JP3826426B2 - ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法 - Google Patents
２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα−アミラーゼの活性測定用基質として有用な式（２）
【０００２】
【化３】
【０００３】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、式（２）の化合物と称することもある）の新規なの製造方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
【０００５】
従来より、膵液や尿など体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断が行われて、多くのα−アミラーゼ活性測定用基質が用いられている。
【０００６】
その中で、特開平６−３１５３９９号公報には、追随酵素を必要としない、高感度なα−アミラーゼ活性測定用基質として、式（２）の化合物が記載されている。
【０００７】
一方、特開平３−２６４５９６号公報には、式（４）
【０００８】
【化４】
【０００９】
（式中、Ｘ1 およびＸ2 の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）で表されるｎが２以上の、ガラクトシル基にグルコース基が４個以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の製造に関して、ラクトースなどのガラクトシル残基をもつ糖と、式（５）
【００１０】
【化５】
【００１１】
（式中、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）で表されるｎが２以上でグルコース基が４個以上結合したマルトオリゴ糖誘導体とに、α−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを作用させる方法が記載されている。
【００１２】
さらに、特開平６−８６６８３号公報には、特開平３−２６４５９６号公報に記載の製造方法を改良することを目的として、式（４）
【００１３】
【化６】
【００１４】
（式中、Ｘ1 およびＸ2 の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは１〜５の整数である。）で表されるグルコース基が３つ以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関して、マルトオリゴ糖とガラクトース残基を有する糖に、β−ガラクトシダーゼを作用させて、式（６）
【００１５】
【化７】
【００１６】
（式中、Ｘ1 およびＸ2 の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、ｎは１〜５の整数を示す。）で表されるｎが１以上の、ガラクトシル基にグルコース残基が３個以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖を製造した後、さらに、水と親水性有機溶媒との混合溶液中で、このガラクトシルマルトオリゴ糖と、式（７）
【００１７】
【化８】
【００１８】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の混合物に、α−アミラーゼを作用させる方法が示されている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ところで、特開平６−３１５３９９号公報によると、式（２）の化合物は、新規化合物であるにもかかわらず、その製造実施例がなく、化学的な物性データの開示もない。本公報には、式（２）の化合物を含むマルトオリゴ糖誘導体は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができると記載されているのみであり、有機化学的合成法および酵素を用いた合成法が概念的に示されているにすぎない。
【００２１】
すなわち、特開平６−３１５３９９号公報によると、「マルトオリゴ糖誘導体（ａ）
【００２２】
【化９】
【００２３】
は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができる。例えば、還元末端のグルコースに２−クロロ−４−ニトロフェノールを結合したマルトオリゴ糖誘導体（ｂ）
【００２４】
【化１０】
【００２５】
（式中、ｎは０〜２の整数を示す。）とラクトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマルトオリゴ糖誘導体（ｂ）の非還元末端にβ−ガラクトピラノシル基を導入することにより製造することができる。
【００２６】
また、別法としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖およびラクトースを用いてβ−ガラクトシダーゼによりマルトオリゴ糖の非還元末端にガラクトピラノシル基を導入して合成したガラクトピラノシルマルトオリゴ糖に、塩基触媒（ピリジンもしくは酢酸ナトリウムなど）の存在下、無水酢酸中で室温あるいは加温してアセチル化し、ガラクトピラノシルマルトオリゴ糖保護体とする。次いで無機溶媒の存在下、もしくは無溶媒下、アルカリおよび無水酢酸およびフェノール類、例えば２−クロロ−４−ニトロフェノールとともに加熱して還元性末端をフェノール類により修飾し、最後にメタノール中、触媒量のナトリウムメチラートによる公知の脱保護反応により、目的であるガラクトピラノシルマルトオリゴ糖誘導体を製造する方法がある。」と記載されている。
【００２７】
ここで、特開平６−３１５３９９号公報に記載されているような有機化学的方法で式（２）の目的化合物を製造しようとする場合、式（３）
【００２８】
【化１１】
【００２９】
で表される高価で、工業的に入手困難なガラクトシルマルトースを原料として用いなければならないといった問題がある。
【００３０】
ここで、本発明者らは、特開平３−２６４５９６号公報に記載のある製造方法を準用して、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造を試みたところ、アミラーゼ基質としては非常に感度の低い（β−１，４結合した化合物の１／２０程度）ガラクトシル基が式（８）
【００３１】
【化１２】
【００３２】
で表されるβ−１，６結合した２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを７０％前後も生成し、選択性が逆転してしまうことが判明した。
【００３３】
また、β−１，４結合した化合物と、β−１，６結合した化合物との混合物より、目的物であるβ−１，４結合した化合物を得ようとしても、工業的に単離することは極めて困難である。
【００３４】
