象としての標的物質の存在下で、該標的物質を介在する相互作用に基づく変化を起す反応系を形成し得る複数の試薬を用いて標的物質を検出する方法に関し、例えば、ウイルス、微生物、動植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の所望の塩基配列の検出、同定、もしくは各種塩基配列における変異の有無の検出に有用な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の分析技術の発達により種々の変異遺伝子が数多く見つけ出され、遺伝子の変異に基づく各種遺伝病の解明も進みつつある。そのなかには、遺伝子中の塩基が部分的に欠失したものや、塩基が点突然変異を起したものがあり、それによって蛋白質に変異が生じ、さまざまな症状を引き起こすものがあることが明かにされてきている。現在のところ、これらの遺伝病は、症状が現れてから、酵素によるアッセイや、抗体を用いた免疫的な方法により発見されることが主流であるが、早期治療という観点から、重篤な症状が現れる前に遺伝子上で変異の有無を早期に発見することの重要性が指摘されている。
【０００３】
また、ＤＮＡ診断は、必ずしもヒトの遺伝子に用いられるだけでなく、感染した細菌の同定においても利用できる。
【０００４】
従来は、分離した細菌の形態学的性状および生化学的性状から、類似性に基づいて菌種を同定する方法が取られていた。この方法では、培養に時間がかかる上に、検査法の違いによって性状の判定が異なったり、どの性状に重点を置くかによって同定の結果が異なる等の問題があった。
【０００５】
そこで近年、特に、細菌感染症における原因細菌の検出や同定の分野において、、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション法を用いる試みがなされている。この方法は、細菌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出し、細菌由来の核酸のうち特定部分に着目して、その部分の塩基配列とホモロジーの高い塩基配列が、対象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイブリダイゼーション法によって調べ、サンプル中に問題となる細菌が存在するか否かを判定する方法である。
【０００６】
また、近年、核酸の特定配列の新しい検出方法として、ＰＣＲ法も用いられるようになってきている。この方法は、検出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅された特定配列の有無を検出することで、標的核酸の検出が可能となる。ＰＣＲ法を用いることで核酸の検出感度は向上し、ハイブリダイゼーション法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の検出に利用されている。
【０００７】
しかし、ＰＣＲ法では調べたい特定塩基配列が明かな場合に、その増幅に最適なプライマーを選定することにより、初めて特定配列の有無を調べることができるもので、プライマーが非特異的に標的核酸に結合したり、本来なら増幅されない配列が形成されることが多々ある。また、ある標的核酸中の欠損のような遺伝子異常は、その長さを解析することにより情報を得ることができるが、点突然変異のような長さに変化が現れないような異常に対しては知る術もないという欠点を持つ。
【０００８】
したがって、ハイブリダイゼーション法が完全にＰＣＲ法に置き換えられるというわけではなく、ハイブリダイゼーション法による簡便な遺伝子検出法もやはり必要とされる。
【０００９】
ハイブリダイゼーション反応では、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとがお互いの相補的な配列部分で水素結合によりハイブリッド体を形成する。ハイブリダイゼーション反応において、相補的な配列間で正確にハイブリッド体を形成させるためには、反応の温度、イオン強度を最適に選ぶ必要がある。つまり、温度が高すぎると、プローブと相補的配列をもつ核酸とが結合できず、逆に低すぎると、プローブが非特異的に核酸に結合してしまう。さらに、より正確さを期すために、溶液の塩濃度を下げて、あるいは、溶液の温度を上げて、不安定な水素結合を除き、非特異的に結合したプローブやミスマッチしているプローブを洗い流すことが重要となる。従って、適当な反応条件、洗浄条件の設定には、かなりの試行錯誤が必要になる。
【００１０】
遺伝子診断では、ハイブリッド体形成反応、及び、洗いの条件設定に、一塩基対レベルのミスマッチをも除去する精度が更に要求される。
【００１１】
ハイブリダイゼーション反応は、従来は標的核酸をニトロセルロースのような担体に固定させた状態で行われてきた。しかし、この方法は極めて操作が煩雑であるため、溶液中でのハイブリダイゼーションのような簡便な方法の開発が期待されてきた。従来のような核酸の固定化を行わない方法における最大の課題は、標的核酸に結合しているプローブと、結合していない過剰なプローブをどのようにして区別するか（Ｂ／Ｆ分離）というところにある。さらに、この場合にも、上述の固定化核酸を用いたハイブリダイゼーション反応と同様に、プローブの非特異的吸着やミスマッチを除くための適当な反応条件、洗浄条件設定が重要な課題となる。
【００１２】
Ｂ／Ｆ分離を行わずに標的核酸とプローブとのハイブリッド体を検出するための方法としては、蛍光偏光解消法を用いた検出方法がいくつか提案されている（特開平２−２９５４９６号公報、特開平２−７５９５８号公報等参照）。これらの方法は、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡプローブを、分析検体中のＤＮＡと接触させて二本鎖ＤＮＡを形成させ、二本鎖形成前の蛍光偏光と二本鎖形成後の蛍光偏光との変異を測定して検体中のＤＮＡに、プローブの塩基配列に対応する塩基配列が存在するかどうかを検出する方法である。この方法は、一本鎖のプローブに結合させた蛍光物質が、二本鎖になったことによって動きにくくなり、蛍光異方性が増大することがその検出の原理となっている。
【００１３】
ところが、これらの方法では、検体中に蛋白質等の夾雑物が含まれていて、それがプローブＤＮＡに非特異的に吸着すると、ハイブリッド体検出のバックグランドを上昇させる原因となるため、あらかじめこれらの夾雑物を完全に除去するという煩雑な作業が必要となる。また、プローブＤＮＡの非特異的吸着、及び、塩基のミスマッチによる擬ハイブリッド体は他の溶液系の場合、それをあらかじめ除去する操作が必要である。さらに、確かにＢ／Ｆ分離は必要ないもののプローブ濃度が標的ＤＮＡ濃度と同程度であることが蛍光の変異を測定する上で必要となる。
【００１４】