したがって、特開平６−３１５３９９号公報に記載のある特開平３−２６４５９４号公報を準用する製造方法では、グルコースの繰り返し単位が異なるだけの類似化合物であるものの、式（２）の目的化合物を満足に合成することはできない。
【００３５】
また、酵素の起源によっては、たとえβ−ガラクトシダーゼであっても目的物質であるβ−１，４結合した化合物を優先的に生成することはなく、β−１，６結合した化合物を優先的に生成することもある。上記のようなβ−ガラクトシダーゼ転移能の位置選択性の制御に関する問題については、これまで何ら認識されたことはなかった。
【００３６】
このように従来の製造方法によると、α−アミラーゼ活性測定基質としては極めて感度の低い式（８）
【００３７】
【化１３】
【００３８】
で表されるβ−１，６結合した２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドが、副生物として生成し、それを工業的に除去精製することは極めて困難であり、また、このような副生物が高純度品が要求される臨床診断用の基質に混入することは好ましくないことから、ガラクトシル基を高位置選択的に導入する技術が求められていた。
【００３９】
この点に関し、特開平６−８６６８３号公報によると、β−１，６結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の副生を抑えるため、第２段階の反応としてマルトオリゴ糖誘導体に、α−アミラーゼを作用させる方法を採用している。
【００４０】
しかしながら、同法ではガラクトシル基の導入に関して、その位置選択性を向上させることは可能となったものの、転移率が１０％〜２０％程度と大変低い酵素転移反応を２段階も用いる同法は、非常に収率および生産効率が低いといった問題を生じてしまい、工業的製法としては不十分なものであった。
【００４１】
【発明の課題を解決するための手段】
【００４２】
本発明者らは、各種疾患の診断に用いられるα−アミラーゼ活性測定試薬測定用基質である式（２）の化合物を、安価な原料を用い、一段階の酵素反応で、高収率、かつ高位置選択的に製造することを目的として鋭意検討を行い、本発明方法を完成するに至った。
【００４３】
すわなち、本発明は、ラクトースと、式（１）
【００４４】
【化１４】
【００４５】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドとを、β−ガラクトシダーゼの共存下に反応させることを特徴とする式（２）で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法に関する。
【００４６】
【発明の実施の形態】
【００４７】
本発明の製造方法にて用いられる式（１）の化合物は、市販のマルトースより特開平８−６７６９１号公報、特開平８−６７６９２号公報などに記載の方法で製造される。
【００４８】
転移反応において、ラクトースの基質濃度は、反応溶液に対して、３〜４０％、好ましくは５〜２０％とし、式（１）の化合物の基質濃度は、反応溶液に対して、１〜４０％、好ましくは１〜２０％、さらに好ましくは２〜９％である。
【００４９】
β−ガラクトシダーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の酵素がよく、たとえば、市販品として入手できる大和化成株式会社製の商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼＩＩ」があげられる。また、公知の固定化酵素法を用いても本発明方法により、目的物を生成することができる。
【００５０】
β−ガラクトシダーゼの濃度は、ガラクトシル基を高位置選択的に導入するために、反応溶液１ｍｌあたり０．０１〜０．８ｍｇ、好ましくは０．０１〜０．４ｍｇ、さらに好ましくは、０．０１〜０．１ｍｇである。
【００５１】
反応時間は、酵素を添加したのち１分〜３０時間から選択することができる。
【００５２】
反応温度は２０〜７０℃の範囲から選択することができる。
【００５３】
反応溶媒は、水、または水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロプロピルアルコール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはこれらの混合物を挙げることができる。
【００５４】
親水性有機溶媒の含有率は１０〜９０％、好ましくは４０〜７０％が適当である。また、これらの親水性有機溶媒は単独あるいは混合しての使用も可能である。
【００５５】
反応溶媒は、ｐＨを５〜８の範囲で調整されるのがよく、このために公知の緩衝溶液などが使用できる。
【００５６】
反応終了後、反応液を加熱または反応液のｐＨを低下あるいは上昇させることで酵素反応を停止させる。次いでカラムクロマトグラフィーなどにより精製し、目的物質を得ることができる。
【００５７】
【実施例】
【００５８】
実験例中に記載された略号は、以下の通りを意味する。
酵素Ａ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製；商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼＩＩ」）。
酵素Ｂ：Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ（フナコシ株式会社製；商品番号「ＦＴ−００５２−０９」）。
酵素Ｃ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．由来のβ−ガラクトシダーゼ（フナコシ株式会社製；商品番号「ＦＴ−００５２−０１」）。
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール。
ＡＮ：アセトニトリル。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド。
６７ｍＭリン酸緩衝溶液：規定濃度のリン酸水溶液（ｐＨ７．０）。
【００５９】
実験例１：比較例１〜６
ラクトース一水和物６００．０ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシド３００．０ｍｇを、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドの何れかの親水性有機溶媒と、６７ｍＭリン緩衝溶液とを、下記に示した割合で混合した混合溶媒５．０ｍｌに投入後、酵素Ａを、混合溶媒１ｍｌあたり１．０ｍｇの割合で添加し、４０℃で、３時間または１０時間反応させた。１００℃に加温することにより反応を終了させた。反応終了後、ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体（以下に示したβ−１−４体とβ−１−６体の混合物である）を分離し、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドに対するガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の収率（以下、糖誘導体収率と示す。）を測定したところ、いずれも１５〜２０％であった。反応終了後、ＯＤＳカラムで精製する前の反応生成物について、式（２）
【００６０】
【化１５】
【００６１】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、β−１−４体と示す。）と、式（８）
【００６２】
【化１６】
【００６３】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、β−１−６体と示す。）との生成比（以下、１−４／１−６生成比と示す。）を、高速液体クロマトグラフィーを用いて求めた。これらの結果を以下に示した。
【００６４】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例１ Ａ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ２８： ７２ １０時間
比較例２ Ａ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ３４： ６６ １０時間
比較例３ Ａ １．００ ＡＮ ：水＝５：５ ３６： ６４ １０時間
比較例４ Ａ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ４７： ５３ ３時間
比較例５ Ａ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ５１： ４９ ３時間
比較例６ Ａ １．００ ＡＮ ：水＝５：５ ５４： ４６ ３時間
【００６５】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ａを用いた実験例１において、β−１，４体は選択的に得られず、β−１，６体の方がより多く生成した例もあった。
【００６６】
実験例２：比較例７〜１２
実験例１と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いて、同様の実験を行った。
これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００６７】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例７ Ｂ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ １０時間
比較例８ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例９ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝２：８ ０：１００ １０時間
比較例１０ Ｂ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ ３時間
比較例１１ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例１２ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝２：８ ０：１００ ３時間
【００６８】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ｂを用いた実験例２において、β−１，４体は得られず、β−１，６体のみが生成した。
【００６９】
実験例３：比較例１３〜１６
実験例１と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００７０】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例１３ Ｃ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ３： ９７ １０時間
比較例１４ Ｃ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ５： ９５ １０時間
比較例１５ Ｃ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ １２： ８８ ３時間
比較例１６ Ｃ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ １０： ９０ ３時間
【００７１】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ｃを用いた実験例３において、β−１，４体はほとんど得られず、むしろβ−１，６体が選択的に生成した。
【００７２】
実験例４：実施例１〜２４
ラクトース一水和物６００．０ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシド３００．０ｍｇを、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドの何れかの親水性有機溶媒と、６７ｍＭリン緩衝溶液とを、下記に示した割合で混合した混合溶媒５．０ｍｌに投入後、酵素Ａを、混合溶媒１ｍｌあたり下記に示した割合で添加し、４０℃で、３時間または１０時間反応させた。１００℃に加温することにより反応を終了させた。糖誘導体収率は、いずれも１５〜２０％であった。反応終了後、ＯＤＳカラムで精製する前の反応生成物について、実験例１と同様に、１−４／１−６生成比を求めた。
【００７３】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
実施例１ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９２： ８ １０時間
実施例２ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ８２： １８ １０時間
実施例３ Ａ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ６７： ３３ １０時間
実施例４ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝２：８ ７６： ２４ １０時間
実施例５ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝２：８ ６７： ３３ １０時間
実施例６ Ａ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ９２： ８ １０時間
実施例７ Ａ ０．１０ ＡＮ ：水＝５：５ ８０： ２０ １０時間
実施例８ Ａ ０．３０ ＡＮ ：水＝５：５ ６８： ３２ １０時間
実施例９ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ８９： １１ １０時間
実施例１０ Ａ ０．１０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ８２： １８ １０時間