エネルギー移動を利用したハイブリッド体検出方法として、Ｇａｒｄｕｌｌｏらは３通りの方法を提案している（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８７９０−８７９４）。これらはいずれもエネルギー供与体としてフルオレセイン、アクリジンオレンジ、エネルギー受容体としてローダミンを用いたもので、（ｉ）５’をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドとそれに相補的で５’をローダミンで標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、（ｉｉ）５’をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドのそれぞれ相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、（ｉｉｉ）５’をローダミンで標識したオリゴヌクレオチドのアクリジンオレンジ存在下での相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションである。この方法は、近接する蛍光発色団の励起光と蛍光が重なり合っている場合に、供与体の励起状態エネルギーが近接する受容体に転移される現象であり、その結果として供与体の寿命の減少、供与体の蛍光のクエンチング及び受容体の蛍光強度の増強などが見られる。ハイブリダイゼーションの有無を溶液のまま判定できるという点では一連の煩雑な操作を一挙に省ける点で画期的な方法といえるが、感度的に既存のハイブリダイゼーンに比べて数オーダー低く、実用化のためには蛍光団の改良や検出系の飛躍的な進歩が望まれていた。
【００１５】
また、最近、ＤＮＡの二本鎖に二種類の色素を遊離の状態で混合した時に、これらの色素間でＤＮＡを介した電荷移動が検出されたという報告がある（Ｊ．Ａｍｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．，１９９２，１１４，３６５６−３６６０）。それは、蛍光を持つ電子供与体（エチジウムブロマイドあるいはアクリジンオレンジ）にそれぞれの励起波長に対応する波長の光を照射すると、もうひとつの色素（電子受容体：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，７−ｄｉａｚａｐｙｒｅｎｉｕｍ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）存在下では、その蛍光強度が減少するというもので、両色素がインターカレーターと考えられていることから電子がＤＮＡの二重らせんを介して電子供与体から電子受容体の方へ流れているというものである。しかし、その変化の程度は非常に小さいものであり、ハイブリッド体の検出に利用しうるほどの感度ではない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来のような標的核酸を固定したハイブリダイゼーション法はもちろん、Ｂ／Ｆ分離を必要としない蛍光偏光解消のような方法においても、プローブの非特異的吸着やミスマッチの発生を防止する、あるいは発生した非特異的吸着やミスマッチを除去するための煩雑な処理が必要である場合が多い。しかも、これらの操作の最適条件はプローブの長さ、あるいはそれぞれの塩基配列によって異なるため、それぞれの場合で条件を検討し、設定していく必要がある。特に、ミスマッチしている塩基のプローブ上の位置もハイブリッド体の安定性に影響を与える重要な因子となり、その位置によってはミスマッチしているハイブリッド体を除去できない場合も生じるため、ミスマッチの可能性を考慮して、ハイブリダイゼーション反応の条件を個々のケースに応じて設定するという更に煩雑な作業が必要となる。
【００１７】
電荷移動、エネルギー移動を利用する溶液中の検出系は、標的核酸を固定する場合や、Ｂ／Ｆ分離を必要とする系に比べて簡便な方法ではあるものの、その感度は非常に低く、実用に供せられるほどのものではない。さらに、従来例で用いられている色素は遊離の状態でも蛍光を有し、蛍光強度の変化を検出しても、それがエネルギー供与体とエネルギー受容体（または、電子供与体と電子受容体）とのＤＮＡを介した相互作用なのか、溶液による単なるクエンチングなのか、あるいは夾雑物の存在による影響なのか判定することは困難である。
【００１８】
本発明は、以上のような従来技術における問題に鑑みなされたものであり、ハイブリッド体の検出においてＢ／Ｆ分離の必要がなく、より簡易化された工程からなり、良好な測定感度を得ることができる標的核酸の検出に好適な方法を提供することにある。本発明の他の目的は、ミスマッチしているハイブリッド体が存在する場合でも所望のハイブリッド体のみを正確に検出できる標的核酸の検出に好適な方法を提供することにある。
【００１９】
本発明は、更に、イムノアッセイ等の免疫反応を利用した各種物質の検出に有用な検出系を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明の標的物質の検出方法は、標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬を、試料と反応させ、試料中に前記標的物質が存在する場合に生じる前記相互作用に基づく変化を測定することによって該試料中の標的物質を検出する方法において、前記反応系を構成する試薬の少なくとも１つがピリリウム化合物及びピリリウム類似化合物から選ばれたものであることを特徴とする。
【００２１】
本発明で利用する相互作用とは、標的物質を含む反応系を介して２つの物質が起す相互作用をいう。この相互作用としては、例えば、電荷の授受（電荷移動）やエネルギーの授受（エネルギー移動）が利用できる。電荷移動の場合は、相互作用を起す２つの物質の一方は電子供与体であり、他方は電子受容体となる。また、エネルギー移動の場合は、一方がエネルギー供与体で、他方がエネルギー受容体となる。本発明においては、このような相互作用を起す２つの物質を含む試薬群を用いて、標的物質の存在下で相互作用を起させ、それによって生じる変化を測定して標的物質を検出するものであり、この相互作用を行う反応系を構成する試薬の少なくとも１つにピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物（以下ピリリウム系化合物と総称する）を用いるものである。
【００２２】
更に、本発明における試薬間の相互作用を、イムノアッセイ等の免疫反応における検出対象物質への第１次反応体と第２次反応体の反応の際のこれらの複合体の生成に伴って生じるようにすれば、上記の試薬による反応系を免疫反応の検出に利用できる。例えば、イムノアッセイにおいて、第１次反応体及び第２次反応体の一方がエネルギー供与体あるいは電子供与体であるような試薬で標識されており、他方がこれと相補的なアクセプター（例えばエネルギー受容体あるいは電子受容体）のような試薬で標識されており、これらの免疫反応が起り、第１次反応体と第２次反応体とが結合した結果生じるドナーとアクセプターとの近接によるエネルギーの転移や電荷の移動が検出可能なシグナルを生じ、このシグナルを検出することで、免疫反応の有無を検出できる。この標識試薬の少なくとも一方としてピリリウム系化合物を用いることができる。
【００２３】
以下、標的物質として核酸二重らせん構造を検出する場合を代表例として本発明を説明するが、同様の作用により検出できるものであれば、本願発明はこれに限定されない。
【００２４】
図１及び２に、本発明で利用する相互作用を起こす反応系のモデルを電荷移動の場合を例として模式的に示す。図１のものは、標的物質３（核酸二重らせん構造）と相互作用を起す２つの試薬１、２から構成される最も単純な反応系であり、この反応系では電子供与体となる試薬１から標的物質３を介して電子受容体となる試薬２まで矢印方向に電荷移動が行われる。図２の反応系は、相互作用を起す試薬４、５に加えて、反応経路中で電荷移動を媒体する試薬６、７が更に追加されいるもので、矢印方向に電荷の移動が行われる。図示した場合を例にとれば、試薬１、２、４〜７の少なくとも１つにピリリウム系化合物が使用される。なお、試薬の数は少なくとも２種とされるが、検出における操作効率や検出感度などを考慮してその数を設定することができる。試薬６、７はいわゆるメディエーターまたはセンシタイザー等として機能するものが利用できる。更に、図２で示される反応経路の各反応物質間、例えば試薬４と６の間、試薬６と標的物質３の間などに、反応を仲介する１以上の物質が必要に応じて更に関与しても良い。従って、ピリリウム系化合物は、相互作用の反応経路を構成する試薬の少なくとも１つとして利用され、その利用する反応系での役割に応じた機能を有するものが選択され、例えば電子供与体、電子受容体、メディエーターまたはセンシタイザー等として利用される。
【００２５】
二重らせん構造と直接反応させる目的で使用する試薬、例えば図１及び２の試薬１、２、６、７はこれが二重らせん構造と特異的に結合するインターカレーター等としての性質を有するものが好ましい。この場合の試薬としては、例えば、二重らせん構造を構成している核酸等の物質と反応して、それ自身が、あるいは核酸の構成成分側が化学変化や構造的変異を起すことで、あるいは反応系に加えた第３の物質と二重らせん構造の存在下で反応して変化を起すことで検出可能な相互作用に基づく変化を引き起こすものが利用できる。
【００２６】
この直接反応としては、例えば、二重らせん構造をとる核酸の構成成分と試薬物質との間の電荷移動あるいはエネルギー移動を引き起す反応などが利用できる。電荷移動を利用する場合には、試薬物質としては、二重らせん構造特異的に挿入され核酸の構成成分に対して電子供与体または電子受容体となり得る物質が利用される。
【００２７】
この電荷移動に基づく反応としては、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｏｎｄの場合とが考えられる。前者の場合には、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介して電子供与体と電子受容体が相互作用するような場合と、二重らせん構造への変化に伴う電子供与体と電子受容体の近接効果に基づくような場合とが含まれる。後者（ｔｈｏｕｇｈ ｂｏｎｄ）では核酸を構成する塩基、リン酸部分、或は、糖の部分をも含めた電荷の移動が考えられる。いずれの場合もこの直接反応が、二重らせんを形成したことに由来するものであればその形態はなんら限定されない。
【００２８】
核酸塩基対間のスタッキングを介する場合とは、二重らせん構造と反応できる位置に置かれた電子供与体と電子受容体（例えば図１の試薬１、２）の距離が本来相互作用できないほど離れている時、電子供与体から放出された電子が、核酸塩基対上に広がる電子雲を介して、電子を次々隣接する核酸塩基対に受け渡され、最終的に電子受容体にまで電子を到達させるというものである。また、逆に、電子受容体が核酸塩基対から電子を引き抜き、それが連鎖的に行われて最終的に電子供与体から電子が奪い取られるという機構も成り立つ。つまり、電荷移動におけるメディエーターが、核酸塩基対ということになる。
【００２９】
これに対し、電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく場合とは、二重らせん構造の形成によって電子供与体と電子受容体の距離がこれらの相互作用が可能な程度に近くなる場合である。例えば、電子供与体と電子受容体の両方が存在しても、溶液中でこれらの化合物の距離が十分に離れているような一本鎖の状態のときには、これらが相互作用を起さず、標的核酸とハイブリダイズして二重らせん構造を形成して電子供与体と電子受容体が近接した場合に、これらの相互作用が生じるように設定すれば、二重らせん構造の形成をこれらの相互作用が生じたかどうかによって検出できる。なお、二重らせん構造と試薬物質での電荷移動が起りにくい場合には、先に述べたように、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエーター、あるいはセンシタイザーと称させる物質を介在させてもよい。
【００３０】
このように二重らせん構造と反応する位置に用いる試薬には、これが二重らせん構造と反応できる位置に配置されて、これらの反応が生じる必要がある。このような試薬が二重らせん構造と反応可能な位置に配置される方式としては、インターカレーターのように核酸塩基対の間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋め込まれる場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で配置される場合等が利用できる。いずれの場合も、ハイブリッド体の二重らせん構造に試薬が特異的に配置されることが本発明にとって本質的に必要なことである。
【００３１】
これらの中では、インターカレーターは、スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有利である。つまり、インターカレーターは、一般には、電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じような距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例えば、電子供与体としてインターカレーターを用い、二重らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に送られ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由して、一直線に電子受容体に向って流れ得る。あるいは、この逆に、電子受容体としてインターカレーターを用い、二重らせんを挟んだ反対側に電子受容体を配置すれば、電子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基対から電子を引き抜き、この電子の引抜きが他の核酸塩基対間に次々と生じて最終的に電子供与体から電子を引き抜き、電荷移動が行われる場合もある。これらの点を考慮すると、スタッキングを介する電荷移動の場合には、電子供与体、電子受容体のうち、少なくともひとつがインターカレーターであることが好ましく、両者が共にインターカレーターである場合には、さらに電荷移動効率を上げることが可能であるのでより好ましい。インターカレーターは二重らせん構造を安定化させ、その融解温度を上昇させることが知られており、電子供与体や電子受容体がインターカレーターであることは、プローブと標的核酸間のハイブリッド体を安定化させるという点でも有利である。
【００３２】
本発明においては、標的物質を介した相互作用に基づいた変化を測定することで標的物質の検出が行われる。この変化は、標的物質及びその検出に用いられる試薬から構成される相互作用を起す反応系の種類により異なり、その変化の検出方法も反応系の構成によって個々に異なる。例えば、相互作用を行う試薬（例えば図１及び２の試薬１、２、４、５）に電荷移動に基づく相互作用を行うものを用いた場合、二重らせん構造を介したこれら試薬の相互作用を電子受容体側の変化としてとらえて、その変化に適した手段で測定することができる。例えば、電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、あるいは、変化としてとらえることができる。また、電荷移動の結果溶液が着色あるいは変色するような系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。また、電子受容体が電子移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出するという方法も利用できる。この時、変化した物質に、後から第３の物質を加え、両者の化学反応により化学発光を起し検出することも可能である。第３の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。また、標的物質自体が検出可能な変化を起す場合は、これを検出することができる。