実施例１１ Ａ ０．３０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ６３： ３７ １０時間
実施例１２ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ７９： ２１ １０時間
実施例１３ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９０： １０ ３時間
実施例１４ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９１： ９ ３時間
実施例１５ Ａ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ８０： ２０ ３時間
実施例１６ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝２：８ ７４： ２６ ３時間
実施例１７ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝２：８ ８３： １７ ３時間
実施例１８ Ａ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ９０： １０ ３時間
実施例１９ Ａ ０．１０ ＡＮ ：水＝５：５ ８７： １３ ３時間
実施例２０ Ａ ０．３０ ＡＮ ：水＝５：５ ８２： １８ ３時間
実施例２１ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ８６： １４ ３時間
実施例２２ Ａ ０．１０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ７５： ２５ ３時間
実施例２３ Ａ ０．３０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ７７： ２３ ３時間
実施例２４ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ８７： １３ ３時間
【００７４】
実験例４により、酵素Ａを用いて、β−ガラクトシダーゼの濃度を、混合溶媒１ｍｌあたり０．０４ｍｇ、０．１ｍｇ、または０．３ｍｇとしたところ、β−１，４体が選択的に得られることがわかった。
【００７５】
実施例１について、反応終了後、ＯＤＳカラムを用いて分離精製し、凍結乾燥して、β−１，４体である２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド７２ｍｇを得た。
【００７６】
実験例５：比較例１７〜２８
実験例４と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００７７】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例１７ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例１８ Ｂ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例１９ Ｂ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例２０ Ｂ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例２１ Ｂ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ １０時間
比較例２２ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例２３ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２４ Ｂ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２５ Ｂ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２６ Ｂ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２７ Ｂ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ ３時間
比較例２８ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
【００７８】
酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いたところ、β−１，４体は得られず、β−１，６体のみが生成した。
【００７９】
実験例６：比較例２９〜３２
実験例４と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００８０】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例２９ Ｃ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ５： ９５ １０時間
比較例３０ Ｃ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ７： ９３ １０時間
比較例３１ Ｃ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ７： ９３ ３時間
比較例３２ Ｃ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９： ９１ ３時間
【００８１】
酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いたところ、β−１，４体はほとんど得られず、むしろβ−１，６体が選択的に生成した。
【００８２】
上記の実験例１〜６により、β−ガラクトシダーゼの濃度と種類を選択することにより、本発明の目的であるβ−１，４体を選択的に製造することができることが、確認された。
【００８３】
【発明の効果】
【００８４】
本発明の式（２）
【００８５】
【化１７】
【００８６】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法は、高価な式（３）
【００８７】
【化１８】
【００８８】
で表されるガラクトシル−マルトースを用いることなく大変安価なラクトースと、式（１）
【００８９】
【化１９】
【００９０】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドとを出発原料にし、非常に高い選択性でβ−１，４結合を生成させることを可能にしたことで、一段階のみの酵素転移反応で、目的物質を純度よく生成し得る非常に効率の良い工業的製造法として極めて有用である。
【発明の属する技術分野】
本発明はα−アミラーゼの活性測定用基質として有用な式（２）
【０００２】
【化３】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、式（２）の化合物と称することもある）の新規なの製造方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
【０００５】
従来より、膵液や尿など体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断が行われて、多くのα−アミラーゼ活性測定用基質が用いられている。
【０００６】
その中で、特開平６−３１５３９９号公報には、追随酵素を必要としない、高感度なα−アミラーゼ活性測定用基質として、式（２）の化合物が記載されている。
【０００７】
一方、特開平３−２６４５９６号公報には、式（４）
【０００８】
【化４】
（式中、Ｘ1 およびＸ2 の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）で表されるｎが２以上の、ガラクトシル基にグルコース基が４個以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の製造に関して、ラクトースなどのガラクトシル残基をもつ糖と、式（５）
【００１０】
【化５】
（式中、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）で表されるｎが２以上でグルコース基が４個以上結合したマルトオリゴ糖誘導体とに、α−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを作用させる方法が記載されている。
【００１２】
さらに、特開平６−８６６８３号公報には、特開平３−２６４５９６号公報に記載の製造方法を改良することを目的として、式（４）
【００１３】
【化６】
（式中、Ｘ1 およびＸ2 の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは１〜５の整数である。）で表されるグルコース基が３つ以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関して、マルトオリゴ糖とガラクトース残基を有する糖に、β−ガラクトシダーゼを作用させて、式（６）
【００１５】
【化７】
（式中、Ｘ1 およびＸ2 の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、ｎは１〜５の整数を示す。）で表されるｎが１以上の、ガラクトシル基にグルコース残基が３個以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖を製造した後、さらに、水と親水性有機溶媒との混合溶液中で、このガラクトシルマルトオリゴ糖と、式（７）
【００１７】
【化８】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の混合物に、α−アミラーゼを作用させる方法が示されている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ところで、特開平６−３１５３９９号公報によると、式（２）の化合物は、新規化合物であるにもかかわらず、その製造実施例がなく、化学的な物性データの開示もない。本公報には、式（２）の化合物を含むマルトオリゴ糖誘導体は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができると記載されているのみであり、有機化学的合成法および酵素を用いた合成法が概念的に示されているにすぎない。
【００２１】
すなわち、特開平６−３１５３９９号公報によると、「マルトオリゴ糖誘導体（ａ）
【００２２】
【化９】
は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができる。例えば、還元末端のグルコースに２−クロロ−４−ニトロフェノールを結合したマルトオリゴ糖誘導体（ｂ）
【００２４】
【化１０】
（式中、ｎは０〜２の整数を示す。）とラクトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマルトオリゴ糖誘導体（ｂ）の非還元末端にβ−ガラクトピラノシル基を導入することにより製造することができる。
【００２６】
また、別法としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖およびラクトースを用いてβ−ガラクトシダーゼによりマルトオリゴ糖の非還元末端にガラクトピラノシル基を導入して合成したガラクトピラノシルマルトオリゴ糖に、塩基触媒（ピリジンもしくは酢酸ナトリウムなど）の存在下、無水酢酸中で室温あるいは加温してアセチル化し、ガラクトピラノシルマルトオリゴ糖保護体とする。次いで無機溶媒の存在下、もしくは無溶媒下、アルカリおよび無水酢酸およびフェノール類、例えば２−クロロ−４−ニトロフェノールとともに加熱して還元性末端をフェノール類により修飾し、最後にメタノール中、触媒量のナトリウムメチラートによる公知の脱保護反応により、目的であるガラクトピラノシルマルトオリゴ糖誘導体を製造する方法がある。」と記載されている。
【００２７】
ここで、特開平６−３１５３９９号公報に記載されているような有機化学的方法で式（２）の目的化合物を製造しようとする場合、式（３）
【００２８】
【化１１】
で表される高価で、工業的に入手困難なガラクトシルマルトースを原料として用いなければならないといった問題がある。
【００３０】
ここで、本発明者らは、特開平３−２６４５９６号公報に記載のある製造方法を準用して、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造を試みたところ、アミラーゼ基質としては非常に感度の低い（β−１，４結合した化合物の１／２０程度）ガラクトシル基が式（８）
【００３１】
【化１２】
で表されるβ−１，６結合した２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを７０％前後も生成し、選択性が逆転してしまうことが判明した。
【００３３】
また、β−１，４結合した化合物と、β−１，６結合した化合物との混合物より、目的物であるβ−１，４結合した化合物を得ようとしても、工業的に単離することは極めて困難である。
【００３４】
したがって、特開平６−３１５３９９号公報に記載のある特開平３−２６４５９４号公報を準用する製造方法では、グルコースの繰り返し単位が異なるだけの類似化合物であるものの、式（２）の目的化合物を満足に合成することはできない。
【００３５】
また、酵素の起源によっては、たとえβ−ガラクトシダーゼであっても目的物質であるβ−１，４結合した化合物を優先的に生成することはなく、β−１，６結合した化合物を優先的に生成することもある。上記のようなβ−ガラクトシダーゼ転移能の位置選択性の制御に関する問題については、これまで何ら認識されたことはなかった。
【００３６】
このように従来の製造方法によると、α−アミラーゼ活性測定基質としては極めて感度の低い式（８）