【００３３】
検出方法として、電子受容体の変化の他に、電子供与体側での変化で反応を検出しても良い。そして、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられる方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電子供与体して用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消失のような直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさらにいくつかの反応と組み合せて可視化する方法も利用できる。
【００３４】
このように、本発明において検出される相互作用に基づく変化は、相互作用を起す反応系を構成する各試薬や標的物質のいずれにおける変化であっても良く、その変化を直接あるいは、他の検出用の試薬を用いて間接的に測定してもよい。
【００３５】
一方、本発明では、電子供与体が光によって活性化されて電子を放出して電荷移動が開始されるものでもよく、更に、第３の物質として、電子供与体を刺激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。さらに、電子受容体の方を活性化して、それに誘起されて電子が電子供与体から引き抜かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、なんらかの開始剤であってもよい。
【００３６】
また、先に述べたように、電子供与体、電子受容体の他に、第３の物質として、電荷移動を仲介するようなメディエーター、あるいはセンシタイザーと称させる物質が仲介してもよい。そして、これらの物質が二重らせんと相互作用し、直接二重らせんとは結合していない電子供与体、電子受容体に電荷移動を促しても良い。
【００３７】
プローブ核酸とのハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出の場合には、相互作用に基づく変化は、例えば、所望のハイブリッド体形成前後における試薬を構成するピリリウム系化合物やピリリウム系化合物以外の化合物、あるいは標的物質である核酸の構成成分の化学構造や特性の変化、電子状態の変化、或いはまた、この相互作用により変化した物質に由来する信号の変化として測定、検出される。
【００３８】
電子供与体と電子受容体を用いる形態としては、例えば以下のものを挙げることができる。
（ｉ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時に反応系に存在させる。
（ｉｉ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成後に反応系に添加する。
（ｉｉｉ）これらの一方を、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時に反応系に存在させておき、その後に他方を添加する。
【００３９】
相互作用としてエネルギー移動を利用する場合には試薬には、少なくともエネルギー供与体とエネルギー受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後におけるエネルギー受容体、エネルギー供与体、または、これらの物質と相互作用しうる第３の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、あるいはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。例えば、エネルギー供与体の蛍光強度の減少、エネルギー受容体の蛍光強度の増大によりハイブリッド体を検出することができる。このような場合には、ハイブリッド体の二本鎖部分にエネルギー供与体とエネルギー受容体がインターカレート等の様式により入り込み、溶液中の場合に比べて両者が近接し、相互作用が可能になってエネルギー移動が起こると考えられる。
【００４０】
エネルギー供与体、エネルギー受容体を用いる様式としては、電子供与体、電子受容体と同様な（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の様式がそのまま利用できる。エネルギー移動開始剤としては主に光が利用される。
【００４１】
ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出に本発明の方法を利用する場合のプローブの長さは、標的核酸との良好なハイブリダイゼーションが可能で、安定した二重らせん構造が得られる長さが個々のケースにおいて適宜選択される。電子供与体、あるいは電子受容体、またはエネルギー供与体、あるいはエネルギー受容体等としての試薬（例えば図１、２における試薬１、２、６、７）が核酸塩基と直接相互作用するために必要な安定した二重らせん構造が可能な長さであれば良く、その長さは、例えば、８塩基以上、好ましくは１２塩基以上とされる。
【００４２】
しかしながら、二重らせん構造の安定化には、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列ではより安定な二重らせん構造が形成される。また、ＫＣｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。また、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与する。従って、これらの安定化因子を適宜利用することによって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能である。
【００４３】
また、電子供与体、電子受容体、あるいはエネルギー供与体、エネルギー受容体の性質もプローブ選定上考慮しなければならない因子である。これらの試薬物質が二重らせんのどの配列にも同じ確立で入り込むという保証はない。Ｇ−Ｃ塩基対を好むものと、Ａ−Ｔ塩基対を好むもの等それぞれの試薬によりその性質は異なる。したがって、プローブの配列選定にはプローブと標的核酸とで構成される二重らせんの安定性のほかに、このような試薬の性質を加味することが重要である。
【００４４】
電子供与体と電子受容体の相互作用に基づく変化は、不可逆的なものであることが好ましい。すなわち、検出に供せられる電子供与体、あるいは、電子受容体が不可逆的に変化するものであれば、変化を蓄積して検出することも可能であり、その場合感度の点で有利である。
【００４５】
ピリリウム系化合物としては、例えば、下記一般式［Ｉ］で表わされる化合物を挙げることができる。
【００４６】
【化３】
【００４７】
【化４】
【００４８】
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を示す。
【００４９】
Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）を表わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることができ、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するものでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げることができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示される基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造としては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキソ基を有するものを挙げることができる。
【００５０】
−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わされる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００５１】
【化５】
【００５２】
【化６】
【００５３】
【化７】
【００５４】
【化８】
【化９】
【００５６】
一般式［Ｉ］のＲ3におけるＡは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わす。Ｒ5の複素環としては、
【００５７】
【化１０】
【００５８】
【化１１】
【００５９】
Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００６０】
Ｙ-はアニオンを示し、該アニオンとしては、例えばＢＦ4 -、過塩素酸イオン、ＨＯ3ＳＣＨ2ＣＯＯ-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることができる。
【００６１】
以上挙げた各種の置換基に更に置換される基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、その炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。
【００６２】
一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員環の場合のそのような化合物としては、
（１）Ｘを含む６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（２）該６員環の３位と５位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（３）該６員環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
などを挙げることができる。このような位置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、このピリリウム系化合物を核酸の二重らせん構造の検出に利用する場合に核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００６３】
標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬の一方または両方を一般式［Ｉ］の化合物から選択して利用することができる。核酸の検出においては、一般式［Ｉ］の化合物として、インターカレーターとして核酸の二重らせん構造に挿入されるものが好ましい。
【００６４】
電荷移動による変化を検出する場合においては、例えば、一般式［Ｉ］の化合物の中で電子供与性基を有するものが電子供与体として利用できる。そのような化合物としては、ピリリウム環またはピリリウム類似環の置換基を構成するアリール基として、低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等で置換されたアリール基を有するもの等を挙げることができ、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。この置換アリール基は、ピリリウム環あるいはピリリウム類似環に直接置換されていてもよいし、例えば低級アルキル基を置換して、低級アルアルキル基を構成するものでもよい。この電子供与体として利用できる化合物の一例を、後述の表１に示す。これらの化合物の中では、特に２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩、または２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム塩を好ましいものとして挙げることができる。
【００６５】
表１の化合物に対して電子受容体となり得る化合物としては、例えば後述の表２に示す化合物を挙げることができる。
【００６６】
しかしながら、表１の化合物が電子供与体で、表２の化合物が電子受容体と規定されるものではない。電子供与体と電子受容体はそれぞれの酸化還元電位等により相対的に決まるものであり、一義的には決められない。したがって、例えば、表１の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方を、あるいは表２の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方が選ばれることも十分に有り得る。更に、表１の化合物の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを、表２の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを設定することも可能である。
【００６７】
エネルギー移動の場合は、エネルギー供与体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことが最も重要である。両者が標的物質、例えば核酸二重らせん構造に挿入される結果、エネルギー供与体とエネルギー受容体が近接することがエネルギー移動を引き起こすと考えられる。例えば、表１のピリリウム系化合物のなかで二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、励起状態が安定であると考えられるものはエネルギー供与体として利用可能である。それぞれの蛍光エネルギーレベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好ましい。また、エネルギー移動の場合も電荷移動の場合と同様、エネルギー供与体とエネルギー受容体の両方をピリリウム系化合物から選んでもよいし、ピリリウム系化合物とピリリウム系化合物以外の試薬物質のセットを選ぶこともできる。
【００６８】
ピリリウム系化合物以外のものを試薬として用いる場合、本発明で目的とする検出が行えるものであれば特に制限なく利用できるが、電荷移動を利用する場合の電子受容体としては、例えばスピンラベル化剤としての、４，４−ジメチルオキサゾリジン−Ｎ−オキシル（ＤＯＸＸＬ：4,4-Dimethyloxazolidine-N-oxyl）、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル（ＰＲＯＸＬ：2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidine-N-oxyl）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（2,2,6,6-Tetramethylpiperidine-N-oxyl）及びこれらの誘導体などを挙げることができる。また、リボフラビン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，７−ジアザピレニウム イオン（N,N-Dimethyl-2,7-diazapyrenium ion）及びこれらの誘導体も利用可能である。