【００３７】
【化１３】
で表されるβ−１，６結合した２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドが、副生物として生成し、それを工業的に除去精製することは極めて困難であり、また、このような副生物が高純度品が要求される臨床診断用の基質に混入することは好ましくないことから、ガラクトシル基を高位置選択的に導入する技術が求められていた。
【００３９】
この点に関し、特開平６−８６６８３号公報によると、β−１，６結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の副生を抑えるため、第２段階の反応としてマルトオリゴ糖誘導体に、α−アミラーゼを作用させる方法を採用している。
【００４０】
しかしながら、同法ではガラクトシル基の導入に関して、その位置選択性を向上させることは可能となったものの、転移率が１０％〜２０％程度と大変低い酵素転移反応を２段階も用いる同法は、非常に収率および生産効率が低いといった問題を生じてしまい、工業的製法としては不十分なものであった。
【００４１】
【発明の課題を解決するための手段】
【００４２】
本発明者らは、各種疾患の診断に用いられるα−アミラーゼ活性測定試薬測定用基質である式（２）の化合物を、安価な原料を用い、一段階の酵素反応で、高収率、かつ高位置選択的に製造することを目的として鋭意検討を行い、本発明方法を完成するに至った。
【００４３】
すわなち、本発明は、ラクトースと、式（１）
【００４４】
【化１４】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドとを、β−ガラクトシダーゼの共存下に反応させることを特徴とする式（２）で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法に関する。
【００４６】
【発明の実施の形態】
【００４７】
本発明の製造方法にて用いられる式（１）の化合物は、市販のマルトースより特開平８−６７６９１号公報、特開平８−６７６９２号公報などに記載の方法で製造される。
【００４８】
転移反応において、ラクトースの基質濃度は、反応溶液に対して、３〜４０％、好ましくは５〜２０％とし、式（１）の化合物の基質濃度は、反応溶液に対して、１〜４０％、好ましくは１〜２０％、さらに好ましくは２〜９％である。
【００４９】
β−ガラクトシダーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の酵素がよく、たとえば、市販品として入手できる大和化成株式会社製の商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼＩＩ」があげられる。また、公知の固定化酵素法を用いても本発明方法により、目的物を生成することができる。
【００５０】
β−ガラクトシダーゼの濃度は、ガラクトシル基を高位置選択的に導入するために、反応溶液１ｍｌあたり０．０１〜０．８ｍｇ、好ましくは０．０１〜０．４ｍｇ、さらに好ましくは、０．０１〜０．１ｍｇである。
【００５１】
反応時間は、酵素を添加したのち１分〜３０時間から選択することができる。
【００５２】
反応温度は２０〜７０℃の範囲から選択することができる。
【００５３】
反応溶媒は、水、または水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロプロピルアルコール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはこれらの混合物を挙げることができる。
【００５４】
親水性有機溶媒の含有率は１０〜９０％、好ましくは４０〜７０％が適当である。また、これらの親水性有機溶媒は単独あるいは混合しての使用も可能である。
【００５５】
反応溶媒は、ｐＨを５〜８の範囲で調整されるのがよく、このために公知の緩衝溶液などが使用できる。
【００５６】
反応終了後、反応液を加熱または反応液のｐＨを低下あるいは上昇させることで酵素反応を停止させる。次いでカラムクロマトグラフィーなどにより精製し、目的物質を得ることができる。
【００５７】
【実施例】
【００５８】
実験例中に記載された略号は、以下の通りを意味する。
酵素Ａ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製；商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼＩＩ」）。
酵素Ｂ：Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ（フナコシ株式会社製；商品番号「ＦＴ−００５２−０９」）。
酵素Ｃ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．由来のβ−ガラクトシダーゼ（フナコシ株式会社製；商品番号「ＦＴ−００５２−０１」）。
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール。
ＡＮ：アセトニトリル。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド。
６７ｍＭリン酸緩衝溶液：規定濃度のリン酸水溶液（ｐＨ７．０）。
【００５９】
実験例１：比較例１〜６
ラクトース一水和物６００．０ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシド３００．０ｍｇを、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドの何れかの親水性有機溶媒と、６７ｍＭリン緩衝溶液とを、下記に示した割合で混合した混合溶媒５．０ｍｌに投入後、酵素Ａを、混合溶媒１ｍｌあたり１．０ｍｇの割合で添加し、４０℃で、３時間または１０時間反応させた。１００℃に加温することにより反応を終了させた。反応終了後、ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体（以下に示したβ−１−４体とβ−１−６体の混合物である）を分離し、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドに対するガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の収率（以下、糖誘導体収率と示す。）を測定したところ、いずれも１５〜２０％であった。反応終了後、ＯＤＳカラムで精製する前の反応生成物について、式（２）
【００６０】
【化１５】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、β−１−４体と示す。）と、式（８）
【００６２】
【化１６】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、β−１−６体と示す。）との生成比（以下、１−４／１−６生成比と示す。）を、高速液体クロマトグラフィーを用いて求めた。これらの結果を以下に示した。