【００６９】
電子供与体として利用できるピリリウム化合物以外の化合物としては、例えば蛍光性インターカレーターとしての、アクリジン、アントラセン、ピレン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポリフィリン、チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾールイエロー（ＹＯＹＯ）、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール ジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ：4,6-Diamino-2-phenylindole dihydrochloride）、プロピジウム アイオダイド（ＰＩ：Propidium iodide）等を挙げることができる。
【００７０】
また、一般的な試薬として用いられている、シアニン、アズレン、ダンシル、フルオレセイン、エオシン、ローダミン及びこれらの誘導体等の蛍光色素も利用できる。
【００７１】
以上挙げたピリリウム系化合物以外の化合物も、電子供与体、電子受容体等として規定されるものではなく、同時に用いられる他の試薬との相対的関係から、例えば酸化還元電位等を相対的に評価して、電子供与体、電子受容体、メディエーター、センシタイザー等として適宜使用することができる。
これらの点から、本発明においては、後述する実施例１における化合物ａとｂの組合せか、または、実施例４における化合物ｂとＦＩＴＣの組合せが用いられる。
【００７２】
【実施例】
以下参考例及び実施例により本発明を更に詳細に説明する。
参考例１
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）で再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイド（表１の化合物１（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。
得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２５４〜２５７℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４４４ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．３７３７（１Ｈ、ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、３．１３４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１２００、１１６０
更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムの過塩素酸塩（化合物１（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
【００７３】
参考例２
硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交換水に溶解させ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸水素ナトリウム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０ｍｌのエタノールを更に加えてから、室温で３０分間攪拌した。析出した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌのエタノールで洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍｌの水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液を得た。
【００７４】
次に、参考例１で得た２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジクロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エタノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶させて、０．７ｇの２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム アイオダイドの結晶（表１の化合物２（ただし、ＹはＩである））を得た。
得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２４６〜２４８℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４９５ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．５６７９（１Ｈ、ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、３．１１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６００（ｓ）、１５６０（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ）
更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウムの過塩素酸塩（化合物２（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
参考例３
表１に示す化合物３〜５５をそれぞれ用意した。表１において、Φはｐ−フェニレン基：
【００７５】
【化１２】
【００７６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【００９５】
化合物７は、W.Foerstらの「New Methods of Preparative Organic Chemistry」、Acad. Press（1964）に記載の方法に従って、化合物［ｉ］
【００９６】
【化１３】
【００９７】
【化１４】
【００９８】
【化１５】
【００９９】
【化１６】
【０１００】
R. WizingerらのHelv. chim. Acta、39、217 (1956)に記載の方法に従い、アセトフェノンとアセトアルデヒドから以下に示すルート
【０１０１】
【化１７】
【０１０２】
【化１８】
【０１０３】
【化１９】
【０１０４】
【化２０】
【０１０５】
更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチオン部分を得た後、これに硫化ナトリウムを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデヒとアセトフェノンから化合物［ｖ］