【００６４】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例１ Ａ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ２８： ７２ １０時間
比較例２ Ａ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ３４： ６６ １０時間
比較例３ Ａ １．００ ＡＮ ：水＝５：５ ３６： ６４ １０時間
比較例４ Ａ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ４７： ５３ ３時間
比較例５ Ａ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ５１： ４９ ３時間
比較例６ Ａ １．００ ＡＮ ：水＝５：５ ５４： ４６ ３時間
【００６５】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ａを用いた実験例１において、β−１，４体は選択的に得られず、β−１，６体の方がより多く生成した例もあった。
【００６６】
実験例２：比較例７〜１２
実験例１と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いて、同様の実験を行った。
これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００６７】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例７ Ｂ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ １０時間
比較例８ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例９ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝２：８ ０：１００ １０時間
比較例１０ Ｂ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ ３時間
比較例１１ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例１２ Ｂ １．００ ＩＰＡ ：水＝２：８ ０：１００ ３時間
【００６８】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ｂを用いた実験例２において、β−１，４体は得られず、β−１，６体のみが生成した。
【００６９】
実験例３：比較例１３〜１６
実験例１と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００７０】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例１３ Ｃ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ３： ９７ １０時間
比較例１４ Ｃ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ ５： ９５ １０時間
比較例１５ Ｃ １．００ ＤＭＳＯ：水＝２：８ １２： ８８ ３時間
比較例１６ Ｃ １．００ ＩＰＡ ：水＝５：５ １０： ９０ ３時間
【００７１】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ｃを用いた実験例３において、β−１，４体はほとんど得られず、むしろβ−１，６体が選択的に生成した。
【００７２】
実験例４：実施例１〜２４
ラクトース一水和物６００．０ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシド３００．０ｍｇを、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドの何れかの親水性有機溶媒と、６７ｍＭリン緩衝溶液とを、下記に示した割合で混合した混合溶媒５．０ｍｌに投入後、酵素Ａを、混合溶媒１ｍｌあたり下記に示した割合で添加し、４０℃で、３時間または１０時間反応させた。１００℃に加温することにより反応を終了させた。糖誘導体収率は、いずれも１５〜２０％であった。反応終了後、ＯＤＳカラムで精製する前の反応生成物について、実験例１と同様に、１−４／１−６生成比を求めた。
【００７３】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
実施例１ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９２： ８ １０時間
実施例２ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ８２： １８ １０時間
実施例３ Ａ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ６７： ３３ １０時間
実施例４ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝２：８ ７６： ２４ １０時間
実施例５ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝２：８ ６７： ３３ １０時間
実施例６ Ａ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ９２： ８ １０時間
実施例７ Ａ ０．１０ ＡＮ ：水＝５：５ ８０： ２０ １０時間
実施例８ Ａ ０．３０ ＡＮ ：水＝５：５ ６８： ３２ １０時間
実施例９ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ８９： １１ １０時間
実施例１０ Ａ ０．１０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ８２： １８ １０時間
実施例１１ Ａ ０．３０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ６３： ３７ １０時間
実施例１２ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ７９： ２１ １０時間
実施例１３ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９０： １０ ３時間
実施例１４ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９１： ９ ３時間
実施例１５ Ａ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ８０： ２０ ３時間