【０１０６】
【化２１】
【０１０７】
【化２２】
【０１０８】
化合物１９、２０及び２１は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン部分とを
【０１０９】
【化２３】
【０１１０】
【化２４】
【０１１１】
【化２５】
【０１１２】
化合物３３〜５５は以下の各反応によりそれぞれ合成した。
化合物３３の合成
【０１１３】
【化２６】
【０１１４】
【化２７】
【０１１５】
【化２８】
【０１１６】
【化２９】
【０１１７】
【化３０】
【０１１８】
【化３１】
【０１１９】
【化３２】
【０１２０】
【化３３】
【０１２１】
【化３４】
【０１２２】
化合物４１は、化合物３７の合成で原料を
【０１２３】
【化３５】
【０１２４】
【化３６】
【０１２５】
化合物４２は、化合物３８の合成で原料を
【０１２６】
【化３７】
【０１２７】
【化３８】
【０１２８】
化合物４３は、化合物３９の合成で原料を
【０１２９】
【化３９】
【０１３０】
【化４０】
化合物４４の合成
【０１３１】
【化４１】
【０１３２】
【化４２】
【０１３３】
【化４３】
【０１３４】
【化４４】
【０１３５】
【化４５】
【０１３６】
【化４６】
【０１３７】
化合物４９は、化合物４５の合成で原料を
【０１３８】
【化４７】
【０１３９】
【化４８】
【０１４０】
化合物５０は、化合物４６の合成で原料を
【０１４１】
【化４９】
【０１４２】
【化５０】
【０１４３】
化合物５１は、化合物４７の合成で原料を
【０１４４】
【化５１】
【０１４５】
【化５２】
化合物５２の合成
【０１４６】
【化５３】
【０１４７】
【化５４】
【０１４８】
【化５５】
【０１４９】
【化５６】
【０１５０】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
［１］２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム パークロレート（化合物ａ）の合成
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを
室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更に７０％過塩素酸水溶液を加えると、粗結晶が析出した。この粗結晶を瀘過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）から再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム パークロレート（化合物ａ）を得た。
【０１６７】
［２］４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレートの合成
Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレート（化合物ｂ）を合成した。
【０１６８】
［３］オリゴヌクレオチドの合成
標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）と部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。５’末端ジメトキシトリチル基は自動合成機上で除去した。その塩基配列は以下のとおりである。
【０１６９】
５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：１）
［４］プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応
上記［３］項で作製されたオリゴヌクレオチドプローブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）の０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。
【０１７０】
［５］二種のピリリウム色素の特性
化合物ａ及び化合物ｂの核酸との相互作用を知るために、それぞれの化合物を市販のＤＮＡ溶液に加えて、その特性を調べた。化合物ａそのものは、水溶液中で無蛍光であるのが、ＤＮＡ溶液中では６４０ｎｍ（５８０ｎｍで励起）に強い蛍光を持つものであった。また、その吸収ピークはＤＮＡ添加時に約４０ｎｍ長波長シフトし、蛍光性のインターカレーターである。化合物ｂは、化合物ａとは逆に遊離の状態で強い蛍光があるが、ＤＮＡ共存下では蛍光が消失するものであった。
【０１７１】
［６］二種のピリリウム色素を用いた電荷移動によるハイブリッド体の検出
上記［４］項で作製したプローブとＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体に化合物ａを最終濃度が５μＭになるように加え、更に、各種濃度の化合物ｂを加えた。この溶液に化合物ａの吸収波長である５８０ｎｍの可視光を照射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観測した。その結果、化合物ｂを加える前に観測された６４０ｎｍの蛍光は消失し、かわりに４５０ｎｍに新たに蛍光が現れた。このことは、ハイブリッド体に挿入された化合物ａと化合物ｂとの間で核酸の二重らせん構造を介した電荷移動が起こり、４５０ｎｍに蛍光が出現したものと考えられる。また、４５０ｎｍの蛍光は化合物ｂが５μＭの時が最大であった。
【０１７２】
実施例２（ミスマッチの検出）
下記の塩基配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた以外は、実施例１と同様にして、プローブ・標的ＤＮＡハイブリッド体を調製した。
【０１７３】
５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：２）
なお、この塩基配列は、実施例１で用いたプローブ用塩基配列の５’末端から１０番目のＣをＧに変換したものであり、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとミスマッチするように設計されたものである。
【０１７４】
このハイブリッド体に実施例１と同様に２種類のピリリウム色素を加え、５８０ｎｍの光を励起光として、その蛍光増大、蛍光消失を観測した。実施例１とは異なり、化合物ａ及び化合物ｂのいずれの蛍光もその強度に変化は見られなかった。この結果は、ミスマッチしているハイブリッド体ではこれらの色素間の相互作用が起きなかったためと考えられる。
【０１７５】
実施例３（２種のピリリウム色素によるＤＮＡハイブリッド体の検出）
実施例１と同様な方法によりプローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。これに、化合物ａを加え、その後、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−４−フェニルピリリウム アイオダイド（化合物ｃ）を加えた。
【０１７６】
あらかじめ化合物ｃとＤＮＡとの相互作用を調べた。その結果、化合物ｃは６００ｎｍ付近に吸収があり、化合物ａと同様、ＤＮＡ添加に伴って吸収スペクトルのシフトが見られ（６４０ｎｍ）、インターカレーターと思われるが、その蛍光はＤＮＡ溶液中でも小さかった。
【０１７７】
プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体にこれら２種類のピリリウム色素を加え、化合物ａの励起波長である５８０ｎｍの光を照射したところ、本来、化合物ｃがなかった時にＤＮＡ共存下で観測された化合物ａの強い吸収は消失し、代わりに７２０ｎｍにあらたに蛍光が出現した。このことは、化合物ａから化合物ｃへエネルギー移動が起きたためと考えられる。化合物ｃの量をいろいろ変えて実験したところ、供与体の蛍光の減少と受容体の蛍光の増大はそれぞれが同じモル数の時に最も効果的であった。
【０１７８】
実施例４（標識抗体と電荷移動によるハイブリッド体の検出）
［１］標識抗体の作製
（１）４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレートの合成
Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート（化合物ｂ）を合成した。
【０１７９】
（２）抗体の標識
化合物ｂの４．３ｇ、カルボキシベンツアルヒド２ｇ、７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還流した後、析出した沈澱を集め、上記エタノール／エーテルの混合系から再結晶させて、４−（４−カルボキシスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレート（化合物ｄ）を得た。
【０１８０】
化合物ｄの１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌した。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈澱を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥させた。得られた活性エステル体［化合物ｅ］を抗体のアミノ基と反応させて、標識抗体を作製した。
【０１８１】
［２］ＦＩＴＣ標識２次抗体による検出
抗原と、上記［２］項で作製した一次抗体を常法により反応させて、その後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を反応させた。
【０１８２】
このサンプルに４８０ｎｍの可視光を照射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観測した。その結果、標識抗体を反応させる前に観測されたＦＩＴＣの５２０ｎｍの蛍光は消失し、かわりに４５０ｎｍに新たに蛍光が現われた。このことは、一次抗体と二次抗体とが反応した結果、標識抗体上の化合物ｂとＦＩＴＣとの間で電荷移動が起ったものと考えられる。
【０１８３】
【発明の効果】
本発明の検出方法によれば、標的物質の検出をより高精度で行うことが可能となる。例えば、プローブを用いたハイブリダイゼーションによって得られたハイブリッド体を標的物質とした場合、Ｂ／Ｆ分離が必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で不可決であった過剰なプローブの除去、非特異吸着を除くための煩雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が不要となった。更に、正確なハイブリッド体でのみ信号変化が観測されるように試薬物質を選択することで、反応系中にミスマッチが発生している場合でも、正確な二重らせん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出することが可能となる。
【０１８４】
更に、本発明の方法においてピリリウム系化合物を電子供与体として用いる場合、遊離時にはほとんど蛍光がなく、核酸の二重らせん構造に結合した際にその蛍光特性が大きく変化するものを利用すれば、検出時におけるＳ／Ｎ比を上昇させることが可能になる。また、ピリリウム系化合物は他の縮合環タイプのインターカレーターに比べ、より二重らせん構造特異的に挿入され、一本鎖ＤＮＡの部分的二本鎖構造には挿入されにくいことが特徴である。その結果、少なくとも２種の試薬の少なくとも一つにピリリウム系化合物を用いることにより部分的二本鎖構造による擬ハイブリッド体由来の信号を除外することができる。
【０１８５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の検出方法で利用する標的物質を介する相互作用を行う反応系のモデルを示す図である。
【図２】本発明の検出方法で利用する標的物質を介する相互作用を行う反応系のモデルを示す図である。
【符号の説明】
１、２、４、５、６、７ 試薬
３ 標的物質
Claims (13)
- 標的物質を介在した相互作用として電荷移動に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬を、試料と反応させ、試料中に前記標的物質が存在する場合に生じる前記電荷移動に基づく変化を測定することによって該試料中の標的物質を検出する方法において、前記２種の試薬が、下記の組合せ（１）又は（２）であることを特徴とする標的物質の検出方法：
（１）下記構造式（ａ）及び（ｂ）の組合せ；
- 前記相互作用に基づく変化が、光学的に検出可能なものである請求項１に記載の検出方法。
- 前記相互作用に基づく変化が、光照射により開始される請求項１又は２に記載の検出方法。
- 前記相互作用に基づく変化が、不可逆的である請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
- 核酸の二重らせん構造を介在した相互作用として電荷移動により検出可能な変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬を、試料と反応させ、試料中に前記二重らせん構造が存在する場合に生じる前記検出可能な変化を測定することによって該試料中の二重らせん構造を検出する方法において、前記２種の試薬が下記の組合せ（１）又は（２）であることを特徴とする核酸二重らせん構造の検出方法：
（１）下記構造式（ａ）及び（ｂ）の組合せ；
- 前記電荷移動が、二重らせん構造を構成する塩基対のスタッキングを介して起る請求項５に記載の検出方法。
- 前記相互作用に基づく変化が、光照射により開始される請求項５又は６に記載の検出方法。
- 前記相互作用に基づく変化が、不可逆的である請求項５〜７のいずれかに記載の検出方法。
- 前記二重らせん構造が、標的核酸にプローブ核酸を反応させて得られるハイブリッド体である請求項５〜８のいずれかに記載の検出方法。
- 検出対象物質に対して免疫反応を生じ得る第１次反応体及び第２次反応体をこの順に反応させて得られる複合体の生成を測定することにより免疫反応の有無を検出する方法において、前記第１及び第２の反応体のそれぞれが、これら反応体が反応した際に得られる複合体を介在した相互作用としての電荷移動に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬で標識されており、該２種の試薬が、下記の組合せ（１）又は（２）であることを特徴とする免疫反応の検出方法：
（１）下記構造式（ａ）及び（ｂ）の組合せ；
- 前記相互作用に基づく変化が、光学的に検出可能である請求項１０に記載の検出方法。
- 前記相互作用が、光照射により開始される請求項１０又は１１に記載の検出方法。
- 前記相互作用が、不可逆的である請求項１０〜１２のいずれかに記載の検出方法。
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