実施例１６ Ａ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝２：８ ７４： ２６ ３時間
実施例１７ Ａ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝２：８ ８３： １７ ３時間
実施例１８ Ａ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ９０： １０ ３時間
実施例１９ Ａ ０．１０ ＡＮ ：水＝５：５ ８７： １３ ３時間
実施例２０ Ａ ０．３０ ＡＮ ：水＝５：５ ８２： １８ ３時間
実施例２１ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ８６： １４ ３時間
実施例２２ Ａ ０．１０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ７５： ２５ ３時間
実施例２３ Ａ ０．３０ ＤＭＳＯ：水＝５：５ ７７： ２３ ３時間
実施例２４ Ａ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ８７： １３ ３時間
【００７４】
実験例４により、酵素Ａを用いて、β−ガラクトシダーゼの濃度を、混合溶媒１ｍｌあたり０．０４ｍｇ、０．１ｍｇ、または０．３ｍｇとしたところ、β−１，４体が選択的に得られることがわかった。
【００７５】
実施例１について、反応終了後、ＯＤＳカラムを用いて分離精製し、凍結乾燥して、β−１，４体である２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド７２ｍｇを得た。
【００７６】
実験例５：比較例１７〜２８
実験例４と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００７７】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例１７ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例１８ Ｂ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例１９ Ｂ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例２０ Ｂ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例２１ Ｂ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ １０時間
比較例２２ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ １０時間
比較例２３ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２４ Ｂ ０．１０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２５ Ｂ ０．３０ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２６ Ｂ ０．０４ ＡＮ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
比較例２７ Ｂ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ０：１００ ３時間
比較例２８ Ｂ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ０：１００ ３時間
【００７８】
酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いたところ、β−１，４体は得られず、β−１，６体のみが生成した。
【００７９】
実験例６：比較例２９〜３２
実験例４と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００８０】
試験例 酵素 酵素濃度 溶媒組成 1-4/1-6 生成比 反応時間
比較例２９ Ｃ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ５： ９５ １０時間
比較例３０ Ｃ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ７： ９３ １０時間
比較例３１ Ｃ ０．０４ ＤＭＳＯ：水＝２：８ ７： ９３ ３時間
比較例３２ Ｃ ０．０４ ＩＰＡ ：水＝５：５ ９： ９１ ３時間
【００８１】
酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いたところ、β−１，４体はほとんど得られず、むしろβ−１，６体が選択的に生成した。
【００８２】
上記の実験例１〜６により、β−ガラクトシダーゼの濃度と種類を選択することにより、本発明の目的であるβ−１，４体を選択的に製造することができることが、確認された。
【００８３】
【発明の効果】
【００８４】
本発明の式（２）
【００８５】
【化１７】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法は、高価な式（３）
【００８７】
【化１８】
で表されるガラクトシル−マルトースを用いることなく大変安価なラクトースと、式（１）
【００８９】
【化１９】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドとを出発原料にし、非常に高い選択性でβ−１，４結合を生成させることを可能にしたことで、一段階のみの酵素転移反応で、目的物質を純度よく生成し得る非常に効率の良い工業的製造法として極めて有用である。
Claims (2)
- 水、または水と親水性有機溶媒とを混合した溶液中において、当該溶液１ｍｌあたり０．０４〜０．３０ｍｇの濃度である、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来酵素であるβ−ガラクトシダーゼ存在下に、ラクトースと、式（１）
- β−ガラクトシダーゼの濃度が、水、または水と親水性有機溶媒とを混合した溶液１ｍｌあたり０．０４〜０．１０ｍｇである請求項１に記載した製造方法。
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| JP (1) | JP3826426B2 (ja) |
-
1996
- 1996-04-19 JP JP09831196A patent/JP3826426B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
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| JPH09275995A (ja) | 1997-10-28 |
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